Изучение структурной и функциональной роли элементов центрального протуберанца большой субчастицы рибосомы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Кипарисов, Сергей Владиславович

• Кипарисов, Сергей Владиславович
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Кипарисов, Сергей Владиславович

Содержание.

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Морфология рибосомы.

1.2. Особенности строения функциональных центров и структурных элементов рибосомы.

1.2Л. Элонгационный цикл рибосомы.

1.2.2. Пептидилтрансферазный центр.

1.2.3. Центр связывания элонгационных факторов.

1.2.4. Декодирующий центр.

1.2.5. А-сайтовый палец.

1.2.6. 5S рРНК.

1.2.7. Спирали 89 и 91.

1.3J Передача сигнала в рибосоме.

1.3:1. Декодирование, конформационные изменения при связывании EF-Tu.

1.3.2. Транслокация, конформационные изменения при связывании EF-G.

1.3.3. Передача сигнала.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение структурной и функциональной роли элементов центрального протуберанца большой субчастицы рибосомы»

Синтез белка— сложный процесс, центральную роль в нем играет рибосома -молекулярная машина, задача которой декодировать матричную РНК (мРНК) в соответствующую последовательность аминокислот с помощью аминоацил-тРНК.

Рибосома состоит из рибосомной РНК (рРНК) и белков. В научном мире долго велись споры о функции рРНК, были выдвинуты гипотезы о том, что она; может являться матрицей, определяющей последовательность синтезируемого белка,, или г образует каркас, на который крепятся каталитически активные белковые компоненты. Накопление большого количества биохимических данных, свидетельствующих о том, что рРНК вовлечена в работу рибосомы, открытие каталитической активности-РНК в 80-х годах [1], и наконец, разрешение структуры рибосомы на атомарном уровне позволили установить, что главным компонентом, ответственным за функцию макромолекулярного комплекса является рРНК, а белки выполняют роль скорее структурных, чем функциональных составляющих.

Успехи в определении структуры различных функциональных комплексов рибосомы в сочетании с биохимическими методами, такими, как; сайт-направленный мутагенез рРНК, химический пробинг, футпринтинг и фотоаффинная, химическая модификация открывают широкие возможности для установления механизма трансляции и динамики работы рибосомы на молекулярном уровне.

Данные полученные в результате рентгеноструктурного анализа позволили различить отдельные структурные компоненты рибосомы, которые вовлечены во взаимодействия как между собой, так и с основными участниками трансляции -трансляционными факторами и тРНК. Большой конформационной подвижностью в процессе биосинтеза обладают области контакта центрального протуберанца большой и головы малой субъединицы. Именно в этом регионе рибосомы располагаются высоко-консервативные структурные элементы - А-сайтовый палец и 5S рРНК, функциональному исследованию которых и посвящена данная работа.

1. Обзор литературы.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Кипарисов, Сергей Владиславович

4. Выводы.

1. Укорочение спирали 38 23 S рРНК, приводящее к разрушению В1а " межсубъединичного мостика, замедляет рост клеток, влияет на ассоциацию субчастиц и понижает ОТРазную активность EF-G, индуцированную рибосомой или ее комплексом с деацилированной тРНК, при этом оно не летально для клеток и не вызывает изменений в принципиальных стадиях элонгационного цикла.

2. Пробинг структуры рибосом, содержащих мутацию в спирали 38 23S рРНК, показал, что В1а мостик, образованный спиралью 38 23 S рРНК, может влиять на формирование третичных контактов, соединяющих 5S рРНК со структурными компонентами пептидилтрансферазного центра и элементами, взаимодействующими с элонгационными факторами. Таким образом, локальные изменения структуры могут передаваться по цепям элементов рибосомы на 4 большие расстояния.

3. Среди 246 точечных мутаций в 5S рРНК Saccharomyces cerevisiae только 7 оказались нелетальными для клеток: А20С, C69U, A76U, A79U, U81C, A84G и C93U.

4. Структурные изменения в различных доменах 5S рРНК могут передаваться в район D-петли 5S рРНК и на центр связывания элонгационных факторов в 80S рибосомах Saccharomyces cerevisiae. т

2.3. Заключение.,

Удаление участка 872-905 консервативного структурного элемента рибосомы -спирали 38 23S рРНК нарушает В1а мостик. . Результаты тестов мутантных ДВ1а рибосом /и vivo и in viro позволяют сделать выводы о роли этого межсубъединичного мостика в рибосоме. Мутация замедляет рост клеток, влияет на ассоциацию субчастиц и понижает СТРазную активность EF-G, индуцированную рибосомой или ее; комплексом с деацилированной тРНК. При этом она не детальна для клеток, не вызывает изменений в принципиальных стадиях элонгационного цикла, а также не влияет на способность деацилированной тРНК, связанной в Р-участке, стимулировать ОТРазную активность EF-G. Похожие случаи были описаны в литературе. Так, замещение консервативного G2655 на А не приводило к функциональным дефектам [91, 93]. Замещение консервативного С2475 на G [238] и мутация C2254U [239] не имели фенотипа, несмотря на то, что С2475 образует консервативную неканоническую обращенную Уотсон-Криковскую пару с основанием нуклеотида G2529 спирали 91 23S рРНК [26], а нуклеотид С2254 защищается тРНК, связанной в А участке [97].

Пробинг структуры рибосом, содержащих мутацию в спирали 38 23S рРНК подтверждает связь структурных элементов 23S рРНК и то, что локальные изменения; структуры могут передаваться по цепям элементов рибосомы на большие расстояния. Мутация ДВ1а, так же как и другие, описанные в литературе мутации [140, 216], скорее сдвигают равновесие между конформерами в рибосоме, а не полностью разрушают ее структурные элементы. Такой переход может осуществляться, например, при движении спирали 89 23S рРНК, расположенной- между пептидилтрансферазным центром, и центром связывания элонгационных факторов.

Вероятно, рибосома может использовать множественные, альтернативные пути коммуникации' между функциональными центрами и потеря, одних взаимодействий компенсируется другими. Так, по-видимому, укорочение спирали; 38 23S рРНК, разрушающее В1 а мостик, приводит к тому, что его роль начинают выполнять мостики Bib и В 1с. Интересно, что недавние эксперименты по изучению способности субъединиц- рибосомы к ассоциации показали, что среди 12 межсубъединичных мостиков, которые были классифицированы Юсуповым и коллегами [28], только В2а и В4 абсолютно необходимы для ассоциации субчастиц [240]. Все мостики В 1а группы включают в себя структурные элементы большой субъсдиницы, связанные с 5S рРНК, а именно спираль 38 23S рРНК (В1а мостик), и белок L5 (Bib, Blc мостики), который взаимодействует с S13 [28, 36]. Для того, чтобы нарушить нормальное функционирование рибосомы, по-видимому, необходимо мутировать одновременно спираль 38 вместе с L5 или 5S рРНК.

Для ЗБ рРНК в литературе были предложены различные функции; Так полагают, что она увеличивает сродство аминоацил-тРНК к рибосоме [141, 142], помогает в формировании, правильной геометрии пептидилтрансферазного центра [144], или увеличивает пептидилтраисферазную активность [137, 141, 143]. Еще до получения структуры 50S субчастицы с высоким разрешением [26], возникла гипотеза о том, что 5S рРНК может связывать функциональные центры рибосомы и передавать между ними конформационный сигнал [145] и, в частности, соединять пептидилтрансферазный центр и центр, ассоциированный: с ОТРазной активностью. Методом мутагенеза и химического пробинга структуры рибосом, содержащих точечную мутацию в спирали 39 в 23S рРНК, показано, что нуклеотиды D-петли 5S рРНК вовлечены в образование третичных контактов, связывающих эти функциональные центры [140].

Структурные изменения в 80S рибосоме Saccharomyces cerevisiae, которые вызывают мутации в 5S pPHK скорее можно отнести к категории слабых. Однако, вместе с результатами о летальности большинства (239 из 246) мутаций в 5S рРНК для; клетки, они четко свидетельствуют о том, что 5S рРНК является высококонсервативной и высокоструктурированной!молекулой. При этом, даже незначительные структурные изменения ; в ее доменах могут передаваться в район D-петли 5S; рРНК, который взаимодействует с карманом, образованным спиралью 42 25S рРНК, поддерживающей центр, ассоциированный с ОТРазной активностью, спиралью 39 и 89 25S рРНК. Если идея об аллостерической связи структурных элементов рибосомы верна, то "голова" 5 S рРНК может влиять на конформацию "нижней" части молекулы. Таким образом, структурные изменения в области центрального протуберанца большой субъединицы, например, во время относительного поворота субчастиц при транслокации [135, 184] или; при переходе малой субъединицы из "открытого" состояния в "закрытое" при декодировании [112. 136], могут передаваться с "головы" 5S рРНК на D-петлю молекулы, а через нее на другие структурные элементы» рибосомы. Такое предположение подтверждается данными, полученными в этой работе, что мутации в различных доменах 5S рРНК могут потенциально влиять на третичные контакты между спиралями 25S рРНК в 80S рибосоме Saccharomyces cerevisiae, которые связывают структурные элементы пептидилтрансферазного центра и центра связывания элонгационных факторов.

3. Материалы и методы.

3.1. Исследование спирали 38 23S рРНК E.coli. 3.1.1. Выделение 70S рибосом E.coli несущих мутацию ДВ1а.

Выделение ДВ 1а мутантных рибосом проводили из штамма AVS69009 E.coli, в котором все семь рибосомных оперонов (ггп\) удалены из хромосомы, а гены 16S, 23S, и 5S рРНК представлены в опероне ггпС на плазмиде pHK-rrnC+ [241]. После замещения, [140] данной плазмиды на плазмиду plkl 192U, несущей мутацию в спирали 38, был получен штамм, продуцирующий только мугантные рибосомы.

Рибосомы выделялись с использованием: модифицированной методики: реассоциации: субчастиц [242]. 500 мл среды LB инокулировали свежей ночной культурой клеток и инкубировали при 37°С и перемешивании 160-170 грт до Л600 ~ 0,4-0,5. Клетки охлаждали на льду в течение 30 минут (все дальнейшие манипуляции• проводили при +4°С) и собирали центрифугированием при 7000 об/мин: 10 минут: при* 4°G в роторе: GSA. Осадок ресуспендировали в охлажденном буфере для диссоциации H20M1N200S4 (20мМ Hepes-KOH рН 7,5; 1 мМ MgOAc2; 200 мМ NH4C1;.4 мМ Р-меркаптоэтанол), снова осаждали, буфер декантировали и осадок хранили при; необходимости при -20°С.

Полученные осадки дальше ресуспендировали в 3-4 мл буфере для диссоциации H20M1N200S4 и разрушали клетки ультразвуком5 8-10 раз по 15 сек во льду, интенсивность около 5-6, с промежутками по 45 секунд во льду, контролировали лизат по вязкости, прозрачности и температуре.

От клеточного дебриса избавлялись центрифугированием в роторе SS34 при ? 15000 об/мин на. протяжении 30 мин в препаративной центрифуге Sorvall. Из полученного супернатанта отбирали объем, в котором содержалось 180 ОЕгбОпш и наносили на градиент сахарозы 10-40%. Центрифугирование в сахарозном; градиенте проводили на: ультрацентрифуге Beckman L7-55 в роторе SW28! в течение 18 ч при 22000 ■ об/мин. Субъединицы собирали в одну общую фракцию, не разделяя по субчастицам, доводили до нужного объема буфером для диссоциации, доводили концентрацию ионов магния до 15-17 мМ и осаждали центрифугированием; при 43000 об/мин? в роторе Ti-60 в течение 22 часов.

После осаждения растворяли субъединицы в 700; мкл буфера для ассоциации H2oM2oN3oS4= (20мМ Hepes-KOH рН 7.5; 20 мМ MgOAc2; 30 мМ NH4C1; 4 мМ [)-меркаптоэтанол) и центрифугировали в настольной центрифуге в 1,5 мл пробирках Eppendorf при 7000 об/мин 10 минут. После чего проводили реассоциацию рибосомных субъедишш, проинкубировав субъсдиницы 15 мин при 42°С. 70S частицы отделяли от 30S и 50S субъединиц путем центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы 10-40% в роторе SW28 в течение 18 ч при 22000 об/мин. Из сахарозы рибосомы осаждали центрифугированием при 43000 об/мин в роторе Ti-60 в течение 22 часов. Осадки растворяли в буфере для ассоциации H20M20N30S4. Концентрацию полученных рибосом оценивали спектрофотометрически:ТО.Е.260=24 пмоль 70S Е. coli/sm [243].

3.1.2. Определение зависимости степени ассоциации рибосомных субчастиц; от, концентрации Mg2+.

Степень ассоциации рибосомных субчастиц рассчитывали по результатам центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы 10-40% (vv/v) в буфере H20M4N30S4 (20мМ Hcpes-KOH рН 7,5; х мМ MgOAc2; 30 мМ NH4C1; 4 мМ р-меркаптоэтанол), с различной концентрацией Mg2+ (5, 14, 21 мМ).

100 мкл 0.4 мкМ раствора рибосом в буфере H20MXN30S4 инкубировали в течение 10 мин при: 37°С и наносили на градиент концентрации сахарозы 10-40%, который предварительно охлаждали до 4°С. Центрифугирование проводили в течение 18 часов; при 22000 об/мин и 4°С в роторе SW28 (Beckman).

3.1.3. Эффективность polyU зависимого синтеза polyPhe.

Эффективность polyU зависимого синтеза polyPhe проводили согласно методике, описанной в [210].

Трансляцию проводили в два этапа. На первом этапе проводили связывание N-ацетил-фенилаланил-тРНКРЬе. Для чего 5 пмоль рибосом, 7,5 пмоль N-ацетил-фенилаланил-тРНКРЬе, 50 мкг полиуридиловой кислоты (polyU) в буфере, содержащем 10 мМ Hepes-KOH, рН 7,6; 6 мМ Mg(CH3COO):;150 mM NH4C1; 0,6 мМ спермина; 0,4 мМ спермидина; 4 мМ Р-меркаптоэтанола инкубировали 10 мин. при 37°С после чего увеличивали объем:реакционной смеси с 25 мкл до 50 мкл, оставив: концентрации; ионов неизменными, и инкубировали 25 мин. при 37°С.

На втором этапе к исходной смеси для связывания добавляли 150 мкл смеси, включавшей 25000 пмоль фенилаланина (Phe) с удельной активностью [I4C]Phe 50 cpm/пмоль. 3 мкг пируваткиназы, 30 мкл S100 экстракта, а также 30 мкл буфера. содержащего 40 мМ Hepes-KOH, рН 7,6; 750 мМ NH4CI: 16 мМ Р-меркаптоэтанола; 3 мМ спермина; 2 мМ спермидина; 10 мМ АТР; Т мМ GTP; 50 мМ фосфоенолпирувата.

Для определения уровня ошибочного включения' лейцина в реакционную смесь добавляли также 250 пмоль лейцина (Leu) с удельной активностью [3H]Leu 10000 cpm/пмоль и стрептомицин до конечной концентрации 5 мкМ, Конечная концентрация: солей на втором этапе трансляции была та же, что и при связывании, только количество

76 ионов Mg2f было уменьшено до 3 мМ. Синтез проводили при 37°С на протяжении 5 мин, после чего реакцию останавливали добавлением 1 мл раствора, содержащего 10% ТХУ и по 0,5% (w/v) фенилаланина и лейцина. Смеси инкубировали 10 мин при 100°С, после чего фильтровали на стеклянных фильтрах (Schleicher-Schull), промывали десятикратным объемом раствора ТХУ/аминокислоты и десятикратным объемом изопропанола. Отрицательные контроли, без polyU или без рибосом, обрабатывали аналогично.

Подсушенные на воздухе в течение часа фильтры интенсивно встряхивали в сцинтилляторе OCS (Amersham) и радиоактивность обсчитывали на счетчике.

З.Г.4: Тестирование способности* мутантных рибосом ДВ1а осуществлять базовые стадии процесса трансляции in vitro:

3.1.4.1. Получение MFK-mPHK.

Для? получения MFK-mPHK был использован ПЦР-продукт, полученный при амплификации участка плазмиды рЕТЗЗВ+, несущей последовательность MFK-mPHK с клонированным с З'-конца гена промотором РНК-полимеразы бактериофага Т7.

Реакцию транскрипции проводили в течение ночи при 37°С в объеме 300 мкл.

Реакционная смесь содержала 40 мМ Tris-HCl, рН 8,0; 6 мМ MgCb; 10 мМ ДТТ; 2 мМ спермидина, по 1 мМ каждого из рибонуклеозидтрифосфатов, 3 мМ ДТТ, 0,1 мг/мл

BSA (New England Biolabs), 0,01 ед./мкл пирофосфатазы, от 1 до 5 мкг ПЦР-продукта,

0,5 ед./мкл ингибитора РНКаз RNasin (Promega) и 1,7 ед./мкл Т7-РНК-полимеразы (New

England Biolabs).

Продукт транскрипции очищали электрофорезом в 8% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в присутствии 7М" мочевины, проводили фенол-хлороформную экстракцию смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт 125:24:1 рН. 4,5 (Ambion) и дважды осаждали этанолом. Концентрацию конечного препарата оценивали спектрофотометрически, измеряя поглощение аликвоты при 260 нм.

На 5'-коиец ДНК праймера, комплементарного З'-концевой области MFK-mPHK вводили радиоактивный фосфат Р при помощи реакции кинирования. Реакцию^ проводили в буфере , содержащем 50 мМ Tris-HCl рН 8,2; 10 мМ MgCb; 0,1 мМ EDTA; 5 мМ DTT, 0,1 мМ спермидина, 500 пмоль праймера, 20 ед. Т4-полинуклеотидкиназы (Roche, 10 ед./мкл) и 56 пмоль [у- Р]АТР (Amersham Biosciences Part of GE Healthcare удельная активность 220 ТБк/ммоль или 6000 Ки/ммоль). Кинирование проводили при 37°С в течение 30 мин. после чего киназу инактивировали. нагреванием в течение 15 минут при 65 °С.

Далее производили отжиг полученного радиоактивного праймера на З'-конец MFK-mPHK для чего нагревали эквимолярные количества праймера и MFK-mPHK в буфере H;oM6Ni?oS4Spo.o5Spm2 (20мМ Hepes-KOH рН 7,5; 6 мМ MgOAc2; 150 мМ NH4CI; 4 мМ р-меркаптоэтанол; 0,05 мМ спермин; 2 мМ спермидин ) до 75°С с последующим охлаждением до 37°С. Полученную MFK-mPHK с отожженным праймером использовали в последующих экспериментах.

3.1.4.2. Формирование комплексов.

Все реакции проводили в буфере H2oM6Ni5oS4Spo,o5Spm2. На первой стадии, формировали инициаторный комплекс, содержащий fMet-TPHKfMet в Р-участке. Реакцию проводили в 10 мкл. Концентрация 70S рибосом была 0, Г мкМ, MFK-mPHK -0,1 мкМ, fMet-TPHKfMct - 0,1 мкМ, IF-2 - 0,3 мкМ, IF-3 0,3 мкМ и GTP с общей концентрацией 0,2 мМ инкубировали 10 мин при 37°С.

На втором этапе к исходной смеси прибавляли 5 мкл раствора? до конечных концентрации EF-Tu 0,2 мкМ, EF-Ts - 0,2 мкМ, Phe-TPHKphe 0,2 мкМ, и GTP с общей концентрацией 0,5 мМ. Добавляемую смесь предварительно инкубировали при 37°С в течение 1 мин. Полученный раствор инкубировали 10 мин при 37°С.

На третьем этапе в ту же смесь прибавляли 2 мкл смеси, до конечных концентраций EF-G - 0,1 мкМ и GTP общей концентрацией; 0,5 мМ, инкубировали в течение 10 мин при Ю мин при 37°С.

На четвертом этапе следующем этапе в систему прибавляли 5 мкл раствора, до конечных концентраций EF-Tu - 0.2 мкМ^ EF-Ts - 0.2 мкМ; Lys-TPHKLy5 - 0,2 мкМ и до концентрации 0,5 мМ. Полученный раствор инкубировали; 10 мин при 37°С.

3:1.4.3. Анализ комплексов:.

Эффективность отдельных стадий, элонгационного цикла бьша детектирована методом тупринтинга (от англ. toe-printing), который позволяет определять положение: рибосомы на мРНК и полноту образования комплекса [211]. Проводили 4 независимых одинаковых эксперимента каждый из которых останавливался на одном из этапов. Для; этого в систему прибавлялись все четыре дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфата до концентрации 0,4 мМ а также 0,5 мкл (10 ед.) AMV обратной транскриптазы (Roche). Обратную транскрипцию проводили; в течение 15 мин при 37°С. Затем смесь подвергали фенол-хлороформной экстракции и осаждали спиртом. Высушенные после осаждения образцы растворяли в краске, содержащей 10 мМ; EDTA, 95% [v/v] деионизованного формамида, 0,3% [w/v] бромфенолового синего, 0,3% [w/v] ксиленцианола. Анализ продуктов обратной транскрипции проводили электрофорезом в 10% полиакриламидном голе, содержащем 7М мочевину. Протекание отдельных стадий трансляции идентифицировали методом радиоавтографии.

З.П5. Тестирование ОТРазной активности EF-G, индуцированной различными рибосомными комплексами.

Для реакции использовали 0,04 мкМ рибосом, polyU и тРНКр1к. Реакцию проводили в буфере 60 мМ Hepes-KOH (рН 7,6); 6 мМ MgCl2; 80 мМ NH4C1; 8 мМ р--меркаптоэтанол при 37°С. Рибосомы, тРНК и мРНК инкубировали 10 мин при 37°С, после чего добавляли EF-G до концентраций 0,0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 мкМ и 5-10 мкКи у-32Р-гуанозинтрифосфата до конечной концентрации 0,5 мМ. Реакцию останавливали через 20 минут добавлением равного объема 20% муравьиной кислоты. ОТРазную активность оценивали, исходя из данных тонкослойной хроматографии, которую проводили как: описано в [244]. Пластины с PEl-целлюлозным покрытием промывали буфером 50 мМ КН2РО4 рН 3.5, после высыхания наносили аликвоту образца, после высыхания нижний край пластины помещали в 50 мМ КН2РО4 рН 3.5 в хроматографической ванночке. После достижения фронтом уровня 1 см выше линии нанесения-образцов подвижную фазу заменяли на 500 мМ КЫ2РО4 рН 3.5. После окончания хроматографии пластины высушивали, распределение радиоактивности детектировали с помощью Phosphorlmager (Typhoon 8600, Molecular Dynamics), интенсивности рассчитывали на программе ImageQuant 5.2 (Molecular Dynamics).

3.1.6. Химический пробинг рибосомных структуры рибосом E.coli;несущих мутацию в спирали 38 23S рРНК.

В работе использовалась классическая5 методика пробинга- рибонуклеопротеидов; реагентами, специфичными для азотистых оснований - диметилсульфатом, кетоксалем: (3-этоксибутанон-2-аль-1) и водорастворимым карбодиимидом (1-Циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимидлге?то-/7-толуолсульфонат или СМСТ) [215].

3.1.6.1. Буферы и растворы.

Для приготовления буферов деионизованную воду (сопротивление^ 18 QOm,

Millipore) инкубировали 12 часов при; постоянном перемешивании с 1/1000 объема диэтилпирокарбоната (DEPC,. Sigma), - после чего автоклавировали 1 час на жидком цикле Весь пластик для? эксперимента был или одноразовый стерильный; или: автоклавированный.

Растворы и буферы, необходимые для пробинга структуры рибосомы приведены в таблице 3.1. Для обратной транскрипции с рРНК использовали набор олигодезокенрибонуклеотидных праймеров (Таблица 3.2). Конечная концентрация раствора котированного праймера была 0.19 - 0.20 пмоль/.мкл.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Кипарисов, Сергей Владиславович, 2005 год

1. Cech, T.R., Zaug, A.J., and Grabowski, P.J. (1981) In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor ofTetrahymena: involvement of a guanosine nucleotide in the excision of the intervening sequence. Cell 27: 487-496.

2. Hall, C.A. and Slayter, H.S. (1959) Electron microscopy of ribonucleoprotein particles from; E.coli. J.Mol. Biol. 1: 329-332.

3. Huxley, H.E. and Zubay, G. (1960) Electron microscope observations on the structure of microsomal particles from Escherichia coli. J.Mol. Biol. 2: 10-18.

4. Vasiliev, V.D. (1971) Electron microscopy study of 70S ribosomes of Escherichia coli. FEBS Lett. 14: 203-205.

5. Nonomura, Y., Blobel, G., and Sabatini, D. (1971) Structure of liver ribosomes studied by negative staining. J. Mol. Biol. 60: 303-323:

6. Vasiliev, V.D. (1974) Morphology of the ribosomal 30S subparticle according to electron: microscopy data. Л с/а 5/o/. Med. Germ. 33:119-192.

7. Lake, J. A. (1976) Ribosome structure determined by electron microscopy of Escherichia coli small subunits, large subunits and monomeric ribosomes. J. MoL Biol. 105: 131-159.

8. Vasiliev, V.D., Selivanova, O.M., and Ryazantsev, S.N. (1983) Structure of the Escherichia coli 50S ribosomal subunit J.Mol. Biol. 171: 561-569.

9. Unwin, P.N.T. (1977) Three-dimensional model of membrane bound ribosomes obtained by electron microscopy. Nature 269: 118-122.

10. Frank, J. (1989) Image analysis of single macromolecules. Electron Microsc. Rev. 2: 53-74.

11. Stark, H „ Mueller, F., Orlova, E.V., Schatz, M., Dube, P., Erdemir, Т., Zemlin, F., Brimacombe, R., and van Heel, M. (1995) The 70S Escherichia coli ribosome at 23 A resolution: fitting the ribosomal RNA. Structure 3: 815-821.

12. Berman, H.M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Bhat, T.N., Weissig, H., Shindyalov, I.N., and Bourne, H.R. (2000) The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research 28: 235-242.

13. Yonath, A.E., Mussig, J., Tesche, В., Lorenz, S., Erdmann, V.A., and Wittmann, H.G. (1980) Crystallization of the large ribosomal subunits from Bacillus stearothermophilus. Biochem. Int. 1: 428-435.

14. Trakhanov, S., Yusupov, M.M., Agalarov, S.C., Garber, M., Ryazantsev, S.N., Tischenko, S.V., and Shirokov, V.A. (1987) Crystallization of 70Sribosomes and 30Sribosomal subunits from Thermus thermophilus. FEBS Lett. 220: 319-322.

15. Юсупов, M.M., Траханов, С. Д., Барынин, В.В., Боровягин, В Л., Гарбер, М.Б., Седельникова, О.М., и др. (1987) Кристаллизация 30S рибосомных субчастиц из Т. thermophilus. Докл. Акад. Наук СССР 292: 1271 -1274.

16. Yusupov, M.M., Tischenko, S.V., Trakhanov, S.D., Ryazantsev, S.N., and Garber, M.B. (1988) A new crystalline form of 30 S ribosomal subunits from Thermus thermophilic. FEBS Letters 238: 113-115.

17. Yonath, A. and Wittmann, H.G. (1988) Approaching the molecular structure of ribosome. Biophys. Chem. 29: 17-29.

18. Garber, М/, Gongadze, G., Meshcheryakov, V., Nikonov, O., Nikulin, A., Perederina, A., Piendl, W., Serganov, A., and Tishchenko, S. (2002) Crystallization of RNA/protein complexes. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 58: 1664-1669.

19. Trakhanov, S., Yusupov, M., Shirokov, V., Garber, M., Mitschler, A., Ruff, M., Thierry, J.C., and Moras, D. (1989) Preliminary X-ray investigation of 70 S ribosome crystals from Thermus thermophilus. J. Mol. Biol. 209: 327-328.

20. Yusupov, M., Garber, M.B., Vasiliev, V.D., and Spirin, A.S. (1991) Thermus thermophilus ribosomes for crystallographic studies. Biochimie. 73: 887-897.

21. Yusupova, G., Yusupov, M., Spirin, A., Ebel, J.P., Moras, D:, Ehresmann, C., and Ehresmann, B. (1991) Formation and crystallization of Thermus thermophilus 70S ribosome/tRNA complexes. FEBS Lett. 290: 69-72.

22. Wimberly, В.Т., Brodersen, D.E., Clemons, W.M., Jr., Morgan-Warren, R.J., Carter, A.P., Vonrhein, C., Hartsch, Т., and Ramakrishnan, V. (2000) Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature 407: 327-339.

23. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2000) The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 289: 905-920.

24. Harms, J., Schluenzen, F., Zarivach, R., Bashan, A., Gat, S., Agmon, I., Bartels, H., Franceschi, F., and Yonath, A. (2001) High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell 107: 679-688.

25. Yusupov, M.M., Yusupova, G.Z., Baucom, A., Lieberman, K., Earnest, T.N., Cate, J.H., and Noller, H.F. (2001) Crystal Structure of the Ribosome at 5.5 A Resolution. Science 292: 883896.

26. Ramakrishnan, V. and Moore, P.B. (2001) Atomic structures at last: the ribosome in 2000. Curr. Opin. Struct. Biol. 11: 144-154.

27. Ban, N., Freeborn, В., Nissen, P., Penczek, P., Grassucci, R:A., Sweet, R., Frank, J., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (1998) A 9 A resolution X-ray crystallographic map of the large ribosomal subunit Cell 93: 1105-1115.

28. Gabashvili, I.S., Agrawal, R.K., Spahn, C.M., Grassucci, R:A., Svergun, D.I., Frank, J., and Penczek, P. (2000) Solution structure ofthe E. coli 70S ribosome at 11.5 A resolution. Cell 100: 537-549.

29. Lata, K.R., Agrawal, R.K., Penczek, P., Grassucci, R:, Zhu, J., and Frank, J. (1996) Three-dimensional reconstruction of the Escherichia coli 30 S ribosomal subunit in ice. J. Mol. Biol. 262:43-52.

30. Cate, J.H., Yusupov, M.M., Yusupova, G.Z., Earnest, T.N., and Noller, H.F. (1999) X-ray crystal structures of 70S ribosome functional complexes. Science 285: 2095-2104.

31. Svergun, D.I., Koch, M.H., Pedersen, J.S., and Serdyuk, l.N. (1994) Structural model of the 50 S subunit of Escherichia coli ribosomes from solution scattering. II. Neutron scattering study. J. Mol. Biol. 240: 78-86.

32. Nakagawa, A., Nakashima, Т., Taniguchi, M., Hosaka, H., Kimura, M., and Tanaka, I. (1999) The three-dimensional structure of the RNA-binding domain of ribosomal protein L2; a protein at the peptidyl transferase center of the ribosome. 18: 1459-1467.

33. Worbs, M;, Huber, R., and Wahl, M.C. (2000) Crystal structure of ribosomal protein L4 shows RNA-binding sites for ribosome incorporation and feedback control of the S10 operon. EMBOJ. 19:807-818.

34. Spillmann, S., Dohme, F., and Nierhaus, K.H. (1977) Assembly in vitro of the 50 S subunit from Escherichia coli ribosomes: proteins essential for the first heat-dependent conformational changq. J. Mol. Biol. 115: 513-523.

35. Bourne, H.R., Sanders, D.A., and McCormick, F. (1990) The GTPase superfamily: a conserved switch for diverse cell functions. Nature 348: 125-132.

36. Stark, H., Rodnina, M.V., Rinke-Appel, J., Brimacombe, R., Wintermeyer, W., and van Heel, M. (1997) Visualization of elongation factor Tu on the Escherichia coli ribosome. Nature 389: 403-406.

37. Moazed, D. and Noller, H.F. (1989) Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature 342: 142-148:

38. Rodnina, M.V., Pape, Т., Fricke, R., Kuhn, L., and Wintermeyer, W. (1996) Initial binding of the elongation factor Tu.GTP.aminoacyl-tRNA complex preceding codon recognition on the ribosome. J.Biol.Chem. 271: 646-652.

39. Valle, M., Sengupta, J., Swami, N.K., Grassucci, R.A., Burkhardt, N., Nierhaus, K.H., Agrawal, R.K., and Frank, J. (2002) Cryo-EM reveals an active role for aminoacyl-tRNA in the accommodation process. EMBO J. 21: 3557-3567.

40. Ramakrishnan, V, (2002) Ribosome structure and the mechanism of translation. Cell 108: 557-572.

41. Pape, Т., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (1998) Complete kinetic mechanism of elongation factor Tu-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A site of the E. coli ribosome. EMBO J. 17: 7490-7497.

42. Rodnina, M.V., Fricke, R., Kuhn, L., and Wintermeyer, W. (1995) Codon-dependent conformational change of elongation factor Tu preceding GTP hydrolysis on the ribosome. EMBO J. 14: 2613-2619.

43. Rodnina, M.V;, Pape, Т., Fricke, R., and Wintermeyer, W, (1995) Elongation factor Tu, a GTPase triggered by codon recognition on the ribosome: mechanism and GTP consumption. Biochem.CellBiol. 73: 1221-1227.

44. Savelsbergh, A., Katunin, V., Mohr, D., Peske, F., Rodnina, M., and Wintermeyer, W. (2003) An elongation factor G-induced ribosome rearrangement precedes tRNA-mRNA translocation. Mol. Cell 11: 1517-1523.55,56,57.58,59,60.63,64.