Молекулярные аспекты функционирования рибосомных РНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, доктор химических наук Сергиев, Петр Владимирович

• Сергиев, Петр Владимирович
• доктор химических наук
• 2008

Оглавление диссертации доктор химических наук Сергиев, Петр Владимирович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Основные морфологические элементы рибосомы.

2.2. Инициация трансляции.

2.3. Связывание аа-тРНК с А участком.

2.4. Пептидилтрансферазная реакция.

I ' г

2.5. Транслокация.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Мутагенез рРНК и способы выделения рибосом, содержащих мутации.,

3.1.1. Используемые плазмиды.

3.1.2. Используемые штаммы.

3.1.3. Выделение рибосом, несущих летальные мутации.

3.2. Определение генов, кодирующих рРНК метилтрансферазы и получение рибосом, не содержащих метилированных оснований.

3.3. Методы изучения фенотипа мутаций и отсутствия модификаций рРНК.

3.3.1. Измерение характеристик роста клеток.

3.3.2. Измерение точности трансляции in vivo.

3.3.3. Химическая модификация.

3.3.4. Выделение компонентов для тестов in vitro.

3.3.5. Toy-принт.

3.3.6. Изучение связывания тРНК с рибосомой.

3.3.7. Измерение активности белковых факторов трансляции.

3.4. Определение гена рРНК-метилтрансферазы, метилирующей G966 16S рРНК.

3.5. Мутации нуклеотидов спиралей 31,34,35 и 38 16S рРНК.'.

3.6. Определение гена рРНК-метилтрансферазы, метилирующей G1835 23S рРНК.

3.7. Изучение функциональной значимости межсубчастичного мостика В1а: укорочение ASF.

3.8. Мутации нуклеотидов, образующих "ворота", через которые проходит перемещение аа-тРНК в А участок.

3.9 Разработка метода прямого определения протонированных оснований в рРНК.

ЗЛО. Определение гена рРНК-метилтрансферазы, метилирующей G2445 23S рРНК.

3.11. Определение гена рРНК-метилтрансферазы, метилирующей А1618 23S рРНК.

3.12. Изучение роли Е участка в работе рибосомы с помощью мутации C2394G, препятствующей связыванию тРНК с Р и Р/Е участками.

3.13. Изучение роли нуклеотида G2655 SRL 23S рРНК в связывании EF-G и транслокации.

3.14. Изучение роли взаимодействия между спиралями 89 и 91 23S рРНК в функционировании факторов трансляции - GTPa3.

3.15. Изучение роли взаимодействия между спиралями 39 23S рРНК и D петлей 5S рРНК в формировании структуры РТС и участка предполагаемой передачи аллостерического сигнала.

3.16. Изучение движения GAC, как основного конформационного изменения, необходимого для связывания EF-G. Роль GAC в связывании EF-G и EF-Ти.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1 Реактивы и биопрепараты.

4.2. Буферы и растворы.

4.3. Штаммы и плазмиды.

4.4 Манипуляции с ДНК: клонирование, мутагенез.

4.4.1 Выделение плазмидной ДНК.

4.4.2. Определение концентрации ДНК в растворе.

4.4.3 ПЦР.

4.4.4. Разделение фрагментов ДНК в агарозпом геле.

4.4.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

4.4.6. Приготовление векторов и вставок.

4.4.7. Лигирование.

4.4.8. Приготовление компетентных клеток Е. coli.

4.4.9. Трансформация компетентных клеток Е. coli.

4.4.10. Мутагенез М13 по методу Кункеля.

4.4.11. Мутагенез с помощью набора QuickChange (Stratagenc).

4.4.12. Создание плазмид для экспрессии генов 16S и 23S рРНК с мутациями.

4.4.13. Создание плазмиды, кодирующей модельную мРНК.

4.4.14. Создание плазмиды pYbinPPAA.

4.5. Манипуляции с клетками.

4.5.1. Создание штаммов для экспрессии генов рРНК с мутациями.238 4.5.2 Измерение времени удвоения клеток.

4.5.3. Измерение скорости вытеснения клеток мутантных штаммов клетками дикого типа при совместном культивировании.

4.5.4. Измерение точности трансляции in vivo.

4.5.5. Создание штаммов для экспрессии генов рекомбинантных белков.

4.6 Выделение рибосом, рибосомных субчастиц, рРНК и частично депротеинизированных частиц.

4.6.1. Выделение рибосом из штамма AVS69009.

4.6.2. Выделение рибосом с помощью аффинной хроматографии.

4.6.3. Выделение больших количеств рибосом.

4.6.4. Выделение рРНК.

4.6.5. Выделение суммарной клеточной РНК.

4.6.6. Выделение частиц, частично депротеинизированных LiCl.

4.6.7. Выделение частиц, частично депротеинизированных NH4Cl/EtOH.

4.7. Выделение рекомбинантных белков.

4.7.1. Выделение рекомбинантных белков с помощью аффинной хроматографии на N1NTA агарозе.

4.7.2. Электрофоретическое разделение белков в SDS-ПААГ.

4.8 Выделение других компонентов для реакций in vitro.

4.8.1. Получение S100 экстракта без тРНК.

4.8.2. Получение аминоацил-тРНК.

4.8.2.1. Получение [3H]£Met-TPHKfMet Е. coli.

4.8.2.2. Получение [14С]РЬе-тРНКРНе Е. coli.

4.8.2.3. Получение Lys-TPHKLys Е. coli.

4.8.2.4. Получение радиоактивно меченной тРНКРЬе Е. coli.

4.8.2.5. Получение радиоактивно меченной TPHKfMet Е. coli.

4.8.3. Получение мРНК, кодирующей MFK пептид.

4.8.4. Электрофорез РНК в денатурирующем ПААГ.

4.9. Манипуляции с рРНК в составе рибосом и в депротеинизированном виде.

4.9.1. Ферментативное метилирование рибосом, рРНК и частично депротеинизированных частиц.

4.9.2. Обработка рибосом и рРНК борогидридом натрия для модификации протонированных оснований.

4.9.3. Обработка рибосом и рРНК модифицирующими реагентами.

4.9.3.1. Модификация диметилсульфатом.

4.9.3.2. Модификация кетоксалем.

4.9.3.3. Модификация карбодиимидом.

4.9.4. Вырезание фрагмента РНК с помощью РНКазы Н.

4.9.5. Разрезание фрагмента РНК с помощью РНКазы Т1.

4.9.6. Анализ олигонуклеотидных фрагментов рРНК с помощью масс-спектрометрии.

4.9.7. Анализ модификации рРНК с помощью обратной .транскрипции.

4.9.8. Анализ с помощью обратной транскрипции соотношения рРНК дикого типа и рРНК, несущей мутации в образце.

4.10 Функциональные тесты рибосом.

4.10.1. Оценка способности рибосомных субчастиц к ассоциации.

4.10.2. Оценка эффективности poIyU-зависимого синтеза polyPhe и частоты ошибочного встраивания Leu.

4.10.3. Тестирование при помощи тоу-припта способности мутантных рибосом осуществлять базовые стадии процесса трансляции in vitro.

4.10.4. Стимуляция СТРазной активности фактора элонгации G.

4.10.5. Стимуляция СТРазной активности фактора инициации 2.

4.10.6. Стимуляция СТРазной активности фактора элонгации Ти.

4.10.7. Анализ функциональных комплексов рибосомы с помощью химической модификации (футпринтинг).

4.10.8. Определение степени связывания тРНК с рибосомами с помощью фильтрования через нитроцеллюлозные фильтры.

4.10.9. Измерение степени и скорости образования дипептида.

4.10.10. Пуромициновая реакция.

5. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярные аспекты функционирования рибосомных РНК»

Жизнь основана на взаимодействии и взаимопревращении биомолекул и собранных из них надмолекулярных устройств. Биомолекулы физически и химически ничем не отличаются от всех остальных органических и неорганических соединений и совершенно также подчиняются классическим законам химии [1]. Однако биомолекулы обладают несвойственной другим молекулам особенностью, которая делает их столь интересными в глазах исследователей. Эта особенность, присущая также устройствам, созданным человеком, - функциональность. Биологические молекулы обладают функцией, или многими функциями, и эта функциональность заложена в биомолекулах изначально, т.е. они возникли (были отобраны в ходе эволюции) для выполнения той или иной цели. Мы не можем ответить на вопрос: "зачем в природе водород?", но можем ответить на вопрос: "зачем в природе рибосома?". С тем, чтобы по возможности, не слишком углубляться в вопросы философии, мы не будем стремиться пройти по цепочке последовательных вопросов "зачем синтезировать белки?", "зачем нужен метаболизм?", "зачем нужна жизнь?", оставив это занятие Фоме Аквинскому [2]. В данной работе нас больше будет интересовать, насколько можно приписать функциональность более мелким компонентам, частям биомолекул. В этом ключе уместно будет сравнить биомолекулы с устройствами, созданными человеком. Несмотря на то, что принципы работы молекулярных устройств живой природы и, скажем, автомобиля, совершенно различны, нас будут интересовать "детали" молекулярного устройства, функцию которых мы будем стараться понять, как, например, мы можем понять функцию руля или фар у автомобиля.

Данная работа посвящена изучению рибосомы. Рибосома - это крупное надмолекулярное устройство, функция которого заключается в синтезе белков [3], согласно информации, закодированной в матричной РНК (мРНК) [4]. При этом синтез белка осуществляется из аминокислотных остатков, присоединенных к индивидуальным транспортным РНК (тРНК). Каждая тРНК отвечает за перенос одной единственной аминокислоты и может существовать в трех видах: деацилированном (без аминокислоты), аминоацилированном (с аминокислотой, присоединенной к ее 3'-концу) и пептидильном (с присоединенным к 3'-концу пептидом). Собственно, синтез белка, т.е. полимеризация аминокислот, состоит из повторяющихся реакций присоединения растущего пептида к аминокислоте. При этом до начала реакции и пептид, и аминокислота присоединены к разным молекулам тРНК.

Изучение рибосомы ведется уже несколько десятилетий, за которые был накоплен колоссальный массив данных о структуре рибосомы и протекании всех этапов ее функционального цикла. В наше время основной интерес представляет взаимосвязь структуры и функции отдельных элементов рибосомы. Эта взаимосвязь изучается с помощью двух дополняющих друг друга подходов. Во-первых, это изучение параметров протекания тех или иных стадий цикла работы рибосомы и выявление сопутствующих им структурных изменений тех или иных компонентов рибосомы и ее лигандов. Во-вторых, это намеренное изменение каких-либо элементов рибосомы или ее лигандов и выявление тех стадий функционального цикла, которые были нарушены в результате такого воздействия. Естественно, что оба эти подхода применяются совместно и необходимо дополняют друг друга. Воспользовавшись аналогией, можно представить себе, что для изучения функционирования автомобиля можно подвергать его различным тестам, как на станции технического осмотра, а можно ломать последовательно те или иные детали автомобиля и смотреть с помощью тестов, какие функции окажутся нарушенный. В случае рибосомы, "ломать" что-либо можно несколькими основными способами. Во-первых, использовать аналоги субстратов, неспособные участвовать в тех или иных химических реакциях. Например, вместо GTP использовать его негидролизуемый аналог -GDPNP. Во-вторых, использовать природные ингибиторы работы рибосомы -антибиотики. Эти, как правило, небольшие молекулы связываются с достаточно небольшим участком рибосомы или ее лигандов и могут влиять на множество стадий работы рибосомы. И, в-третьих, можно вводить мутации в компоненты рибосомы и изучать функциональные последствия таких структурных изменений.

Особое внимание мы уделим движущимся "деталям" рибосомы. Говоря о движении компонентов и лигандов рибосомы, необходимо оговориться, что рибосома, как и всякое другое молекулярное образование, подчиняется статистическим законам физической химии и не может быть полным аналогом какой-либо механической машины, созданной человеком [5, 6]. Функционирование рибосомы построено на принципах работы всех ферментов и движения компонентов и лигандов рибосомы должны относиться к следующим нескольким типам. Во-первых, взаимодействие рибосомы и ее лиганда может быть построено на принципе "жесткого соответствия" [7], когда и рибосома и ее лиганд при взаимодействии друг с другом не изменяют своей пространственной структуры. Тогда только сам факт связывания лиганда будет иметь функциональное значение. Во-вторых, связывание лиганда может осуществляться по принципу "индуцированного соответствия" [8]. При этом конформационное изменение рибосомы при связывании с лигандом будет происходить из-за того, что тот или иной компонент рибосомы или лиганд обладает достаточной подвижностью, и одна из его конформаций стерически благоприятна для связывания. В этом случае мы будем наблюдать, что при связывании с лигандом рибосома меняет конформацию, но никакой функциональной ролью это изменение конформации не обладает — важно лишь связывание лиганда. В-третьих, изменение конформации рибосомы или ее лиганда при связывании может иметь функциональное значение. При этом мы можем говорить об "аллостерическом эффекте" [9], когда взаимодействие рибосомы с лигандом может влиять на конформацию других лигандов или компонентов рибосомы, не находящихся в прямом контакте с участниками взаимодействия. Иными словами, функциональные центры рибосомы получают возможность "передавать сигналы" друг другу. Разумеется, такая передача сигналов возможна только с помощью индуцированного изменения структуры элементов рибосомы/лигандов, находящихся между сообщающимися центрами. И, в-четвертых, изменение пространственного расположения молекулярных структур рибосомы или ее лигандов может быть обусловлено их подвижностью и не иметь никакого функционального значения.

В обзоре литературы будут последовательно рассмотрены инициация синтеза белка, связывание аминоацил-тРНК (аа-тРНК) с А участком рибосомы, пептидилтрансферазная реакция и транслокация. Будут сформулированы основные вопросы, относящиеся к механизму протекания отдельных стадий, и дан обзор тех ответов, которые уже были найдены.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Сергиев, Петр Владимирович

5. ВЫВОДЫ

1. Гены yhhF, ybiN, ygjO и ycbY кодируют ферменты, метилирующие нуклеотиды G966 16S рРНК, А1618, G1835 и G2445 23S рРНК Escherichia coli. Субстратом для YhhF служит 30S субчастица, для YbiN - рибонуклеопротеид, промежуточный в процессе сборки 50S субчастиц, и депротеинизированная 23S рРНК для YgjO и YcbY. Делеции генов yhhF, ybiN, ygjO и ycbY приводят к замедлению роста клеток, но не летальны.

2. Третичные взаимодействия нуклеотидов А1201 и А1191 спирали 34 16S рРНК, способствуют ассоциации субчастиц и обеспечения точности трансляции.

3. Сужение, образованное нуклеотидами U2492, С2556 и С2573 23S рРНК на пути перемещения аминоацил-тРНК в А участок, не влияет на скорость этого перемещения.

4. Перемещение деацилированной тРНК из Р в Р/Е участок способствует взаимодействию EF-G*GTP с рибосомой, повышает эффективность и точность транслокации.

5. Межсубчастичный мостик В 1а не важен для транслокации, но способствует формированию структуры 50S субчастицы.

6. Мутации нуклеотида А960 23S рРНК стабилизируют конформацию рибосомы, в которой нуклеотиды, образующие Р участок 50S субчастицы, защищены от действия модифицирующих реагентов.

7. Взаимодействие петель спиралей 89 и 91 23 S рРНК не важно для элонгации трансляции, но способствует функционированию фактора инициации 2.

8. Прочное взаимодействие EF-G с SRL не важно для ОТРазной активности EF-G, но необходимо для транслокации.

9. Вставка пары нуклеотидов в спираль 42 23 S рРНК, предположительно сближающая GAC и SRL, нарушает аллостерическое взаимодействие между Р/Е участком связывания тРНК и участком связывания факторов элонгации, благоприятно для связывания и функциональной активности EF-Tu и ингибирует связывание и функциональную активность EF-G.

Список литературы диссертационного исследования доктор химических наук Сергиев, Петр Владимирович, 2008 год

1. Wohler, F., (1828) Uber kunstliche Bildung des Harn-stoffes. Annalen der Physik und Chemie, 88.

2. Aquinas, Т., (1265-1274) Summa theologiae.

3. Littlefield, J.W., E.B. Keller, J. Gross and P.C. Zamecnik, (1955) Studies on cytoplasmic ribonucleoprotein particles from the liver of the rat J Biol Chem, 217(1): p. 111-23.

4. Gros, F., H. Hiatt, W. Gilbert, C.G. Kurland, R.W. Risebrough and J.D. Watson, (1961) Unstable ribonucleic acid revealed by pulse labelling of Escherichia coli. Nature, 190: p. 581-5.

5. Spirin, A.S., (2002) Ribosome as a molecular machine. FEBSLett, 514(1): p. 2-10.

6. Spirin, A.S., (2004) The ribosome as an RNA-based molecular machine. RNA Biol, 1(1): p. 3-9.

7. Fischer, E., (1894) Einfluss der Configuration auf die Wirkung der Enzyme. Chem.Ber., 27: p. 2985-2993.

8. Koshland, D.E., (1958) Application of a Theory of Enzyme Specificity to Protein Synthesis. Proc Natl Acad Sci USA, 44(2): p. 98-104.

9. Monod, J., J.P. Changeux and F. Jacob, (1963) Allosteric proteins and cellular control systems. JMolBiol, 6: p. 306-29.

10. Lubin, M., (1968) Observations on the shape of the 50S ribosomal subunit Proc Natl Acad Sci USA, 61(4): p. 1454-61.

11. Lake, J. A., (1976) Ribosome structure determined by electron microscopy of Escherichia coli small subunits, large subunits and monomeric ribosomes. JMol Biol, 105(1): p. 1319.

12. Vasiliev, V.D., (1974) Morphology of the ribosomal 30S subparticle according to electron microscopic data Acta Biol Med Ger, 33(5-6): p. 779-93.

13. Spirin, A.S., (1964) Macromolecular Structure and Ribonucleic Acids. New York: Reinhold.

14. Vasiliev, V.D., O.M. Selivanova and V.E. Koteliansky, (1978) Specific selfpacking of the ribosomal 16 S RNA FEBS Lett, 95(2): p. 273-6.

15. Wimberly, B.T., D.E. Brodersen, W.M. Clemons, Jr., R.J. Morgan-Warren, A.P. Carter, C. Vonrhein, T. Hartsch and V. Ramakrishnan, (2000) Structure of the 30S ribosomal subunit Nature, 407(6802): p. 327-39.

16. Cate, J.H., M.M. Yusupov, G.Z. Yusupova, T.N. Earnest and H.F. Noller, (1999) X-ray crystal structures of 70S ribosome functional complexes. Science, 285(5436): p. 2095104.

17. Ban, N., P. Nissen, J. Hansen, P.B. Moore and T.A. Steitz, (2000) The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution Science, 289(5481): p. 90520.

18. Klein, D.J., P.B. Moore and T.A. Steitz, (2004) The roles of ribosomal proteins in the structure assembly, and evolution of the large ribosomal subunit JMol Biol, 340(1): p. 141-77.

19. Vasiliev, V.D. and O.M. Zalite, (1980) Specific compact selfpacking of the ribosomal 23 S RNA FEBS Lett, 121(1): p. 101-4.22,23,24.25,2627,28,29,30,31,32,3334,35,3637,38,39,4041,

20. Bernabeu, С. and J. A. Lake, (1982) Nascent polypeptide chains emerge from the exit domain of the large ribosomal subunit: immune mapping of the nascent chain Proc Natl AcadSci USA, 79(10): p. 3111-5.

21. Choi, K.M. and R. Brimacombe, (1998) The path of the growing peptide chain through the 23S rRNA in the 50S ribosomal subunit; a comparative cross-linking study with three different peptide families. Nucleic Acids Res, 26(4): p. 887-95.

22. Doty, P., H. Boedtker, J.R. Fresco, R. Haselkorn and M. Litt, (1959) Secondary Structurein Ribonucleic Acids. Proc Natl AcadSci USA, 45(4): p. 482-99.

23. Shatsky, I.N., A.V. Bakin, A.A. Bogdanov and V.D. Vasiliev, (1991) How does themRNA pass through the ribosome? Biochimie, 73(7-8): p. 937-45.

24. Balakin, A.G., E.A. Skripkin, I.N. Shatsky and A.A. Bogdanov, (1992) Unusual ribosome binding properties of mRNA encoding bacteriophage lambda repressor. Nucleic Acids Res, 20(3): p. 563-71.

25. Boni, I.V., D.M. Isaeva, M.L. Musychenko andN.V. Tzareva, (1991) Ribosome-messenger recognition: mRNA target sites for ribosomal protein SL Nucleic Acids Res, 19(1): p. 155-62.

26. Юсупова, Г., Дженнер, Л., и М. Юсупов (2007) Перемещение матричной РНК на рибосоме. Молекулярная биология, 41(2): с. 274-83.

27. Huttenhofer, A. and H.F. Noller, (1994) Footprinting mRNA-ribosome complexes with chemical probes. Embo J, 13(16): p. 3892-901.

28. O'Donnell, S.M. and G.R. Janssen, (2001) The initiation codon affects ribosome binding and translational efficiency in Escherichia coli of cl mRNA with or without the 5' untranslated leader. JBacteriol, 183(4): p. 1277-83.

29. Crick, F.H., (1966) Codon—anticodon pairing: the wobble hypothesis. JMol Biol, 19(2): p. 548-55.

30. Dallas, A. and H.F. Noller, (2001) Interaction of translation initiation factor 3 with the 30S ribosomal subunit Mol Cell, 8(4): p. 855-64.