Мутации с изменением копийности в генах PARK2 и SNCA при болезни Паркинсона в России тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Семенова, Елена Владимировна

• Семенова, Елена Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Семенова, Елена Владимировна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика болезни Паркинсона.

1.1.1. Эпидемиология.

1.1.2. Клинические признаки.

1.1.3. Нейропатология.

1.1.4. Проблемы лечения и диагностики болезни Паркинсона.

1.2. Причины развития болезни Паркинсона.

1.2.1. Гены и локусы моногенных форм болезни Паркинсона.

1.2.1.1. Ген SNCA (PARK1/PARK4).

1.2.1.2. Ген PARK2 (.PARK2).

1.2.1.3. Ген UCHL1 (PARK5).

1.2.1.4. Ген PINK1 (PARK6).

1.2.1.5. Ген DJ-1 (RARK7).

1.2.1.6. Ген LRRK2 (PARK8).

1.2.1.7. Ген АТР13А2 (PARK 9).

1.2.2. Механизмы гибели дофаминергических нейронов.

1.2.3. Полногеномный ассоциативный анализ при болезни Паркинсона.

1.3. Современные методические подходы к определению мутаций с измененной копийностью.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Характеристика анализируемых выборок.

2.2. Анализ делеций и дупликаций отдельных экзонов гена PARK2.

2.3. Анализ мультипликаций гена SNCA.

2.4. Статистическая обработка результатов.

2.4.1. Расчет относительных рисков развития болезни

Паркинсона.

2.4.2. Выявление корреляций между наличием делеций/ дупликаций экзонов гена PARK2 и клиническими характеристиками больных.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Подбор праймеров и оптимизация метода анализа дозы отдельных экзонов генов PARK2 и SNCA.

3.2. Анализ делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 в выборке спорадических больных болезнью Паркинсона с ранним началом развития заболевания.

3.3. Анализ делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 в выборке спорадических больных болезнью Паркинсона с поздним началом развития заболевания.

3.4. Анализ делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 в выборке популяционного контроля и расчет относительных рисков развития болезни Паркинсона в российской популяции.

3.5. Выявление корреляций между наличием делеций/ дупликаций экзонов гена PARK2 и клиническими характеристиками больных.

3.6. Анализ дупликаций и трипликаций гена SNCA в выборке аутосомно-доминантных больных болезнью Паркинсона.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Мутации с изменением копийности в генах PARK2 и SNCA при болезни Паркинсона в России»

На современном этапе достигнут большой прогресс в идентификации генов, вовлеченных в этиологию моногенных наследственных болезней. Это связано, как с успешным применением стратегии позиционного клонирования и развитием новых технологий, так и с успехами, достигнутыми в расшифровки генома человека. Основной проблемой сейчас является выявление генов, вовлеченных в патогенез мультифакториальных заболеваний. К такому типу заболеваний относятся, прежде всего, болезни сердечно-сосудистой системы, астма, сахарный диабет, многие нейропсихиатрические и неврологические заболевания. Особый интерес представляет изучение молекулярно-генетических основ мультифакториальных неврологических заболеваний, поскольку это позволит, во-первых, выявить новые закономерности в функционировании нервной системы на всех уровнях — от уровня клетки до организма в целом. Кроме того, выявление генетических маркеров данных заболеваний поможет разработать новые методы их диагностики. Разрабатываемые методы лечения и профилактики, в свою очередь, будут максимально учитывать генетические особенности каждого конкретного человека.

К числу тяжелых неврологических патологий относится болезнь Паркинсона (БП), которая является вторым по распространенности (после болезни Альцгеймера) нейродегенеративным заболеванием человека. Болезнь Паркинсона — это мультисистемное хроническое медленно прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, связанное с нарушением деятельности базальных ганглиев головного мозга. В настоящее время полагают, что в основе БП лежит дегенерация или дисфункция дофаминергических нейронов в черной субстанции, однако причины такой избирательной гибели нейронов полностью не выяснены.

С генетической точки зрения БП представлена двумя формами: семейной и спорадической. В 10-15% случаев заболевание может наследоваться по моногенному аутосомному типу, но в большинстве случаев носит спорадический идиопатический характер. В настоящее время картировано 17 локусов моногенных форм болезни Паркинсона. Анализ известных локусов и генов БП позволил выделить несколько механизмов, вовлеченных в патогенез паркинсонизма. К их числу, в первую очередь, относятся процессы убиквитин зависимой протеасомной деградации белков, которые часто связаны с мутациями в генах паркина (PARK2) и а-синуклеина (iSNCA). Известно, что гомозиготность или компаундная гетерозиготность по мутациям в гене PARK2 является причиной развития заболевания у примерно половины больных с ювенильной аутосомно-рецессивной формой БП и у примерно 10% спорадических больных с ранним началом развития заболевания. Более того, установлено, что даже в гетерозиготном состоянии мутации в гене PARK2 могут вести к субклиническим нарушениям обмена дофамина в полосатом теле. Эти данные позволяют предположить, что гетерозиготность по мутациям в гене PARK2 может приводить к БП или повышать риск ее развития при взаимодействии с другими факторами. Для проверки этой гипотезы необходимо проведение массового скрининга мутаций в гене PARK2 у больных спорадической формой БП. Интересной особенностью мутаций в этом гене является высокая частота делеций или дупликаций, захватывающих целиком один или несколько экзонов. Следовательно, анализ мутаций гена PARK2 целесообразно начинать именно с поиска экзонных делеций и дупликаций. Также, сравнительно недавно появились данные о том, что мутации гена SNCA, связанные с изменением его копийности, могут приводить к развитию семейной формы БП с аутосомно-доминантным типом наследования. Было показано, что дупликации и трипликации гена SNCA встречаются гораздо чаще, чем точковые мутации данного гена.

Цели и задачи работы.

Целью настоящей работы являлось оценить вклад делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 и мультипликаций гена SNCA в развитие болезни Паркинсона у пациентов из России.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка быстрого и эффективного метода анализа дозы отдельных экзонов гена PARK2 и гена SNCA на основе ПЦР в реальном времени.

2. Анализ делеций и дупликаций всех 12 экзонов гена PARK2 у пациентов со спорадической формой БП с ранним и поздним началом развития заболевания.

3. Оценка риска развития спорадической БП у носителей делеций/дупликаций экзонов гена PARK2. Анализ корреляции мутаций с изменением копийности с клиническими характеристиками БП.

4. Анализ дупликаций и трипликаций экзонов 4-6 гена SNCA в выборке пациентов с БП.

Научная новизна.

Разработан быстрый и эффективный метод выявления делеций и дупликаций экзонов 1-12 в гене PARK2 и мультипликаций гена SNCA на основе ПЦР в реальном времени технологии TaqMan.

Впервые проведен анализ спорадических больных с ранним началом развития заболевания (<45 лет) из России на наличие экзонных перестроек в гене PARK2. Установлено, что частота больных с экзонными перестройками в гене PARK2 составляет 12,4%, и показано, что наиболее подвержены экзонным перестройкам экзоны 3 и 4. Обнаружено, что относительный риск развития БП у лиц в молодом возрасте при наличии делеций или дупликаций в гене PARK2 повышен в 12,4 раза. Получено подтверждение гипотезы о том, что мутации в гетерозиготном состоянии в гене RARK2 влияют на риск развития заболевания.

Впервые проведен анализ представительной выборки спорадических больных с поздним началом развития заболевания (>45 лет) из России на наличие экзонных перестроек в гене PARK2. Установлено, что частота больных с экзонными перестройками в гене PARK2 составляет 3,8%.

Впервые в российской популяции проведен корреляционный анализ в выборках спорадических больных с ранним и поздним началом развития заболевания между наличием экзонных перестроек в гене PARK2 и характерными клиническими признаками БП. Установлено, что наличие экзонных перестроек способствует существенному снижению возраста начала БП (на 9 лет), развитию дистонии и симметричному протеканию заболевания и не влияет на скорость и тяжесть протекания болезни.

Впервые проведен анализ больных с семейной формой БП с аутосомно-доминантным типом наследования на наличие дупликаций и трипликаций гена SNCA. В результате анализа было показано, что мультипликации гена SNCA не вносят существенного вклада в патогенез БП у больных из России.

Практическая значимость работы.

Показано, что экзонные перестройки в гене PARK2 вносят существенный вклад в патогенез БП у больных из России. Разработан эффективный метод их выявления, подходящий, в том числе, для массового скрининга больных в клинических условиях. Выявление данных мутаций на ранних стадиях заболевания может скорректировать терапию и при грамотном лечении значительно уменьшить тяжесть его протекания. Выявление таких мутаций у лиц из группы риска на доклинической стадии поможет вовремя принять профилактические меры и, если не предотвратит развитие БП, то отодвинет ее появление на более поздний срок и значительно снизит тяжесть протекания заболевания. В будущем, в том числе с использованием результатов данного исследования, возможно создание единого комплексного генетического теста, выявляющего риск развития БП по результатам анализа локусов заболевания.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Семенова, Елена Владимировна

выводы.

1. Разработан основанный на ПЦР в реальном времени метод анализа дозы отдельных экзонов гена PARK2 и гена SNCA, позволяющий проводить диагностику мутаций с изменением копийности при семейной и спорадической формах болезни Паркинсона.

2. Показано, что делеции и дупликации экзонов гена PARK2 встречаются у 21 из 170 (12,4%) обследованных пациентов со спорадической формой болезни Паркинсона с ранним началом развития (до 45 лет) из России. Наиболее часто у этих больных встречаются делеции экзонов 3, 4 гена PARK2. Риск развития болезни Паркинсона в молодом возрасте у лиц с наличием мутаций с изменением копийности в гене PARK2 повышен в 12,4

3 раза.

3. У пациентов со спорадической формой болезни Паркинсона с ранним началом развития выявлены корреляции между наличием мутаций с изменением копийности в гене PARK2, возрастом начала заболевания и наличием дистонии. Показано, что у носителей делеций и дупликаций в гене PARK2 возраст начала заболевания в среднем на 9 лет меньше и составляет 24 года.

4. Показано, что мутации с изменением копийности в гене PARK2 встречаются у 7 из 183 (3,8%) обследованных пациентов со спорадической формой болезни Паркинсона с поздним началом развития (после 45 лет) из России. В данной выборке больных выявлена корреляция между наличием мутации с изменением

I копийности в гене PARK2 и симметричным течением заболевания.

5. У 61 обследованного больного с аутосомно-доминантной формой болезни Паркинсона из России не выявлено дупликаций и трипликаций гена SNCA. i

1 100 j

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В последнее время особое значение приобретают исследования тяжелых нейродегенеративных заболеваний человека, поскольку эти заболевания широко распространены и в большинстве случаев неизлечимы. Современные технологии позволяют попробовать взглянуть на патогенез данных заболеваний с молекулярно-генетической точки зрения, что дает надежду на их выявление на доклинической стадии и разработку эффективных методов профилактики и лечения. Одним из таких заболеваний является болезнь Паркинсона. К настоящему моменту найдены основные локусы семейных форм БП и ведется активный поиск генетических факторов развития гораздо более распространенной спорадической формы БП. Из литературных данных известно, что наиболее частой генетической причиной развития БП являются мутации в гене PARK2, основную долю которых составляют экзонные делеции и дупликации. Также относительно недавно были получены данные о том, что мутации, связанные с увеличением числа копий гена SNCA, могут быть частой причиной развития семейной формы БП с аутосомно-доминантным типом наследования. Высокая частота данных мутаций требует разработки эффективного метода их типирования. В связи с этим нами был разработан быстрый и точный метод выявления экзонных перестроек в генах PARK2 и SNCA, применимый для массового скрининга больных в клинических условиях. Полученные нами данные подтверждают высокую встречаемость экзонных перестроек в гене PARK2 и их важную роль в патогенезе спорадической формы БП, особенно с ранним началом развития, у больных из России. При анализе спектра делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 было установлено, что наиболее часто встречаются экзонные перестройки экзонов 3 и 4. Анализ мультипликаций гена SNCA показал, что данные мутации не играют существенной роли в развитии БП в российской популяции. Таким образом, можно сделать вывод о необходимости анализа делеций и дупликаций экзонов гена PARK2 (в первую очередь, экзонов 3 и 4) у больных из России, особенно на ранних стадиях заболевания, когда с помощью грамотной терапии возможно замедлить развитие заболевания или уменьшить его тяжесть. Также анализ экзонных перестроек в гене PARK2 может быть очень эффективен на доклинических стадиях у родственников спорадических больных, которые составляют группу риска. В случае выявления экзонных перестроек, им может быть предложена терапия, способная, если не остановить развитие заболевания, то сдвинуть его дебют на более поздний срок и снизить тяжесть его протекания.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Семенова, Елена Владимировна, 2010 год

1. Голубев В.Л., Левин Я.И, Вейн A.M. Болезнь Паркинсона и синдром паркинсонизма // М.: Медпресс. 1999.

2. Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология // СПб.: Интермедика. 2002. С. 111.

3. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. М.: Медиа Сфера. 2002. С. 166-180, 191-194.

4. Федорова H.B. Лечение и реабилитация больных паркинсонизмом // Дисс. на соискание ученой степени д. м. н. М. 1996.

5. Ю.Шадрина М.И., Сломинский П.А. Значение митохондриальной дисфункции и окислительных повреждений в молекулярной патологии болезни Паркинсона // Молекулярная биология. 2008. Т. 42(5). С. 1-11.

6. П.Шадрина М.И., Сломинский П.А. Молекулярная генетика болезни Паркинсона // Генетика. 2006. Т. 42(8). С. 1045-1059.

7. Ahn T.B., Kim S.Y., Kim J.Y., Park S.S., Lee D.S., Min HJ., Kim Y.K., Kim S.E., Kim J.M., Kim H.J., Cho J., Jeon B.S. alpha-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease // Neurology. 2008. V. 70(1). P. 43-49.

8. Benmoyal-Segal L., Soreq H. Gene-environment interactions in sporadic Parkinson's disease // J Neurochem. 2006. V. 97(6). P. 1740-1755.

9. Bergman O, Häkansson A, Westberg L., Nordenström K., Carmine Belin A., Sydow O., Olson L., Holmberg B., Eriksson E., Nissbrandt H. PITX3 polymorphism is associated with early onset Parkinson's disease // Neurobiol Aging. 2010. V. 31(1). P. 114-117.

10. Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping. //Analytycal Biochemistry. 1999. V. 273(2). P. 221-228.

11. Biskup S., Gerlach M., Kupsch A., Reichmann H., Riederer P., Vieregge P., Wüllner U., Gasser T. Genes associated with Parkinson syndrome // J Neurol. 2008. V. 255(5 Suppl.). P. 8-17.

12. Biskup S., Moore D.J., Celsi F., Higashi S., West A.B., Andrabi S.A., Kurkinen K., Yu S.W., Savitt J.M., Waldvogel HJ., Faull R.L., Emson P.C.,

13. Torp R., Ottersen O.P., Dawson T.M., Dawson V.L. Localization of LRRK2tt to membranous and vesicular structures in mammalian brain // Ann. Neurol.2006. V. 60(5). P. 557-569.