Ферментативные свойства pPHK метилтрансферазы RSMD Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Сергеева, Ольга Владимировна

• Сергеева, Ольга Владимировна
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Сергеева, Ольга Владимировна

Содержание

Список сокращений

Введение

Литературный обзор

Морфологические элементы рибосомы

Нуклеолитический процессинг рРНК

Сборка 30S субчастицы рибосомы

Рибосомные белки 30S субчастицы

Интермедиаты сборки 30S субчастицы

Процесс сборки центрального домена 16S рРНК

Кинетика связывания рибосомных белков с 30S субчастицей

Сборка 50S субчастицы рибосомы

Рибосомные белки 50S субчастицы

Интермедиаты сборки 50S субчастицы

Белки, участвующие в сборке рибосомы

Хеликазы

Шапероны

GTPasbi

Модификация нуклеотидов рРНК

Модификация 16S рРНК 30S субчастицы

т62А1518иш62А1519

m2G966 и т5С967

Модификация 16SрРНК, происходящая после сборки 30S субчастицы

m7G527

m2G1207

m4Cml402

m3U1498

m5C1407

m2G1516

Модификация 23SрРНК 50S субчастицы 42 ¥516 в 30S субчастице; ¥746, ¥955, ¥1911, т3¥1915, ¥1917, ¥2457,

¥2504, ¥2580, 2604, ¥2605 в 50S субчастице

m'G745

m5U747 и m5U1939

m6A1618

m2G1835

m5C1962

m6A2030, m7G2069, C*2501, D2449

Gm2251, Cm2498, Um2552

m2G2445

m2A2503

Ферментативная модификация рибосомных белков

Результаты и обсуждение

Постановка задачи 60 Образование стабильного комплекса между метилтрансферазой RsmD

и 30S субчастицами рибосомы

Комплексообразование в присутствии мРНК, тРНКи факторов инициации

Применение RsmD для сайт-специфического введения флуоресцентной метки 61 Определение константы диссоциации комплекса 30S субчастиц

с метилтрансферазой RsmD

Ферментативные свойства метилтрансферазы RsmD

Химический и ферментативный пробинг комплекса RsmD с 30S субчастщами

Изучение активного центра метилтрансферазы RsmD с помощью мутагенеза

Заключение

Материалы и методы

Реактивы

Буферы и растворы

Биопрепараты

Выделение 30S, 70S субчастиц рибосом wt и ARsmD

Введение мутаций в метилтрансферазу RsmD

Трансформация клеток Е. coli 95 Выделение рекомбинантных белков RsmD и мутантов PPF128-130AAS, F130S,

РР128-129АА, D58A, D58A/PP128-129AA

Электрофоретическое разделение белков в SDS-ПААГ 91 Выделение комплекса метилтрансферазы RsmD с 30S ArsmD

методом гель-фильтрации 98 Выделение комплекса метилтрансферазы RsmD с 30S ArsmD

методом ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы

Иммуноблотинг 100 Определение степени связывания тРНК с рибосомами

с помощью фильтрования через нитроцеллюлозные фильтры

Комплексообразование в присутствии факторов инициации, тРНК, мРНК

In vitro алкинилирование

Реакция Хьюсгена

In vitro инициация трансляции

Определение константы диссоциации комплекса 30S субчастиц с RsmD 103 Определение кинетических свойств метилтрансферазы RsmD

и мутантов РР128-129АА, D58A, D58A/PP128-129AA 104 Математическая обработка данных,

полученных с помощью счетчика радиоактивности

Химический и ферментативный пробинг комплекса RsmD с 30S субчастицами 105 Измерение скорости роста штаммов wt и ArsmD в условиях повышенной экспрессии

метилтрансфреразы RsmD и ее неактивного мутанта PPF128-130AAS

Изотермическое калориметрическое титрование

Выводы

Список литературы

Список сокращений

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомная РНК

мРНК - матричная РНК

тРНК - транспортная РНК

IF1, IF2, IF3 - факторы инициации 1, 2,

SAM - S-аденозилметионин

SAH - S-аденозилгомоцистеин

Sin - синефунгин

н. - нуклеотиды

Ka - константа диссоциации

Кт - константа Михаэлиса

kcat - каталитическая константа

G - гуанин или остаток гуанидиловой кислоты

GTP - гуанозинтрифосфорная кислота

АТР - аденозинтрифосфорная кислота

IPTG - изопропилтиогалактопиранозид

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Ферментативные свойства pPHK метилтрансферазы RSMD Escherichia coli»

1. Введение

Рибосома представляет собой нуклеопротеид, основной функцией которого является синтез белка, согласно информации, закодированной в мРНК. Рибосомная РНК содержит множество модифицированных нуклеотидов, которые располагаются преимущественно в функционально важных частях рибосомы. Наиболее часто встречающимися модифицированными нуклеотидами рРНК является псевдоуридин и нуклеотиды, метилированные по различным положениям гетероциклического основания или по 2' положению рибозы. Модификацию рРНК бактерий производят специализированные ферменты - рРНК-метилтрансферазы и псевдоуридинсинтазы, каждая из которых специфична для одного или нескольких модифицированных нуклеотидов. Модификация рРНК происходит на разных стадиях сборки субчастиц рибосомы, существуют ферменты, специфичные к рРНК, промежуточным интермедиатам сборки и уже собранным субчастицам. Функция некоторых модифицированных нуклеотидов заключается в обеспечении устойчивости бактерий к антибиотикам за счет изменения участка связывания антибиотика в рибосоме. Функция модифицированных нуклеотидов в рРНК Escherichia coli, не придающих клетке устойчивость к антибиотикам, изучена слабо. Отчасти это связано с недостатком данных о ферментах, осуществляющих модификацию рРНК. Знание о генах, кодирующих тот или иной фермент, дает возможность получать штаммы клеток, лишенных любой конкретной модификации, что может помочь в определении функции модифицированного нуклеотида, а также уточнить некоторые стадии сборки рибосомы. Изучение рРНК метилтрансфераз важно для понимания механизмов появления антибиотикорезистентности. Во многих случаях, появление устойчивых к антибиотикам штаммов обусловлено появлением специфических метилтрансфераз, модифицирующих рибосомную РНК. Также возможно, что некоторые рРНК метилтрансферазы, не несущие функцию защиты от антибиотиков, служат природным резервуаром для эволюции генов устойчивости к антибиотикам.

В рамках данной диссертационной работы охарактеризованы ферментативные свойства метилтрансферазы RsmD, модифицирующей гуанозин, расположенный в Р-участке рибосомы.

2. Литературный обзор

2.1 Морфологические элементы рибосомы

Рибосомы представляют собой самую распространенную молекулярную машину клетки, основной функцией которой является синтез белков. Поэтому основная масса клеточной РНК представляет собой именно рибОсомную PI 1К.

Рибосома состоит из двух неравных субъединиц, которые легко обратимо диссоциируют на малую (рис. 1 А) и большую (рис. 1 Б) субъедипины. У кишечной палочки (Escherichia coli) они называются 5GS и 30S в соответствии со своими коэффициентами седиментации [ 1 ]. Размер полной нрокарнотической рибосомы составляет 20 х 17 х 17 им. Малая рибоеомная субчастица имеет длину около 23 им, а ширину - 12 им.

А

Б

Центр альиый протуберанец

Рис. 1. Основные морофологические элементы малой 3QS [2] (А) и большой 50S (Ь) субчастиц рибосомы. Су б частицы представлены так. как если бы на малую субчастицу смотрели со стороны большой, а на большую со стороны малой. В. Кристаллическая структура 70S рибосомы Е. coli. Малая субчастица слева. 16S рРНК показана синим, S-белки показаны оранжевым. Большая субчастица справа. 23S рРНК доказана красным. 5S покачана розовым, L-белки - зеленым.

Основной компонент малой субчастицы рибосомы - 16S рибосомная PliK (рРНК) длиной 1542 нуклеотида (рис. 2 А). Помимо 16S рРНК в состав малой субчастицы входит 21 белок (от S1 до S21. в порядке увеличения своей электрофоретической Подвижности) [3]. В состав большой субчастицы входит две рРНК - 23S, состоящая ич 2904 нуклеотидов, и 5S - из 120 нуклеотидов (рис. 2Б). а также 33 белка (L1-L36).

А

cTteXJOO ЦЕНТРАЛЬНЫЙ М ДОМЕН Е? ?

Я-

Б

III ДОМЕН

IV ДОМЕН

5 -КОНЦЕВОЙ ь~ ДОМЕН

ГЛАВНЫЙ 3 -КОНЦЕ НОИ ДОМЕН

МАЛЫЙ 3 -КОНЦЕВОЙ ДОМЕН

5S рРНК

I ДОМЕН

Рис. 2. А. Схема вторичной структуры 16S рРНК [4]. Обозначены домены вторичной структуры, В. Схема вторичной структуры 23S рРНК и 5S рРНК [5].

Различные домены вторичной структуры 16S рРНК соответствуют крупным пространственным блокам 30S субчастицы. 5'-концевой домен 16S рРНК образует '"тело" и "плечо", центральный домен образует "платформу", содержащую последовательность анти Шайн-Дальгарно, главный 3'-концевой домен - "[олову", а матый З1-концевой домен 16S рРНК располагается на границе с 50S субчастицей и входит в состав "тела" 30S субчастицы. В составе 30S субчастицы также можно отметить ту ннель, в ходе трансляции содержащий 3'-концевую часть мРНК, "шпору", образованную спиралью 6 16S рРНК, и "шею", образованную спиралью 28 16S рРНК. Глобулярные домены рибосомных белков располагаются на периферии субчастицы с цитоплазмагической стороны, обращенной от 50S субчастицы. Белки, обращенные к 50S субчастицс. например, S12 и SI3, имеют важное функциональное значение. Основная функция 3QS субчастицы - считывание

15 пространственной структуре большой субчастицы можно выделить характерные выступы: L1 и L7/L12 "пальцы" и центральный протуберанец, образованный 5S рРНК и белками L5. L18 и L25. Кроме того, в структуре 50S субчастицы видна ложбина, в глубине которой располагается каталитический пептидилтранеферазный центр рибосомы (ПТЦ). От ПТЦ, к цитоплазматической стороне 50S субчастицы идет сквозной туннель, служащий для выхода синтезируемого пептида. Длина туннеля около 100 Á, диаметр около 25 Л и он может вмещать пептид длиной 40 аминокислот. Обе субчастицы образуют тРНК

мРНК.

связывающие участки А, Р и Е, через которые последовательно проходят тРНК при синтезе полипептида [6].

2.2 Нуклеолитический процессинг рРНК

Все три рРНК (168, 238, синтезируются в виде одного транскрипта (рис. 3) [7]. Созревание транскрипта, образование локальных элементов вторичной структуры и связывание первых рибосомных белков начинается до окончания процесса транскрипции рРНК. Одновременно с этим происходит ферментативная модификация определенных нуклеотидов.

Рис. 3. rrnB оперон. Отмечены промотеры рРНК и тРНК - PI и Р2, соответствующие терминаторы - Т1 и Т2, сайты процессинга РНКазы III (III), РНКазы G (G), РНКазы Е (Е), РНКазы Р (Р), РНКазы Т (Т), и некоторых неизвестных РНКаз.

Первой эндорибонуклеазой, которая разрезает рРНК транскрипт, является РНКаза III [8]. Она отделяет предшественник рРНК от тРНК. В процессе транскрипции последовательности, фланкирующие 16S и 23 S рРНК, образуют структуру двойной спирали. Именно этот элемент узнается РНКазой III [9]. В итоге образуются предшественники 16S рРНК (17S рРНК), 23S рРНК, 5S рРНК (9S) и нескольких тРНК. Для образования 16S рРНК РНКазы Е, G и еще несколько неизвестных удаляют 115 нуклеотидов с 5'-конца и 33 нуклеотида с 3'-конца. Созревание 23S рРНК инициируется РНКазой III. После вырезания РНКазой III, 23S рРНК содержит 3 или 7 лишних нуклеотидов на 5'-конце и 7 или 9 - на 3' [10]. Конечный процессинг 5'-конца выполняется пока неизвестным ферментом, а за созревание 3'-конца отвечает

экзорибонуклеаза РНКаза Т. После разрезания РНКазой III, с 3'-стороны от предшественника 5S рРНК остаются одна или две последовательности тРНК. 5'—конец тРНК процессируется с помощью РНКазы Р, что приводит к образованию 9S рРНК, включающую 84 дополнительных нуклеотида на 5'-конце и 42 - на 3'-конце [11]. Финальный процессинг осуществляется экзорибонуклеазами РНКазой Т и пока неизвестной РНКазой (рис. 4) [12, 13, 14].

РНКаза G

РНКаза Е

РНКаза «I

16S

t 33». 4

? РНКаза III

■ 5' J' ■

■ 3' 5' -

f iff РНКаза Т РНКаза 111

?РНКазаЕ

РНКаза Ш

5S

/

РНКаза Т

4

РНКаза Е РНКаза 111

Рис. 4. Созревание рРНК. Изначально транскрибируемая в виде одного предшественника, рРНК разрезается несколькими РНКазами. Знак «?» обозначают сайт разрезания до сих пор не идентифицированного фермента, зеленые стрелки обозначают сайты разрезания, оранжевым цветом обозначены финальные продукты [14].

2.3 Сборка 305 субчастицы рибосомы

2.3.1 Рибосомные белки ЗОБ субчастицы

Сборка рибосомы представляет собой сложный и точно координированный процесс. Основные этапы включают: а) транскрипцию, процессинг и модификацию рРНК,

б) синтез и модификацию рибосомных белков, в) сворачивание (фолдинг) рРНК и рибосомных белков, г) связывание рибосомных белков с рРНК, д) связывание дополнительных белков, участвующих в сборке. Многие из этих этапов выполняются одновременно [15].

Белки, взаимодействующие с I6S рРНК классифицируют несколькими способами. Можно группировать белки но области рРНК, с которой они связываются: с 5'-концевым доменом рРНК, 3'-концевым доменом илицентральпым доменом рРНК. Второй тип классификации - по очередности связывания: белки, связывающиеся непосредственно с рРНК - первичные; связывающиеся после первичных - вторичные; третичные - белки, связывающиеся последними [16].

Для описания процесса формирования 30S субчастицы была предложена схема, основанная на экспериментах Иомуры по реконструкции 30S субчастицы в опытах in vitro (рис. 5). Эта схема не учитывает множества факторов, действующих в живой клетке.

А

/домен Центральный домен з' домен

$17 820

S7

Г

56:S18 S9 S13 S19 2"

/

Рис. 5. Карта Номуры [17]. 1° - первичпо связывающиеся белки, 2° - вторично связывающиеся белки, 3° -третично связывающиеся белки.

К белкам, связывающимся непосредственно с 168 рРНК, относятся 54, 87, 88. 815, 817 и 820. Комплекс белка 84 с 5"-концевой частью 168 рРНК может образоваться при пониженной температуре. Далее, как было показано с помощью опытов по химической

модификации рРНК (футиринтингу), при нагревании происходят конформационные изменения комплекса, которые укрепляют взаимодействие белка с РНК, а также способствуют связыванию вторичного белка 816 и третичного белка 812 (рис, 5). Вели на1реть 84 и 168 рРНК по-отдельности, а затем смешать, то коиформациошше изменения не произойдут и следующие белки не свяжутся (рис. 6).

!—i€

tf a "S

\ \

ч I W

ai*" ^O

Jf»'

53

t* '/

Г W

l

ss

Й

Л ÇÎÎ,»

T ' ^ :

_ tu

Ч Л .-Î

© *

m

/2 *

s

i

• и ° 1

. я s

¡¡['Л.щ

С

//штГ .1

Рис. 6. Взаимодействия рибосомных белков с рРНК. 2Е) представление 168 рРНК. цветом выделены белки и нуклеотиды, находящиеся с ними и контакте, серым цветом обозначены нуклеотиды, взаимодействующие с несколькими рнбосомными белками.

Исследование связывания остальных первичных белков оыявило подобную иерархию взаимодействия. Связывание S17 и S20 с 5'-доменом 16S рРНК не является температурЯО—зависимым, тогда как для взаимодействия S8 и S15 с центральным доменом методом химического пробинга были показаны некоторые отличия, проявляющиеся при нагревании образца [18]. Взаимодействие 87 с 3'-доменом происходит так же, как и для

S4 с 5*—Доменом. Можно сделать вывод, что одна из ролей первичных белков -обеспечение определенной koi[формации РНК. позволяющей связывать последующие белки. Сайт-направленный гидроксмл-радикальный пробинг окружения белка S15 показал, что хотя S8 не является посредником для его связывания, он все равно влияет на организацию РНК вокруг S15. Подобные исследования окружения S20 показали, что его контакты с 5'-доменом рРНК образуются в начале сборки, а взаимодействие с 3'-минорным доменом (спираль Н44-нуклеотид С1399) уже после этого, соответственно с направлением сборки от 5"-конца к 3'-концу [19J.

2.3.2 Промежуточные интермедиаты сборки 30S субчастицы

При реконструкции 30S субчастицы рибосомы in vitro было замечено образование двух промежуточных интермедиатов, образующихся при разной температуре. При низких температурах от 0°С до )5°С можно зафиксировать интермедиат (RI), состоящий из 16S рРНК и 15 рибосомпых белков, которые осаждаются в соответствии с коэффициентом седиментации 21S-22S, Реконструкция 30S субчастицы не может быть закончена, пока температура не повысится до 40°С. При 40°С дополнительные белки взаимодействуют с интермедиатом RI, происходят конформанионные изменения и образуется интермедиат RI* с коэффициентом седиментации 25S-26S. К интермедиату RI* присоединяются оставшиеся белки и образуется активная 30S субчастица (рис. 7) [20|.

21S-22S 2S5-26S

+ R'30 Rijo* -^->305

+6 белков

Рис. 7. Схема сборки 30S субчастицы in vitro.

Достаточно сложно изучать сборку 30S субчастицы те vivo, так как интермедиаты сложно зафиксировать при нормальных условиях роста клеток. Интермедиаты можно обнаружить с помощью сахарозного градиента цитоплазмы клеток штаммов, имеющих холод о- или термочувствительные мутации в компонентах рибосомы. В штаммах дикого типа интермедиаты можно зафиксировать методом импульсного мечения радиоактивными и стабильными изотопами. Таким образом, in vivo были обнаружены два интермедиата для 30S субчастиц (pl30S и p230S) (рис. 8) [21, 15].

pi 6S pPHK

+ 10 бел кое

21S 30S > p,30S -p230S

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Сергеева, Ольга Владимировна

5. Выводы

1. Метилтрансфераза RsmD образует прочный комплекс с 30S субчастицами, выделенными из штамма Е. coli, лишенного гена RsmD, стабильный в условиях ультрацентрифугирования.

2. Константа диссоциации комплекса метилтрансферазы RsmD с 30S субчастицами - 20-30 нМ; константа Михаэлиса - 3 нМ, каталитическая константа - 0.03 мин"1.

3. Константа диссоциации комплекса метилтрансферазы RsmD с ко-факторами SAM - 0,58 рМ, SAH - 2,5 рМ; с ингибитором синефунгином - 5 рМ.

4. Активный центр метилтрансферазы RsmD необычно устойчив к мутациям, мутации F130S, РР128-129АА, D58A, D58A/PP128-129AA не подавляют активность фермента, только тройная мутация PPF128-130AAS инактивирует фермент.

5. Константы диссоциации комплексов кофактора SAM с активными мутантами метилтрансферазы RsmD: РР128-129АА - 0,55 рМ, D58A - 0,37 рМ.

6. Константы Михаэлиса и каталитические константы комплексов 30S субчастиц с мутантами метилтрансферазы RsmD: D58A - 0,2 рМ и 0,05 мин"1; РР128-129АА - 5 нМ и 0,01 мин"1; D58A/PP128-129AA - 0,1 рМ и 0,038 мин"1.

7. При связывании метилтрансферазы RsmD с 30S субчастицами нуклеотидные остатки А968, А969, С970 16S рРНК экранируются от действия модифицирующих реагентов и РНКаз.

8. Метилтрансфераза RsmD может использовать алкинильное производное SAM (пент-2-ен-4-инил8-аденозилгомоцистеин) в качестве донора алкинильного радикала и переносить его на экзоциклическую аминогруппу нуклеотида G966 16S рРНК в составе 30S субчастицы, неметилированной по этому остатку.

3.8 Заключение

Метилтрансфераза RsmD является эффективным ферментом, образующим прочные комплексы как с S-аденозилметионином, так и с 30S субчастицами рибосомы. Константа диссоциации комплекса метилтрансферазы RsmD с 30S субчастицами рибосомы составляет 20-30 нМ в присутствии нереакционноспособных аналогов S-аденозил метионина. Также были определены константы диссоциации метилтрансферазы с кофактором SAM и его аналогами - SAH и синефунгином, которые составили 0,58 цМ, 2,5 и 5 цМ соответственно. Метилтрансфераза взаимодействует с 30S субчастицей в районе Р-участка, месте связывания тРНК и мРНК. Однако только факторы инициации IF2 и IF3 вместе с тРНК и мРНК полностью вытесняют RsmD из комплекса с 30S субчастицей.

В ходе работы мы проверили возможность использования метилтрансферазы для переноса алкинильного радикала с модифицированного SAM - пент-2-ен-4-инил-8-аденозилгомоцистеина, чтобы в дальнейшем использовать алкинильную группу для реакции Хьюсгена с получением флуоресцентного производного 30S субчастиц. Метилтрансфераза RsmD оказалась способна переносить алкинильный радикал, выход данной реакции составил 88%. Также эффективным было введение флуоресцентной метки в полученные производные 30S субчастицы. Тем не менее, использование предложенной схемы введения флуоресцентной метки оказалось в целом малопригодным из-за деградации 30S субчастиц в условиях реакции 3+2 циклоприсоединения.

Были определены кинетические характеристики RsmD: константа Михаэлиса составила 3 нМ, а каталитическая константа 0,028 мин"1. По-видимому, кинетические характеристики RsmD связаны с ограниченным периодом модификации G966: после сборки 30S субчастиц и до начала формирования инициаторного комплекса.

На основании данных химического и ферментативного пробинга мы предложили модель связывания метилтрансферазы RsmD в полости 16S рРНК, так как происходит изменение реакционной способности нуклеотидов по обеим сторонам полости: А968, А969, С970, А790.

Было проведено исследование центра связывания SAM метилтрансферазы RsmD. Оказалось, что для получения неактивного мутанта необходима замена трех аминокислот - PPF128-130AAS. Ни одиночная, ни двойная мутации не приводят к инактивации фермента. Для активных мутантов метилтранеферазы были определены константы диссоциации комплексов с SAM и кинетические характеристики комплексов с 30S субчастицами рибосомы.

Таким образом, была охарактеризована метилтрансфераза RsmD и изучен центр связывания ко-фактора S-аденозилметионина.

4. Материалы и методы

4.1 Реактивы

В работе были использованы следующие реактивы: рибонуклеозидтрифосфаты, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (Roche, Fermentas); 1,4-дитиотреитол (DTT), 2-меркаптоэтанол, N ,N,N' ,N' -тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), изопропил-ß-D-тиогалактопиранозид (IPTG), 5-Бром-4-хлор-3-индолил-Р-0-галактозид (X-GAL), (Fermentas); этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (Amresco); лизоцим (Boehringer Mannheim); ампициллин, канамицин, хлорамфеникол, спектиномицин, стрептомицин, спермин, спермидин, бромфеноловый синий, ксиленцианол, S-аденозил метионин (SAM), S-аденозилгомоцистеин (SAH), синефунгин (Sin), L-триптофан, Ь-(+)-арабиноза, 2,2-бис-(гидроксиметил)-2,2',2"-нитрилотриэтанол (bis Tris), додецилсульфат натрия (SDS) (Sigma); ангидротетрациклин (АНТ) (IBA); додецилсульфат натрия, акриламид, N,N'-метиленбисакриламид, мочевина, сахароза (Gibco BRL); персульфат аммония, ацетат натрия, хлорид аммония, хлорид натрия, глицерин (Merck); дрожжевой экстракт и бакто-триптон (DIFCO lab); RNeasy mini kit (Qiagen); набор для сайт-направленного мутагенеза QuickChange (Stratagene); Ni-нитрилоацетат-агароза (Qiagen); [3H]Met-TPHKfMet и fMet-TPHKfMet E. coli были любезно предоставлены Дмитрием Бураковским (Гёттинген, Германия); [3H]SAM (Perkin Elmer), y-[32P]GTP (Amersham). В работе использовали ферменты фирм: Promega (США), Gibco BRL (США), GE Healthcare (США), New England Biolabs (Англия), Roche (Франция), MBI Fermentas (Литва). Другие использованные реактивы и соли были производства фирм Merck и Serva.

4.2 Буферы и растворы

Микробиологические среды:

LB: 1 % [w/v] бакто-триптона, 0,5 % [w/v] дрожжевого экстракта, 171 мМ NaCl. Агаризованные среды: LB с добавлением 1.5% бактоагара.

SOB: 2% бакто-триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 8,55 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 0,5 мМ MgCl2.

Буфер для приготовления компетентных клеток ТВ: 10 мМ PIPES рН 6,7; 15 мМ СаС12, 250 мМ КС1, 55 мМ МпС12.

Растворы для электрофореза: Агарозный гель: 0,8-2% агароза, 100 мМ Tris-HCl, 100 мМ Н3В03, 2 мМ EDTA, 0,05 мкг/мл этидийбромид.

Буфер для внесения образцов в агарозный гель: 50% глицерин; ТВЕ; 0,1% бромфеноловый синий; 0,1% ксиленцианол.

ТВЕ: 100 мМ Tris-HCl, 100 мМ Н3В03, 2 мМ EDTA .

Буфер для нанесения продуктов обратной транскрипции: 0,1% бромфеноловый голубой, 0,1% ксиленцианол, 20 мМ EDTA, 98% формамид. Полиакриламидные гели для разделения белков:

Разделяющий: 10% полиакриламид в смеси с 1/30 бисакриламида, 0,375 М Tris-HCl рН 8,8; 0,1% SDS; 0,1% персульфат аммония; 0,03% ТЕМЕД.

Концентрирующий: 5% полиакриламид в смеси с 1/30 бисакриламида; 0,125 М Tris-HCl рН 6,8; 0,1% SDS; 0,1% персульфат аммония; 0,03% ТЕМЕД. Буфер для электрофореза: 25 мМ Tris; 250 мМ глицин; 0,1% SDS.

Буфер для нанесения: 50 мМ Tris-HCl рН 6,8; 100 мМ DTT, 2% SDS, 0,1% бромфеноловый голубой, 10% глицерин.

Буфер для прокрашивания белков: 0,25% кумасси голубой R250, 45% этанол, 10% уксусная кислота.

Буфер для внесения РНК: 7 М мочевина, 50% глицерин, ТВЕ, 0,1% бромфеноловый синий, 0,1% ксиленцианол.

Буфер для внесения ДНК: 98% формамид, 0,025% SDS, 0,5 мМ EDTA, 0,1% бромфеноловый синий, 0,1% ксиленцианол. Буферы для выделения рибосом:

Ml буфер: 20 мМ HEPES-KOH рН 7,5; 1 мМ Mg(OAc)2, 200 мМ NH4OAc, 4 мМ р-меркаптоэтанол.

М10 буфер: 20 мМ HEPES-KOH рН 7,5; 10 мМ Mg(OAc)2, 200 мМ NH4OAc, 4 мМ 0-меркаптоэтанол.

М20 буфер: 20 мМ HEPES-KOH рН 7,5; 20 мМ Mg(OAc)2, 200 мМ NH4OAc, 4 мМ р. меркаптоэтанол.

Буфер НАКМ7: 50 мМ Tris, 70 мМ NH4C1, 30 мМ КС1, 7 мМ Mg(OAc)2. Буфер НАКМ20: 50 мМ Tris, 70 мМ NH4C1, 30 мМ КС1, 20 мМ Mg(OAc)2. Буферы для выделения белков:

Буфер для лизиса: 20 мМ Hepes-KOH (рН 7,5), 200 мМ NH4OAc, 10 мМ имидазол, 0,1% Triton XI00, 1 мг/мл лизоцим.

Буфер для промывки: 20 мМ Hepes-KOH (рН 7,5), 200 мМ NH4OAc, 40 мМ имидазол, 0,1% Triton XI00.

Буфер для элюции: 20 мМ Hepes-KOH (рН 7,5), 200 мМ NH4OAc, 0,1% Triton ХЮО, 500 мМ имидазол.

Буфер для диализа: 20 мМ Hepes-KOH (рН 7,5), 1 мМ Mg(OAc)2, 200 мМ NH4OAc, 10% глицерин, 0,1% Triton ХЮО.

Реактив Брэдфорда: 0,1 мг/мл Coomassie G250, 10% НзР04, 5% EtOH.

TBS 1 ООмМ Tris-HCl; 1,5 мМ NaCl.

TBS-T 10 мМ Tris-HCl; 0,15 мМ NaCl; 0,1% [w/v] Tween 20.

Растворы и буферы, необходимые для пробинга структуры рибосомы приведены в таблице 11. Для приготовления буферов деионизованную воду (сопротивление^ 18 Ом, Millipore), весь пластик для эксперимента был стерильный одноразовый или автокл авированный.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Сергеева, Ольга Владимировна, 2012 год

6. Список литературы

1. Yusupov M., Yusupova G., Baucom A., Lieberman K., Earnest T. Crystal structure of the ribosome at 5.5 angstrom resolution. (2001). Science. 292: p. 883-96.

2. Wimberly B., Brodersen D., demons W., Morgan-Warren R., Carter A. Structure of the 30S ribosomal subunit. (2000). Nature. 407: p. 327-39.

3. Paul B., Ross W., Gaal T., Gourse R. rRNA transcription in Escherichia coli. (2004). Annu. Rev. Genet. 38: p. 749-70.

4. Cannone J., Subramanian S., Schnare M., Collett J., D'Souza L., Du Y., Feng B., Lin N., Madabusi L., Muller K., Pande N., Shang Z., Yu Nand, Gutell R. The comparative RNA web (CRW) site: an online database of comparative sequence and structure information for ribosomal, intron, and other RNAs. (2002). BMC Bioinformatics. 3: p. 2.

5. Wimberly B., Brodersen D., Clemons W., Morgan-Warren Jr., Carter A., Vonrhein C., Hartsch T, Ramakrishnan V. Structure of the 30S ribosomal subunit. (2000). Nature. 407(6802): p. 32739.

6. Klein D., Moore P., Steitz T. The roles of ribosomal proteins in the structure assembly, and evolution of the large ribosomal subunit. (2004). J Mol Biol. 340(1): p. 141-77.

7. Schuwirth B., Borovinskaya M., Hau C., Zhang W., Vila-Sanjurjo A., Holton J., Cate J. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 A resolution. (2005). Science. 310: p.827-834.

8. Williamson J. After the ribosome structure: how are the subunits assembled? (2003). RNA. 9: p. 165-167.

9. Bram R., Young R., Steitz J. The ribonuclease III site flanking 23S sequences in the 30S ribosomal precursor RNA of E. coli. (1980). Cell. 19: p. 393^01.

10. Liiv A., Remme J. Importance of transient structures during post-transcriptional refolding of the pre-23S rRNA and ribosomal large subunit assembly. (2004). J. Mol. Biol. 342: p.725-741.

11. Young R., Steitz J. Complementary sequences 1,700 nucleotides apart from a ribonuclease III cleavage site in Escherichia coli ribosomal precursor RNA. (1978). Proc. Natl. Acad. Sci. 75: p. 3593-3597.

12. Ghora B., Apirion D. Identification of a novel RNA molecule in a new RNA processing mutant of Escherichia coli which contains 5S ribosomal RNA sequences. (1979). J. Biol. Chem. 254: p. 1951-56.

13. Li Z., Deutscher M. The tRNA processing enzyme RNase T is essential for maturation of 5S RNA. (1995). Proc. Natl. Acad. Sci. 92: p. 6883-86.

14. Shajani Z., Sykes M., Williamson J. Assembly of Bacterial Ribosomes. (2011). Annu. Rev. Biochem. 80: p. 501-26.

15. Sykes M., Williamson J. A Complex Assembly Landscape for the 30S Ribosomal Subunit. (2009). Annu. Rev. Biophys. 38: p. 197-215.

16. Grondek J., Culver G. Assembly of the 30S ribosomal subunit: positioning ribosomal protein S13 in the S7 assembly branch. (2004). RNA. 10: p. 1861-66.

17. Held W., Mizushima S., Nomura M. Reconstitution of Escherichia coli 30S ribosomal subunits from purified molecular components. (1973). J. Biol. Chem. 248: p. 5720-30.

18. Jagannathan I., Culver G. Assembly of the central domain of the 30S ribosomal subunit: roles for the primary binding ribosomal proteins S15 and S8. (2003). J. Mol. Biol. 330: p. 373-83.

19. JagannathanL,Culver G. Ribosomal protein dependent orientation of the 16S rRNA environment of S15. (2004). J. Mol. Biol. 335: p. 1173-85.

20. Held W., Nomura M. Rate determining step in the reconstitution of E. coli 30S ribosomal subunits. (1973). Biochemistry. 12: p. 3273-81.

21. Nierhaus K. The assembly of the prokaryotic ribosome. (1980). BioSystems.12: p. 273-82.

22. Bunner A., Nord S., Wikstrom M., Williamson J. The effect of ribosome assembly cofactors on in vitro 30S subunit reconstitution. (2010). J. Mol. Biol. 398: p. 1-7.

23. Batey R., Williamson J. Interaction of the Bacillus stearothermophilus ribosomal protein S15 with 16S rRNA: Defining the minimal RNA site. (1996). J. Mol. Biol. 261: p. 536-49.

24. Agalarov S., Sridhar Prasad G., Funke P., Stout C., Williamson J. Structure of the SI5, S6, SI 8-rRNA complex: assembly of the 30S ribosome central domain. (2000). Science 288: p. 107-13.

25. Talkington M., Siuzdak G., Williamson J. An assembly landscape for the 30S ribosomal subunit. (2005). Nature. 438: p. 628-32.

26. Nierhaus K., Dohme F. Total reconstitution of functionally active 50S ribosomal-subunits from Escherichia coli. (1974). Proc. Natl. Acad. Sci. 71: p. 4713-17.

27. Sieber G., Nierhaus K. Kinetic and thermodynamic parameters of assembly in vitro of large subunit from Escherichia coli ribosomes. (1978). Biochemistry. 17: p. 3505-11.

28. Hayes F., Hayes D. Biosynthesis of ribosomes in E. coli. I. Properties of ribosomal precursor particles and their RNA components. (1971). Biochimie. 53: p. 369-82.

29. Lindahl L. Two new ribosomal precursor particles in E. coli. (1973). Nat. New Biol. 243: p. 170-72.

30. Lindahl L. Intermediates and time kinetics of in vivo assembly of Escherichia coli ribosomes. (1975). J. Mol. Biol. 92: p. 15-37.

31. Tanner N., Cordin O., Banroques J., Doere M., Linder P. The Q motif: a newly identified motif in DEAD box helicases may regulate ATP binding and hydrolysis. (2003). Mol. Cell. 11: p. 12738.

32. Elles L., Sykes M., Williamson J., Uhlenbeck O. A dominant negative mutant of the E. coli RNA helicase DbpA blocks assembly of the 50S ribosomal subunit. (2009). Nucleic Acids Res. 37: p. 6503-14.

33. Charollais J., Pflieger D., Vinh J., Dreyfus M., lost I. The DEAD-box RNA helicase SrmB is involved in the assembly of 50S ribosomal subunits in Escherichia coli. (2003). Mol. Microbiol. 48: p. 1253-65.

34. Charollais J., Dreyfus M., lost I. CsdA, a cold-shock RNA helicase from Escherichia coli, is involved in the biogenesis of 50S ribosomal subunit. (2004). Nucleic Acids Res. 32: p. 2751-59.

35. Jagessar K., Jain C. Functional and molecular analysis of Escherichia coli strains lacking multiple DEAD-box helicases. (2010). RNA. 16: p. 1386-92.

36. Jain C. The E. coli RhIE RNA helicase regulates the function of related RNA helicases during ribosome assembly. (2008). RNA. 14: p. 381-89.

37. El Hage A., Sbai M., Alix J. The chaperonin GroEL and other heat-shock proteins, besides DnaK, participate in ribosome biogenesis in Escherichia coli. (2001). Mol. Gen. Genet. 264: p. 796-808.

38. AI Refaii A., Alix J. Ribosome biogenesis is temperature-dependent and delayed in Escherichia coli lacking the chaperones DnaK or DnaJ. (2009). Mol. Microbiol. 71: p. 748-62.

39. El Hage A., Sbai M., Alix J. The chaperonin GroEL and other heat-shock proteins, besides DnaK, participate in ribosome biogenesis in Escherichia coli. (2001). Mol. Gen. Genet. 264: p. 796-808.

40. Alix J., Guerin M. Mutant DnaK chaperones cause ribosome assembly defects in Escherichia coli. (1993). Proc. Natl. Acad. Sei. 90: p. 9725-29.

41. Britton R. Role of GTPases in bacterial ribosome assembly. (2009). Annu. Rev. Microbiol. 63: p. 155-76.

42. Himeno H., Hanawa-Suetsugu K., Kimura T., Takagi K., Sugiyama W. A novel GTPase activated by the small subunit of ribosome. (2004). Nucleic Acids Res. 32: p. 5303-9.

43. Hwang J., Inouye M. An essential GTPase, Der, containing double GTP-binding domains from Escherichia coli and Thermotoga maritima. (2001). J. Biol. Chem. 276: p. 31415-21.

44. Hwang J., Inouye M. A Bacterial GAP-Like Protein, Yihl, Regulating the GTPase of Der, an Essential GTP-Binding Protein in Escherichia coli. (2010). J. Mol. Biol. 399: p. 759-772.

45. Hwang J., Inouye M. The tandem GTPase, Der, is essential for the biogenesis of 50S ribosomal subunits in Escherichia coli. (2006). Mol. Microbiol. 61:1660-72.

46. Jiang M., Datta K., Walker A., Strahler J., Bagamasbad P. The Escherichia coli GTPase CgtAE is involved in late steps of large ribosome assembly. (2006). J. Bacteriol. 188: p. 6757-70.

47. Woodson S. RNA folding and ribosome assembly. (2008). Curr Opin Chem Biol. 12(6): p. 667673.

48. Mangat C., Brown E. Ribosome biogenesis; the KsgA protein throws a methyl-mediated switch in ribosome assembly. (2008). Molecular Microbiology. 70(5): 1051-1053.Chow C., Lamichhane T., Mahto S. Expanding the Nucleotide Repertoire of the Ribosome with Post-Transcriptional Modifications. (2007). ACS Chem Biol. 2(9): 610-619.

49. Desai P., Rife J. The adenosine dimethyltransferase KsgA recognizes a specific conformational state of the 30S ribosomal subunit. (2006). Archives of Biochemistry and Biophysics. 449: p. 57-63.

50. Hou Y., Perona J. Stereochemical mechanisms of tRNA methyltransferases. (2010). FEBS Lett. 584: p. 278-286.

51. Mangat C., Brown E. Ribosome biogenesis; the KsgA protein throws a methyl-mediated switch in ribosome assembly. (2008). Mol Microbiol. 70(5): p. 1051-1053.

52. O'Farrell H., Scarsdale J., Rife J. Crystal Structure of KsgA, a Universally Conserved rRNA Adenine Dimethyltransferase in Escherichia coli. (2004). J. Mol. Biol. 339: p. 337-353.

53. Denoya C., Dubnau D. Site and substrate specificity of the ermC 23S RNA methyltransferase. (1987). J. Bacteriol. 169(8): p. 3857.

54. Sergiev P., Bogdanov F., Dontsova O. Ribosomal RNA guanine-(N2)-methyltransferases and their targets. (2007). Nucl Ac Res. 35(7): p. 2295-2301.

55. Tscherne J., Nurse K., Popienick P., Michel H., Sochacki M., Ofengand J. Purification, Cloning, and Characterization of the 16S RNA m5C967 Methyltransferase from Escherichia coli. (1999). Biochemistry. 38: p. 1884-1892.

56. Weitzmann C., Tumminia S., Boublik V., Ofengand J. A paradigm for local conformational control of function in the ribosome: binding of ribosomal protein S19 to Escherichia coli 16S rRNA in the presence of S7 is required for methylation of G966 and blocks methylation of C967 by their respective methyltransferases. (1991). Nucl Ac Res. 19(25): p. 7089- 7095.

57. Terribilini M., Lee J., Yan C., Jernigan R., Honavar V., Dobbs D. Prediction of RNA binding sites in proteins from amino acid sequence. (2006). RNA. 12: p. 1450-1462.

58. Bujnicki J. Phylogenomic analysis of 16S rRNA:(guanine-N ) methyltransferases suggests new family members and reveals highly conserved motifs and a domain structure similar to other nucleic acid amino-methyltransferases. (2000). Faseb J. 14: p. 2365-2368.

59. Lesnyak D., Osipiuk J., Skarina T., Sergiev P., Bogdanov A., Edwards A., Savchenko A., Joachimiak A., Dontsova O. Methyltransferase that modifies guanine 966 of the 16 S rRNA. (2007). J. Biol Chem. 282(8): p. 5880-5887.

60. Okamoto S., Tamaru A., Nakajima C., Nishimura K., Tanaka Y., Tokuyama S., Suzuki Y., Ochi K. Loss of a conserved 7-methylguanosine modification in 16S rRNA confers low-level streptomycin resistance in bacteria. (2007). Molecular Microbiology.63(4): p. 1096-1106.

61. Fin ken M., Kirschner P., Meier A., Wrede E., Bottger E. Molecular basis of streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis: alterations of the ribosomal protein S12 and point mutations within a functional 16S ribosomal RNA pseudoknot. (1993). Mol Microbiol. 9: p. 1239-1246.

62. Kagan R., Clarke S. Widespread occurrence of three sequence motifs in diverse S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases suggests a common structure for these enzymes. (1994). Arch Biochem Biophys. 310: p. 417-427.

63. Johansen S., Maus C., Plikaytis B., Douthwaite S. Capreomycin binds across the ribosomal subunit interface using tlyA-encoded 2'-0-methylations in 16S and 23S rRNAs. (2006). Mol Cell. 23: p. 173-182.

64. Sunita S., Purta E., Durawa M., Tkaczuk K., Swaathi J., Bujnicki J., Sivaraman J. Functional specialization of domains tandemly duplicated within 16S rRNA methyltransferase RsmC. (2007). Nucleic Acids Research. 35(13): p. 4264^274.

65. Cheng X., Blumenthal R. S-Adenosylmethionine-dependent Methyltransferases: Structures and Functions. (1999). World Scientific Publishing, New Jersey.

66. Qin D., Fredrick K. Control of translation initiation involves a factor-induced rearrangement of helix 44 of 16S ribosomal RNA. (2009). Mol. Microbiol. 71: p. 1239-1249.

67. Kimura S., Suzuki T. Fine-tuning of the ribosomal decoding center by conserved methyl-modifications in the Escherichia coli 16S rRNA. (2010). Nucleic Acids Research. 38(4): p. 1341-1352.

68. Thomas C., Gregory R., Winslow G., Muto A., Zimmermann R. Mutations within the decoding site of Escherichia coli 16S rRNA: growth rate impairment, lethality and intragenic suppression. (1988). Nucleic Acids Res. 16: p. 8129-8146.

69. Decatur W., Fournier M. rRNA modifications and ribosome function. (2002). Trends Biochem. Sei. 27: p. 344-351.

70. Bujnicki J., Rychlewski L. RNA:(guanine-N2) methyltransferases RsmC/RsmE and their homologs revisited—Bioinformatic analysis and prediction of the active site based on the uncharacterized MJ0882 protein structure. (2002). BMC Bioinformatics. 3: p. 10.

71. Basturea G., Rudd K., Deutscher M. Identification and characterization of RsmE, the founding member of a new RNA base methyltransferase family. (2006). RNA. 12: p. 426-434.

72. Hallberg B., Ericsson U., Johnson K., Andersen N., Douthwaite S., Nordlund P., Beuscher A., Erlandsen H. The Structure of the RNA m5C Methyltransferase YebU from Escherichia coli Reveals a C-terminal RNA-recruiting PUA Domain. (2006). J. Mol. Biol. 360: p. 774-787.

73. Andersen N., Douthwaite S. YebU is a m5C Methyltransferase Specific for 16 S rRNA Nucleotide 1407. (2006). J. Mol. Biol. 359: p. 777-786.

74. Czerwoniec A., Dunin-Horkawicz S., Purta E., Kaminska K., Kasprzak J., Bujnicki J. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2008 update. (2009). Nucleic Acids Res. 37: p. D118-D221.

75. Basturea G., Dague D., Deutscher M., Rudd K. YhiQ Is RsmJ, the Methyltransferase Responsible for Methylation of G1516 in 16S rRNA of E. coli. (2012). J Mol Biol. 415(1): p. 16-21.

76. Ofengand J., Malhotra A., Remme J., Gutgsell N., Del Campo M., Jean-Charles S., Peil L., and Kaya Y. Pseudouridines and pseudouridine synthases of the ribosome. (2001). Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 66: p. 147-159.

77. Ofengand J., Malhotra A., Remme J. Pseudouridines and Pseudouridine Synthases of the Ribosome. (2001). Cold Spring Harbor Simp. 66: p. 147-160.

78. Sivaraman J., Sauve V., Laroeque R., Stura E., Schräg J., Cygler M., Matte A. Structure of the 16S rRNA pseudouridine synthase RsuA bound to uracil and UMP. (2002). Nat. Struct. Biol. 9: p. 353-358.

79. Del Campo M., Ofengand J., Malhotra A. Crystal structure of the catalytic domain of RluD, the only rRNA pseudouridine synthase required for normal growth of Escherichia coli. (2004). RNA. 10: p. 231-239.

80. Conrad J., Sun D., Englund N., Ofengand J. The rluC gene of Escherichia coli codes for a pseudouridine synthase that is solely responsible for synthesis of pseudouridine at positions 955, 2504, and 2580 in 23S ribosomal RNA. (1998). J. Biol. Chem. 273: p. 18562-18566.

81. Caldas T., Binet E., Bouloc P., Richarme G. Translational defect of Escherichia coli mutants deficient in the Um2552 23S ribosomal RNA methyltransferase RrmJ/FTSJ. (2000). Biochem. Biophys. Res. Commun. 271: p. 714.

82. Charette M., Gray M. Pseudouridine in RNA: What, where, how, and why. (2000). IUBMB Life. 49: p. 341.

83. Raychaudhuri S., Conrad J., Hall B., Ofengand J. A pseudouridine synthase required for the formation of two universally conserved pseudouridines in ribosomal RNA is essential for normal growth of Escherichia coli. (1998). RNA. 4: p. 1407.

84. Raychaudhuri S., Niu L., Conrad J., Lane B., Ofengand J. Functional effect of deletion and mutation of the Escherichia coli ribosomal RNA pseudouridine synthase RluA. (1999). J. Biol. Chem. 274: p. 18880.

85. Gustafsson C., Persson B. Identification of the rrrnA Gene Encoding the 23S rRNA mlG745 Methyltransferase in Escherichia coli and Characterization of an mlG745-Deficient Mutant. (1998). J. Bacteriology. 180(2): p. 359-365.

86. Liu M., Novotny G., Douthwaite S. Methylation of 23S rRNA nucleotide G745 is a secondary function of the RlmAI methyltransferase. (2004). RNA. 10: p. 1713-1720.

87. Madsen C., Mengel-Jürgensen J., Kirpekar F., Douthwaite S. Identifying the methyltransferases for m5U747 and m5U1939 in 23S rRNA using MALDI mass spectrometry. (2003). Nucleic Acids Res. 31(16): p. 4738-4746.

88. Agarwalla S., Kealey J., Santi D., Stroud R. Characterization of the 23 S Ribosomal RNA m5U1939 Methyltransferase from Escherichia coli. (2002). J. Biol Chem. 277(11): p. 88358840.

89. Hansen L., Mauvais P., Douthwaite S. The macrolide-ketolide antibiotic binding site is formed by structures in domains II and V of 23S ribosomal RNA. (1999). Mol. Microbiol. 31: p. 623631.

90. Sergiev P., Serebryakova M., Bogdanov A., Dontsova O. The ybiN Gene of Escherichia coli Encodes Adenine-N6 Methyltransferase Specific for Modification of A1618 of 23 S Ribosomal RNA, a Methylated Residue Located Close to the Ribosomal Exit Tunnel. (2008). J. Mol. Biol. 375: p. 291-300.

91. Voss N., Gerstein M., Steitz T., Moore P. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. (2006). J. Mol. Biol. 360: p. 893-906.

92. Sergiev P., Lesnyak D., Bogdanov A., Dontsova O. Identification of Escherichia coli m(2)G methyltransferases: II. The ygjO gene encodes a methyltransferase specific for Gl 835 of the 23S rRNA. (2006). J. Mol. Biol. 364: p. 26-31.

93. Osterman I., Sergiev P., Tsvetkov P., Makarov A., Bogdanov A., Dontsova O. Methylated 23S rRNA nucleotide m2G1835 of Escherichia coli ribosome facilitates subunit association. (2011). Biochimie. 93: p. 725-729.

94. Purta E., O'Connor M., Bujnicki J., Douthwaite S. YccW is the m5C Methyltransferase Specific for 23S rRNA Nucleotide 1962. (2008). J. Mol. Biol. 383: p. 641-651.

95. Kellner S., Burhenne J., Helm M. Detection of RNA modification. (2010). RNA Biol. 7(2): p. 237-247.

96. Lovgren J., Wikstrom P. The rlmB Gene Is Essential for Formation of Gm2251 in 23 S rRNA but Not for Ribosome Maturation in Escherichia coli. (2001). J. Bacteriology. 183(23): p. 69576960.

97. Michel G., Sauve V., Larocque R., Li Y., Matte A., Cygler M. The Structure of the RlmB 23S rRNA Methyltransferase Reveals a New Methyltransferase Fold with a Unique Knot. (2002). Structure. 10: p. 1303-1315.

98. Purta E., O'Connor M., Bujnicki J., Douthwaite S. YgdE is the 2D-0-ribose methyltransferase RlmM specific for nucleotide C2498 in bacterial 23S rRNA. (2009). Molecular Microbiology. 72(5): p. 1147-1158.

99. Hager J., Staker B., Jakob U. Substrate Binding Analysis of the 23S rRNA Methyltransferase RrmJ. (2004). J. Bacteriology. 186(19): p. 6634-6642.

100. Widerak M., Kern R., Malki A., Richarme G. U2552 methylation at the ribosomal A-site is a negative modulator of translational accuracy. (2005). Gene. 347: p. 109-114.

101. Caldas T., Binet E., Bouloc P., Richarme G. Translational Defects of Escherichia coli Mutants Deficient in the Um2552 23S Ribosomal RNA Methyltransferase RrmJ/FTSJ. (2000). Biochemical and Biophysical Research Communications. 271: p. 714-718.

102. Lesnyak D.,Sergiev P., Bogdanov A., Dontsova O. Identification of Escherichia coli m2G methyltransferases: I. The ycbY Gene Encodes a Methyltransferase Specific for G2445 of the 23 S rRNA. (2006). J. Mol. Biol. 364: p. 20-25.

103. Sergiev P., Bogdanov A., Dahlberg A., Dontsova O. Mutations at position A960 of E. coli 23 S ribosomal RNA influence the structure of 5 S ribosomal RNA and the peptidyl transferase region of 23 S ribosomal RNA. (2000). J. Mol. Biol. 299: p. 379-389.

104. Kehrenberg C., Schwarz S., Jacobsen L., Hansen L., Vester B. A new mechanism for chloramphenicol, florfenicol, and clindamycin resistance: Methylation of 23S ribosomal RNA at A2503. (2005). Mol. Microbiol. 57: p. 1064-1073.

105. Ton S., Xiong L., Bae T., Mankin A. The methyltransferase YfgB/RlmN is responsible for modification of adenosine 2503 in 23S rRNA. (2008). RNA. 14: p. 98-106.

106. Arnosti D., Chamberlin M. Secondary a factor controls transcription of flagellar and Chemotaxis genes in Escherichia coli. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. 86: p. 830-934.

107. Colson C., Lhoest J., Urlings C. Genetics of ribosomal protein methylation in Escherichia coli. III. Map position of two genes, prmA and prmB, governing methylation of proteins LI 1 and L3. (1979). Mol. Gen. Genet. 169: p. 245-250.

108. Keener J., Nomura M. Regulation of ribosome synthesis. (1996). In F. C. Neidhardt (ed.). Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. 2nd ed. ASM Press. Washington, DC.

109. David C., Keener J., Aswad D. Isoaspartate in ribosomal protein Sil of Escherichia coli. (1999). J. Bacteriol. 181: p. 2871-2877.

110. Arnold R., Reilly J. Observation of Escherichia coli ribosomal proteins and their posttranslational modifications by mass spectrometry. (1999). Anal. Biochem. 269: p. 105-112.

111. Kowalak J.,Walsh K. Methylthio-aspartic acid: identification of a novel posttranslational modification in ribosomal protein S12 from Escherichia coli. (1996). Protein Sci. 5: p. 16251632.

112. Brosius J., Chen R. The primary structure of protein LI6 located at the peptidyltransferase center of Escherichia coli ribosomes. (1976). FEBS Lett. 68: p. 105-109.

113. Holmes K., Culver G. Mapping structural differences between 30S ribosomal subunit assembly intermediates. (2004). Nat. Struct. Mol. Biol. 11: p. 179-86.

114. Holmes K., Culver G. Analysis of conformational changes in 16S rRNA during the course of 30S subunit assembly. (2005). J. Mol. Biol. 354: p.340-57.

115. Powers Т., Noller H. Hydroxyl radical footprinting of ribosomal proteins on 16S rRNA. (1995). RNA. 1: p. 194-209.

116. Robert J., Sen S., Choo Y., Beltrao P., Zietek M., Chaba R., Lee S., Kazmierczak K., Lee K., Wong A., Shales M., Lovett S., Winkler M., Krogan N., Typas A., Gross C. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. (2011). Cell. 144: p. 143-156.

117. Baba Т., Ara Т., Hasegawa M., Takai Y., Okumura Y., Baba M. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knock-out mutants the Keio collection. (2006). Mol. Systems Biol. 2: p. 2006-2008.

118. Lequin R. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). (2005). Clin Chem. 12: p. 2415.

119. Цветков Ф., Devred F., Макаров А. Термодинамика связывания цинка белком S100A2. (2010). Молекуляр. биология. 44: р. 938-942.

120. Цветков Ф., Макаров А., Арчаков А., Козин С. Влияние изомеризации аспартата-7 на связывание иона меди (II) бета-амилоидным пептидом. (2009). Биофизика. 54(2): 197201.

121. Andrey N., Tsvetkov P., Mantsyzov A., Kulikova A., Kozin S., Makarov A., Polshakov V. NMR Solution Structure of Rat Ab(l-16): Toward Understanding the Mechanism of Rats' Resistance to Alzheimer's Disease. (2012). Biophysical Journal. 102: 136-143.