Направленное изменение спектральных свойств флюоресцентных и окрашенных белков из кораллов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Булина, Мария Евгеньевна

• Булина, Мария Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Булина, Мария Евгеньевна

I. ВВЕДЕНИЕ.

ПЛАН ДИССЕРТАЦИИ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

A. Биологическая роль и биохимические свойства GFP. Строение GFP и GFP-подобных белков.Свойства флюоресценции GFP.

1. Биологическая роль GFP.

2. Биохимические свойства GFP.

3. Пространственная организация GFP.

4. Формирование хромофора GFP.

5. Спектральные свойства.

B. Мутагенез GFP.

1. Мутации, меняющие структуру хромофора.

2. Мутации, изменяющие соотношение пиков возбуждения хромофора GFP.Желтый флюоресцентный белок YFP.

3. Созревание белка.

4. Вставки чужеродных последовательностей.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Направленное изменение спектральных свойств флюоресцентных и окрашенных белков из кораллов»

B. Направления эволюционных изменений в группе GFP-подобных белков.44 c. Получение белков с измененными спектральными свойствами.48

1. Цветовые переходы между различными группами GFP-подобных белков. Переход между группами желтых и зеленых флюоресцентных белков.49

2. Взаимные переходы между группами флюоресцентных и нефлюоресцентных белков.52

3. Заключение.62

D. Метод гетероолигомерных меток.63

1. Предпосылки к созданию метода гетероолигомерных меток. Общая схема метода гетероолигомерных меток.63

2. Получение нефлюоресцентного варианта флюоресцентного белка.66

3. Мечение бета-актина.67

4. Характеризация гетероолигомеров in vitro.69

5. Мечение тубулин-связывающего белка Таи34.71

6. Создание бицистронного вектора на основе asulCP-NF.72

7. Заключение.72

IV. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ.74

A. Оборудование.74

B. Реактивы.74

C. Буферные растворы.75

D. Микробиологические среды.75

V. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.76

A. Амплификация ДНК.76

B. Мутагенез.76

C. Клонирование, наработка и очистка белков.76

D. Трансформация компетентных клеток Е. coli.76

E. Аналитическое и препаративное выделение плазмидной ДНК.77

F. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.77

G. Первичная оценка поведения мутантных белков.77

H. Спектроскопия.78

I. Компьютерная обработка данных.78

VI. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.79

VII. ВЫВОДЫ.80

VIII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.81

IX. ПРИЛОЖЕНИЯ.89

1. Таблица соответствий остатков GFP DsRed по данным рентгеноструктурного анализа.89

2. Множественное выравнивание первичных структур некоторых известных GFP-подобных

3. Таблица положений, подвергающихся положительному давлению отбора в группе флюоресцентных белков твердых кораллов. Жирным шрифтом обозначены остатки, подвергнутые исчерпывающему мутагенезу.92

I. Введение

Первым белком, получившим распространение в качестве внутриклеточного маркера белковой локализации, стал GFP - зеленый флюоресцентный белок, выделенный из гидроидной медузы. В 1961 году, проводя исследования свойств люминесценции гидроидной медузы Aequorea victoria, O.Shimomura с удивлением обнаружил, что очищенная люцифераза гидроида - акварин -испускает синий свет, в то время как живой гидроид обладает способностью к свечению зеленым светом. Оказалось, что наряду с люциферазой, ткани медузы содержат также белок, способный к флюоресценции в зеленой области спектра и конверсии энергии люциферазной реакции в зеленое свечение. Хотя о присутствии флюоресцентных веществ в тканях животных было известно и ранее, GFP стал первым известным флюоресцентным агентом белковой природы [Shimomura et al.,1962]. Открытие люциферазы и GFP медузы Aequorea victoria произошло одновременно, но судьбы двух этих белков в биологии были весьма различными. Уже через несколько лет после обнаружения акварина, в 1967году, этот белок был использован как молекулярно-биологический инструмент в экспериментах с измерениями внутриклеточных концентраций ионов Са2+ [Ridgway et al.,1967]. Дальнейшее стремление к использованию акварина в качестве молекулярного зонда, чувствительного к локальной концентрации одного из наиболее важных внутриклеточных ионов стало причиной всестороннего изучения свойств данной люциферазы. По необходимости изучались и свойства GFP. В частности, структура хромофора GFP была расшифрована Shimomura в 1979г [Shimomura 1979]. Тем не менее, долгое время GFP изучался исключительно как компонент люциферазной системы, не имеющий практического значения. Триумф GFP начался в 1994 году, когда была показана способность данного белка к флюоресценции при экспрессии в клетках [Chalfie et al.,1994]. Первый химерный белок, несущий GFP в качестве ковалентно присоединенного флюоресцентного маркера, был создан лишь в 1995г [Marshall et al.,1995]. За последние 10 лет GFP превратился из необычного белка, составляющего предмет интереса нескольких лабораторий, в важнейший инструмент молекулярной биологии, медицины, клеточной биологии. GFP, обладающий белковой природой, является самым удобным прижизненным маркером для слежения за белками в клетке. Способность к автокаталитической циклизации хромофора, устойчивость к воздействиям среды, нетоксичность для клеток, хорошие показатели яркости флюоресценции, наконец - прямая возможность получения химерных белков с GFP делают данный белок популярным орудием для исследований динамических клеточных процессов и перемещений отдельных молекул, развития организмов и онкологических процессов. Современные методы исследований, направленные на изучение многофакторных процессов, часто используют GFP в сочетании с другими маркерами или несколько форм GFP. Развитие таких методов было бы затруднено, если бы невозможно было «исправить» некоторые свойства GFP. В то же время управление свойствами GFP и получение желаемых вариантов требует всестороннего изучения структурно-функциональных зависимостей строения этой молекулы.

План диссертации.

Данная работа посвящена изучению свойств флюоресцентных и нефлюоресцентных гомологов GFP и возможности взаимного перехода между различными группами GFP-подобных белков. Соответственно, первая часть обзора рассматривает свойства флюоресцентных белков на примере GFP-наиболее хорошо изученного объекта в данной группе белков. Вторая часть описывает свойства флюоресцентных и окрашенных белков из небиолюминесцентных организмов. Практическая часть делится на три состовляющие: изучение эволюционных процессов в группе GFP-подобных белков кораллов и возможности использования математических методов для исследования закономерностей изменчивости в семействе GFP-подобных белков, изучение структурно-функциональной зависимости в группах флюоресцентных и нефлюоресцентных белков и практическое применение обнаруженных закономерностей для преодоления нежелательных последствий тетрамеризации гомологов GFP.

II. Обзор литературы.

А. Биологическая роль и биохимические свойства GFP. Строение GFP и GFP-подобных белков.Свойства флюоресценции GFP.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Булина, Мария Евгеньевна

VII. Выводы

• Изучена возможность применения методов молекулярной эволюции для поиска аминокислотных положений, влияющих на изменение спектральных свойств флюоресцентных белков. Проведен филогенетический анализ групп зеленых и красных флюоресцентных белков твердых кораллов. Показано влияние направляющего отбора в ряду аминокислотных положений.

• Показана принципиальная возможность перехода между некоторыми из спектральных групп флюоресцентных белков. Выявлены основные аминокислотные положения (63, 65, 68), влияющие на цвет флюоресценции для ряда флюоресцентных белков кораллов.

• Показано, что квантовый выход флюоресценции белков кораллов зависит от микроокружения хромофоробразующей триады аминокислот. Исследованы положения, отвечающие за переход между флюоресцентным и нефлюоресцентным состоянием GFP-подобных белков. Показана возможность перехода флюоресцентных белков в нефлюоресцентное состояние при изменении аминокислотного окружения хромофора (остатки 148, 165, 167, 203).

• На основе проведенной работы предложен метод получения псевдо-мономерных флюоресцентных меток для прижизненного мечения клеточных белков.

7. Заключение.

Предложенный нами метод создания мономерных меток теоретически применим для любых интересующих исследователя олигомеризующихся GFP-подобных белков. Преимущество метода, по сравнению с подходом, реализующим создание истинной мономерной метки, состоит в простоте получения нефлюоресцентного мутантного варианта белка. Тем не менее, предложенный метод следует рассматривать как временную меру до момента создания достаточного количества истинных красных флюоресцентных мономерных белков.

Изучение свойств олигомеризующихся GFP-подобных белков в контексте нефлюоресцентных бесхромофорных аналогов может быть использовано в работах биофизического профиля с целью выявления истинных свойств индивидуальных хромофоров.

IV.Материалы и оборудование

A. Оборудование

Центрифуга CentraMP4R (IEC, США); настольные центрифуги Micromax (IEC, США), MiniSpin (Eppendorf, Германия); водяные термостаты: Г8 (MLW, Венгрия); термостатируемый шейкер Orbit (lab-line, США); шейкер Shaker S3 (ELMI, Россия); ламинарный шкаф (FluFrance, Франция); сушильный шкаф КС-65 (СССР); лабораторный рН-метр ОР-211/1 (Radelkis, Венгрия), источники питания постоянного тока: Macrodrive 15 (LKB, Швеция), PS500X (HSI, США), EPS250 (C.B.S., США), EPS500/400 (Pharmacia, Швеция); приборы для горизонтального гель-электрофореза: GNA-200, Hoefer НЕЗЗ (Pharmacia, Швеция), Minicell ЕС370М (Е-С Apparatus Corp., США); весы: WA33 (Польша), 33/200 (Chirana, Чехословакия), JP2-300 (Anselma-lndustrie, Германия); автоматические пипетки (Gilson, Франция); УФ-трансиллюминатор TF-20M (Франция); амплификаторы: DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer Cetus, США), Omnigene (Hybaid, США), PTC-100 Thermal Cycler (MJ Research, США), Mastercycler gradient (Eppendorf, Германия); анализатор изображения Alpha Imager 2000 (Alpha Innotech Inc., США); автоматический секвенатор CEQ2000 (Beckman, США); предметные и покровные стекла Super Frost Plus (Menzel-Glaser, Германия); бинокулярный стереомикроскоп SZX12 (Olympus, Япония); световой микроскоп с фотонасадкой Optiphot (Nikon, Япония); конфокальная система Zeiss (Швейцария).

B. Реактивы

Использовали следующие реактивы отечественного производства (квалификация "хч" и "осч"): мочевину, этиловый спирт, уксусную кислоту, изоамиловый спирт, перегнанный один раз фенол квалификации "чда", медицинский хлороформ, бутанол-1, парафин, ацетат натрия, ацетон.

В работе использовали следующие импортные реактивы: 2'-дезоксирибонуклеозид-б'-трифосфаты, p-меркаптоэтанол, бычий сывороточный альбумин (Bio-Rad, США); агароза, бромфеноловый синий, трисгидроксилметиламинометан (Трис), дитиотрейтол (ДТТ), динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), бромистый этидий, бакто-агар, бакто-триптон, дрожжевой экстракт (Difco, США).

В работе были использованы следующие ферментные препараты: смесь термостабильных ДНК полимераз Advantage Mix (Clontech Lab. Inc, США). Эндонукпеазы рестрикции, ДНК- лигаза фага Т4 (Boehringer Manheim, ФРГ).

C. Буферные растворы

Буфер "ТЕ" (для растворения и хранения препаратов ДНК):

10 мМ Трис-HCI (рН 8.0) 0,1 мМ EDTA

Буфер "ТАЕ"(для электрофореза ДНК в агарозном геле):

50 мМ Трис-ацетат (рН 8.0) 20 мМ ацетат натрия

2 мМ EDTA

Буфер PBS (Phosphate buffered saline):

120 мМ NaCI 7 мМ Na2HP04

3 мМ NaH2P04 2,7 мМ KCI

D. Микробиологические среды Среда "LB" (для выращивания клеток E.coli):

1% триптон; 0.5% дрожжевой экстракт; 0,1% NaCI; 0,01 мМ Трис-HCI (рН 8.0). Среду автоклавировали 45 мин. при 1 атм. и хранили при комнатной температуре. При необходимости добавляли ампициллин до концентрации 100 мкг/мл.

LB-arap"- перед автоклавированием в среду дополнительно добавлен агар (Difco) до концентрации 1.5 %.

V. Методы исследования

A. Амплификация ДНК

На стадиях направленного мутагенеза, клонирования и тестирования полученных конструкций применяли стандартную методику ПЦР, с использованием смеси полимераз Advantage Mix (Clontech). Амплификацию проводили на приборе РТС-100 Thermal Cycler (MJ Reserch). Продукты амплификации анализировали в 1.5% агарозном геле, содержавшем 0.5 мкг/мл бромистого этидия.

B. Мутагенез

Сайт-направленный мутагенез проводили с использованием технологии «пересхлопывания» продуктов ПЦР, используя праймеры, содержащие соответствующие точечные замены, однозначные либо вырожденные, согласно методике, описанной подробно [Но et al., 1989]. Также проводили случайный мутагенез с использованием набора для случайного мутагенеза (Clontech).

C. Клонирование, наработка и очистка белков

Для гетерологической экспрессии как дикого типа белка asulCP, так и мутантных белков, полноразмерные кодирующие участки клонировали в экспрессионный вектор pQE30 (Qiagen), содержащий 6 кодонов гистидинов в той же рамке считывания, на 5'-конце гена. Полученные конструкции трансформировали в компетентные клетки Е.coli (штаммы ТОРО 10 и XL1 Blue) методом теплового шока [Sambrook et al., 1989] и экспрессировали, получая интересующие белки, содержащие N-концевой олигогистидиновый участок. Для дальнейшего исследования белки очищали с использованием металл-афинной смолы TALON (Clontech).

D. Трансформация компетентных клеток Е. coli

К 50 мкл компетентных клеток, предварительно размороженных на льду в течение 30 минут, добавляли 5 мкл лигазной смеси. Инкубировали на льду в течение 40 минут, затем проводили тепловой шок при +42°С в течение 45 сек., после чего помещали пробирку снова в лед на 10 минут. Добавляли 3 объема среды "LB" без антибиотика и инкубировали при 37°С в воздушном термостатируемом шейкере при 150 об/мин. в течение одного часа. Затем клетки высевали на чашку Петри с 1,5% бактоагаром на среде "LB", содержащую 100 мкг/мл ампициллина. Чашки помещали в термостат при 37°С на ночь.

E. Аналитическое и препаративное выделение плазмидной ДНК

Клетки E.coli для аналитического выделения плазмидной ДНК выращивали в 5 мл среды LB с ампициллином до стационарной фазы при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием, и плазмидную ДНК выделяли следующим методом. Клетки суспендировали в 200 мкл раствора, содержащего 50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ трис-HCI рН 8.0 и 4 мг/мл раствора лизоцима, выдерживали 5 мин. при комнатной температуре. Пробирки опускали в лед и раскапывали по 400 мкл раствора, содержащего 0,2 н. NaOH и 1% SDS, после перемешивания выдерживали во льду 5 мин. и добавляли 300 мкл раствора раствора ацетата калия и держали во льду еще 5 мин. Центрифугировали 10 мин. при 14000 об/мин. Надосадочную жидкость переносили в новые пробирки. ДНК высаживали центрифугированием в течение 10 мин. при 14000 об/мин. после добавления 180 мкл изопропанола. Осадок ДНК дважды промывали 80% этанолом, сушили и растворяли в 50-60 мкл буфера "ТЕ". Препаративное выделение осуществляли аналогично, выращивая клетки в 100-200 мл "LB".

F. Определение нуклеотидной последовательности ДНК

Нуклеотидные последовательности ДНК были определены с помощью автоматического секвенатора CEQ 2000 DNA Analysis (Beckman). Использовали праймеры к плазмиде pQE30, позволяющие с двух встречных направлений уверенно прочесть участок в 700 н.п., содержащий ген мутантного белка. Сиквенсы были проанализированы с использованием програмного обеспечения Blast. Множественное выравнивание было осуществлено при помощи пакета программ Clustal X с последующей оптимизацией.

G. Первичная оценка поведения мутантных белков

Колонии бактерий Е. coli, экспрессирующих мутантные белки, наблюдали во флюоресцентном микроскопе Nikon Optiphot и флюоресцентном стереомикроскопе Olympus US SZX12. Фотографии были сделаны с использованием фотокамеры Olympus DP50.

H. Спектроскопия

Спектры поглощения были сняты с использованием спектрофотометра Beckman DU520 UV/VIS. Флюоресцентный спектрофотометр Varian Сагу Eclipse использовали для измерения спектров возбуждения и эмиссии флюоресценции.

Первичную оценку спектроскопических свойств мутантных белков проводили скринированием колоний бактерий Е. coli, экспрессирующих мутантные белки, с использованием флюоресцентного микроскопа Nikon Optiphot (FITC и TRITC фильтры). Для фотоактивации и наблюдения разожженного сигнала использовали 20-кратный и 5-кратный объективы соответственно.

I. Компьютерная обработка данных.

Все множественные выравнивания аминокислотных последовательностей производились с помощью программы ClustalX [Thompson et al., 1997]. Редактирование выравниваний проводилось в программе GeneDoc v.2.5.000.

Филогенетическое дерево для известных первичных структур желтых и зеленых белков твердых кораллов было получено с помощью программы MrBayes [Huelsenbeck и Ronquist, 2001]. Данная программа использует Метод Монте-Карло для поиска филогенетических деревьев, наиболее соответствующих исходным данным, среди набора всех возможных деревьев. Найденные деревья используются для построения конечного дерева, одновременно вычисляется вероятность (Bayesian) существования каждой ветви. Анализ по Методу Монте-Карло был проведен, используя следующие параметры: модель внедрения замен в структуру белков - general time reversible [Tavare, 1986], число цепей симуляций - 4, количество повторов 100 ООО, число изначально отброшенных деревьев 5000.

Визуализация пространственной организации GFP-подобных белков производилась с использованием программ RasMol2.6 и SwissPDBViewer v.3.51.

VI. Список сокращений

GFP - Green Fluorescent Protein - Зеленый флюоресцентный белок

FITC фильтры - стандартные светофильтры для красителя Флюоресцеин изотиоцианат (возбуждение 460-490 нм, эмиссия от 510 нм)

TRITC фильтры - стандартные светофильтры для красителя Тетраметилродамин изотиоцианат (возбуждение 530-560 нм, эмиссия от 590 нм)

ЭДТА - Этилендиаминтетрауксусная кислота, динатриевая соль

Трис - Трис [гидроксиметил] аминометан

ПЦР - Полимеразная цепная реакция

ДТТ - Дитиотрейтол

SDS - Додецилсульфат натрия

БСА - Бычий сывороточный альбумин

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Булина, Мария Евгеньевна, 2003 год

1. Abedi MR, Caponigro G, Kamb A. Green fluorescent protein as a scaffold for intracellular presentation of peptides. Nucleic Acids Res. 1998 Jan 15;26(2):623-30.

2. Ando R, Hama H, Yamamoto-Hino M, Mizuno H, and Miyawaki A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a luorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.2002 10 Dec 99, 12651±12656

3. Baird GS, Zacharias DA, Tsien RY. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Sep 28; 96(20): 11241-6.

4. Baird GS, Zacharias DA, Tsien RY: Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc. Natl. Acad. Sci. 2000, 97:11984-11989

5. Bevis BJ, Glick BS. Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRed).Nat Biotechnol. 2002 Jan;20(1):83-7.

6. Bokman SH, Ward WW Renaturation of Aequorea gree-fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun. 1981 Aug 31; 101 (4): 1372-80).

7. Brejk K, Sixma TK, Kitts PA , Kain SR, Tsien RY, Ormo M, Remington SJ. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997 March Vol. 94, pp. 2306-2311

8. Campbell RE, Tour O, Palmer AE, Steinbach PA, Baird GS, Zacharias DA, Tsien RY. A monomeric red fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Jun 11; 99(12):7877-82.

9. Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 1994 Feb 11;263(5148):802-5.

10. Chalfie M. Green fluorescent protein. Photochem Photobiol. 1995 Oct;62(4):651-6 H.Chudakov DM, Feofanov AV, Mudrik NN, Lukyanov SA, Lukyanov KA.

11. Chromophore environment provides clue to "kindling fluorescent protein" riddle. J. Biol. Chem. 2003b, 278: 7215-7219 12. Cormack BP, Valdivia RH, Falkow S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).Gene. 1996; 173(1 Spec No):33-8.

12. Crameri A, Whitehorn EA, Tate E, Stemmer WP. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling. Nat Biotechnol. 1996 Mar;14(3):315-9.

13. Creemers TM, Lock AJ, Subramaniam V, Jovin TM, Volker S. Three photoconvertible forms of green fluorescent protein identified by spectral hole-burning. Nat Struct Biol. 1999 Jun;6(6):557-60

14. Cubitt AB, Heim R, Adams SR, Boyd AE, Gross LA, Tsien RY. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem Sci. 1995 Nov;20(11):448-55

15. Cubitt AB, Woollenweber LA, Heim R. Understanding structure-function relationships in the Aequorea victoria green fluorescent protein. Methods Cell Biol. 1999; 58:19-30.

16. Delagrave S, Hawtin RE, Silva CM, Yang MM, Youvan DC. Red-shifted excitation mutants of the green fluorescent protein. Biotechnology (N Y). 1995 Feb; 13(2):151-4.

17. Donnelly M, Fedeles F, Wirstam M, Siegbahn PE, Zimmer M. Computa-tional analysis of the autocatalytic posttranslational cyclization observed in histidine ammonia-lyase. A comparison with green fluorescent protein. J Am Chem Soc 2001; 123:4679-4686.

18. Dove SG, Hoegh-Guldberg O, Ranganathan S: Major colour pat-terns of reef-building corals are due to a family of GFP-like proteins. Coral Reefs 2001, 19:197-204 6.

19. Ehrig T, O'Kane DJ, Prendergast FG. Green-fluorescent protein mutants with altered fluorescence excitation spectra. FEBS Lett. 1995 Jun 26; 367(2): 163-6.

20. Fox DL. Biochromes. Occurence, distribution and comparative biochemistry of prominent natural pigments in the marine world. In: Needham AE, editor. The Significance of Zoochromes. New York: Springer Verlag. 1974.

21. Fradkov AF, Chen Y, Ding L, Barsova EV, Matz MV, Lukyanov SA: Novel fluorescent protein from Discosoma coral and its mu-tants possesses a unique far-red fluorescence. FEBS Lett. 2000, 479:127-130

22. Fradkov AF, Verkhusha W, Staroverov DB, Bulina ME, Yanushevich YG, Martynov VI, Lukyanov S, Lukyanov KA. Far-red fluorescent tag for protein labeling. Biochem J. 2002 Sep 27

23. Fukuda H, Arai M, Kuwajima K. Folding of green fluorescent protein and the cycle3 mutant. Biochemistry. 2000 Oct 3;39(39): 12025-32.

24. Garcia-Parajo, M. F Koopman, M van Dijk, E. M Subramaniam, V. and van Hulst, N. F. (2001) The nature of Tuorescence emission in the red Tuorescent protein DsRed, revealed by single-molecule detection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14392±14397

25. Gross LA, Baird GS, Hoffman RC, Baldridge KK, Tsien RY: The structure of the chromophore within DsRed, a red fluores-cent protein from coral. Proc. Natl. Acad. Sci. 2000, 97:11990-11995

26. Gurskaya NG, Fradkov AF, Terskikh A, Matz MV, Labas YA, Martynov VI, Yanushevich YG, Lukyanov KA, Lukyanov SA: GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. FEBS Lett 2001a, 507:16-20

27. Gurskaya NG, Savitsky AP, Yanushevich YG, Lukyanov SA, Lukyanov KA: Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis. BMC Biochem. 2001, 2:6

28. Gurskaya, NG Fradkov, A. F Terskikh, A Matz, M. V Labas, Y. A Martynov, V. I Yanushevich, Y. G Lukyanov, K. A. and Lukyanov, S. A. (2001) GFP-like chromoproteins as a source of far-red Tuorescent proteins. FEBS Lett. 507, 16±20

29. Hartley DL, Kane JF. Properties of inclusion bodies from recombinant Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 1988 Apr; 16(2):101-2.

30. Heikal, A. A Hess, S. T Baird, G. S Tsien, R. Y. and Webb, W. W. (2000) Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically Tuorescent proteins : coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 11996±12001

31. Heim R, Cubitt AB, Tsien RY. Improved green fluorescence. Nature. 1995 Feb 23; 373(6516):663-4.

32. Heim R, Prasher DC, Tsien RY. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Dec 20;91(26):12501-4.

33. Heim R, Tsien RY. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. Curr Biol. 1996 Feb 1;6(2): 178-82.

34. Hendrickson WA, Pahler A, Smith JL, Satow Y, Merritt EA, Phizackerley RP Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.Proc Natl Acad Sci USA. 1989 Apr;86(7):2190-4. 989

35. Ho SN, Hunt HD, Horton RM, Pullen JK, Pease LR: Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene 1989, 77:51-59

36. Hohenester E and Engel J (2002) Domain structure and organisation in extracellular matrix

37. Hori K, Wampler JE, Matthews JC, Cormier MJ. Identification of the product excited states during the chemiluminescent and bioluminescent oxidation of Renilla (sea pansy) luciferin and certain of its analogs. Biochemistry. 1973 Oct 23;12(22);4463-8.

38. Huelsenbeck, J. P. and F. Ronquist. 2001. MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees.Bioinformatics 17: 754-755.

39. J. Sambrook, E. Fritsch, and T. Maniatis. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1989.

40. Labas YA, Gurskaya NG, Yanushevich YG, Fradkov AF, Lukyanov KA, Lukyanov SA, Matz MV. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Apr 2;99(7):4256-61.)

41. Lauf U, Lopez P, Falk MM. Expression of fluorescently tagged connexins: a novel approach to rescue function of oligomeric DsRed-tagged proteins. FEBS Lett. 2001 Jun 1 ;498(1):11-5.

42. Li X, Zhang G, Ngo N, Zhao X, Kain SR, Huang CC Deletions of the Aequorea victoria green fluorescent protein define the minimal domain required for fluorescence. J Biol Chem. 1997 Nov 7;272(45):28545-9

43. Lounis, В Deich, J Rosell, F. I Boxer, S. G. and Moerner, W. E. (2001) Photophysics of DsRed, a red fuorescent protein, from the ensemble to the single- molecule level. J. Phys. Chem. В 105, 5048+5054

44. Marshall J, Molloy R, Moss GW, Howe JR, Hughes ТЕ. The jellyfish green fluorescent protein: a new tool for studying ion channel expression and function. Neuron. 1995 Feb;14(2):211-5.

45. Matz MV, Fradkov AF, Labas YA, Savitsky AP, Zaraisky AG, Markelov ML, Lukyanov SA. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species .Nat Biotechnol. 1999 C)ct;17(10):969-73.

46. Matz MV, Lukyanov KA, Lukyanov SA. Family of the green fluorescent protein: Journey to the end of the rainbow. Bioessays. 2002 Oct;24(10):953-9.

47. Mazel, С. H 1995. Spectral measurements of fluorescence emission in Caribbean cnidarians. Mar. Ecol. Prog. Ser., 120:185-191.

48. Mizuno H, Sawano A, Eli P, Hama H, Miyawaki A: Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for flu-orescence resonance energy transfer. Biochemistry 2001, 40:2502-2510

49. Morise H, Shimomura O, Johnson FH, Winant J. Intermolecular energy-transfer in bioluminescent system of Aequorea. Biochemistry 1974; 13: 2656-2662.

50. Patterson GH, Lippincott-Schwartz J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 2002 Sep 13; 297(5588): 1873-7.

51. Petersen J, Wilmann PG, Beddoe T, Oakley AJ, Devenish RJ, Prescott M, Rossjohn J. The 2.0-A crystal structure of eqFP611, a far red fluorescent protein from the sea anemone Entacmaea quadricolor. J Biol Chem. 2003 Nov 7;278(45):44626-31

52. Prescott M, Ling M, Beddoe T, Oakley AJ, Dove S, Hoegh-Guldberg O, Devenish RJ, Rossjohn J. The 2.2A crystal structure of a pocilloporin pigment reveals a nonplanar chromophore conformation. Structure (Camb). 2003 11:275-284.

53. Rao В, Kemple M, Prendergast F. Proton nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopic studies of segmental mobility in aequorin and a green-fluorescent protein from Aequorea forskalea. Biophys. J. 32:630-632 1980

54. Reid BG, Flynn GC. Chromophore formation in green fluorescent protein. Biochemistry. 1997 Jun 3; 36(22):6786-91.

55. Ridgway E.B Ashley C.C 1967 Calcium transients in single muscle fibers. Biochem. Biophys. Res., Commun. 29:229-234

56. Roth AF Ward WW Conformation stability after protease treatment in Aquarea GFP. Photochem. Photobiol. 37S:S71 1983

57. Salih A, Larkum A, Cox G, Kuhl M, Hoegh-Guldberg O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective.Nature. 2000 Dec 14;408(6814):850-3.

58. Schwede TF, Retey J, Schulz GE. Crystal structure of histidine ammonia-lyase revealing a novel polypeptide modification as the catalytic electrophile. Biochemistry 1999;38:5355-5361.

59. Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from luminous hydro-medusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol 1962;59:223.

60. Shimomura, O. (1979) Structure of the chromophore of Aequorea green fluorescent protein. FEBS Lett. 104:220-222

61. Siemering KR, Golbik R, Sever R, Haseloff J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Curr Biol. 1996 Dec 1;6(12):1653-63.

62. Str Hopf M, Gohring W, Ries A, Timpl R, Hohenester E Crystal structure and mutational analysis of a perlecan-binding fragment of nidogen-1 Nat Struct Biol. 2001 Jul;8(7):634-40.

63. Tavare, L. 1986. Some probabilistic and statistical problems of the analysis of DNA sequences.Lect. Math. Life Sci. 17: 57-86.

64. Verkhusha, V. V Akovbian, N. A Efremenko, E. N Varfolomeyev, S. D. and Vrzheshch, P. V. (2001) The kinetic analysis of maturation and denaturation of DsRed, a coral-derived red Tuorescent protein. Biochemistry (Moscow) 66, 1342±1351

65. Vrzheshch PV, Akovbian NA, Varfolomeyev SD, Verkhusha W: Denaturation and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions. FEBS Lett. 2000, 487:203-208

66. Wachter RM, Elsliger MA, Kallio K, Hanson GT, Remington SJ. Structural basis of spectral shifts in the yellow-emission variants of green fluorescent protein. Structure. 1998 Oct 15;6(10): 1267-77.

67. Wall MA, Socolich M, Ranganathan R. The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed. Nat Struct Biol. 2000 Dec;7(12):1133-8.

68. Ward WW, Bokman SH. Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein. Biochemistry. 1982 Sep 14;21(19):4535-40.

69. Ward WW, Cormier MJ An energy transfer protein in coelenterate bioluminescence. Characterization of the Renilla green-fluorescent protein.J Biol Chem. 1979 Feb 10;254(3):781-8

70. Weissleder R. A clearer vision for in vivo imaging.Nat Biotechnol. 2001 Apr;19(4):316-7

71. Wicksten MK. Why are there bright colors in sessile marine inverte-brates? Bull Mar Sci 1989;45:519-530

72. Wiedenmann J, Elke C, Spindler KD, Funke W: Cracks in the beta-can: fluorescent proteins from Anemonia sulcata (Anthozoa, Actinaria). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97:14091-14096

73. Wiehler, J von Hummel, J. & Steipe, B. Mutants of Discosoma red fluorescent protein with a GFP-like chromophore. FEBS Lett. 487, 384-389 (2001).)

74. Wilson. T and Hastings J.W. (1998) Bioluminescence. Annu. Rev. Cell Dev. Biol 14, 197-230

75. Yang F, Moss LG, Phillips GN Jr: The molecular structure of green fluorescent protein. Nat. Biotechnol 1996, 14:1246-1251

76. Yang Z, Bielawski JP. Statistical methods for detecting molecular adaptation. Tree 2000 Dec 15(12):496-503

77. Yanushevich YG, Staroverov DB, Savitsky AP, Fradkov AF, Gurskaya NG, Bulina ME, Lukyanov KA, Lukyanov SA. A strategy for the generation of non-aggregating mutants of Anthozoa fluorescent proteins. FEBS Lett. 2002 Jan 30;511(1-3):11-4.

78. Yarbrough D, Wachter RM, Kallio K, Matz MV, Remington SJ: Re-fined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0 E resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 2001, 98:462-467

79. Youvan DC, Michel-Beyerle ME. Structure and fluorescence mechanism of GFP. Nat Biotechnol. 1996 0ct;14(10):1219-20

80. Zacharias DA, Violin JD, Newton AC, Tsien RY. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.Science. 2002 May 3;296(5569):913-6.