Молекулярно-генетический анализ структуры природной популяции Sinorhizobium meliloti Европейско-Сибирского генцентра люцерны тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Андронов, Евгений Евгеньевич

• Андронов, Евгений Евгеньевич
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Андронов, Евгений Евгеньевич

ВВЕДНИЕ

Глава 1. АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТОДОВ (Обзор литературы)

1.1. Методы, используемые при изучени разнообразия природных популяций клубеньковых бактерий а) Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ЯРЬР) б) ЛРЬР-анализ ПЦР-амплифицированных фрагментов геномной ДНК в) Использование Саузерн-гибридизации при ЯРЬР-анализе г) Методы геномного фингерпринтинга

1.2. Некоторые аспекты интерпретации результатов изучения генетического разнообразия природных популяций клубеньковых бактерий а) Установление генетической структуры природных популяций ризобий при использовании методов геномного фингерпринтинга б) Оценка генетического разнообразия природных популяций

1.3. Изучение генетических процессов в ризобиальных популяциях на основе анализа природного разнообразия изолятов а) Изучение процессов, происходящш в популяциях клубеньковых бактерий и ответственных за возникновение новых генотипов б) Роль географического фактора и растения-хозяина в формировании генетического разнообразия природных популяций ризобий

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетический анализ структуры природной популяции Sinorhizobium meliloti Европейско-Сибирского генцентра люцерны»

Актуальность темы. Клубеньковые бактерии (ризобии) - микроорганизмы, фиксирующие в симбиозе с бобовыми растениями молекулярный азот атмосферы. В настоящее время ризобии являются одним из наиболее изученных биологических объектов. Интерес к ризобиям вызван, во-первых, сельскохозяйственной значимостью симбиотической азот-фиксации, во-вторых, тем, что бобово-ризобиальный симбиоз является одним из наиболее интересных видов растительно-микробного взаимодействия. Изучение этого взаимодействия может дать ответ на целый ряд вопросов, касающихся процессов, ответственных за формирование генетического разнообразия природных популяций микроорганизмов и их эволюцию.

Одним из наиболее эффективных подходов к изучению природных популяций бактерий является анализ их генетического разнообразия, результатом которого может явиться понимание процессов возникновения новых генотипов (мутации, генетические перестройки, горизонтальный перенос генов) и процессов, определяющих судьбу генотипов в популяции (отбор, конкуренция, миграция штаммов, генетический дрейф). К настоящему времени большое число природных популяций ризобий охарактеризовано с использованием изоферментного анализа. Проанализированы основные параметры популяционной структуры - гетерогенность популяции и неравновесие по сцеплению хромосомных генетических маркеров. Анализ факторов, определяющих генетический полиморфизм ризобий, показал, что растение-хозяин является ключевым фактором как для динамики ризобий в природных популяциях (поддержание численности и стабильности ризобий), так и для увеличения их генетического разнообразия.

В настоящее время для характеристики ризобий широко используются различные методы анализа ДНК. Преимущество этих методов состоит в том, что они позволяют получать стабильные характеристики, независящие от физиологического статуса микроорганизма, более тесно связанные с генотипом и позволяющие анализировать любые участки ризобиального генома. С помощью методов анализа ДНК впервые стало возможным проанализировать участки генома, содержащие симбиотические гены, изучение которых было невозможно с использованием других методов. Анализ симбиотических участков генома ризобий особенно важен для выявления роли растения-хозяина в процессах формирования генетической структуры природных популяций клубеньковых бактерий. Представляет большой интерес использовать методы анализа ДНК для изучения основных параметров популяции - гетерогенности и неравновесия по сцеплению между хромосомными и плазмидными маркерами. Однако работы, сочетающие использование методов анализа ДНК с эффективными методическими подходами к анализу популяционной структуры и процессов, ее определяющих, единичны.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы являлся молекулярно-генетический анализ популяции S.meliloti Европейско-Сибирского генцентра люцерны. В задачу исследований входило:

- выделить природные штаммы клубеньковых бактерий люцерны на двух удаленных участках из-под растений-хозяев двух различных видов - дикорастущих люцерны и донника, входящих в группу перекрестной инокуляции люцерны;

- определить видовую принадлежность штаммов с помощью рестрикционного анализа гена 16SpPHK;

- изучить генетическое разнообразие популяции с помощью RFLP-анализа 5 участков генома (leu, г ее А - хромосома; /íoé/DIABC, nodDl - мегаплазмида-1; ехр - ме-гаплазмида-2), анализа плазмидного состава штаммов и геномного ISi?m2011-2 фингерпринтинга;

- изучить влияние растения-хозяина и географического происхождения штаммов на генетическое разнообразие популяции клубеньковых бактерий люцерны;

- с использованием современных статистических методов оценить основные параметры генетической структуры популяции - гетерогенность и неравновесие по сцеплению между RFLP-типами.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые:

- изучена природная популяция клубеньковых бактерий S.meliloti, относящаяся к Ев-ропейско-Сибирскому генцентру люцерны. 56 природных штаммов S.meliloti охарактеризованы с использованием метода RFLP, анализа состава криптических плазмид и ISi?w2011 -2-фингерпринтинга;

- в геноме S.meliloti выявлен участок (фрагмент симбиотической плазмиды, содержащий гены лойЮ1АВС), структура которого существенно различается у штаммов, выделенных из-под донника и люцерны;

- с помощью метода RFLP определены основные параметры структуры изученной популяции: гетерогенность популяции по пяти различным участкам ризобиального генома (leu, reck. - хромосома; nodDIÁBC, nodD2 - мегаплазмида-1; ехр - мега-плазмида-2) и неравновесие по сцеплению между RFLP-типами;

- показано, что хромосомные гесА. RFLP-типы и Sym-плазмидные ио<Ю1АВС и nodD2 RFLP-типы ассоциированы у штаммов данной популяции случайным образом, на основании чего сделан вывод о возможности переноса симбиотических плазмид между штаммами; показано, что в данной популяции существуют две генетически обособленные группы штаммов, контрастно различающихся по ряду молекулярно-генетических признаков: leu RJFLP-типу, наличию криптических плазмид, числу копий ISi?m2011-2-элемента.

Практическая значимость.

- Установлено, что методом, позволяющим наиболее точно идентифицировать штаммы S.meliloti, является ISi?m2011-2-фингерпринтинг, обладающий большой разрешающей способностью. Данный метод может быть использован для идентификации и мониторинга штаммов 5. meliloti.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на 1-ом Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), 1st European nitrogen fixation conference (Szeged, Hungary 1994), 10th International congress on nitrogen fixation (St.Petersburg, 1995), 2nd European nitrogen fixation conference and NATO advanced research workshop (Poznan, Poland, 1996), 2-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000).

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Андронов, Евгений Евгеньевич

ВЫВОДЫ

- Проведен молекулярно-генетический анализ 56 симбиотически активных штаммов S.meliloti, выделенных в Европейско-Сибирском генцентре люцерны. По результатам RFLP-анализа по участкам leu, гесА, ехр, шсЮ1АВС и посЮ2 ризобиального генома выявлено 24 RFLP-генотипа. На основании анализа состава криптических плазмид выявлено 11 плазмидных типов. По результатам IS-типирования выявлено 42 ISi?m2011-2-фингерпринта.

- Показано, что главным фактором, определяющим генетическое разнообразие данной популяции, является растение-хозяин. Различия между штаммами, выделенными из-под различных растений-хозяев (D=0,15; Р<0,01), по результатам RFLP-анализа, более существенны, чем различия между штаммами, выделенными на различных участках (D=0,07; Р<0,05). Штаммы, выделенные из-под различных растений-хозяев, достоверно различаются по составу крип-тических плазмид (х2=23,74; df=8; Р<0,01), в то время как между штаммами, выделенными на различных участках, не выявлено различий по данному признаку (%2=8,07; df=8; РОД).

Штаммы, выделенные из-под донника, имеют четкие отличия от штаммов, выделенных из-под люцерны, по структуре симбиотического участка генома, на котором локализованы гены nodDl ABC (D-0,52; Р<0,005).

Показано, что у штаммов S.meliloti наиболее гетерогенными являются сим-биотические участки генома nodD 1АВС (Н=0,78) и nodDl (Н=0,66), в то время как гетерогенность по участкам leu, гесА (хромосома) и ехр (мегаплазми-да-2) значительно меньше (Н= 0,51; 0,42 и 0,52, соответственно). Анализ неравновесия по сцеплению с учетом всех 5 участков генома показал, что популяция характеризуется высоким значением индекса ассоциации (1д=1,42±0,04), что свидетельствует о небольшом вкладе рекомбинантных генотипов в структуру популяции. Однако поскольку RFLP-типы в парах гесА-nodDXABC и recA-nodD2 ассоциациированы случайным образом (Р=0,53 и 0,24, соответственно), это указывает на то, что имел место перенос симбиоти-ческой плазмиды между штаммами.

Показано, что в данной популяции имеется две группы штаммов «I» (26 штаммов) и «II» (30 штаммов), контрастно различающихся по ряду молеку-лярно-генетических признаков: RFLP-типу (в первой группе представлены штаммы leu RFLP-типа «а», во второй - leu RFLP-типа «b»); наличию крип-тических плазмид (в первой группе только один штамм (4%) не содержит криптических плазмид, во второй - 12 штаммов (40%)); числу копий ISi\!w2011-2-элемента (в первой группе среднее число копий ISi?w2011-2 составило 13,3±0,6, во второй - 6,5±0,7). Анализ неравновесия по сцеплению между RFLP-типами свидетельствует о том, что перенос Sym-генов имел место только между штаммами, принадлежащими к одной группе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Заключая настоящий обзор, отметим, что молекулярные методы дают уникальную возможность всестороннего анализа природных популяций клубеньковых бактерий - генетической структуры и основных ее параметров; факторов, определяющих генетический состав популяции; процессов, обуславливающих возникновение новых генотипов и их судьбу в популяции. К преимуществам молекулярных методов необходимо отнести их универсальность - с их помощью может быть охарактеризован как небольшой участок генома, так и геном в целом. Что особенно важно, молекулярные методы дают возможность проанализировать любые участки генома -не только хромосомные, но и симбиотические. Такие преимущества уже реализуются в современных исследованиях. Так, при использовании изоферментного анализа было показано, что природные популяции ризобий гетерогенны, однако оставалась неизвестной гетерогенность популяций по симбиотическим участкам генома. Последние исследования показали, что симбиотические участки, по всей видимости, более гетерогенны, чем хромосомные - и этот факт весьма важен для понимания механизмов эволюции клубеньковых бактерий. Ранее на основании результатов изоферментного анализа было показано, что структура природных популяций клубеньковых бактерий в основном клональна. Однако теперь появилась возможность проанализировать неравновесие по сцеплению не только между хромосомными, но и Sym-плазмидными маркерами. Такие исследования показали, что симбиотические маркеры гораздо более подвижны, чем хромосомные. Наконец, целый ряд ранее полученных результатов, указывал на то, что растение-хозяин является важнейшим фактором, определяющим генетический состав популяций ризобий. Молекулярные методы дают возможность проанализировать влияние растения-хозяина, изучая разнообразие популяции по симбиотическим участкам генома - именно там, где и следовало бы искать наиболее ясные свидетельства такого влияния. Однако работ по изучению генетического разнообразия ризобий, использующих все преимущества молекулярных методов все еще крайне мало и данные работы, как правило, затрагивают только один из аспектов изучения генетического разнообразия.

Таким образом, необходимы комплексные исследования природных популяций ризобий, использующих все преимущества молекулярных методов и отвечающих на следующие вопросы: какова генетическая структура природных популяций клубеньковых бактерий, каковы ее основные параметры (гетерогенность, неравновесие посцеплению), каковы основные факторы, влияющие на формирование генетической структуры популяции.

ГЛАВА 2

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Отбор проб почв

Рис. 4. Географическая карта района, где были отобраны пробы почвы.

Образцы почв отбирали летом 1996 года в Иркутской области на двух участках А и Б, расположенных примерно в 80 км один от другого (рис. 4). На каждом из участков пробы отбирали из-под растений дикорастущих форм многолетней люцерны (Medicago varia) и донника (Melilotus officinalis) на глубине 15-20 см и на расстоянии не менее 50 м друг от друга. На участке А пробы отбирали из-под люцерны (пробы №1-9) и донника (пробы №2730); на участке Б из-под люцерны (пробы № 10-18) и донника (пробы №20-26). Пробы хранили при +4°С в течение 14 дней.

2.2. Выделение клубеньковых бактерий из почв

Из каждой пробы была приготовлена почвенная суспензия, содержащая 1 г почвы на 10 мл воды (Young et al., 1987), которой были инокулированы стерильные двухдневные проростки люцерны. Для выделения штаммов клубеньковых бактерий использовали 2 вида люцерны - многолетняя форма М. sativa сорт Вега и однолетняя форма M.truncatula сорт Jemalong. Растения выращивали в условиях стерильного микровегетационного опыта в течение 6 недель (Федоров и др., 1983). На корнях всех растений, кроме контрольных растений, инокуляция которых не проводилась, а также растений, инокулированных суспензией пробы №17, были обнаружены розовые клубеньки. Выделение бактерий из клубеньков проводили в соответствии с обычной методикой (Young et al., 1987). Бактерии рассевали истощающим штрихом на твердой среде TY (Beringer, 1974) и выращивали при 28°С в течение 3 суток. Затем отдельные колонии повторно рассевали истощающим штрихом до образования отдельных колоний. Далее, после второго рассева, отбирали по одной колонии из каждого варианта для последующего анализа. Симбиотические свойства отобранных штаммов повторно проверяли в стерильном микровегетационном опыте с люцерной. Всего было отобрано 56 штаммов, образующих эффективные клубеньки на растениях М. sativa, т.е. по 2 штамма от каждой из 28 исходных проб почв, из которых один штамм был выделен из клубеньков М. sativa, а другой - из клубеньков M.truncatula. В дальнейшем штаммы хранили как на косяках с агаризованной средой TY (Beringer, 1974) при +4°С, так и в жидкой среде TY, содержащей глицерин в концентрации 15%, при -70°С (Маниатис и др., 1984).

2.3. Нумерация штаммов

Все отобранные штаммы обозначили индексом SB (с SB011 по SB302). Первые две цифры после индекса соответствуют номеру пробы почвы, из которой была приготовлена почвенная суспензия. Третья цифра обозначает растение, которое ино-кулировали соответствующей почвенной суспензией и из клубеньков которого впоследствии был выделен штамм: 1 - M.sativa, 2 - M.truncatula.

2.4. Тестерные штаммы

В работе использованы три тестерных штамма: Rm2011 S.meliloti (Casse et al., 1979), MVII S.meliloti (Kosier et al., 1993) и CC169 S.medicae (Eardly et al., 1990).

2.5. Методы работы с ДНК

Общую ДНК клубеньковых бактерий выделяли по следующей методике. 1,5 мл ночной культуры клеток ризобий, выращенных в жидкой среде TY при 28°С на качалке (180 об/мин), центрифугировали при 14000 об/мин в течение 2 мин. Надоса-дочную жидкость удаляли, а клетки ресуспендировали в 500 мкл буфера ТЕ (10 ммоль TRIS-HC1, 5 ммоль ЭДТА, рН-8,0). К суспензии добавляли лизоцим (1мг/мл) и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли SDS до концентрации 0,5% и протеиназу К до концентрации 0,05 мг/мл и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Для уменьшения вязкости, образовавшийся прозрачный лизат замораживали при -20°С, и после этого замороженный лизат размораживали. Дважды экстрагировали смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта (24:24:2). ДНК осаждали двумя объемами этанола 5 мин при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 2 мин при 14000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость, осадок осторожно промывали 70% этанолом, подсушивали и растворяли в 100 мкл дистиллированной воды. Концентрация ДНК в каждой из проб составляла примерно 0,5 - 1 мкг/мл.

Рестрикцию общей ДНК клубеньковых бактерий проводили по стандартной методике (Маниатис и др., 1984). 2 мкг ДНК обрабатывали 10 ед. ЕсоШ-эндонуклеазы в 20 мкл соответствующего буфера в течение 15-20 ч. Электрофорети-ческое разделение и перенос фрагментов рестрикции ДНК на нейлоновую мембрану проводили обычным способом (Маниатис и др., 1984). При этом на одну дорожку 1% агарозного геля наносили 0,5-1 мкг рестрицированной ДНК. Электрофоретиче-ское разделение фрагментов рестрикции проводили в течение 5 часов при 5 в/см.

Для проведения блоттинг-гибридизации по Саузерну использовали пробы, меченные дигоксигенином, в соответствии с рекомендациями изготовителя (Boehringer Mannheim GmBH). Для приготовления гибридизационных проб были использованы следующие фрагменты ДНК: 1) 4.4 тпн ücoRI-фрагмент плазмиды pSUP202::/eM+, содержащий гены, влияющие на биосинтез лейцина штамма СХМ1 S.meliloti (Аронштам и др., 1993); 2) 3.3 тпн jBg/I/EcoRI-фрагмент плазмиды pKSK5, включающий nodABC гены штамма 41 S.meliloti (Румянцева и др., 1999); 3) в качестве единой пробы были использованы 5 фрагментов ДНК, каждый из которых был клонирован в одной из следующих плазмид: pARX::2.7 тпн, pARI::9.5 тпн, pARII/l::3.4 тпн, pARIV/l::2.9 тпн, рАВ57-1::10.9 тпн. Все 5 фрагментов составляют большую часть ехр-кластера (32 тпн) штамма Rm2011 S.meliloti (Becker et al., 1997); 4) ПЦР-амплифицированный фрагмент ДНК (223 пн) штамма Rm2011 S.meliloti, содержащий внутренний фрагмент гена nodD 1 (Румянцева и др., 1999); 5) ПЦР-амплифицированный фрагмент ДНК (около 1.0 тпн) штамма Rm2011 S.meliloti, содержащий ген гесА (Румянцева и др., 1999); 6) ПЦР-амплифицированный ISRm2011-2 элемент (Selbitschka et al., 1995).

Размеры гибридизующихся фрагментов определяли относительно электрофо-ретической подвижности Hindill- или Äy/EII-фрагментов ДНК фага X, используя линейную регрессию (logM от электрофоретической подвижности).

2.6. Рестрикционный анализ ПЦР-амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК

Фрагмент общей ДНК размером 1.5 тпн, содержащий последовательность гена 16S рРНК, был амплифицирован методом ПЦР с помощью праймеров Ю1 (5-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и rDl (5'-CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3'), содержащих последовательности гена 16S рРНК E.coli 8-27 и 1541-1525, соответственно, а также линкер-ные последовательности для клонирования (Weisburg et al., 1991). Аликвоты ам-плифицированной ДНК переваривали с помощью эндонуклеазы Rsal. Реакцию ПЦР и электрофоретическое разделение полученных фрагментов ДНК проводили в соответствии со стандартной методикой (Terefework et al., 1998).

2.7. Определение плазмидного состава штаммов

Плазмидный состав природных штаммов S.meliloti определяли по модифицированному методу Экхардта (Eckhardt, 1978). Примерно 50 |il ночной культуры штамма, выращенной в жидкой среде TY при 28°С на качалке (180 rpm), добавляли к 2 ml свежей жидкой среды TY и инкубировали при 2 8° С на качалке еще 2 часа. После этого полученную культуру инкубировали 30 мин при 4°С в холодильнике. Затем ее центрифугировали при 14000 rpm в течение 2 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в 30 лизирующего буфера IxTBE (Манниатис и др., 1984): 20% (w/v) сахароза; 1 mg/ml лизоцим; 0,1 mg/ml РНК-за. Суспензию немедленно вносили в лунку геля (IxTBE; 0,6% агароза; 0,4% SDS). Электрофорез проводили в IxTBE буфере: префорез в течение 30 мин при напряжении 0,5 v/cm; далее плазмидную ДНК разделяли в течение 10-14 часов при напряжении 3 v/cm. Гель окрашивали бромистым этидием, отмывали в воде и фотографировали. Размер плазмид определяли относительно электрофоретической подвижности плазмид тес-терного штамма МУП, используя линейную регрессию (^М от электрофоретической подвижности).

2.8. Статистическая обработка данных

На основании результатов гибридизационного анализа для каждой из использованных проб вычисляли коэффициент гетерогенности Н (генное разнообразие): где р~ частота Ш^ЬР типа в популяции, А - число М^ЪР-типов, а п - число штаммов (Вейр Б., 1994; ВготйеИ <* а1., 1998).

Чтобы определить, насколько штаммы из двух различных субпопуляций отличаются друг от друга по частотам Ю^ЪР-типов, вычисляли коэффициент различия /)=1-/, где 1- коэффициент идентичности М. Нея (Вейр Б., 1994): где а, и ¿>, - частоты 1УРЬР типов в сравниваемых субпопуляциях А и Б, к — число Ш^Р-типов (Вейр Б., 1994). Коэффициенты £> определяли как для каждого из изучаемых генетических районов, так и для всех пяти районов в совокупности (Д?), исходя из значения Значения Б могут варьировать от 0 (частоты всех ЫГЬР-типов одинаковы в субпопуляциях) до 1 (субпопуляции не имеют общих ИРЬГ-типов). к =

Достоверность определенных значений И оценивали по ^-критерию сходства между вариационными рядами (Лакин, 1990): к к где щ и hi - частоты RFLP типов в сравниваемых субпопуляциях А и Б, к - число RFLP-типов, щ- число штаммов с г-тым RFLP-типом.

Для того, чтобы определить, насколько случайно ассоциированы RFLP-типы в RFLP-генотипах, вычисляли индекс ассоциации Ia (Maynard Smith et al., 1993; Gordon et al., 1995). Для каждой пары штаммов определяли число несовпадений (mismatches) в составе RFLP-генотипов по RFLP-типам. Затем для всей популяции вычисляли дисперсии: а) для наблюдаемого числа несовпадений (Vo) и б) для числа несовпадений, распределенного по нормальному (гауссовому) закону (Ve), что ожидается при полной панмиктичности популяции. Показателем (индексом) неравновесия по сцеплению (linkage disequilibrium) является величина Ia=Vo /Ve , при этом нулевая гипотеза о панмиктической структуре популяции отвергается при Ia> 1.

Vexp и ее стандартная ошибку вычисляли следующим образом: где pi - частота /-того RFLP-типа по /-тому локусу; т - число локусов; к - число RFLP-типов по данному локусу. т к

К,Р= где hj = 1 - J] Р? i ' сту=1/и \hj0--hj)2

Для оценки сцепления между локусами использовали программу Arlequin 1.1. (Schneider et al., 1997), позволяющую проводить точный тест сцепления между локусами при вычислении точного значения критической вероятности Р.

Для построения дендрограммы родства использовали невзвешенный парно-групповой метод кластеризации с арифметическим средним (UPGMA) (Вейр Б., 1994), при этом за меру генетического сходства между двумя RFLP-генотипами принималось число (доля) общих RFLP-типов.

Глава 3.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Андронов, Евгений Евгеньевич, 2000 год

1. Вавилов Н.И. Центры происхождения культурных растений. Труды по прикл. бот., ген., и сел. 1926. Т. 16. вып. 2. С. 7-26.

2. Вейр Б. Анализ генетических данных. М.: Мир. 1995. 400 с.

3. Доросинский JI.M. Клубеньковые бактерии и нитрагин. JL: Колос. 1970. 191 с.

4. Доросинский JI.M. Конкурентная способность клубеньковых бактерий. Биологический азот в сельском хозяйстве СССР. М.: Наука. 1989. С.27-34.

5. Иванов А.И. Люцерна. М.: Колос. 1980. 350 с.

6. Израильский В.П., Рунов Е.В., Бернард В.В. Клубеньковые бактерии и нитрагин. М.: Сельхозгиз. 1933. 232 с.

7. Красильников H.A., Мелкумова Т.А. Изменчивость клубеньковых бактерий внутри клубеньков бобовых растений. Изв. Акад. Наук СССР. 1963. №5. С.693-706.

8. Жуковский П.М. Новые очаги происхождения и генцентры культурных растений и узкоэндемичные микроцентры родственных видов. Ботанич. журн. 1968. Т.53, №4, С.430-460.

9. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. 1990. 352 с.

10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. 480 с.

11. Мишустин E.H., Шильникова В.К. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. М.: Наука. 1973. 288 с.

12. Проворов H.A. Эволюция генетических систем симбиоза у клубеньковых бактерий. Генетика. 1996. Т.32. №8. С. 1029-1040.

13. Проворов H.A., Воробьев Н.И. (а) Популяционная генетика клубеньковых бактерий: моделирование циклических процессов в микробно-растительных системах. Генетика. 1998. Т.34.№ 12. С.1704-1711.

14. Проворов H.A., Воробьев Н.И. (б) Роль межштаммовой конкуренции в эволюции генетически полиморфных популяций клубеньковых бактерий. Генетика. 1998. Т.34. № 12. С.1712-1719.

15. Проворов H.A., Воробьев Н.И. Роль частотозависимого отбора в эволюции клубеньковых бактерий. Исследования по генетике. 1999. Вып.12. С.24-33.

16. Румянцева М.Л., Андронов Е.Е., Сагуленко В.В., Онищук О.П., Симаров

17. Федоров С.Н., Бутвина О.Ю., Симаров Б.В. Мутагенное действие УФ-излучения на клубеньковые бактерии люцерны и анализ симбиотических свойств полученных ауксотрофных мутантов. Генетика. 1983. Т.19. №5. С. 727 -736.

18. Bazzicalupo М. 1998. Личное сообщение.

19. Bergersen F.J., Brockwell J., Gibson A.H., Schwinghamer E.A. Studies of natural populations and mutants of Rhizobium in the improvement of the legume inoculation. Plant and Soil. 1971. Spec. Vol. P. 3-16.

20. Beringer J.E. R1 transfer in Rhizobium leguminosarum. J.Gen.Microbiol. 1974.V.84. P.188-198.

21. Bromfield E.S.P., Sinha I.B., Wolynetz M.S. Influence of location, host cultivar, and inoculation on the composition of naturalized populations of Rhizobium meliloti in Medicago sativa nodules. Appl.Environ.Microbiol. 1986. V.51. №5. P. 1077-1084.

22. Bromfield E.S.P., Behara A.M.P., Singh R.S., Barran L.R. Genetic variation in local populations of Sinorhizobium meliloti. Soil.Biol.Biochem. 1998. V.30. №13. P.1707-1716.

23. Broughton W.J., Heycke N., Priefer U., Schneider G.-M., Stanley J. Ecological genetics of Rhizobium meliloti: diversity and competitive dominance. FEMS Microbiol. Ecol. Lett. 1987. V.40. P.245-249.

24. Brown A.H.D., Felaman M.W. Population structure of multilocus associations. Proc. natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P.5913-5916.

25. Brunei B., Rome S., Cleyet-Marel J.C. Comparison of nucleotide diversity and symbiotic properties of Rhizobium meliloti population from annual Medicago species. FEMS Microb.Ecol. 1996. V.19. P.71-82.

26. Campbell A. Evolutionary significance of accessory DNA elements in bacteria. Ann. Rev. Microbiol. 1981. V.35. P.55-83.

27. Casse F., Boucher C., Julliot J.S., Denarie J. Identification and characterization of large plasmids in Rhizobium meliloti using agarose gel electrophoresis. J. Gen. Microbiol. 1979. V.113. P.229-242.

28. Coutinho H.L.C., Handley B.A., Kay H.E., Stevenson L., Beringer J.E. The effect of colony age on PCR fingerprinting. Lett. Appl. Microbiol. 1993. V.17. P. 282-284.

29. Dadarwal K.R., Prabha S., Tauro P., Subba Rao N.S. Serology and host range in-fectivity of «cowpea group» rhizobia. Indian J. Exper. Biol. 1977. V.15. P.462-465.

30. Demezas D.H., Reardon T.B., Watson J.M., Gibson A.H. Genetic diversity among Rhizobium leguminosarum bv. trifolii strains revealed by allozyme and restriction fragment length polymorphism analyses. Appl. Environ. Microb. 1991. V.52. №12. P.3489-3495.

31. Denarie J., Debelle F., Truchet G., Prome J.-K. Rhizobium and Legume nodulation: a molecular dialogue. New horizons in nitrogen fixation./Eds. Palacios R., Mora J., Newton W.E. 1993. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. P.19-30.

32. Eardly B.D., Materon L.A., Smith N.H., Johnson D.A, Rumbaugh M.D., Se-lander R.K. Genetic structure of natural populations of the nitrogen fixing bacterium Rhizobium meliloti. Appl. Environ. Microb. 1990. V.56, № 1. P. 187-194.

33. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid deoxyribonucleic acid in bacteria. Plasmid. 1978. V.l. P.584-588.

34. Fred E.B., Baldwin I.L., McCoy E. Root nodule bacteria and leguminous plants. Madison: Univ.Wiscon. Stud. Sci., 1932. 343 P.

35. Freiberg C., Fellay R., Bairoch A., Broughton W., Rosental A., Perret X. Molecular basis of symbiosis between Rhizobium and legumes. Nature. 1997. V.387. №22. P.394-401.

36. Selenska-Pobell S., Evguenieva-Hackenberg E., Radeva G., Squartini A. Characterization of Rhizobium 'hedysari' by RFLP analysis of PCR amplified rDNA and by genomic PCR fingerprinting. J. Appl. Bacteriol. 1996. V. 80. N5. P. 517-28.

37. Givaudan A., Bally R. Similarities between large plasmids of Azospirillum lipoferum. FEMS Microbiol Lett. 1991. V.78. P.245-251.

38. Glinn P., Higgins P., Squartini A., O'Gara F. Strain identification in Rhizobium tri-folii using DNA restriction analysis, plasmid DNA profiles and intrinsic antibiotic resistances. FEMS Microb. Lett. 1985. V.30. P. 177-182.

39. Gordon D.M., Wexler M., Reardon T.B., Murphy P.J. The genetic structure of Rhizobium populations. Soil. Biol. Biochem. 1995. V.27. №4/5. P.491-499.

40. Graham P.H. Antibiotic sensitivities of root nodule bacteria. Austral. J. Biol. Sci. 1963. V.16. P.557-559.

41. Graham P.H. Serological studies with Agrobacterium radiobacter, A.tumefaciens and Rhizobium strains. Arch. Microbiol. 1971. V.78. P. 70-75.

42. Hallet B., Sherratt D.J. Transposition and site-specific recombination: adapting DNA cut-and-paste mechanisms to a variety of genetic rearrangements. FEMS Microbiol. Rev. 1997. V.21. P.157-178.

43. Harrison S.P., Young J.P.W., Jones D.G. Rhizobium population genetics: effect of clover variety and inoculum dilution on the genetic diversity sampled from natural populations. 1987. Plant and Soil. V.103. P.147

44. Harrison S.P., Jones D.G., Schunman P.H.D., Forster J.W., Young P.W. Variation in Rhizobium leguminosarum biovar trifolii Sym plasmid and the association with effectiveness of nitrogen fixation. J.Gen.Microbiol. 1988. V.134. №10, P. 2721-2730.

45. Harrison S.P., Jones D.G., Young J.P.W. Rhizobium population genetics: genetic variation within and between population from diverse locations. J. Gen. Microbiol. 1989. V.135. P. 1061

46. Harrison S.P., Mytton L.R., Scat L., Dye M., Cresswell A. Characterization of Rhizobium isolates by amplification of DNA polymorphisms using random primers. Can. J. Microbiol. 1992. V.38. P.1009-1015.

47. Hartmann A., Amarger N. Genotypic diversity of an indigenous Rhizobium meliloti population assessed by plasmid profiles, DNA fingerprinting and insertion sequence typing. Can. J. Microbiol. 1991. V.37. P.600-608.

48. Hartman A., Giraud J.J., Catroux G. Genotypic diversity of Sinorhizobium (formerly Rhizobium) meliloti strains isolated directly from a soil and from nodules of alfalfa (Medicago sativa) grown in the same soil. FEMS Microb.Ecol. 1998. V.25. P.107-116.

49. Hirsh P.R. Population dinamics of indigenous and genetically modified rhizobia in the field. New. Phitol. 1996. V.133. P.159-171.

50. Honma M.A., Ausubel F.M. Rhizobium meliloti has three functional copies of the nodD symbiotic regulatory gene. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1987. V.84. №23.1. P.8558-8662.

51. Honma A.M., Asomaning ML, Ausubel F.M. Rhizobium meliloti nodD genes mediate host-specific activation of nodABC. J. Bacteriol. 1990. V.172. №2. P.901-911

52. Hynes M.F., Simon R., Müller P., Niehaus K., Labes M., Pühler A. The twomegaplasmids of Rhizobium meliloti are involved in the effective nodulation of alfalfa. Mol. Gen. Genet. 1986. V.202. N3. P. 356-362.

53. Huber I., Selenska-Pobel S. Characterization of Rhizobium galegae by REP-PCR, PFGE and 16S rRNA sequencing. 1994. In. Symiotic nitrogen fixation. Eds. Graham P.H., Sadovsky M.J., Vance C.P. Kluver Academic Publishers. Netherland. P.153-158.

54. Jensen H.L. Nitrogen fixation in leguminous plants. 1. General characteristics of root nodule bacteria isolated from species of Medicago and Trifolium in Australia. Proc. Linn. Soc. N.S.W. 1942. V.67. P.98-108.

55. Johnston A.W.B., Hombrecher G., Brewin N.J., Cooper M.C. Two transmissible plasmids in Rhizobium leguminosarum strain 300. J. Gen. Microbiol. 1982. V.128. №1. P.85-93.

56. Jordan, D.S. Family III. Rhizobiaceae. Bergey's manual of systematic bacteriology/Eds. Krieg N.R. and Holt J.G. Baltimor: Williams & Wilkins. 1984. Vol.1. P.234-256.

57. Kamberger W. An ouchterlony double diffusion study on the interaction between legume lectins and rhizobial cells surface antigens. Arch. Microbiology. 1979. 121. P. 83-90.

58. Kosier B., Ptihler A., Simon R. Monitoring the diversity of Rhizobium meliloti field and microcosm isolates with a novel rapid genotyping method using insertion elements. Molec. Ecol. 1993. V.12. P.35-46.

59. Laberge S., Middleton A.T., Wheatcroft R. Characterization, nucleotide sequence and conserved genomic locations of insertion sequence ISRmS in Rhizobium meliloti. J. Bact. 1995. V.177. №11. P.3133-3142.

60. Laguerre G., Masurier S.I., Amarger N. Plasmid profiles and restriction fragment length polymorphism of Rhizobium leguminosarum bv. viciae in field populations. FEMS Microb. Ecol. 1992. V.101. P. 17-26.

61. Laguerre G., Allard M.R., Revoy F., Amarger N. Rapid identification of Rhizobia by restriction fragment lenght polymorphism analysis of PCR-amplified 16S rRNA genes. Appl. Environ. Microb. 1994. V.60. №1. P.56-63.

62. Lenski R.E. Assessing the genetic structure of microbial populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90. P. 4334-4336.

63. Lindstrom K., Lipsanen P., Kaijalainen S. Stability of markers used for identification of two Rhizobium galegae inoculant strains after five years in the field. Appl. Environ. Microbiol. 1990. V.56. № 2. P.444-450.

64. Lindstrom K. International Committee on Systematic Bacteriology Subcommittee on Taxonomy of Agrobacterium and Rhizobium. Minutes of the Meeting, 2 June 1995, St.Petersburg, Russia. Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. V.46. P.623.

65. Louvrier P., Laguerre G., Amarger N. Distribution of symbiotic genotypes in Rhizobium leguminosarum biovar viceae populations isolated directly from soils. Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. № 11. P.4202-4205.

66. Martinez E., Romero D., Palacios R. The Rhizobium genome. Crit. Rev. Plant Sci. 1990. V.131.P.1779.

67. Mazurier S.-I., Rigotter-Gois L., Amarger N. Characterisation, distribution, and localization of ISR12, an insertion sequence element isolated from Rhizobium leguminosarum bv. viciae. Appl. Environ. Microbiol. 1996. V.62. P.685-693.

68. Mercado-Blanco J. and Toro N. Plasmids in Rhizobia: The role of nonsymbiotic plasmids. MPMI. 1996. V.9. №7. P.535-545.

69. Milkman R., Electrophoretic variation in Esherichia coli from natural sources. Science. 1973. 182, 1024-1026.

70. Nelson K., Whittam T.S., Selander R.K. Nucleotide polymorphism and evolution in the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (gapA) in natural populations of Salmonella and Esherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.88. P.6667.

71. Nick G. Polyphastic taxonomy of Rhizobia isolated from tropical tree legumes. Academic dissertation in microbiology. 1998. University of Helsinki.

72. Nieman S., PUhler A., Tichy H.-V., Selbitschka W. Evaluation of the resolving power of three different DNA fingerprinting methods to discriminate among isolates of a natural Rhizobium meliloti population. J. Appl. Microbiol. 1997. V.82. P. 477484.

73. Nour S.N., Cleyet-Marel J.-C., Beck D., Effosse A., Fernandez M. Genotypic and phenotypic diversity of Rhizobium isolated from chickpea. Can. J. Microbiol. 1994. V.40. P. 345-354.

74. Pafetti D., Scotti C., Gnocchi S., Fancelli S., Bazzicalupo M. Genetic diversity of an Italian Rhizobium meliloti population from different Medicago sativa varieties. Appl. Environ. Microb. 1996. V.62. №7. P. 2279-2285.

75. Plazanet C., Refregier G., Demont N., Truchet G., Rosenberg C. The Rhizobium meliloti region located downstream of the nod box n6 is involved in the specific nodu-lation of Medicago lupulina. FEMS Microbiol. Lett. 1995. V.133. P.285-291.

76. Prakash R.K., Atherly A.G. Plasmids of Rhizobium and their role in symbiotic nitrogen fixation. Int.Rev.Cyto!. 1986. V.104. P. 1-24.

77. Rome S., Fernandez M.P., Brunei B., Normand P., Cleyet-Marel J.-C. Sinorhizo-bium medicae sp. nov., isolated from annual Medicago spp. Int. J. Syst. Bact.1996. V.46. № 4. P. 972-980.

78. Van Rossum D., Schuurmans F.P., Gillis M., Muyotcha A., Verseveld H.W., Stouthhammer A.H., Boogerd F. Genetic and phenetic analyses of Bradirhizobium strains nodulating peanut. Appl. Environ. Microbiol. 1995. V.61. № 4. P. 1599-1609.

79. Schofield P.R., Gibson A.H., Dudman W.F., Watson J.M. Evidence for genetic exchange and recombination of Rhizobium symbiotic plasmids in a soil population. Appl. Environ. Microbiol. 1987. V.53. №12. P. 2942-2947.

80. Selander R.K., Levin B.R. Genetic structure in Esherichia coli populations. Science. 1980. V.210,№31,P. 545-547

81. Selbitschka W., Arnold W., Jording D., Kosier B., Toro N., Piihler A. The insertion sequence element lSRm2011-2 belongs to the IS<530-Tcl family of transposable elements and is abundant in Rhizobium meliloti. Gene. 1995. V. 163. P. 59-64.

82. Selenska-Pobel S., Gigova L., Petrova N. Strain-specific fingerprints of Rhizobium galegae generated by PCR with arbitrary and repetitive primers. J. Appl. Bact. 1995. V.79. P. 425-431.

83. Shishido M., Pepper L. Identification of dominant indigenous Rhizobium meliloti by plasmid profiles and antibiotic resistance. Soil. Biol. Biochem. 1990. V.2 2. №1. P. 11-16.

84. Shneider S., Kueffer J.-M., Roessli D., Excoffier L. Arlequin ver. 1.1: A software for population genetic data analysis. 1997. Genetics and Biometry Laboratory, Univer sity of Geneva, Switzerland.

85. Simon R., Hotte B., Klauke B., Kosier B. Isolation and haracterization of insertion sequence elements from Gram-negative bacteria by using new broad-host-range, positive selection vectors. J. Bacteriol. 1991. V. 173. №4. P. 1502-1508.

86. Smith J.M., Smith N.H., O'Rourke M., Spratt B.G. How clonal are bacteria? Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. № 5. P. 4384-4388.

87. Sobral B.W.S., Honeycutt R.J., Atherly A.G., McClelland M. Electrophoretic separation of the three Rhizobium meliloti replicons. J. Bact. 1991. V. 173. №16. P. 51735180.

88. Souza V., Nguyen T.T., Hudson R.R., Pinero, Lenski R.E. Hierarchical analysis of linkage desequilibrium in Rhizobium populations: evidence for sex?

89. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1992. V. 89. P. 8389-8393.

90. Spoerke J.M., Wilkinson H.H., Parker M.A. Nonrandom genotypic associations in alegumQ-Bradyrhizobium mutualism. Evolution. 1996. V. 50. №1. P. 146-154.

91. Stern M.J., Ames G.F.-L., Smith N.H., Robinson E.C., Higgins C.F. Repetitive extragenic palindromic sequences: a major component of the bacterial genome. Cell. 1984. V. 37. P.1015-1026.

92. Terefework Z., Nick G., Suomalainen S., Paulin L., Lindstrom. Philogeny of Rhizobium galegae with respect to other rhizobia and agrobacteria. Int. J. Syst. Bact. 1998. V. 48. P. 349-356.

93. VaIdes A.M., Pinero D. Philogenetic estimation of plasmid exchange in bacteria. Evolution. 1992. V. 46. №3. P. 641-656.

94. Vos P., Hogers R., Beeker M., Reijans M., van de Lee T., Homes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zabeau M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucl. Acid Research. 1995. V. 23. P. 4407-4414.

95. Weisburg, W.G., Barns, S.M., Pelletier, D.A., Lane, D.J. 16S ribosomal DNA amplification for philogenetic study. J. Bacteriol. 1991. V. 173. №2. P. 697-703.

96. Wernegreen J.J., Harding E.E., Riley M.A. Rhizobium gone native: unexpected plasmid stability of indigenous Rhizobium leguminosarum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997.V. 94. P. 5483-5488.

97. Wexler M., Gordon D.M., Murphy P.J. Genetic relationships among rhizopine-producing Rhizobium strains. Microbiology. 1996. V. 142. P. 1059-1066.

98. Young J.P.W. The population genetics of bacteria. Genetics of bacterial diversity. /Eds. Hopwood D.A., Chater K.F. 1989. Academic press. London.

99. Young J.P.V., Demetriou L., Apte R.G. Rhizobium population genetics: enzyme polymorphism in Rhizobium leguminosarum from plants and soil in a Pea Crop. Appl. Anviron. Microb. 1987. V. 53. №2. P. 397-402.

100. Young J.P.V.and Wexler M. Sym-plasmid and chromosomal genotypes are corre lated in field populations of Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 1988. V. 134. P. 2731-2739.1. БЛАГОДАРНОСТИ