Белки, взаимодействующие с LIM-доменным цитоскелетным белком зиксином в раннем развитии центральной нервной системы шпорцевой лягушки Xenopus laevis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Ермолина, Людмила Викторовна

• Ермолина, Людмила Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ермолина, Людмила Викторовна

2. ВВЕДЕНИЕ.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.

3.1 Нейральная индукция и регионализация эмбриональной эктодермы.

3.2. Дифференцировка нервной пластинки.

3.3. Роль гомеобоксного гена Xanfl в раннем развитии переднего мозга эмбрионов шпорцевой лягушки.

3.4. Участие белка Sonic hedgehog в формировании дорсо-вентральной разметки нервной трубки.

3.4.1. Основные компоненты сигнального каскада, запускаемого белками семейства Hedgehog.

3.5. Цитоскелетный белок зиксин — универсальный регулятор клеточной адгезии и экспрессии генов.

3.5.1. Белок зиксин: локализация и гомологи.

3.5.2. Молекулярная структура зиксина.

3.5.3. Зиксин как компонент клеточных контактов и его роль в регуляции сборки актинового цито скелета.

3.5.4. Механизмы перемещения зиксина между цитоплазмой и ядром.

3.5.5. Зиксин как регулятор генной экспрессии.

3.6. Дрожжевая двугибридная ЬехА-система.

3.7. Зародыши шпорцевой лягушки Xenopus laevis как экспериментальная модель для изучения молекулярно-генетических механизмов эмбриогенеза

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Поиск белков, взаимодействующих с транскрипционным фактором Xanfl, при помощи дрожжевой двугибридной ЬехА-системы.

4.2. Клонирование полноразмерной последовательности кДНК зиксина Xenopus laevis.

4.3. Экспрессия гена зиксина в эмбриональном развитии Xenopus laevis.

4.4. Зиксин способен связываться с Xanfl in vivo.

4.5. Второй LIM-домен зиксина отвечает за связывание с Engrailedподобным репрессорным доменом Xanfl.

4.6. Ко-локализация белков Xanfl и зиксина в клетках линии CV-1.

4.7. Зиксин подавляет активность транскрипционного репрессора Xanfl в клетках зачатка переднего мозга зародышей шпорцевой лягушки Xenopus laevis.

4.8. Поиск белков, способных взаимодействовать с зиксином в ходе раннего развития шпорцевой лягушки.

4.9. Зиксин связывается с белками Ptc2, Ziel и Glil in vivo.

5. ВЫВОДЫ.

6. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

6.1. Материалы.

6.1.1 Реактивы.

6.1.2. Ферментные препараты.

6.1.3. Лабораторное оборудование.

6.1.4. Лабораторные животные.

6.1.5. Буферы и растворы.

6.1.6. Микробиологические среды.

6.1.7. Предоставленные штаммы.

6.1.8. Предоставленные плазмиды.

6.2. Методы.

6.2.1. Амплификация ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР).

6.2.2. Электрофорез в агарозном геле.

6.2.3. Элюция ДНК из агарозного геля.

6.2.4. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

6.2.5. Достройка З'-конца двухцепочечных молекул ДНК.

6.2.6. Отщепление выступающего У- конца двухцепочечных молекул ДНК.

6.2.7. Лигирование молекул ДНК.

6.2.8. Трансформация клеток Escherichia coli.

6.2.9. Выделение плазмидной ДНК из бактерий Escherichia coli.

6.2.10. Изготовление ДНК конструкций.

6.2.11. Трансформация плазмидной ДНК в дрожжевые клетки с использованием ацетата лития.

6.2.12. Выделение плазмидной ДНК из дрожжей.

6.2.13. Изучение белковых взаимодействий в дрожжах с помощью Colony-lift filter assay.

6.2.14. Изучение белок-белковых взаимодействий в дрожжах с помощью цветной ферментативной реакции с использованием субстрата ONPG в жидкой среде (Liquid Culture Assay).

6.2.15. Транскрипция in vitro.

6.2.16. Получение зародышей шпорцевой лягушки Xenopus laevis.

6.2.17. Получение ооцитов шпорцевой лягушки Xenopus laevis.

6.2.18. Синтез белков в ооцитах или зародышах Xenopus laevis.

6.2.19. Экспрессия клонированных генов в E.coli с использованием IPTG-зависимого промотора.

6.2.20. Электрофоретическое разделение белков в денатурирующих условиях в ПААГ.

6.2.21. Иммуноблот (Western Blotting).

6.2.22. Изучение белок-белковых взаимодействий в системе in vitro с помощью метода pull down.

6.2.23. Изучение белок-белковых взаимодействий в системе in vivo с помощью метода коиммунопреципитации.

6.2.24. Блокирование трансляции эндогенных мРНК, кодирующих Xanfl, при помощи микроинъекций синтетических анти-смысловых олигонуклеотидов.

6.2.25. Фиксация зародышей.

6.2.26. Гибридизация in situ на целых зародышах шпорцевой лягушки.

6.2.27. Синтез дигоксигенин-меченной антисмысловой РНК для проведения гибридизации in situ.

6.2.28. Экстракция тотальной РНК из зародышей шпорцевой лягушки. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР).

6.2.29. Поддержание в культуре и трансфекция клеток линии CV-1.

7 БЛАГОДАРНОСТИ.

8. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.