Молекулярные и клеточные механизмы контракции сгустков крови и ее нарушений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Пешкова Алина Дмитриевна

• Пешкова Алина Дмитриевна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Пешкова Алина Дмитриевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Современные представления о свертывании крови и гемостазе

1.1.1 Компоненты гемостаза: сосудистый, тромбоцитарный и плазменный

1.1.2 Плазменный гемостаз: свертывание крови

1.1.3 Образование, строение и свойства фибрина

1.1.4 Физиологические антикоагулянты

1.1.5 Фибринолиз

1.2 Тромбоциты в норме и при патологии

1.2.1 Образование, строение и функции тромбоцитов

1.2.2 Активация тромбоцитов

1.2.3 Ингибирование функций тромбоцитов

1.2.4 Адгезия тромбоцитов

1.2.5 Агрегация тромбоцитов

1.2.6 Методы оценки функционального состояния тромбоцитов

1.3 Молекулярные и клеточные механизмы тромбоза

1.3.1 Артериальный тромбоз

1.3.2 Венозный тромбоз

1.4 Контракция (ретракция) сгустка крови - конечная стадия свертывания крови

1.4.1 Методы изучения контракции сгустков крови

1.4.2 Активированные тромбоциты как движущая сила контракции сгустков крови

1.4.3 Роль сократительного аппарата тромбоцитов в контракции сгустков крови

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Кровь доноров и пациентов. Разрешения этических комитетов

2.2 Оборудование и реактивы

2.3 Клинико-лабораторные исследования крови

2.4 Получение стабилизированной крови и ее фракций

2.5 Сканирующая электронная микроскопия тромбов

2.6 Выделение моноцитов и их характеристика

2.6.1 Биохимическая активация и ингибирование функций моноцитов

2.6.2 Оценка экспрессии тканевого фактора на активированных моноцитах

2.7 Выделение тромбоцитов с помощью гель-фильтрации и их характеристика

2.7.1 Определение молекулярных маркеров активации тромбоцитов методом проточной цитометрии

2.7.2 Сканирующая электронная микроскопия тромбоцитов

2.8 Исследование кинетики внутреннего фибринолиза

2.9 Исследование кинетики внешнего фибринолиза

2.10 Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 71 3.1 Разработка методики изучения кинетики контракции сгустков крови

in vitro

3.1.1 Регистрация контракции сгустка крови при помощи анализатора тромбодинамики и расчет кинетических параметров

3.1.2 Фазовый анализ кинетических кривых контракции сгустков крови

3.1.3 Оптимизация условий формирования и контракции сгустков крови in vitro

Заключение по разделу

3.2 Зависимость контракции сгустков крови от состава крови и функции тромбоцитов

3.2.1 Число тромбоцитов

3.2.2 Концентрация фибриногена

3.2.3 Гематокрит

3.2.4 Активность фактора XIIIa

3.2.5 Ингибирование тромбоцитарного миозина IIa

3.2.6 Ингибирование взаимодействия тромбоцитарного интегрина aIIbß3 с фибрином

Заключение по разделу

3.3 Влияние активированных моноцитов на контракцию сгустков крови

3.3.1 Стимуляция контракции сгустков крови под действием активированных моноцитов

3.3.2 Роль экспрессии тканевого фактора в стимуляции контракции сгустков крови под действием активированных моноцитов

Заключение по разделу

3.4 Влияние контракции сгустков крови на их чувствительность

к фибринолизу

3.4.1 Ингибирование контракции сгустков крови для сравнения

со сгустками, претерпевшими контракцию

3.4.2 Влияние контракции сгустков крови на внешний фибринолиз

3.4.3 Влияние контракции сгустков крови на внутренний фибринолиз

Заключение по разделу

3.5 Изменения контракции сгустков крови при тромботических состояниях

3.5.1 Контракция сгустков крови и тромбов при остром ишемическом инсульте

3.5.1.1 Морфологические признаки прижизненной контракции церебральных тромбов

3.5.1.2 Показатели контракции сгустков крови in vitro при остром ишемическом инсульте

3.5.1.3 Связь параметров контракции сгустков крови с лабораторными показателями гемостаза и клеточным составом крови при остром ишемическом инсульте

3.5.1.4 Функциональное состояние тромбоцитов у пациентов

с острым ишемическим инсультом

3.5.1.5 Связь параметров контракции сгустков крови с клиническими проявлениями острого ишемического инсульта

Заключение по подразделу

3.5.2 Контракция сгустков крови при венозных

тромбоэмболических осложнениях

3.5.2.1 Морфологические признаки прижизненной контракции венозных тромбов

3.5.2.2 Показатели контракции сгустков крови in vitro

у пациентов с изолированным тромбозом глубоких вен (ТГВ) и тромбоэмболией легочной артерии (ТЭЛА)

3.5.2.3 Связь параметров контракции сгустков крови

с лабораторными показателями гемостаза и клеточным составом крови при венозных тромбоэмболических осложнениях

3.5.2.4 Функциональное состояние тромбоцитов у пациентов с венозными тромбоэмболическими осложнениями

3.5.2.5 Связь параметров контракции сгустков крови

с клиническими проявлениями венозных тромбоэмболических осложнений

Заключение по подразделу

Заключение по разделу

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО РАБОТЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПРИЛОЖЕНИЕ К ДИССЕРТАЦИИ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Настоящее исследование относится к трансляционной медицине, которая применяет достижения фундаментальной науки для разработки эффективных методов профилактики, диагностики и лечения заболеваний. Работа выполнена на стыке общей и клинической биохимии, клеточной биологии, гематологии и направлена на повышение эффективности борьбы с кровотечениями и тромбозами.

Известно, что кровь способна свертываться, т. е. загустевать с образованием желеобразного сгустка. Свертывание крови, или гемокоагуляция, — это биологическая реакция, которая является одним из главных механизмов гемостаза, т. е. остановки кровотечения. Система гемостаза, с одной стороны, должна поддерживать нормальную текучесть крови в физиологических условиях, а, с другой стороны, - быстро реагировать на нарушение целостности сосудистого русла путем образования сгустка, чтобы остановить истечение крови в месте повреждения кровеносного сосуда [Атауллаханов, 2015]. Нарушение гемостатического баланса, т. е. равновесия между жидкой и свернувшейся кровью, встречается часто при самых разных патологических состояниях (травмы, онкологические и сердечно-сосудистые заболевания, хирургические операции и т. д.) и может привести к кровопотере или, наоборот, угрожать закупоркой кровеносных сосудов, т.е. тромбозом [Panteleev, 2015].

Гемостаз и тромбоз - два противоположных по последствиям жизненно важных результата свертывания крови, которые определяют исключительное значение этого процесса для биологической науки и медицинской практики. Кровотечения и другие гемостатические нарушения являются доминирующими причинами инвалидности и смертности [PrevitaH, 2011]. По данным ВОЗ, в мире за год от сердечно-сосудистых заболеваний, тесно связанных с нарушениями гемостаза, умирает около 17,5 млн. человек, что составляет 31% всех случаев смерти [Jankovic, 2015].

Сравнительно много известно о начальных реакциях свертывания крови, формировании сгустка крови и его ферментативном растворении (фибринолизе). Гораздо менее изучен процесс структурной реорганизации сгустка крови, известный под названием контракции, или ретракции. Контракция сгустка крови - это механохимический процесс сжатия сгустка с отделением сыворотки крови [Carr, 2003; Stalker, 2014]. Если контракция происходит in vivo, она может предотвращать или уменьшать потерю крови за счет стягивания краев раны сразу после повреждения [Lam, 2011] и восстанавливать кровоток в обход сгустка или тромба, закупоривающего просвет кровеносного сосуда [Muthard, 2012]. Несмотря на биологическую и медицинскую важность, контракция сгустка крови изучена недостаточно, отчасти из-за несовершенства существующих методов объективной регистрации и количественной оценки этого процесса.

Исходя из сказанного, цель работы - исследование молекулярных и клеточных механизмов механохимической контракции (ретракции) сгустков крови.

Основные задачи исследования:

1) разработать методику количественного анализа кинетики контракции сгустков крови in vitro;

2) оценить влияние клеточного и белкового состава крови на процесс контракции сгустков крови;

3) изучить роль тканевого фактора моноцитов в контракции сгустков крови;

4) оценить влияние контракции сгустков крови на фибринолиз;

5) определить параметры контракции сгустков крови у пациентов с острым ишемическим инсультом и венозными тромбоэмболическими осложнениями.

Научная новизна

Разработана методика изучения контракции сгустков крови, которая апробирована в клинико-диагностической лаборатории как новый интегральный тест гемостаза. Изучена зависимость кинетики контракции сгустков крови от патологических вариаций белкового и клеточного состава крови. Установлены механизмы изменений контракции сгустков крови при тромбозах, которые объясняют патогенетическое значение контракции и её нарушений, а также подводят научную базу под использование кинетики контракции сгустков крови как лабораторного теста, имеющего прогностическое и диагностическое значение.

Обнаружена способность активированных моноцитов стимулировать контракцию сгустков крови путем экспрессии тканевого фактора с последующей генерацией тромбина, что является дополнительным доказательством прямой связи между тромбозом и воспалением.

Установлена зависимость протеолитического расщепления (фибринолиза) сгустков крови от степени их контракции. Показано, что сгустки, претерпевшие полную контракцию, подвержены ускоренному (пато)физиологическому фибринолизу изнутри, но в то же время становятся устойчивыми к внешнему, или наружному, фибринолизу, аналогичному тромболитической терапии.

Выявлено нарушение контракции сгустков крови при тромботических состояниях у людей и установлен механизм этого патологического феномена. Разработана новая схема патогенеза тромбообразования с учетом антитромботической роли контракции сгустков крови и тромбов и протромботических последствий ее нарушений.

Теоретическая и практическая значимость работы

Новая методика изучения кинетики контракции сгустков крови может быть использована как тест для интегральной характеристики гемостаза и его нарушений как в научно-исследовательских, так и в клинико-диагностических лабораториях. Определены нормальные характеристики контракции сгустков

крови у здоровых доноров и параметры контракции, которые характеризуют патологические изменения в сторону гиперкоагуляции и (пред)тромботических состояний.

Изучение контракции сгустков крови у пациентов при ряде тромботических состояний (ишемический инсульт, венозный тромбоз, тромбоэмболия легочной артерии) показало, что способность сгустков крови к сжатию ослаблена вследствие биохимической активации тромбоцитов в кровотоке, их энергетического истощения и вторичной дисфункции, включая снижение сократительного потенциала. Это указывает на важную патогенетическую роль прижизненной контракции внутрисосудистых сгустков крови при тромбозах, что может определять течение и исход тромботических состояний. Так, при нарушении контракции несжатые тромбы могут перекрывать просвет сосуда и тормозить кровоток, в отличие от полностью контрактированных, менее окклюзивных тромбов. Важный патогенетический аспект контракции сгустков и тромбов связан с тем, что нарушение контракции, независимо от причин, прямо коррелирует с риском легочной эмболии при венозном тромбозе.

Практическое значение работы состоит в том, что полученные результаты позволяют рассматривать кинетику контракции сгустков крови in vitro как новый клинико-лабораторный тест для оценки риска тромбоэмболии. Кроме того, тест кинетики контракции сгустков крови в комбинации с другими лабораторными тестами может использоваться для ранней диагностики (пред)тромботических состояний и контроля за эффективностью проводимого лечения.

Учитывая малоудовлетворительные результаты профилактики и лечения тромботических осложнений во всем мире, результаты исследования дают основание считать контракцию сгустков и тромбов недооцененной и практически важной проблемой в области гемостаза и тромбоза, заслуживающей дальнейшего изучения.

Положения, выносимые на защиту

1. Кинетика контракции сгустков крови in vitro - информативный лабораторный тест, характеризующий изменения коагуляционного и тромботического потенциала.

2. Параметры контракции сгустков крови зависят от патологических изменений клеточного и белкового состава крови.

3. Тромботические состояния у людей сопровождаются нарушением контракции сгустков крови и тромбов вследствие хронической активации, энергетического истощения и дисфункции тромбоцитов, включая их пониженную способность к сокращению.

Степень достоверности результатов

Достоверность результатов исследования обусловлена тщательным выбором и характеристикой объектов исследования, большим количеством экспериментальных данных, полученных на современном оборудовании, и детальным анализом результатов, в том числе с использованием обоснованных методов статистической обработки. Все результаты исследования представлены и обсуждены на многочисленных научных конференциях с участием ведущих специалистов и опубликованы в рецензируемых российских и зарубежных изданиях.

Внедрение в практику

Результаты работы внедрены в повседневную работу следующих научных и клинических подразделений: научно-исследовательской лаборатории «Белково-клеточные взаимодействия» Института фундаментальной медицины и биологии Казанского федерального университета, клинико-диагностической лаборатории №1 Университетской клиники Казанского федерального университета, клинико-диагностической лаборатории Межрегионального клинико-диагностического центра (г. Казань) и лаборатории клеточного гемостаза и тромбоза Национального медицинского исследовательского центра

детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева (г. Москва). Материалы диссертации используются в учебном процессе при преподавании курса «Введение в молекулярную патологию» на кафедре биохимии, биотехнологии и фармакологии Казанского федерального университета.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярные и клеточные механизмы контракции сгустков крови и ее нарушений»

Апробация работы

Основные научные результаты были доложены на следующих научных конференциях и съездах:

• Итоговая ежегодная научная конференция Казанского федерального университета (Казань, 6.02.20);

•2-я Всероссийская школа-конференция молодых ученых «Биохимия -основа наук о жизни» (Казань, 7.11.19 - 9.11.19);

• VI Съезд биохимиков России (Сочи, 1.10.2019-6.10.2019);

• V Международная конференция ПОСТГЕНОМ'2018 «В поисках моделей персонализированной медицины» (Казань, 29.10.2018 - 2.10.2018);

• 9-я Всероссийская конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии, объединенная с международным Конгрессом по противоречиям в гемостазе и тромбозе (Санкт-Петербург, 04.10.2018 - 06.10.2018);

• 52-я ежегодная международная научная конференция Европейского общества клинических исследований (Барселона, Испания 30.05.2018 -01.06.2018);

• Всероссийская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы патологии гемостаза» (Санкт-Петербург, 22.03.2018 - 23.03.2018);

• Итоговая ежегодная научная конференция Казанского федерального университета (Казань, 6.02.18);

• X Всероссийский с международным участием Конгресс молодых ученых-биологов «Симбиоз-2017» (Казань, 25.10.17 - 28.10.17);

• XXIII съезд Физиологического общества им. И. П. Павлова (Воронеж,

18.09.2017 - 22.09.2017);

• Конгресс Международного общества по тромбозу и гемостазу 2017 года (Берлин, Германия, 8.07.2017 -13.07.2017);

• 6-я международная конференция «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 31.05.17 -2.06.17);

• Итоговая ежегодная научная конференция Казанского федерального университета (Казань, 7.02.17);

• Международная научно-образовательная конференция «Всероссийская конференция по клиническому гемостазу и гемореологии», объединенная с международным Конгрессом по противоречиям в гемостазе и тромбозе (Москва, 20.10.2016 - 22.10.2016);

• Международная научно-практическая конференция «Трансляционная медицина - 2016» (Казань, 13.10.2016 - 15.10.2016);

• VIII Всероссийский конгрессе молодых биологов с международным участием «Симбиоз-Россия» (Новосибирск, 05.10.2015 - 09.10.2015);

• Конгресс Международного общества по тромбозу и гемостазу 2015 года (Торонто, Канада, 20.06.2015 - 25.06.2015);

• XIX Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 20.04.2015 - 24.04.2015);

Публикация результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 26 работ, в том числе 10 научных статей, среди них 4 статьи в российских рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК, и 6 статей в международных журналах, индексируемых в базах данных Scopus и WoS. Кроме того, по материалам диссертации получен 1 патент.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, общего заключения, списка цитированной литературы и приложения. Работа изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 43 рисунка и 9 таблиц в основном тексте и 2 дополнительные таблицы. Библиография включает 139 наименований.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Современные представления о свертывании крови и гемостазе

В результате эволюции многоклеточные организмы приобрели способность защищаться от последствий механического повреждения и предупреждать истечение биологических жидкостей (гемолимфы, лимфы, крови) из замкнутой циркуляторной системы путем закупорки отверстия в стенке сосуда желеобразным сгустком. Этот процесс получил название гемостаз (от греческих слов haema - кровь и stasis - остановка), а образование сгустка, т.е. свертывание крови или гемокоагуляция, является одним из главных механизмов гемостаза.

1.1.1 Компоненты гемостаза: сосудистый, тромбоцитарный и плазменный

Гемостаз у млекопитающих и человека — это совокупность клеточных и молекулярных реакций, направленных на остановку кровотечения, которые искусственно подразделяются на три группы, или компоненты, гемостаза.

Сосудистый гемостаз складывается из следующих реакций. Во-первых, при повреждении происходит спазм сосудистой стенки для снижения объема протекающей крови [Атауллаханов, 2015]. Спазм сосудов обусловлен сокращением гладкомышечных клеток сосудистой стенки под действием вазоконстрикторов - серотонина и тромбоксана А2 (ТХА2), секретируемых активированными тромбоцитами [Пантелеев, 2008]. Во-вторых, сосудистый гемостаз включает в себя обнажение адгезивной (т.е. липкой для клеток) поверхности субэндотелия, прежде всего коллагена, которая сопровождается прилипанием активированных тромбоцитов и их агрегатов, что способствует механической закупорке, или «заклеиванию», повреждения. В-третьих, сосудистая стенка, и прежде всего эндотелиоциты, способны выделять в кровоток или экспрессировать на поверхность биологически активные вещества, способствующие свертыванию крови (например, тканевой фактор) [Покровский, 2007].

Тромбоцитарный гемостаз включает в себя адгезию тромбоцитов, их агрегацию, высвобождение биологически активных веществ и образование прокоагулянтной поверхности на наружной клеточной мембране. При повреждении сосуда активированные тромбоциты прилипают (адгезируются) к месту повреждения и формируют агрегаты, препятствующие истечению крови. Адгезия тромбоцитов обусловлена наличием в тромбоцитах и плазме крови фактора Виллебранда (vWF) [Ruggeri, 2007]. Этот крупный белок имеет три активных центра, один из которых связывается с коллагеном субэндотелия, а два - с рецепторами тромбоцитов. Агрегация тромбоцитов осуществляется после их активации под действием многочисленных физиологических индукторов (тромбин, АДФ, ТХА2, адреналин и др.) и опосредуется фибриногеном, молекулы которого связывают клетки между собой [Покровский, 2007]. Мембрана активированных тромбоцитов содержит разнообразные рецепторные белки, имеющие решающее значение для активации, адгезии и агрегации тромбоцитов [Arrieta-Blanco, 2014]. Из активированных тромбоцитов в кровоток высвобождаются прокоагулянты (фибриноген, фактор VIII), вазоконстрикторы (серотонин, ТХА2) и цитокины (фактор 4 тромбоцитов), активирующие другие клетки крови и эндотелиоциты. Наконец, на плазматической мембране активированных тромбоцитов экспрессируется фосфатидилсерин, образующий матрицу для сборки ферментных комплексов, обеспечивающих свертывание крови [Пантелеев, 2008].

Плазменный гемостаз - это и есть свертывание крови в узком смысле этого термина, в результате чего образуется желеобразный фибриновый сгусток, закупоривающий повреждение и предотвращающий потерю крови [Атауллаханов, 2015]. Ввиду исключительной важности и сложности, система свертывания крови рассмотрена ниже отдельно.

1.1.2 Плазменный гемостаз: свертывание крови

Свертывание крови представляет собой сложную сеть ферментативных

реакций, основу которой представляет совокупность белков (факторов свертывания), образующих каскад ферментативных реакций [Smith, 2015] (рисунок 1), в которых продукт предыдущей реакции является катализатором последующей. Инициация, т. е. запуск, реакций гемокоагуляции, может осуществляться двумя путями, «внутренним» и «внешним».

Рисунок 1 - Схема свертывания крови

Внутренний путь свертывания крови (контактный) начинается с того, что кровь соприкасается с отрицательно заряженной поверхностью, искусственной (стекло) или натуральной (полифосфат, сульфатированные гликозаминогликаны), в результате чего происходит «контактная» конформационная активация фактора XII (фактора Хагемана) и он приобретает протеолитическую активность (фактор XIIa) [Silverberg, 1980]. Затем

последовательно активируются факторы XI в XIa, IX в IXa, VIII в VIIIa и X в

2+

Xa при участии ионов Са и фосфолипидов тромбоцитарной мембраны.

Свертывание крови по внутреннему пути in vitro занимает 10-15 минут [Галяутдинов, 2013]. Физиологическая роль этого пути до конца не изучена, однако именно этот механизм играет существенную роль в патологии,

способствуя тромбообразованию на искусственных чужеродных поверхностях (стенты, катетеры, имплантаты) [Атауллаханов, 2015].

Наиболее (пато)физиологически значимым является активация свертывания крови по внешнему пути (путь тканевого фактора) [Smith, 2015], в котором активация ферментативного каскада осуществляется вследствие повреждения или активации клеток крови и сосудистого эндотелия, экспрессирующих тканевой фактор (TF). TF (фактор III) - это трансмембранный гликопротеин, который инициирует свертывание крови посредством взаимодействия с плазменным фактором VII, находящимся в активной форме (VIIa). Комплекс TF и фактора VIIa расположен на поверхности клеток, поскольку TF является интегральным мембранным белком [Smith, 2015]. Свободный фактор VIIa сам по себе обладает низкой ферментативной активностью, но в комплексе с TF служит мощным активатором коагуляции. Связанный с мембранными фосфолипидами компле^ TF и фактора VIIa при участии ионов Са2+ катализирует переход неактивного фактора X в активную форму Xa. Свертывание крови по внешнему путь является ускоренным, «аварийным», и занимает in vitro менее 15 секунд [Галяутдинов, 2013].

С момента образования фактора Xa дальнейшие реакции образуют общий путь гемокоагуляции, который включает образование тромбина и фибрина.

Превращение неактивного протромбина в тромбин происходит под действием фактора Xa при участии фактора Va, фосфолипидов и ионов

Ca2+.

Тромбин является ключевым ферментом свертывания крови, он принадлежит к классу сериновых протеаз, которые способны расщеплять пептидные связи [Долгов, 2005]. Тромбин синтезируется в печени в виде неактивного предшественника протромбина, витамин К-зависимого белка, который циркулирует в плазме крови. Активация протромбина в тромбин происходит протеолитически под действием фактора Xa и некоторых змеиных ядов [Атауллаханов, 2015].

После активации тромбин превращает фибриноген в фибрин. Мономеры фибрина полимеризуются, образуя нерастворимый фибриновый сгусток.

Параллельно с образованием фибрина под действием тромбина в присутствии

2_|_

ионов Са происходит активация фактора XIII с образованием фактора XШa, который представляет собой фермент трансглутаминазу. Он катализирует ковалентную стабилизацию фибрина с образованием «поперечно-сшитого» фибринового сгустка, обладающего механической прочностью и химической устойчивостью, которые необходимы для эффективной остановки кровотечения. Трехмерная сеть, образованная полимером фибрина, имеет большие поры, заполненные жидкостью, т. к. массовая доля фибрина в плазменном сгустке не превышает 0,4% [Литвинов, 2014].

1.1.3 Образование, строение и свойства фибрина

Фибриноген - это белок плазмы крови, одной из главных функций которого является превращение в фибрин, конечный продукт свертывания крови. Плазма крови человека в норме содержит от 1,5 г/л до 3,5 г/л фибриногена [Wolberg, 2007]. Концентрация фибриногена в крови является одним из важных условий, которое определяет склонность к кровоточивости (гипофибриногенемия) или тромбозу (гиперфибриногенемия). Афибриногенемия — это генетический дефект, характеризующийся отсутствием фибриногена и сопровождающийся кровоточивостью. Фибриноген относится к белкам «острой фазы», уровень которых в крови повышается при обширном воспалении [Litvinov, 2016].

Превращение фибриногена в фибрин происходит в 3 стадии:

1. Тромбин отщепляет от фибриногена две пары фибринопептидов А и В, образуя при этом реактивный фибрин-мономер.

2. На второй стадии фибрин-мономер вступает в реакцию спонтанной самосборки, образуя растворимые олигомеры фибрина. Эти олигомеры известны также под названием растворимых комплексов фибрин-мономера (РКФМ), а их обнаружение в крови указывает на внутрисосудистую активацию

свертывания крови и угрозу тромбоза. Олигомеры удлиняются, образуя протофибриллы, которые способны к латеральной агрегации, т. е. связыванию друг с другом «бок-в-бок» [Weisel, 2013].

Рисунок 2 - Схема образования фибрина. [Литвинов, 2014]

3. Дальнейшая самосборка протофибрилл ведет к их полимеризации в волокна и формированию нерастворимого сгустка, называемого фибрином. Удлинение и утолщение фибриновых волокон сопровождается их ветвлением, которое необходимо для получения трехмерной сети [Aleman, 2014] (рисунок 2).

Во время и после полимеризации фибрин ковалентно сшивается фактором XIIIa, который по механизму действия является трансглутаминазой и катализирует образование ковалентной связи между s-аминогруппой лизина (Лиз) и у-аминоацильной группой глутамина (Глн) с выделением аммиака (рисунок 3). Эта связь образуется между соседними молекулами мономеров фибрина через остатки Лиз и Глн, принадлежащих к разным полипептидным у

и а цепям, которые образуют у-у димеры и а-полимеры. Образование у-у димеров и а-полимеров указывает на то, что процесс полимеризации стал необратимым и что стабилизированный фибриновый сгусток стал механически прочным и устойчивым к ферментативному лизису [Weisel, 2013].

Рисунок 3 - Реакция образования ковалентной изопептидной связи, катализируемая фактором XIIIa.

1.1.4 Физиологические антикоагулянты

Установлено, что при свертывании 1 мл крови образуется тромбин в количестве, достаточном для коагуляции всего фибриногена в 3 л крови. Этого фатального эффекта в организме не происходит, благодаря действию противосвертывающих (антикоагулянтных) механизмов, как клеточных, так и гуморальных, которые предотвращают неконтролируемую активацию факторов гемокоагуляции. Среди физиологических антикоагулянтов особо важную роль играют плазменные белки антитромбин III (ATIII), протеин С, протеин S и ингибитор пути тканевого фактора (TFPI). Они инактивируют свои мишени или путем протеолитического разрушения, или благодаря блокировке активного сайта [Атауллаханов, 2015].

При появлении в кровотоке тромбина на поверхности эндотелиальных клеток образуется комплекс тромбин-тромбомодулин, который при участии протеина S активирует протеин С - сериновую протеазу, расщепляющую

факторы Va и VIIIa, что резко тормозит образование тромбина. Врожденная недостаточность протеина С является одной из причин предрасположенности к тромбозу - тромбофилии [Зубаиров, 2000].

ATIII — это белок плазмы крови, который является разновидностью серпинов (ингибиторов сериновых протеаз). ATIII прежде всего ингибирует тромбин и фактор Xa, хотя он также принимает участие в ингибировании факторов IXa, XIa и XIIa [Osunkalu, 2015]. ATIII циркулирует в крови в форме, проявляющей низкую ингибиторную активность, но в присутствии сульфатированных гликозаминогликанов, например, гепарина, увеличивает свою антитромбиновую активность в 1000-5000 раз [Зубаиров, 2000]. Именно на образовании комплекса с ATIII основан антикоагулянтный эффект гепарина - широко применяемого в клинике антикоагулянта. Образование факторов VIIa и Xa при участии тканевого фактора тормозится белком, который называется «ингибитор пути тканевого фактора» (tissue factor pathway inhibitor - TFPI). Около 50-80% общего количества TFPI связано с эндотелиальными клетками, переходя в циркуляцию после инъекции гепарина [Зубаиров, 2000].

Физиологические антикоагулянты препятствуют избыточной активации свертывания крови, тем самым предотвращая образование или сдерживая рост тромбов. Несостоятельность антикоагулянтных механизмов может привести к тромбозу и диффузному фибринообразованию с нарушением гемоциркуляции и последующей дисфункцией органов и тканей.

1.1.5 Фибринолиз

Если в кровеносном сосуде образовался небольшой сгусток, то он обычно растворяется под действием фибринолитической системы. Фибринолиз, или растворение сгустка крови, - это процесс протеолитического расщепления фибрина, направленный на растворение сгустков или тромбов и восстановление нарушенного кровотока. Фибринолиз также важен для заживления ран, воспаления и других внесосудистых процессов, которые сопровождаются отложением фибрина.

Основной фермент системы фибринолиза - плазмин, который непосредственно расщепляет фибриновые волокна. Будучи сериновой протеазой, плазмин формируется из неактивного предшественника, плазминогена, под действием двух активаторов: тканевого активатора плазминогена (t-PA) и активатора плазминогена урокиназного типа (u-PA). Превращение плазминогена в плазмин происходит преимущественно на поверхности фибриновых волокон, после чего образовавшийся плазмин расщепляет фибрин. Прикрепление плазминогена и t-PA к фибриновому сгустку опосредуется свободными С-концевыми остатками лизина на частично расщепленном фибрине, а также специфическими лизин-связывающими участками в молекулах плазминогена и t-PA. Большая часть активного плазмина образуется на фибрине после формирования тройного комплекса фибрин/t-PA/плазминоген. Поскольку плазмин расщепляет в фибрине пептидные связи, образованные остатками лизина, то в процессе фибринолиза образуются новые С-концевые остатки лизина, которые служат для связывания дополнительных молекул плазминогена и t-PA, тем самым ускоряя и усиливая процесс образования плазмина и расщепления фибрина по механизму положительной обратной связи. В результате вся полимерная фибриновая сеть распадается до растворимых фрагментов фибрина, которые выводятся из кровотока [Литвинов, 2013]. Кроме фибринолитической активности, плазмин используется в процессах, требующих миграции клеток, таких как воспаление, метастазирование, ремоделирование тканей, включая ангиогенез, рост аксонов нервных клеток и заживление ран [Зубаиров, 2000].

Наряду с фибринолитиками, есть вещества, которые прямо или косвенно ослабляют действие фибринолитических ферментов; это, как правило, ингибирование плазмина а2-антиплазмином и ингибирование t-PA и u-PA. Ключевыми ингибиторами фибринолиза являются ингибитор активатора плазминогена 1 (plasminogen activator inhibitor, PAI-1) и ингибитор активатора плазминогена 2 (PAI-2) [Dubis, 2014]. Концентрация PAI-1 в плазме составляет всего 0,4 нМ, но в богатых тромбоцитами сгустках локальная концентрация

может быть высокой, поскольку он синтезируется в тромбоцитах и накапливается в зоне повреждения тканей, предотвращая преждевременное рассасывание свежего гемостатического сгустка [Литвинов, 2013].

Относительно недавно обнаружен активируемый тромбином ингибитор фибринолиза (thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor, TAFI), который синтезируется в печени и секретируется в кровоток [Bouma, 2006]. TAFI активируется тромбином, причем наиболее эффективная активация происходит, когда тромбин находится в комплексе с тромбомодулином [Bajzar, 1996]. Кроме того, есть данные о том, что плазмин также участвует в активации TAFI и инактивации TAFIa [Marx, 2002; Longstaff, 2018]. Концентрации TAFI в плазме крови здоровых людей составляет 70-100 нМ и увеличивается с возрастом [Akatsu, 2007]. TAFIa - это карбоксипептидаза, которая участвует в стабилизации сгустка и защищает его от лизиса, отщепляя от фибрина С-концевые остатки лизина и таким образом предупреждая связывание плазминогена и t-PA с фибрином [Dubis, 2014].

Антифибринолитик а2-антиплазмин - серпин, являющийся прямым ингибитором плазмина. Некоторую роль в подавлении фибринолитической системы играет а2-макроглобулин, который при определенных условиях, связывается с растворенным в крови молекулами плазмина и активаторов плазминогена, снижая их активность [Литвинов, 2013].

1.2 Тромбоциты в норме и при патологии

Тромбоциты - это мелкие безъядерные клетки крови размером 2-4 мкм, имеющие объем 3-10 фл и образующиеся в костном мозге из мегакариоцитов. Главной функцией тромбоцитов считается участие в реакциях гемостаза; кроме того, они играют роль в ангиогенезе и врожденном иммунитете. Их нормальное содержание в крови - от 150x10% до 450x10% [Semple, 2011; Lam, 2015]. Пониженное содержание тромбоцитов в крови - тромбоцитопения, повышенное - тромбоцитоз, дисфункция тромбоцитов - тромбоцитопатия [Krishnegowda, 2015].

1.2.1 Образование, строение и функции тромбоцитов

Тромбоциты образуются путем фрагментации мегакариоцитов в костном мозге, откуда тромбоциты поступают в кровоток [Dhurat, 2014; Lam, 2015]. Каждый мегакариоцит может продуцировать от 5000 до 10000 тромбоцитов [Ghoshal, 2014]. Поскольку время жизни тромбоцита составляет всего 7-11 дней, мегакариоцитам, чтобы поддерживать нормальное содержание тромбоцитов в крови, необходимо синтезировать около 100 миллиардов новых тромбоцитов ежедневно [Semple, 2011]. Приблизительно 2/3 тромбоцитов циркулируют в крови, а 1/3 депонируется в селезенке. Старые тромбоциты поглощаются и разрушаются макрофагами селезенки и печени [Ghoshal, 2014].

В покоящемся состоянии тромбоциты имеют дисковидную форму, которая поддерживается спектрином, а также кольцом из тубулиновых микротрубочек, расположенных в плазматической мембране и образующих мембранный цитоскелет. В плазматической мембране находятся различные белки, включая мембранные рецепторы для растворимых агонистов, адгезивные интегриновые и неинтегриновые рецепторы. В цитоплазме тромбоцитов имеются открытая канальцевая система (open canalicular system, OCS) и сеть с закрытыми каналами эндоплазматического ретикулума, образующая плотную тубулярную систему (dens tubular system, DTS). Органеллы представлены секреторными гранулами, пероксисомами, лизосомами, митохондриями и гранулами гликогена, которые расположены в цитозоле [Gundu, 1999] (рисунок 4).

Плазматическая мембрана тромбоцитов состоит из фосфолипидного бислоя, который содержит липидные рафты, гликолипиды и гликопротеины. Мембрана является местом экспрессии различных поверхностных рецепторов, таких как CD9, CD36, CD63, GPCR и интегрины аПЬрЗ, av03, a2p1, которые передают химические сигналы снаружи внутрь клетки. Некоторые поверхностные рецепторы опосредуют высвобождение a-гранул, которые играют важную роль в многочисленных функциях тромбоцитов [Ghoshal, 2014].

Рисунок 4 - Схема образования и строения тромбоцита [Zapata, 2014].

Асимметрично расположенные отрицательно заряженные мембранные фосфолипиды, например, фосфатидилсерин, присутствующие во внутреннем листке плазматической мембраны, сохраняют стабильность тромбоцита в состоянии функционального покоя [Ghoshal, 2014]. Фосфолипидная асимметрия поддерживается АТФ-зависимыми аминофосфолипидными транслоказами (флиппазами), которые активно перемещают отрицательно заряженные фосфолипиды с внешнего на внутренний слой мембраны [Thon, 2012].

Открытая каналъцевая система (OCS) является «туннельной» системой, которая связана с плазматической мембраной и заполняет всю клетку. Основная роль OCS заключается в том, чтобы транспортировать вещества извне в тромбоциты, а также высвобождать содержимое гранул во внешнюю среду. Кроме того, OCS представляет собой обширный внутренний мембранный резервуар, который может способствовать образованию и распространению филлоподий после адгезии тромбоцитов, и является местом хранения гликопротеинов плазматической мембраны.

Плотная тубулярная система (DTS) представляет собой замкнутую сеть каналов эндоплазматического ретикулума. В основном DTS участвует в регуляции уровня внутриклеточного ионизированного кальция с помощью реакций, связанных с активацией G-белкового рецептора, активируемого протеазой (protease-activated receptor, PAR-1) [Ghoshal, 2014]. Высвобождение внутриклеточного кальция из DTS приводит к перераспределению aIIbß3 на поверхность тромбоцита, реорганизации цитоскелета и высвобождению содержимого гранул. Это делает регуляцию внутриклеточных запасов кальция в DTS важной потенциальной мишенью для препаратов, модулирующих функцию тромбоцитов [Thon, 2012].

Цитоскелет тромбоцитов позволяет поддерживать дисковидную структуру неактивных клеток. Он состоит из трех основных компонентов: мембранного скелета на основе спектрина, актина и «кольцевой полосы» микротрубочек [Ghoshal, 2014]. Мембранный цитоскелет на основе спектрина состоит из нитей спектрина, которые связываются посредством актиновых филаментов, создавая треугольные поры [Thon, 2012].

Актин является наиболее распространённым белком в тромбоцитах, в покоящихся клетках более 40% актиновых субъединиц собираются в 2000-5000 линейных филаментов. Остальная часть актина в цитоплазме сохраняется в виде комплекса 1:1 с ß4-тимозином и превращается в филаменты во время активации тромбоцитов [Thon, 2012].

Одной из отличительных особенностей покоящихся тромбоцитов является связанная с плазматической мембраной «кольцевая полоса» микротрубочек. Субъединицы aß-тубулина находятся в динамическом равновесии с микротрубочками, так что наблюдаются циклы сборки-разборки микротрубочек. Основной функцией микротрубочек является поддержание формы диска покоящегося тромбоцита. Охлаждение тромбоцитов до 4°C вызывает деполимеризацию спирали микротрубочек и потерю формы диска [White, 1968]. Кроме того, у трансгенных мышей, у которых отсутствует важная для гемопоэза изоформа ß-тубулина (ß1 тубулин), есть тромбоциты, которые не

имеют характерной формы диска и содержат дефектные мембранные спирали [Schwer, 2001].

Клеточные органеллы, присутствующие в цитоплазме тромбоцитов, подразделяются на три основных типа: а-гранулы, плотные гранулы (5-гранулы) и лизосомы. а-Гранулы являются самыми крупными (200-500 нм) и наиболее многочисленными (~40-80 на клетку), имеют сферическую форму с темным центральным ядром [Heijnen, 2015]. Их содержимое включает белки, поддерживающие адгезию и агрегацию тромбоцитов, которые необходимы для гемостаза и тромбоза. а-Гранулы содержат такие белки, как vWF, фактор V, фактор VIII, адгезивные белки (фибриноген, P-селектин, тромбоспондин, фибронектин, витронектин), и рецепторы клеточной адгезии, такие как интегрины aIIbß3 и avß3 [Blair, 2009]. Внешняя мембрана а-гранул содержит P-селектин и интегрин аПbß3. На периферии гранул находятся канальцы (до 20 нм), содержащие мультимеры vWF. а-Гранулы содержат более 30 регуляторных белков ангиогенеза, которые позволяют тромбоцитам функционировать в качестве регуляторов роста новых кровеносных сосудов [Folkman, 2001]. Совокупность экспериментальных данных позволяет предположить, что определенные классы белков могут быть отдельно упакованы внутри а-гранул тромбоцитов, обеспечивая механизм дифференциального, не одновременного высвобождения белков [Italiam, 2008].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Пешкова Алина Дмитриевна, 2020 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Атауллаханов, Ф.И. Применение теста тромбодинамики для оценки состояния системы гемостаза / Ф.И. Атауллаханов, А.Н. Баландина, Д.М. Варданян, Ф.Ю. Верхоломова, Т.А. Вуймо, С.С. Карамзин и другие; под ред. А.М. Шулутко. - М: Первый Московский государственный медицинский университет, 2015 - 72 с.

2. Галяутдинов, Г.С. Геморрагические диатезы: междисциплинарные аспекты клиники, диагностики и лечения / Г.С. Галяутдинов - Казань: Казанский государственный медицинский университет, 2013 - 220 с.

3. Долгов, В.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза / В.В. Долгов, П.В. Свирин. - Тверь: Триада, 2005 - 227 с.

4. Зубаиров, Д.М. Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования / Д.М. Зубаиров. - Казань: Фэн, 2000 - 364 с.

5. Ланг, Т. Основы описания статистического анализа в статьях, публикуемых в биомедицинских журналах. Руководство «Статистический анализ и методы в публикуемой литературе (САМПЛ)». Медицинские технологии. / Т. Ланг, Д. Альтман // Оценка и выбор. - 2014. - V.1(15). - C.11-16. [Lang, T. Basic Statistical reporting for articles published in clinical médical journals: the SAMPL Guidelines. In: Smart P., Maisonneuve H., Polderman A. (eds). / T. Lang, D. Altman // Science Editors' Handbook, European Association of Science Editors. - 2013].

6. Литвинов, Р.И. 9^2 уроков по биохимии свертывания крови: Учебно-практическое руководство / Р.И. Литвинов. - Казань: КФУ, 2014. - 128 с.

7. Литвинов, Р.И. Молекулярные механизмы и клиническое значение фибринолиза / Р.И. Литвинов // Казанский медицинский журнал. - 2013. -T.94(5). - C.711-718.

8. Литвинов, Р.И. Современные ингибиторы тромбоцитов / Р.И. Литвинов // Казанский медицинский журнал. - 2004. - T.85(2). - C. 125-134.

9. Пантелеев, М.А. Свертывание крови: биохимические основы / М.А. Пантелеев, Ф.И. Атауллаханов // Клиническая онкогематология. - 2008. -Т.1(1). - С.50-62.

10. Покровский, В.М. Физиология человека / В.М. Покровский, Г.Ф. Коротько. - М.:Медицина. - 2007. - 656 с.

11. Тарковская, Л.Р. Изучение ретрактильной активности тромбоцитов у здоровых людей и у больных с нарушениями гемостаза. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 14.00.29. - Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии, Санкт-Петербург, 2001 - 127 с.

12. Филлипова, О.И. Методы исследования функциональной активности тромбоцитов / О.И. Филиппова, А.А. Колосков, А.А. Столица // Трансфузиология. - 2012. - Т.13. - С.493-514.

13. Шатурный, В.И. Активаторы, рецепторы и пути внутриклеточной сигнализации в тромбоцитах крови / В.И. Шатурный, С.С. Шахиджанов, А.Н. Свешникова, М.А. Пантелеев // Биомедицинская химия. - 2014. - Т.60(2). -С.182-200.

14. Akatsu, H. Plasma levels of unactivated thrombin activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) are down-regulated in young adult women: analysis of a normal Japanese population / H. Akatsu, M. Ishiguro, Ogawa N., T. Kanesaka, N. Okada, T. Yamamoto et.al. // Microbiol Immunol. - 2007. - V. 51(5). - P. 507-517.

15. Aleman, M.M. Fibrinogen and red blood cells in venous thrombosis / M.M. Aleman, B.L. Walton, J.R. Byrnes, A.S. Wolberg // Thromb Res. - 2014. -V.133(1). - P.S38-S40.

16. Andrews, R.K. Glycoprotein Ib-IX-V / R.K. Andrews, E.E. Gardiner, Y. Shen, J.C. Whisstock, M.C. Berndt // Int J Biochem Cell Biol. - 2003. - V.35(8). - P. 1170-1174.

17. Arrieta-Blanco, J.J. Inherited, congenital and acquired disorders by hemostasis (vascular, platelet & plasmatic phases) with repercussions in the therapeutic oral sphere / J.J. Arrieta-Blanco, R. Onate-Sanchez, F. Martinez-Lopez,

D. Oñate-Cabrerizo, M.C. Cabrerizo-Merino // Med Oral Patol Oral Cir Bucal. -2014. - V.19(3). - P.e280-e288.

18. Ashorobi, D. Thrombosis / D. Ashorobi, R. Femandez // StatPearls [Internet] - 2019.

19. Bajzar, L. TAFI, or plasma procarboxypeptidase B, couples the coagulation and fibrinolytic cascades through the thrombin-thrombomodulin complex / L. Baizar, J. Morser, M. Nesheim // J Biol Chem. - 1996. - V. 271(28). - P.16603-16608.

20. Baskurt, O.K. Patrogenic hyperviscosity and thrombosis / O.K. Baskurt, H.J. Meiselman // Semin Thromb Hemost. - 2012. - V.38(8). - P.854-64.

21. Blair, P. Platelet a-granules: Basic biology and clinical correlates / Blair P., Flaumenhaft R. // Blood Reviews. - 2009. - T. 23(4). - C.177-189.

22. Bledzka, K. Integrin aIIbß3: from discovery to efficacious therapeutic target / K. Bledzka, S.S. Smyth, E.F. Plow //Circ Res. - 2013. - V.112(8). - P.1189-1200.

23. Bodin, S. Integrin-dependent interaction of lipid rafts with the actin cytoskeleton in activated human platelets / S. Bodin, C. Soulet, H. Thonchere, P. Sie, C. Gachet, M. Plantavid, B. Payrastre // J Cell Sci. - 2005. - V.118(4). - P.759-769.

24. Bouma, B.N. Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) - how does thrombin regulate fibrinolysis? / B.N. Bouma, L.O. Mosnier // Ann Med. -2006. - V.38(6). - P.378-388.

25. Brass, L.F. Regulating thrombus growth and stability to achieve an optimal response to injury / L.F. Brass, K.M. Wannemacher, P. Ma, T.J. Stalker // J Thromb Haemost. - 2011. - V.9(1). - P. 66-75.

26. Broos, K. Platelets at work in primary hemostasis / K. Broos, H.B. Feys, F.D. Meyer, K. Vanhoorelbeke, H. Deckmyn // Blood Rev. - 2011. - V.25(4). -P.155-167.

27. Byrnes, J.R. Newly-recognized roles of factor XIII in thrombosis / J.R. Brynes, A.S. Wolberg // Semin Thromb Hemost. - 2017. - V.42(4). - P. 445-454.

28. Candia, E. De Mechanisms of platelet activation by thrombin: A short history / Candia E. De // Thromb Res. - 2012. - V.129(3). - P.250-256.

29. Carr, M.E. Development of platelets contractile force as a research and clinical measure of platelet function / M.E. Carr // Cell Biochem Biophys. - 2003. -V.38(1). - P.55-78.

30. Carr, M.E. Measurement of platelet force: the Hemodyne® hemostatic analyzer / M.E. Carr // Clin Lab Manag Rev. - 1995. - V.9(4). - P. 312-320.

31. Cines, D.B. Clot contraction: compression of erythrocytes into tightly packed polyhedra and redistribution of platelets and fibrin / D.B. Cines, T. Lebedeva, C. Nagaswami, V. Hayes, W. Massefski, R.I. Litvinov et al. // Blood. - 2014. -V.123(10). - P.1596-1603.

32. Claessens, M.M. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles / M.M. Claessens, C. Semmrich, L. Ramos, A.R. Bausch // Proc Natl Acad Sci USA. -2008. - V.105(26). - P. 8819-8822.

33. Clauser, S. Role of platelet electron microscopy in the diagnosis of platelet disorders / S. Clauser, E. Cramer-Border // Semin Thromb Hemost. - 2009. -V.35(2). - P.213-223.

34. Connolly, G.C. Platelets and cancer-associated thrombosis / G.C. Connolly, R.P. Phipps, C.W. Francis // Seminars Oncol. - 2014. - V.41(3). -P.302-310.

35. Cosemans, J.M. Multiple ways to switch platelet integrins on and off / J.M. Cosemans, B.F. Iserbyt, H. Deckmyn, J.W. Heemskerk // J Thromb Haemost. -2008. - V.6(8). - P.1253-1261.

36. Coxon, C.H. ITIM receptors: more than just inhibitors of platelet activation / C.H. Coxon, M.J. Greer, Y.A. Senis // Blood. - 2017. - V.129(26). -P.3407-3418.

37. Dhurat R. Principles and methods of preparation of platelet-rich plasma: a review and author's perspective / R. Dhurat, M. S. Sukesh // J Cutan Aesthet Surg. -2014. -V.7(4). - P.189-197.

38. Dickson, B.C. Virchow's triad. / B.C. Dickson // Br J Haematol. - 2009.

- V.145(3). - P.433.

39. Dubis, J. Activity of thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor in the plasma of patients with abdominal aortic aneurysm / J. Dubis, N. Zuk, R. Grendziak, N. Zapotoczny, M. Pfanhauser, W. Witkiewicz // Blood Coagul Fibrinolysis. - 2014.

- V.25(3). - P.226-231.

40. Duss, S.B. The role of sleep in recovery following ischemic stroke: A review of human and animal data / S.B. Duss, A. Seiler, M.H. Schmidt, M. Pace, A. Adamantidis, R.M. Muri, C.L. Bassetti // Neurobiol Sleep Circadian Rhythms. -2016. - V.2. - P.94-105.

41. Eilertsen, K. E. Tissue factor: (patho)physiology and cellular biology / K. E. Eilertsen, M. Osterud // Blood Coagul Fibrinolysis. - 2004. - V.15(7). - P.521-538.

42. Erhardt, J.A. P2X1 stimulation promotes thrombin receptor-mediated platelet aggregation / J.A. Erhardt, J.R. Toomey, S.A. Douglas, D.G Johns // Thromb Haemost. - 2006. - V.4(4). - P.882-890.

43. Farndale, R.W. Collagen-platelet interaction: recognition and signaling / R.W. Farndale, P.R. Siljander, D.J, Onley, P. Sundaresan, C.G. Knight, M.J. Barnes // Biochem Soc Symp. - 2003. - V.70. - P.81-94.

44. Feghhi, S. Nonmuscle Myosin IIA Regulates Platelet Contractile Forces Through Rho Kinase and Myosin Light-Chain Kinase / S. Feghhi, W.W. Tooley, N.J. Sniadecki // J Biomech Eng. - 2016. - V.138(10). - P.104506.

45. Folkman, J. Angiogenesis research: guidelines for translation to clinical application. / J. Folkman, T. Browder, J. Palmblad // Thromb Haemost. - 2001. -V.86(1). - P.23-33.

46. Fox, J.E. Actin filament content and organization in unstimulated platelets / J.E. Fox, J.K. Boyles, C.C. Reynolds, D.R. Phillips // J Cell Biol. - 1984. -V.98(6). - P.1985-1991.

47. Fujimura, K. Calcium cation regulation of glycoprotein IIb-IIIa complex formation in platelet plasma proteins / K. Fujimura, D.R. Phillips // J Biol Chem. - 1983. - V. 258(17). - P.10247-10252.

48. Fung, C.Y A major role for P2X1 receptors in the early collagen-evoked intracellular Ca2+ responses of human platelets / C.Y. Fung, C.A, Brearley, R.W, Farndale, M.P. Mahaut-Smith // Thromb Haemost. - 2005. - V.94(1). - P.37-40.

49. Garraud O. Are platelets cells? And if yes, are they immune cells? / O. Garraud, F. Cognasse // Front Immunol. - 2015. -V.6(70). -P.1-6.

50. Ghasemzadeh, M. Platelet-leukocyte crosstalk: Linking proinflammatory responses to procoagulant state / M. Ghasemzadeh, E. Hosseini // Tromb Res. - 2013. - V.131(3). - P.191-197.

51. Ghoshal K. Overview of Platelet Physiology: Its Hemostatic and Nonhemostatic Role in Disease Pathogenesis / K. Ghoshal, M. Bhattacharyya // ScientificWorldJournal. - 2014. - V.2014. - P.781857.

52. Golebiewska, E.M. Platelet secretion: From haemostasis to wound healing and beyond / E.M. Golebiewska, A.W. Poole // Blood Rev. - 2015. -V.29(3). - P.153-162.

53. Gundu H.R. Handbook of platelet physiology and pharmacology / H.R. Gundu. -London. - Kluwer Academic Publishers, 1999. - 533 P.

54. Hechler, B. A role of the fast ATP-gated P2X1 cation channel in thrombosis of small arteries in vivo / Hechler B., Lenain N., Marchese P., Vial C., Heim V., Freund M. et al. // J Exp Med. - 2003. - V.198(4). - P.661-667.

55. Hechler, B. Purinergic receptor in thrombosis and inflammation / B. Hechler, C. Gachet // Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 2015. - V.35(11). - P.2307-2315.

56. Heijnen, H. Platelet secretory behaviour: as diverse as the granules or not? / Heijnen H., van der Sluijs P. // J Thromb Haemost. - 2015. - V.13(12). -P.2141-2151.

57. Heit, J.A. Epidemiology of venous thromboembolism / J.A. Heit, F.A. Spencer, R.H. White // Nat Rev Cardiol. - 2015. - V.12(8). - P.464-474.

58. Ignatova, A.A. Flow cytometry for pediatric platelets / A.A. Ignatova, E.A. Ponomarenko, D.M. Polokhov, E.V. Suntsova, P.A. Zharkov, D.V. Fedorova // Platelets. - 2019. - V.30(4). - P.428-437.

59. Israels, S.J. Laboratory testing for platelet function disorders / S.J. Israels // Int lab Hematol. - 2015. - V.37(1). - P.18-24.

60. Italiano, J.E. Angiogenesis is regulated by a novel mechanism: pro- and antiangiogenic proteins are organized into separate platelet alpha granules and differentially released / J.E. Italiano, J.K. Richardson, S. Patel-Hett, E. Battinelli, A. Zaslavsky, S. Short, S. Ryeom, J. Folkman, G.L. Klement // Blood. - 2008. -V.111(3). - P.1227-1233.

61. Jagroop, I.A. Plant extracts inhibit ADP-induced platelet activation in humans: their potential therapeutic role as ADP antagonists / I.A. Jagroop // Purinergic. Sigmal. - 2014. - V.10(2). - P.233-242.

62. Jankovic, N. Who guidelines for a healthy diet and mortality from cardiovascular disease in European and American elderly: the chances project / N. Jankovic, A. Geelen, M.T. Streppel, L. Groot, J. Jong, P. Orfanos at el. // Am J Clin Nutr. - 2015. - V.102(4). - P. 745-756.

63. Jin, R.C. Endogenous mechanisms of inhibition of platelet function / R.C. Jin, B. Voetsch, J. Loacalzo // Microcirculation. - 2005. - 12(3). - 247-258.

64. Johnson, G.L. The critical role of myosin IIA in platelet internal contraction / G.L. Johnson, L.A. Leis, M.D. Krumwiede, J.G. White // J Thromb Haemost. - 2007. - V.5(7). - P.1516-1529.

65. Jude, B. Relevance of tissue factor in cardiovascular disease / B. Jude, C. Zawadzki, S. Susen, D. Corseaux // Arch Mal Coeur Vaiss.- 2005. - V.98(6). -P.667-71.

66. Kapoor, S. The role of neutrophils in thrombosis / S. Kapoor, A. Opneja, L. Nayak // Thromb Res. - 2018. - V.170. - P.87-96.

67. Kasahara, K. Clot retraction is mediated by factor XIII-dependent fibrin-aIIbb3-myosin axis in platelet sphingomyelin-rich membrane rafts / K.

Kasahara, M. Kaneda, T. Miki, K. Lida, N. Sekino-Suzike, I. Kawashina // Blood. -2013. - V.122(10). - P.3340-3348.

68. Kasahara, R. Impaired clot retraction in factor Xllla subunit-deficient mice / R. Kasahara, M. Souri, M. Kaneda, T. Miki, N. Yamamoto, A. Ichinose // Blood. - 2010. - V.115(8). - P.1277-1286.

69. Khaddaj, M.R. The vascular endothelium:A regulator of arterial tone and interface for the immune system / M.R. Khaddaj, J.C. Mathew, D.J. Kendrick,

A.P. Braun // Crit Rev Clin Lab Sci. - 2017. - V.54(7-8). - P.458-470.

70. Kim, O.V. Quantitative structural mechanobioligy of blood clot contraction / O.V. Kim, R.I. Litvinov, M. Alber, J.W. Weisel // Nat Comm. - 2017. -V.8(1). - P.1274.

71. Kornfeld, S. The biogenesis of lysosomes / S. Kornfeld, I. Mellman // Annu Rev Cell Biol. - 1989. - V.5. - P.483-525.

72. Koupenova, M. Thrombosis and platelets: an update / M. Koupenova,

B.E. Kehrel, H.A. Corkrey, J.E. Freedman // Eur Heart J. - 2017. - V.38(11). -P.785-791.

73. Krishnegowda, M. Platelet disorders: an overview / M. Krishnegowda, V. Rajashekaraiah // Blood Coagul Fibrinolysis. - 2015. - V.26(5). - P.479-491.

74. Kwaan, H.C. Hyperviscosity in polycythemia vera and other red cell abnormalities / H.C. Kwaan, J. Wang // Semin Thromb Hemost. - 2003. - V.29(5). -P.451-8.

75. Lam F. W. Platelets and Their Interactions with Other Immune Cells / F. W Lam, K.V. Vijayan, R. E. Rumbaut // Compr Physiol. - 2015. - V.5(3). - P.1265-1280.

76. Lam, W.A. Mechanics and contraction dynamics of single platelets and implications for clot stiffening / W.A. Lam, O. Chaudhuri, A. Crow, K.D. Webster, T.D. Li, A. Kita, J. Huang, D.A. Fletcher. // Nat Mater. - 2011. - V.10(1). - P.61-66.

77. Leatham, E. W. Increased monocyte tissue factor expression in coronary disease. / E. W. Leatham, P. M. Bath, J. A. Tooze, A. J. Camm // Br Heart J. - 1995. - V.73. - P.10-13.

78. Leon, C. Megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation dramatically affects hemostasis while preserving platelet aggregation and secretion / C. Leon, A. Eckly, B. Hechler, B. Aleil, M. Freund, C. Ravanat, et al. // Blood. - 2007. -V.110(9). - P.3183-3191.

79. Libby, P. Inflammation and thrombosis: the clot thickens / P. Libby, D. I. Simon // Circulation. - 2001. - V.103(13). - P.1718-1720.

80. Lind, S.E. Human platelets contain gelsolin. A regulator of actin filament length / S.E. Lind, H.L. Yin, T.P. Stossel // J Clin Invest. - 1982. - 69(6). -P.1384-1387.

81. Lippi, G. Venous and Arterial Thromboses: Two Sides of the Same Coin? / G. Lippi, E.J. Favaloro // Semin Thromb Hemost. - 2018. - 44 (3). -P.239-248.

82. Litvinov, R.I. What is the biological and clinical relevance of fibrin? / Litvinov R.I., Weisel J.W. // Semin Thromb Hemost. - 2016 - V. 42(4). - P.333-343.

83. Longstaff, C. Measuring fibrinolysis: from research to routine diagnostic assays. / C. Longstaff // J Thromb Haemost. - 2018. - V.16(4). - P.652-662.

84. Mackman, N. Triggers, targets and treatments for thrombosis / N. Mackman // Nature. - 2008. - V.451(7181). - P.914-918.

85. Mahaut-Smith, M.P. The P2X1 receptor and platelet function / M.P. Mahaut-Smith, S. Jones, R.J. Evans // Purinergic Signal. - 2011. - 7(3). - P.341-356.

86. Marder, V.J. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke / V.J. Marder, D.J. Chute, S. Starkman, A.M. Abolian, C. Kidwell, D. Liebeskind et. al. // Stroke. - 2006. - V.37(8). - P.2086-2093.

87. Marx, P.F. Plasmin-mediated activation and inactivation of thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor. / P.F. Marx, P.E. Dawson, B.N. Bouma, J.C. Meijers // Biochemistry. - 2002. - V.41(21). - P.6688-6696.

88. Mattheij, N.J. Dual mechanism of integrin aIIbp3 closure in procoagulant platelets // N.J. Mattheij, K. Gilio, R. van Kruchten, S.M. Jobe, A.J.

Wieschhaus, A.H. Chishti et al. // J Biol Chem. - 2013 - V.288(19). - P.13325-13336.

89. Montague, S.J. Mechanisms of receptor shedding in platelets / S.J. Montague, R.K. Andrews, E.E. Gardiner // Blood. - 2018. -V.132(24). - P.2535-2545.

90. Muthard, R.W. Blood clots are rapidly assembled hemodynamic sensors: flow arrest triggers intraluminal thrombus contraction / R.W. Muthard, S.L. Diamond // Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 2012. - V.32(12). - P.2938-2945.

91. Neve, B.P. PPARa agonists inhibit tissue factor expression in human monocytes and macrophages / B.P. Neve, D. Corseaux, G. Chinetti, C. Zawadzki, J.C. Fruchart, P. Duriez, B. Staels, B. Jude // Circulation. - 2001. - V.103(2). -P.207-212.

92. Nieswandt, B. Platelet-collagen interaction: is GPVI the central receptor? / B. Nieswandt, S.P. Watson // Blood. - 2003. - V.102(2). - P. 449-461.

93. Osunkalu, V.O. Antithrombin III: Plasma activity and reference range among Nigerian blood donors / V.O. Osunkalu, O.O. Kanu, F. Ngwuli // Niger Postgrad Med J. - 2015. - V.22(4). - P.209-221.

94. Panteleev, M.A. Global/integral assays in hemostasis diagnostics: promises, successes, problems and prospects / M.A. Panteleev, H.C. Hemker // Thromb J. - 2015. - V.13(1). - P.e5.

95. Podolnikova, N.P. The interaction of integrin aIIbß3 with fibrin occurs through multiple binding sites in the aIIb ß-propeller domain / N.P. Podolnikova, S. Yakovlev, V.P. Yakubenko, X. Wang, O.V. Gorkun, T.P. Ugarova // J Biol Chem. -2014. - V.289(4). - P.2371-2383.

96. Peters, C.G. Granule exocytosis is required for platelet spreading: Differential sorting of alpha-granules expressing VAMP-7 / Peters C.G., Michelson A.D., Flaumenhaft R. // Blood. - 2012. - V.120(1) - P.199-206.

97. Previtali, E. Risk factors for venous and arterial thrombosis / Previtali E, Bucciarelli P, Passamonti SM, Martinelli I. // Blood Transfus. - 2011. - V.9(2). -P.120-138.

98. Purrucker, J.C. Serum protein S100P is a diagnostic biomarker for distinguishing posterior circulation stroke from vertigo of nonvascular causes / J.C. Purrucker, O. Herrmann, J.K. Lutsch, M. Zorn, M. Schwaninger, T. Bruckner, G.U. Auffarth, R. Veltkamp // Eur Neurol. - 2014 - V.72(5-6). - P.278-84.

99. Quadras, A.S. Red versus white thrombi in patients with ST-elevation myocardial infarction undergoing primary percutaneous coronary intervention: Clinical and angiographic outcomes / A.S. Quadras, E. Cambruzzi, J. Sebben [et al.] // Am. Heart. J. - 2012. - V.164(4). - P.553-560

100. Ramaiola, I. Changes in thrombus composition and profilin-1 release in acute myocardial infarction / I. Ramaiola, T. Padro, E. Pena, O. Juan-Babot, J. Cubedo, V. Martin-Yuste et al. // Eur Heart J. - 2015. - V.36(16). - P.965-975.

101. Reid, T.J. A method for the quantitative assessment of platelet-induced clot retraction and clot strength in fresh and stored platelets/ T.J. Reid, R. Snider, K. Hartman, P.E. Greilich, M.E. Carr, BM. Alving // Vox Sang. - 1998. - V.75(4). -P.270-277.

102. Rendu, F. The platelet release reaction: granules' constituents, secretion and functions / Rendu F., Brohard-Bohn B. // Platelets. - 2001. - V.12(5). - P.261-273.

103. Rooney, M.M. Dissecting clot retraction and platelet aggregation clot retraction does not require an intact fibrinogen y chain c terminus / M.M. Rooney, L.V. Parise, S.T. Lord // J Biol Chem. - 1996. - V.271(15). - P.8553-8555.

104. Ruggeri, Z.M. The role of von Willebrand factor in thrombus formation / Z.M. Ruggeri // Thromb Res. - 2007. - V.120(1). - P.S5-S9.

105. Sadowski, M. Coronary thrombus composition: links with inflammation, platelet and endothelial markers / M. Sadowski, M. Z^bczyk, A. Undas // Atherosclerosis - 2014. - V.237(2). - P.555-561.

106. Schellong, S.M. Isolated distal deep vein thrombosis: perspectives from the GARFIELD-VTE registry / S.M. Schellong, S.Z. Goldhaber, J.I. Weitz, W. Ageno, H. Bounameaux, A.G. Turpie et al. // Thromb Haemost. -2019. - V.19(10). -P.1657-1685.

107. Schwer, H.D. A lineage-restricted and divergent beta-tubulin isoform is essential for the biogenesis, structure and function of blood platelets / H.D. Schwer, P. Lecine, S. Tiwari, J.E. Italiano J.H. Hartwig, R.A. Shivdasani // Curr Biol. - 2001. - V.11(8). - P.579-586.

108. Semple, J. W. Platelets and the immune continuum / J. W. Semple, J. E. Italian, J. Freedman // Nat Rev Immunol. - 2011. -V.11(4). - P. 264-274.

109. Silvain, J. Composition of coronary thrombus in acute myocardial infarction / J Silvain, J.P. Collet, C. Nagaswami, F. Beygui, K.E. Edmondson, A. Bellemain-Appaix et al. // J Am Coll Cardiol. - 2011. - V.57(12). - P.1359-1367.

110. Silverberg, M. Autoactivation of human Hageman factor. Demonstration utilizing a synthetic substrate / M. Silverberg, J.T. Dunn, L. Garen, A.P. Kaplan // J Biol Chem. - 1980. - V.255(15). - P.7281-7286.

111. Sinauridze, E.I. Thrombodynamics, a new global coagulation test: Measurement of heparin efficiency / E.I. Sinauridze, T.A. Vuimo, I.D. Tarandovskiy, et al. // Talanta. - 2018. - V.180. - P.282-291.

112. Smith, S.A. How it all starts: Initiation of the clotting cascade / S.A. Smith // Crit Rev Biochem Mol Biol. - 2015. - V.50(4). - P.326-336.

113. Stalker, T.J. A systems approach to hemostasis: 3. Thrombus consolidation regulated intrathrombus solute transport and local thrombin activity / T.J. Stalker, J.D. Welsh, M. Tomaiuolo, J. Wu, T.V. Colace , S.L. Diamond, L.F. Brass // Blood. - 2014. -V.124(11). - P.1824-1831.

114. Stalker, T.J. Platelet signaling / T.J. Stalker, D.K. Newman, P. Ma, K.M. Wannemacher, L.F. Brass //Handb Exp Pharmacol. - 2012. - V.210. - P.59-85.

115. Sveshnikova, A.N. Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling / A.N. Sveshnikova, A.V. Balatskiy, A.S. Demianova, T.O. Shepelyuk, S.S. Shakhidzhanov, M.N. Balatskaya et al. // J Thromb Haemost. - 2016. - 14(10). - P.2045-2057.

116. Swystun, L.L. The role of leukocytes in thrombosis / L.L. Swystun, P.C. Liaw // Blood. - 2016. - V.128(6). - P.753-762.

117. Tamagawa-Mineoka, R. Elevated platelet activation in patients with atopic dermatitis and psoriasis: increased plasma levels of ß - thromboglobulin and platelet factor 4 / R. Tamagawa-Mineoka, N. Katon, E. Ueda, K. Masuda, S. Kishimoto // Allergol Internat. - 2008. - V.57(4). - P.391-396.

118. Thon, J.N. Platelets: Production, Morphology and Ultrastructure / J.N. Thon, J.E. Italiano // Handb Exp Pharmacol. - 2012. - V.210 - P.3-22.

119. Ting H.J. Platelet function and Isoprostane biology. Should isoprostanes be the newest member of the orphan-ligand family? / H.J. Ting, F.T. Khasawneh // J Biomed Sci. - 2010. - V.17(1). - P.24.

120. Tutwiler, V. Interplay of platelet contractility and elasticity of fibrin/erythrocytes in blood clot retraction. V. Tutwiler, H. Wang, R.I. Litvinov, J.W. Weisel, V.B. Shenoy // Biophys J. - 2017. - V.112(4). - P.714-723.

121. Ulrichts, H. The von Willebrand factor self-association is modulated by a multiple domain interaction / H. Ulrichts, K. Vanhoorelbeke, J.P. Girma, P.J. Lenting, S. Vauterin, H.Deckmyn // J Thromb Haemost. - 2005. - V.3(3). - P.552-561.

122. Versteeg, H.H. New Fundamentals in Hemostasis / Versteeg H.H., Heemskerk J.W.M., Levi M., Reitsma P.H. // Physiol Rev. - 2013. - V.93(1). -P.327-358.

123. Vial, C. Lack of evidence for functional ADP-activated human P2X1 receptors supports a role for ATP during hemostasis and thrombosis / C. Vial, S.J. Pitt, J. Roberts, M.G. Rolf, Mahaut-Smith M.P., R.J. Evans // Blood. - 2003. -V.102(10). - P.3646-3651.

124. Von Brühl, M.L. Monocytes, neutrophils and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo / M.L. Bruhl, K. Stark, A. Steinhart, S. S. Chandraratne, I. Konrad, M. Lorenz et al. // J Exp Med. - 2012. -V.209(4). - P.819-35.

125. Weisel, J. W. Red blood cells: the forgotten player in hemostasis and thrombosis / J. W. Weisel, R. I. Litvinov // J Thromb Haemost. - 2019. - V.17(2). -P.271-282.

126. Weisel, J.W. Mechanism of fibrin polymerization and clinical implications / J.W. Weisel, R.I. Litvinov // Blood. - 2013. - V.121(10). - P.1712-1721.

127. Whelihan, M.F. Prothrombin activation in blood coagulation: the erythrocyte contribution to thrombin generation / M.F. Whelihan, V. Zachary, T. Orfeo, K.G. Mann // Blood. - 2012. - V. 120(18). - P.3837-3845.

128. White, J.G. The substructure of human platelet microtubules / J.G. White // Blood. - 1968. - V.32(4). - P.638-648.

129. Wohner, N. Lytic resistance of fibrin containing red blood cells / N. Wohner, P. Sotonyi, R. Machovich, L. Szabo, K. Tenekedjiev, M.M, Silva et.al. // Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 2011. - V.31(10). - P.2306-2313.

130. Wolberg, A.S. Fibrinogen and factor XIII: newly recognized roles in venous thrombus formation and composition / A.S. Wolberg // Curr Opin Hematol. -2018. - V.25(5). - P.358-364.

131. Wolberg, A.S. Thrombin generation and fibrin clot structure /A.S. Wolberg // Blood Rev. - 2007. - V.21(3). - P.131-42.

132. Wolberg, A. S. Primes to understand fibrinogen in cardiovascular disease / A.S. Wolberg // Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 2016 - V.36(1). - P.4-6.

133. Wolberg, A.S. Procoagulant activity in hemostasis and thrombosis: Virchow's triad revisited / A.S. Wolberg, M.M. Aleman, K. Leiderman, K.R. Machlus // Anesth Analg. - 2012. - V.114(2). - P.275-285.

134. Wolberg, A.S. Venous thrombosis / A.S. Wolberg, F.R. Rosendaal, J.I. Weitz, I.H. Jaffer, G. Agnelli, T. Baglin et al. // Nat Rev Dis Primer. - 2015. -V.7(1). - P.15006.

135. Zabczyk, M. Polyhedrocytes in intracoronary thrombi from patients with ST-elevation myocardial infarction / M. Zabczyk, M. Sadowski, J. Zalewski, A. Undas // Int J Cardiol. - 2015. - V.179. - P.186-187.

136. Zalewski, J. Plasma fibrin clot phenotype independently affects intracoronary thrombus ultrastructure in patients with acute myocardial infarction / J.

Zalewski, J. Bogaert, M. Sadowski, O. Woznicka, K. Doulaptsis, M. Ntoumpanaki // Thromb Haemost. - 2015. - V.113(6). - P.1258-69.

137. Zang, Y. Nitric oxide-mediated fibrinogen deposition prevents platelet adhesion and activation / Y. Zang, K.C. Popat, M.M. Reynolds // Biointerphases. - 2018. - V.13(6). - P.06E403.

138. Zapata, J.C. The role of platelets in the pathogenesis of viral hemorrhagic fevers / J.C. Zapata, D. Cox, M.S. Salvato // PLoS Neql Trop Dis. -2014 - V.8(6) - P.e2585.

139. Zhenyu, L. Signaling during platelet adhesion and activation / L. Zhenyu, K.M Delaney, K.A. O'Brien, D. Xiaoping // Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 2010. - V. 30(12). - P.2341-2349.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ТХА2 - тромбоксан А2 vWF - фактор фон Виллебранда АДФ - аденозиндифосфат TF - тканевой фактор

РКФМ - растворимые комплексы фибрин-мономера ATIII - антитромбин III

TFPI - ингибитор пути тканевого фактора (tissue-factor pathway inhibitor) t-PA - тканевой активатор плазминогена (tissue-type plasminogen activator) u-PA - активатор плазминогена урокиназного типа (urokinase-type plasminogen activator)

PAI-1 - ингибитор активатора плазминогена 1 (plasminogen activator inhibitor-1) PAI-2 - ингибитор активатора плазминогена 2 (plasminogen activator inhibitor-2) TAFI - активируемый тромбином ингибитор фибринолиза (thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor)

OCS - открытая канальцевая система (open canalicular system)

DTS - плотная тубулярная система (dens tubular system)

PAR - рецептор, активируемый протеазой (protease-activated receptor)

AТФ - аденозинтрофосфат

PF4 - тромбоцитарный фактор 4 (platelet factor 4)

IP3 - инозитол-3-фосфата

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

PI3KP - фосфоинозитид-3-киназа

PGHS-1 - простагландин-эндопероксид-Н-синтетаза 1 TP - тромбоксановый рецептор PGI2 - простациклин (простагландин) NO - оксид азота

VASP - сосудорасширяющий фосфопротеин (vasodilator-stimulated phosphoprotein)

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

ГТФ - гуанозинтрифосфат

GC - гуанилатциклаза

sGC - растворимая гуанилатциклаза

GPVI - гликопротеин VI

GPIb - гликопротеин Ib

MPV - средний объем тромбоцитов (mean platelet volume)

PDW - ширина распределения тромбоцитов (platelet distribution width)

PCT - тромбокрит (plateletcrit)

АФС - антифосфолипидный синдром

ГИТ - гепарин-индуцированная тромбоцитопения

ИИ - ишемический инсульт

ВТЭО - венозные тромбоэмболичекие осложнения

ТГВ - глубоких вен нижних конечностей

ТЭЛА - тромбоэмболия легочной артерии

MLCK - киназа легкой цепи миозина (myosin light-chain kinase)

NETs - внеклеточных нейтрофильных ловушек

МНО - международное нормализованное отношение

TRAP - пептид, активирующий тромбиновый рецептор (thrombin receptor

activating peptide)

HMDS - гексаметилдисилазан

RGDS - пептид Арг-Гли-Асп-Сер

BSA - бычий сывороточный альбумин

PBS - фосфатно-солевой буферный раствор

РВМС - мононуклеарные клетки периферической крови

PMA - форбол 12-миристат 13-ацетат

Приложение к диссертации

Дополнительная таблица 1. Клиническая характеристика пациентов с ишемическим инсультом (ИИ)

Классификация патогенетических типов ИИ согласно TOAST

Кардиоэмболи-ческий Атеросклероти-ческий Лакунарный Всего пациентов

Количество пациентов(%) 33 (39) 45 (54) 6 (7) 84 (100)

Мужчин (%) 13 (39) 25 (56) 3 (50) 41 (48)

Возраст, лет 69+2 68+1 60+4 68+1

Классификация ишемического инсульта

По шкале NIHSS (медиана; 1-й и 3-й квартили) 9; 4.5, 17 7; 3, 13 4; 3.5, 6 7; 4; 13.5

По шкале mRs (медиана; 1-й и 3-й квартили) 3; 2, 4.5 3; 2, 4 1; 0.75, 1.75 3; 2, 4

По шкале ASPECT (медиана; 1 -й и 3-й квартили) 7; 3, 8 8; 3, 8 9; 9, 9 7; 3.5, 8.5

Дополнительный таблица 2. Клиническая характеристика пациентов с венозными тромбоэмболическими осложнениями (ВТЭО)

Клинические характеристики Число пацентов с ВТЭО (п=41)

Характеристика тромбоза

Уровень тромбоза Проксимальный тромбоз 22(54%)

Дистальный тромбоз 19 (46%)

Размер флотирующей головки тромба >7 см 4 (9%)

<7 см 16 (40%)

Отсутствует 21 (51%)

Тромбоз Спровоцированный 6 (15%)

Неспровоцированный 35 (85%)

Срок тромбоза <21 дня (подострый) 34 (83%)

>21 дня (острый) 7 (17%)

Сопутствующие заболевания/Преморбидный фон

Злокачественные новообразования 7 (17%)

Острые инфекции 1(2%)

Тромбоз поверхностных вен 14 (34%)

Ишемическая болезнь сердца 2 (5%)

Гипертоническая болезнь 14 (35%)

Сахарный диабет 4 (10%)

Факторы риска

Варикозная болезнь нижних конечностей в анамнезе 17 (41%)

Острые нарушения мозгового кровообращения в анамнезе 3(7%)

Обширная травма 4 (10%)

Иммобилизация более 4-х дней 4 (10%)

Предшествующая операция в пределах одного месяца 2 (5%)

ВТЭО в анамнезе 8 (19%)

Врожденная или приобретенная тромбофилия 3 (7%)

Осложенная наследственность по ВТЭО 1 (2%)

Курение 13 (32%)

Ожирение (ИМТ>30 кг/м2) 7 (17%)

Применение эстроген-гестагенных препаратов (контрацепция, гормональная терапия) 1 (2%)