Использование хромобелков морских кишечнополостных для создания флуоресцентных белков с новыми свойствами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Шкроб, Мария Александровна

• Шкроб, Мария Александровна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шкроб, Мария Александровна

Используемые сокращения.

1.Введение.

П.Обзор литературы.

TI.1 GFP-подобные белки.

IIЛ Л Зеленый флуоресцентный белок медузы Aequorea victoria (GFP).

II. 1.2 GFP-подобные белки коралловых полипов Anthozoa.

Структура GFP-подобных белков.

Структура хромофора DsRed.

Влияние конформации хромофора на флуоресцентные свойства.

Функции GFP-подобных белков небиолюминесцентных кораллов.

Распространение GFP-подобных белков.

Эволюция семейства GFP/G2FP.

Структурные особенности GFP-подобных хромобелков.

IIЛ.3 Методы использования GFP-подобных хромобелков.

Фотоактивируемые хромобелки.

Хромобелки как акцепторы для резонансного переноса энергии.

Использование мутантных вариантов хромобелков в двухцветовой флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии.

Использование хромобелков для создания псевдо-мономерных меток.

Флуоресцентные белки с эмиссией в дальне-красной области спектра.

II.2 Фотосенсибилизаторы и их использование.

Флуоресцентные белки в качестве генетически-кодируемых фотосенсибилизаторов.

Фотодинамическая терапия (ФДТ).

III. Экспериментальная часть.

IV. Результаты и обсуждение.

Создание флуоресцентного белка с эмиссией в дальне-красной области спектра на основе хромобелка из Actinia equina.

Получение фототоксичного белка на основе хромобелка медузы.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Шкроб, Мария Александровна

выводы

1. Показано, что окраска края ножного диска пурпурной актинии Actinia equina определяется синим GFP-подобным хромобелком, названным аеСР597, с максимумом поглощения при 597 нм.

2. Путем мутагенеза хромобелка аеСР597 получены флуоресцентные белки, чьи максимумы эмиссии (655-663 нм) наиболее сдвинуты в дальне-красную область видимого спектра по сравнению со всеми опубликованными на сегодняшний день GFP-подобными белками. Показана применимость одного из этих белков в качестве флуоресцентного маркера для мечения in vivo.

3. Путем мутагенеза природного хромобелка апш2СР гидромедузы был получен первый GFP-подобный фототоксичный белок, названный KillerRed, фототоксичность которого по крайней мере в 1000 раз выше, чем у других представителей этого семейства.

4. Показано, что белок KillerRed может быть использован в качестве генетически кодируемого фотосенсибилизатора для светоиндуцируемого уничтожения бактериальных и эукариотических клеток и инактивации целевых белков.

5. Продемонстрировано, что GFP-подобные хромобелки являются перспективной основой для создания флуоресцентных белков с уникальными свойствами, не встречающимися среди природных флуоресцентных белков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе была показана возможность использования GFP-подобных хромобелков для создания флуоресцентных белков, обладающих уникальными свойствами, которые могут найти применение в молекулярной биологии.

Из пурпурной актинии (.Actinia equina) была получена последовательность, кодирующая хромобелок синего цвета, названный аеСР597. Мы показали, что спектр поглощения аеСР597 совпадает со спектром поглощения, измеренным непосредственно с образца тканей актинии. Это дает основания полагать, что именно этот белок определяет синюю окраску ножного диска этого животного.

Мы предполагаем, что аеСР597 имеет DsRed-подобный хромофор, что подтверждается измерениями спектра поглощения в денатурирующих условиях и данными электорфореза в в полиакриламидном геле.

Пик поглощения аеСР597 сдвинут в длинноволновую область по сравнению с большинством опубликованных на сегодняшний день GFP-подобных белков. Исходя из этого, мы предположили, что флуоресцентные белки, полученные на основе аеСР597 путем мутагенеза, должны обладать эмиссией в дальне-красной области спектра.

С использованием мутагенеза последовательности аеСР597 нам удалось создать флуоресцентные белки, чьи максимумы эмиссии находились в дальне-красной области спектра. Полученный флуоресцентный белок AQ14 обладает максимумом эмиссии наиболее сдвинутым в дальне-красную область (максимум эмиссии при 663 нм) по сравнению со всеми опубликованными на сегодняшний день GFP-подобными белками и мутантами на их основе. Так положение максимума эмиссии AQ14 отличается от такового красного флуоресцентного белка DsRed на 80 нм. Это демонстрирует насколько важную роль играет белковое окружение в определении не только квантового выхода, но и спектра эмиссии.

На примере AQ14 нами был описан уникальный для GFP-подобных белков тип спектральных превращений. При длительном облучении и хранении происходит падение пика красой флуоресценции и его смещение в сторону меньших длин волн. Одновременно возрастает пик зеленой флуоресценции и меняется соотношение пиков поглощения. Мы показали, что эти процессы не связаны с расщеплением полипептидной цепи AQ14. Предположительно, изменение спектральных свойств происходит из-за гидратации C=N связи ацилиминной группы хромофора, происходящей с участием молекулы воды.

Изменение спектральных свойств AQ14 при облучении ограничивает возможности его практического применения. С помощью мутагенеза последовательности AQ14 нам удалось получить более стабильный вариант AQ14, названный AQ143. Максимум эмиссии AQ143 достигается при длине волны 655 нм. В отличие от AQ14, флуоресценция AQ143 не чувствительна к продолжительному облучению. Таким образом, AQ143 может быть использован для флуоресцентного мечения эукариотических клеток, что и было доказано в эксперименте с экспрессией последовательности AQ143 в клетках линии HeLa.

Полученные нами флуоресцентные белки с эмиссией в дальне-краен ой области видимого спектра представляют интерес и с фундаментальной, и с практической точки зрения. Благодаря уникальным спектральным свойствам AQ143 в будущем может быть использован в биотехнологии:

• Пик эмиссии AQ143 приходится на область спектра, в которой животные ткани практически не поглощают свет, что увеличивает эффективность детекции флуоресценции.

• Разница между максимумами эмиссии белков AQ143 и DsRed составляет более 70 нм, что позволяет одновременно использовать эти белки для многоцветового мечения.

• Для возбуждения AQ143 можно использовать лазер 600 нм, что позволяет использовать новый канал для многоцветовой проточной цитометрии.

Недостатком AQ143 для использования в качестве маркера является его склонность к тетрамеризации и наличие зеленого пика эмиссии.

В результате мутагенеза хромобелка anm2CP нами был получен красный флуоресцентный белок KillerRed. В ходе тестирования большого количества образцов из коллекции лаборатории молекулярных технологий ИБХ РАН выяснилось, что KillerRed обладает уникальными фототоксичными свойствами.

Мы установили, что эффективность KillerRed зависит от времени облучения и от длины волны возбуждающего света. Было показано, что наибольшей эффективности в экспериментах с KillerRed можно достичь, используя для возбуждения зеленый свет, что объясняется тем, что возбуждение флуоресценции KillerRed происходит именно в этом диапазоне длин волн.

Мы обнаружили, что при облучении выделенного KillerRed происходит заметная агрегация белка. Образующиеся агрегаты не разрушаются при денатурации, что можно объяснить образованием ковалентных сшивок между отдельными молекулами KillerRed.

Было показано, что KillerRed проявляет фототоксичность не только в отношение бактериальных клеток, но и в отношение клеток эукариот. При этом степень воздействия KillerRed на клетку при облучении существеннно зависит от внутриклеточной локализации фототоксичного белка. Направление KillerRed в митохондрии клетки позволяет вызвать гибель клетки, используя меньший интервал облучения и свет меньшей мощности.

Морфологических изменений, просходящих с клеткой, продуцирующей KillerRed, после облучения не происходило, если клетки были предварительно обработаны ингибитором каспаз, что свидетельствует о том, что механизмом действия KillerRed в эукариотических клетках является запуск апоптоза.

KillerRed является уникальным генетически-кодируемым фотосенсибилизатором, который потенциально может быть использован для широкого круга задач экспериментальной биологии - эмбриологии, молекулярной и клеточной биологии. В отличие от химических фотосенсибилизаторов фототоксичный флуоресцентный белок может быть направлен в клетки определенного типа либо в определенный компартмент клетки. Развитие методов адресной доставки генов в раковые клетки может в будущем позволить использовать фототоксичные флуоресцентные белки для фотодинамической терапии опухолей.

В заключение автор выражает глубокую благодарность коллективу лаборатории молекулярных технологий Института биоорганической химии РАН и сотрудников компании «Евроген» за профессиональную и дружескую поддержку, в особенности Юрия Янушевича, Татьяну Чепурных, Надежду Гурскую, Марию Булину, а также заведующего лабораторией, Сергея Лукьянова.

Особую признательность хочется выразить научному руководителю, Константину Лукьянову, за чуткое руководство, помощь в освоении новых методов исследований и всесторонюю поддержку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шкроб, Мария Александровна, 2009 год

1. Agostinis P., Vantieghem A., Merlevede W., De Witte P.A. Hypericin in cancer treatment: more light on the way // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2002. - V.34(3). - P. 221-241.

2. Almeida R.D., Manadas B.J., Carvalho A.P., Duarte C.B. Intracellular signaling mechanisms in photodynamic therapy // Biochim. Biophys. Acta. 2004. -V. 1704(2).-P. 59-86.

3. Beermann A.E., Jay D.G. Chromophore-assisted laser inactivation of cellular proteins // Methods Cell. Biol. 1994. - V.44- P. 715-732.

4. Bulina M.E., Chudakov D.M., Mudrik N.N., Lukyanov K.A. Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis // BMC Biochem. 2002. - V.3- P. 7.

5. Bulina M.E., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Chudakov D.M., Lukyanov K.A. Hetero-oligomeric tagging diminishes non-specific aggregation of target proteins fused with Anthozoa fluorescent proteins // Biochem. J. 2003. - V.371(Pt 1). - P. 109-114.

6. Burr A.Ii., Hunt P., Wagar D.R., Dewilde S., Blaxter M.L., Vanfleteren J.R., Moens L. A hemoglobin with an optical function // J. Biol. Chem. 2000. -V.275(7).-P. 4810-4815.

7. Buytaert E., Dewaele M., Agostinis P. Molecular effectors of multiple cell death pathways initiated by photodynamic therapy // Biochim. Biophys. Acta. 2007. -V. 1776(1).-P. 86-107.

8. Calzavara-Pinton P.G., Venturini M., Sala R. Photodynamic therapy: update 2006. Part 1: Photochemistry and photobiology II J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. -2007.-V.21(3). — P. 293-302.

9. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science. 1994. - V.263(5148). - P. 802805.

10. Chudakov D.M., Belousov V.V., Zaraisky A.G., Novoselov V.V., Staroverov D.B., Zorov D.B., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling H Nat. Biotechnol. 2003. - V.21(2). - P. 191-194.

11. Chudakov D.M., Chepurnykh T.V., Belousov V.V., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Fast and precise protein tracking using repeated reversible photoactivation // Traffic. 2006. - V.7(10). - P. 1304-1310.

12. Chudakov D.M., Feofanov A.V., Mudrik N.N., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Chromophore environment provides clue to "kindling fluorescent protein" riddle // J. Biol. Chem. 2003. - V.278(9). - P. 7215-7219.

13. Chudakov D.M., Lukyanov K.A. Use of green fluorescent protein (GFP) and its homologs for in vivo protein motility studies // Biochemistry (Mosc). 2003. — V.68(9). - P. 952-957.

14. Chudakov D.M., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2 // Nat. Protoc. 2007. - V.2(8). - P. 2024-2032.

15. Chudakov D.M., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement II Biotechniques. 2007. -V.42(5). - P. 553-557.

16. Cody C.W., Prasher D.C., Westler W.M., Prendergast F.G., Ward W.W. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein II Biochemistry. 1993. - V.32(5). - P. 1212-1218.

17. Dedecker P., Hotta J., Ando R., Miyawaki A., Engelborghs Y., Hofkens J. Fast and reversible photoswitching of the fluorescent protein dronpa as evidenced by fluorescence correlation spectroscopy // Biophys. J. 2006. - V.91(5). - P. 45-47.

18. Deheyn D.D., Kubokawa K., McCarthy J.K., Murakami A., Porrachia M., Rouse G.W., Holland N.D. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus // Biol. Bull. — 2007. V.213(2). - P. 95-100.

19. Delagrave S., Hawtin R.E., Silva C.M., Yang M.M., Youvan D.C. Red-shifted excitation mutants of the green fluorescent protein // Biotechnology> (NY). 1995. -V. 13(2).-P. 151-154.

20. Dolmans D.E., Fukumura D., Jain R.K. Photodynamic therapy for cancer // Nat. Rev. Cancer. ~ 2003. V.3(5). - P. 380-387.

21. Dougherty T.J., Gomel* C.J., Henderson B.W., Jori G., Kessel D., Korbelik M., Moan J., Peng Q. Photodynamic therapy II J. Natl. Cancer. Inst. 1998. - V.90(12). -P. 889-905.

22. Eustace B.K., Buchstaller A., Jay D.G. Adapting chromophore-assisted laser inactivation for high throughput functional proteomics // Brief Funct. Genomic Proteomic. 2002. - V.l(3). - P. 257-265.

23. Fradkov A.F., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Bulina M.E., Yanushevich Y.G., Martynov V.I., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Far-red fluorescent tag for protein labelling // Biochem. J. 2002. - V.368(Pt 1). - P. 17-21.

24. Goldstein J.C., Munoz-Pinedo C., Ricci J.E., Adams S.R., Kelekar A., Schuler M., Tsien R.Y., Green D.R. Cytochrome с is released in a single step during apoptosis // Cell Death Differ. 2005. - V. 12(5). - P. 453-462.

25. Green D.R., Reed J.C. Mitochondria and apoptosis // Science. 1998. -V.281(5381). -P. 1309-1312.

26. Green H.M., Alberola-Ila J. Development of ERK Activity Sensor, an in vitro, FRET-based sensor of Extracellular Regulated Kinase activity // BMC Chem. Biol. -2005. V.5-R1.

27. Griffin B.A., Adams S.R., Jones J., Tsien R.Y. Fluorescent labeling of recombinant proteins in living cells with FlAsH // Methods Enzymol. — 2000. -V.327- P. 565-578.

28. Griffin B.A., Adams S.R., Tsien R.Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells II Science. 1998. -V.281(5374). -P.269-272.

29. Gross L.A., Baird G.S., Hoffman R.C., Baldridge K.K., Tsien R.Y. The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V.97(22). - P. 11990-11995.

30. Gurskaya N.G., Fradkov A.F., Terskikh A., Matz M.V., Labas Y.A., Martynov V.I., Yanushevich Y.G., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A. GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins // FEBS Lett. 2001. - V.507(l). - P. 16-20.

31. Gurskaya N.G., Savitsky A.P., Yanushevich Y.G., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A. Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis // BMC Biochem. 2001. - V.2- P. 6.

32. Hastings J.W. Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review // Gene. — 1996. — V. 173(1 Spec No).-P. 5-11.

33. Haustein E., Schwille P. Single-molecule spectroscopic methods // Curr. Opin. Struct. Biol. -2004. V.14(5). - P. 531-540.

34. Heim R., Prasher D.C., Tsien R.Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994. -V.91(26). — P. 12501-12504.

35. Henderson J.N., Ai H.W., Campbell R.E., Remington SJ. Structural basis for reversible photobleaching of a green fluorescent protein homologue // Proc. Natl. Acad. Sci USA.- 2007. -V. 104(16). -P. 6672-6677.

36. Henderson J.N., Remington S.J. Crystal structures and mutational analysis of amFP486, a cyan fluorescent protein from Anemonia majano // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V.102(36). - P. 12712-12717.

37. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K., Pease L.R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction // Gene. — 1989. V.77(l). - P. 51-59.

38. Hoffman-Kim D., Diefenbach T.J., Eustace B.K., Jay D.G. Chromophore-assisted laser inactivation // Methods Cell Biol. 2007. - V.82- P. 335-354.

39. Hofmann M., Eggeling C., Jakobs S., Hell S.W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy at low light intensities by using reversibly photoswitchable proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102(49). - P. 17565-17569.

40. Hopf M., Gohring W., Ries A., Timpl R., Hohenester E. Crystal structure and mutational analysis of a perlecan-binding fragment of nidogen-1 // Nat. Struct. Biol. 2001. - V.8(7). - P. 634-640.

41. Jay D.G. Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V.85(15). - P. 5454-5458.

42. Jay D.G., Keshishian H. Laser inactivation of fasciclin I disrupts axon adhesion of grasshopper pioneer neurons // Nature. 1990. - V.348(6301). - P. 548-550.

43. Jay D.G., Sakurai T. Chromophore-assisted laser inactivation (CALI) to elucidate cellular mechanisms of cancer // Biochim. Biophys. Acta. 1999. -V. 1424(2-3).-P. M39-48.

44. Jimenez-Banzo A., Nonell S., Hofkens J., Flors C. Singlet oxygen photosensitization by EGFP and its chromophore HBDI // Biophys. J. 2008. -V.94(l). - P. 168-172.

45. Kessel D., Luo Y. Photodynamic therapy: a mitochondrial inducer of apoptosis // Cell Death Differ. 1999. - V.6(l). - P. 28-35.

46. Kessel D., Luo Y., Deng Y., Chang C.K. The role of subcellular localization in initiation of apoptosis by photodynamic therapy // Photochem. Photobiol. 1997. -V.65(3). - P. 422-426.

47. Kessel D., Oleinick N.L. Initiation of autophagy by photodynamic therapy // Methods Enzymol. 2009. - V.453- P. 1-16.

48. Kessel D., Reiners J.J. Jr. Apoptosis and autophagy after mitochondrial or endoplasmic reticulum photodamage // Photochem. Photobiol. 2007. - V.83(5). -P. 1024-1028.

49. Konig K. Multiphoton microscopy in life sciences // J. Microsc. — 2000. — V.200(Pt 2).-P. 83-104.

50. Labas Y.A., Gurskaya N.G., Yanushevich Y.G., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A., Matz M.V. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V.99(7). - P. 4256-4261.

51. Liao J.C., Berg L.J., Jay D.G. Chromophore-assisted laser inactivation of subunits of the T-cell receptor in living cells is spatially restricted // Photochem. Photobiol. 1995. - V.62(5). - P. 923-929.

52. Liao J.C., Roider J., Jay D.G. Chromophore-assisted laser inactivation of proteins is mediated by the photogeneration of free radicals // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. -V.91(7). - P. 2659-2663.

53. Linden K.G., Liao J.C., Jay D.G. Spatial specificity of chromophore assisted laser inactivation of protein function // Biophys. J. 1992. - V.61(4). - P.956-962.

54. Marcinkowska A., Malarska A., Saczko J., Chwilkowska A., Wysocka Т., Drag-Zalesinska M., Banas T. Photofrin—factor of photodynamic therapy induces apoptosis and necrosis // Folia Histochem. Cytobiol. 2001. - V.39 Suppl 2- P. 177-178.

55. Martynov V.I., Maksimov B.I., Martynova N.Y., Pakhomov A.A., Gurskaya N.G., Lukyanov S.A. A purple-blue chromoprotein from Goniopora tenuidens belongs to the DsRed subfamily of GFP-like proteins // J. Biol. Chem. 2003. -V.278(47). - P. 46288-46292.

56. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species IINat. Biotechnol. 1999. -V. 17(10). -P. 969-973.

57. Miyawalci A. Green fluorescent protein-like proteins in reef Anthozoa animals // Cell Struct. Funct. 2002. - V.27(5). - P. 343-347.

58. Miyawaki A., Llopis J., Heim R., McCaffery J.M., Adams J.A., Ikura M., Tsien R.Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin II Nature. 1997. - V.388(6645). - P. 882-887.

59. Nagai Т., Miyawaki A. A high-throughput method for development of FRET-based indicators for proteolysis // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2004. -V.319(l). P. 72-77.

60. Niwa H., Inouye S., Hirano Т., Matsuno Т., Kojima S., Kubota M., Ohashi M., Tsuji F.I. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V.93(24). - P. 13617-13622.

61. Ormo M., Cubitt A.B., ICallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., Remington S.J. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein // Science. 1996. -V.273(5280). - P. 1392-1395.

62. Palmer A.E., Tsien R.Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators // Nat. Protoc. 2006. - V.l(3). - P. 1057-1065.

63. Plaetzer K., Kiesslich Т., Oberdanner C.B., Krammer B. Apoptosis following photodynamic tumor therapy: induction, mechanisms and detection // Curr. Pharm. Des. 2005. - V.l 1(9). - P. 1151-1165.

64. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W., Prendergast F.G., Cormier M.J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein // Gene. -1992. V.lll(2). -P. 229-233.

65. Prescott M., Ling M., Beddoe Т., Oakley A.J., Dove S., Hoegh-Guldberg O., Devenish R.J., Rossjohn J. The 2.2 A crystal structure of a pocilloporin pigment reveals a nonplanar chromophore conformation // Structure. 2003. - V. 11(3). - P. 275-284.

66. Quillin M.L., Anstrom D.M., Shu X., O'Leary S., Kallio K., Chudakov D.M., Remington S.J. Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution // Biochemistry. 2005. - V.44(l 5). - P.5774-5787.

67. Raj fur Z., Roy P., Otey C., Romer L., Jacobson K. Dissecting the link between stress fibres and focal adhesions by CALI with EGFP fusion proteins // Nat. Cell. Biol. 2002. - V.4(4). - P. 286-293.

68. Sasnauskiene A., Kadziauskas J., Vezelyte N., Jonusiene V., Kirveliene V. Apoptosis, autophagy and cell cycle arrest following photodamage to mitochondrial interior II Apoptosis. 2009. - V.14(3). - P. 276-286.

69. Schroder R., Jay D.G., Tautz D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped // Mech. Dev. 2000. - V.90(2). - P. 329.

70. Schwentker M.A., Bock H., Hofmann M., Jakobs S., Bewersdorf J., Eggeling C., Hell S.W. Wide-field subdiffraction RESOLFT microscopy using fluorescent protein photoswitching // Microsc. Res. Tech. 2007. - V.70(3). - P. 269-280.

71. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea // J. Cell Сотр. Physiol. 1962. - V.59-P. 223-239.

72. Shimozono S., Miyawaki A. Engineering FRET constructs using CFP and YFP // Methods Cell Biol. 2008. - V.85- P. 381-393.

73. Shu X., Shaner N.C., Yarbrough C.A., Tsien R.Y., Remington S.J. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits // Biochemistry. 2006. -V.45(32).- P. 9639-9647.

74. Tanabe Т., Oyamada M., Fujita K., Dai P., Tanaka H., Takamatsu T. Multiphoton excitation-evoked chromophore-assisted laser inactivation using green fluorescent protein // Nat. Methods. 2005. - V.2(7). - P. 503-505.

75. Ting A.Y., Kain K.H., Klemke R.L., Tsien R.Y. Genetically encoded fluorescent reporters of protein tyrosine kinase activities in living cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V.98(26). - P. 15003-15008.

76. Tour О., Meijer R.M., Zacharias D.A., Adams S.R., Tsien R.Y. Genetically targeted chromophore-assisted light inactivation // Nat. Biotechnol. — 2003. -V.21(12). P. 1505-1508.

77. Tsien R.Y. The green fluorescent protein // Annu. Rev. Biochem. 1998. - V.67-P. 509-544.

78. Verkhusha V.V., Chudakov D.M., Gurskaya N.G., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins // Chem. Biol. 2004. - V. 11(6). - P. 845-854.

79. Verkhusha V.V., Lukyanov K.A. The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins // Nat. Biotechnol. — 2004. — V.22(3). P. 289-296.

80. Vitriol E.A., Uetrecht A.C., Shen F., Jacobson K., Bear J.E. Enhanced EGFP-chromophore-assisted laser inactivation using deficient cells rescued with functional EGFP-fusion proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. - V.104(16). - P. 67026707.

81. Wang C.L., Yang D.C., Wabl M. Directed molecular evolution by somatic hypermutation II Protein Eng. Des. Sel. 2004. - V.17(9). - P. 659-664.

82. Wang L., Jackson W.C., Steinbach P.A., Tsien R.Y. Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101 (48). - P. 16745-16749.

83. Weissleder R. A clearer vision for in vivo imaging // Nat. Biotechnol. 2001. -V. 19(4).-P. 316-317.

84. Wiedenmann J., Elke C., Spindler K.D., Funke W. Cracks in the beta-can: fluorescent proteins from Anemonia sulcata (Anthozoa, Actinaria) // Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 2000. - V.97(26). - P. 14091-14096.

85. Yampolsky I.V., Remington S.J., Martynov V.I., Potapov V.K., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Synthesis and properties of the chromophore of the asFP595 chromoprotein from Anemonia sulcata // Biochemistry. — 2005. V.44(15). — P. 5788-5793.

86. Yarbrough D., Wachter R.M., Kallio K., Matz M.V., Remington S.J. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2001.- V.98(2). P. 462-467.

87. Dove S.G. H.-G.O., Ranganathan S. . Major colour patterns of reef-building corals are due to a family of GFP-like proteins // Coral Reefs. 2001. - V.19- P. 197-204.

88. Kawaguti S. The effect of green fluorescent pigment on the productivity of the reef corals // Micronesica. 1969. - V.5- P. 313.

89. Mazel C.H. Green-fluorescent proteins in Caribbean corals // Limnol. Oceanogr. 2003. - V.48- P. 402-411.

90. Salih A., Larkum, A., Cox, G., Kiihl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective // Nature. 2000. - V.408- P. 850-853.

91. Зубова H. H., Булавина А. Ю., Савицкий А. П. Спектральные и физико-химические свойства зеленого (GFP) и красного (drFP583) флуоресцирующих белков // Успехи б иол. химии. — 2003. —Т. 43. — С. 163-224.

92. Красновский А.А. Фотодинамическое действие и синглетный кислород // Биофизика. 2004. - Т.49(2). - С. 305-321.