Молекулярно-генетическая идентификация потожировых следов в отпечатках пальцев на коже человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Фалеева Татьяна Георгиевна

• Фалеева Татьяна Георгиевна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Фалеева Татьяна Георгиевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ВОЗМОЖНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОТОЖИРОВЫХ СЛЕДОВ ЧЕЛОВЕКА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Объекты ДНК-идентификации личности

1.2. Морфология кожи, физиология потоотделения и источники ДНК в потожировом веществе человека

1.3. Методы обнаружения следов рук и их влияние на эффективность

ДНК-идентификации

1.4. Методы сбора и хранения ДНК-содержащих биологических следов

1.5. Методы выделение ДНК из потожировых следов

1.6. Генотипирование объектов, содержащих малое количество ДНК, и

интерпретация результатов

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Методы обнаружение потожировых следов

2.2.1.1. Использование дактилоскопических порошков для обнаружения потожировых следов

2.2.1.2. Использование нингидрина для обнаружения потожировых следов

2.2.1.3. Использование цианоакрилата для обнаружения потожировых следов

2.2.1.4. Использование паров йода для обнаружения потожировых следов

2.2.2. Методы сбора потожировых следов

2.2.2.1. Использование дактилоскопических пленок и клейких

лент для сбора потожировых следов

2.2.2.2. Использование метода смыва потожировых следов на бумажный и хлопчатобумажный носитель

2.2.2.3. Использование ДНК-стабилизирующего раствора для сбора, хранения и

пробоподготовки препаратов ДНК из потожирового вещества

2.2.2.4. Использование различных сред для установления наличия пота и определения его групповой принадлежности

2.2.3. Методы выделения ДНК

2.2.3.1. Выделение ДНК методом органической экстракции

2.2.3.2. Выделение ДНК методом нуклеосорбции

2.2.3.3. Выделение ДНК при помощи ионообменной смолы ОДе1ех

2.2.3.4. Сравнение эффективности методов выделения ДНК

из объектов с малым её содержанием

2.2.4. Количественная оценка ДНК при помощи ПЦР «в реальном времени»

2.2.5. Качественная оценка выделенной ДНК и ампликонов при помощи электрофореза в агарозном геле

2.2.6. Генотипирование ДНК

2.2.7. Характеристика использованных статистических методов

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Исследование архивного материала

3.2. Особенности влияния средств обнаружения потожировых следов на ПЦР

3.2.1. Исследование влияния дактилоскопических порошков на ПЦР

3.2.2. Исследование влияния нингидрина на ПЦР

3.2.3. Исследование влияния цианоакрилата на ПЦР

3.2.4. Исследование влияния паров йода на ПЦР

3.3. Особенности влияния методов фиксации и сбора

потожировых следов на ПЦР

3.3.1. Исследование влияния дактилоскопических пленок

и клейких лент на ПЦР

3.3.2. Исследование влияния бумажного и хлопчатобумажного

носителя на ПЦР

3.4. Исследование стабильности ДНК в смывах при хранении

3.5. Исследование жидкостей, применяемых для установления пота, его групповой принадлежности, и оценка их влияния на сохранность ДНК и ПЦР

3.6. Сравнительная оценка эффективности методов выделения ДНК из объектов с

малым её содержанием

3.7. Исследование количества ДНК в потожировом веществе на кожных покровах человека

3.8. ДНК-идентификация личности по потожировому веществу, оставленному человеком на искусственной коже

3.9. ДНК-идентификация личности по потожировому веществу, оставленному человеком на кожных покровах живых лиц

3.10. ДНК-идентификация личности по потожировому веществу, оставленному человеком на кожных покровах трупов

3.11. Применение разработанной методики в судебно-медицинской экспертной

практике

Глава 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетическая идентификация потожировых следов в отпечатках пальцев на коже человека»

Актуальность темы исследования

Потожировые следы (ПЖС) человека, оставленные на коже другого лица во время совершения противоправных действий, являются весьма сложным объектом молекулярно-генетического исследования в судебно-медицинской экспертной практике [57, 225, 236, 268]. Это обусловлено низким содержанием в них генетического материала, который в значительной степени подвержен деградации из-за воздействия факторов внешней среды [1, 20, 55, 77, 184, 215, 230]. Идентификация следов рук также осложняется присутствием на поверхности кожи собственного потожирового вещества (ПЖВ), содержащего дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) [14, 42, 254].

Применительно к контактным следам на коже человека молекулярно-генетический анализ представляет собой альтернативу дактилоскопии, поскольку в подобных случаях получить пригодные для криминалистического исследования отпечатки пальцев крайне сложно [9, 132, 147, 167, 224, 251, 254]. К тому же специальная обработка, используемая для обнаружения латентных следов, может оказывать негативное воздействие на результаты анализа ДНК [70, 106, 139, 141, 145, 147, 170, 218, 219, 230].

Изучение влияния на молекулярно-генетический анализ средств обнаружения, фиксации, сбора потожировых следов, а также условий их хранения, разработка методик выделения из них ДНК, интерпретация результатов генотипирования столь сложных объектов является актуальной научно -практической задачей. Для идентификации следов рук на коже человека необходима комплексная оптимизация подходов в методологии их исследования [56, 58, 62, 63].

Степень разработанности темы исследования

В судебно-медицинской практике при молекулярно-генетической идентификации личности в процессе расследования преступлений против жизни и

здоровья граждан, таких как убийство, насильственные действия сексуального характера, изнасилование, причинение телесных повреждений, приходится исследовать потожировое вещество, отобранное с различных, чаще всего открытых участков тела (верхние конечности, шея, лицо) [7, 19, 65, 71, 151, 213, 251, 252], на предмет обнаружения в образцах постороннего генетического материала. Существующие методики выявления, сбора контактных следов и экстракции из них ДНК способны затруднять получение идентификационно значимых результатов. Прежде всего, это связано с изначально малым количеством генетического материала в данных биологических объектах [215, 230, 268]. Хранение отобранных следов в виде смывов без наличия защищающих от разрушения ДНК компонентов при комнатной температуре способствует значительной деградации активной ДНК-матрицы [27, 28, 64, 184].

В литературе подробно не описано влияние на ДНК-анализ средств обнаружения и изъятия потожировых следов при проведении их комплексного дактилоскопического и молекулярно-генетического исследования. Отсутствуют оптимизированные эффективные методики экстракции ДНК из потожирового вещества. Используемые методы хранения биологического материала энергоемки, требуют значительных материальных затрат и не позволяют надежно хранить ДНК в условиях комнатной температуры длительное время. Не разработаны рекомендации по оценке результатов генотипирования ДНК в смешанных следах, содержащих низкое количество генетического материала [2, 27, 100, 115, 116].

Все вышеизложенное определило необходимость проведения настоящего исследования и его актуальность для идентификации личности в судебно-медицинской практике.

Цель исследования - оптимизация подходов молекулярно-генетического исследования ядерной ДНК потожировых следов в отпечатках пальцев на коже человека.

Задачи исследования

1. Оценить влияние на эффективность молекулярно-генетического исследования средств обнаружения и фиксации потожировых следов в отпечатках пальцев на коже человека.

2. Разработать методику сбора, хранения, пробоподготовки и экстракции ДНК из потожировых следов, оставленных на кожных покровах человека.

3. Оценить количество генетического материала в потожировом веществе на коже различных участков тела мужчин и женщин.

4. Установить возможности обнаружения генетического материала в потожировом веществе, оставленном на кожных покровах живых лиц и трупов.

5. Определить подходы к интерпретации результатов генотипирования препаратов ядерной ДНК, полученных из потожировых следов, оставленных на кожных покровах человека.

Научная новизна полученных результатов

Подобраны средства обнаружения и фиксации потожировых следов человека, не оказывающие отрицательного влияния на выполнение молекулярно-генетического исследования. Предложена классификация исследованных дактилоскопических порошков по уровню ингибиторного воздействия на энзиматическую амплификацию.

Разработана оригинальная методика сбора, хранения и экстракции ДНК из потожировых следов человека на основе применения уникального ДНК-стабилизирующего раствора, позволяющая защищать генетический материал от деградации, минимизировать его потери и нивелировать действие ингибиторов в процессе пробоподготовки биологического образца.

Установлено содержание ядерной ДНК в потожировом веществе на кожных покровах различных участков тела мужчин и женщин. Оценена вероятность выявления генетического материала донора в потожировых следах, оставленных на поверхности искусственной кожи, коже живых лиц и трупов (реципиентов).

Определены подходы к интерпретации результатов генотипирования препаратов ядерной ДНК потожировых следов, оставленных на коже.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты исследования средств обнаружения и фиксации потожировых следов позволили определить материалы и реагенты, которые могут быть применены в экспертной практике при производстве комплексных дактилоскопических и молекулярно-генетических экспертиз.

Разработанный ДНК-стабилизирующий раствор обеспечивает длительный срок пригодности биологических следов, отобранных путем смыва на носитель, для проведения их молекулярно-генетического исследования. ДНК-стабилизирующий раствор может применяться в качестве растворителя в ходе судебно-биологического исследования образцов пота и не препятствует их последующему ДНК-анализу при производстве комплексной экспертизы объекта.

Потожировые следы рук мужчин более информативны для ДНК-идентификации по сравнению со следами рук женщин. Кожные покровы живых лиц выступают следовоспринимающей поверхностью, на которой выявление ДНК донора выше, чем на коже трупа при посмертном контакте.

Показано, что ДНК-идентификация потожировых следов, оставленных на коже человека, должна базироваться в основном на учете полиморфных аутосомных микросателлитных локусов размером не более 250 пар нуклеотидов (п.н.), а при исследовании локусов У-хромосомы - размером не более 300 п.н. Сформулированные в диссертации подходы к интерпретации результатов генотипирования потожировых следов рекомендуются в качестве критериев оценки данных ДНК-анализа сложных биологических объектов в судебно-медицинской экспертной практике.

Материалы исследования могут быть применены в практической экспертной деятельности, а также в учебном процессе при профессиональной подготовке и повышении квалификации врачей судебно-медицинских экспертов,

экспертов-генетиков, экспертов-криминалистов и работников

правоохранительных органов.

Методология и методы исследования

Методология диссертационной работы базируется на изучении литературы по теме исследования, использовании сравнительно-аналитических методов и статистической обработке полученных результатов. Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с действующим законодательством и нормативно-правовыми актами, регулирующими биомедицинские исследования с участием людей. На проведение исследований получено разрешение Локального Этического комитета ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России (протокол № 3 от 14.03.2018 г.). Использованные в работе методы исследования составили пять основных групп: методы обнаружения потожировых следов; методы фиксации, сбора и хранения потожировых следов; методы пробоподготовки и выделения ДНК из потожировых следов; генотипирование потожировых следов; ДНК-идентификация потожировых следов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Материалы и реагенты, используемые при физических и физико-химических методах выявления и фиксации потожировых следов человека, оказывающие минимальное негативное воздействие на ДНК-анализ, позволяют осуществлять комплексное дактилоскопическое и молекулярно-генетическое исследование.

2. Сбор, пробоподготовка и экстракция генетического материала из потожирового вещества с использованием разработанного ДНК-стабилизирующего раствора позволяет проводить комплексное судебно-биологическое и молекулярно-генетическое исследование, существенно увеличить сохранность ДНК в отобранных образцах, минимизировать ее потери и деградацию.

3. При молекулярно-генетической идентификации потожировых следов, оставленных на коже живых лиц и трупов, наиболее значимы полиморфные участки аутосомной ДНК размером не более 250 п.н., а при исследовании локусов У-хромосомы - размером не более 300 п.н.

Достоверность и обоснованность результатов исследования

Объективность полученных результатов, обоснованность и достоверность научных положений, выводов и рекомендаций, сформулированных в диссертации, обеспечена достаточным количеством исследованного материала: изучением архивного материала (26546 судебно-медицинских исследований); проведением оценки влияния различных реагентов и материалов для работы со следами рук на энзиматическую амплификацию (495 объектов); анализом ДНК в потожировом веществе на коже человека (164 объекта); анализом ДНК в следах рук, оставленных на искусственной коже (199 объектов), при контакте доноров с кожными покровами живых лиц (116 объектов) и трупов (349 объектов), применением высокоинформативного молекулярно-генетического метода, выполнением компетентного статистического анализа с использованием компьютерных программ. При проведении исследования создана репрезентативная выборка данных по количеству генетического материала в образцах и результатам генотипирования в случаях контакта кожных покровов испытуемых.

Апробация результатов исследования

Материалы диссертации изложены в 24 печатных работах, в том числе в 7 статьях в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве науки и высшего образования Российской Федерации. Получен патент на изобретение.

Результаты исследования были представлены на заседаниях Петербургского научного общества судебных медиков (Санкт-Петербург, 2015, 2018), на региональных научных конференциях Северо-Запада России «Актуальные

вопросы теории и практики судебной медицины» (Санкт-Петербург, 2015, 2016, 2017, 2020, 2021), Всероссийских научно-практических конференциях «Молекулярная диагностика 2017» (Москва, 2017), «Аквакультура: мировой опыт и российские разработки» (Ростов-на-Дону, 2017), научно-практических конференциях с международным участием «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2013), «История Российского центра судебно-медицинской экспертизы в лицах и фактах, к 85-летию со дня образования» (Москва, 2017), «Горизонты медицинской науки» (Москва, 2017), «Генетика - фундаментальная основа инноваций в медицине и селекции» (Ростов -на-Дону, 2017), IV Российском конгрессе лабораторной медицины (Москва, 2018), Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика 2018» (Минск, 2018).

Полученные данные внедрены в экспертную деятельность Государственного бюджетного учреждения Ростовской области «Бюро судебно -медицинской экспертизы», Санкт-Петербургского государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Бюро судебно-медицинской экспертизы», Бюро судебно-медицинской экспертизы Федерального государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Клиническая больница № 122 имени Л.Г. Соколова Федерального медико-биологического агентства», филиала № 1 федерального государственного казенного учреждения «111 Главный государственный центр судебно-медицинских и криминалистических экспертиз» Министерства обороны Российской Федерации, а также в учебный процесс кафедры судебной медицины ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России.

Личный вклад автора в проведенные исследования

Автором лично исследованы 1323 объекта, полученные при контактных взаимодействиях кожных покровов 235 живых лиц и 84 трупов, а также при исследовании влияния различных реагентов и материалов для работы со следами рук на энзиматическую амплификацию (495 объектов). Выполнен анализ 21537 актов судебно-медицинских исследований (заключений эксперта) трупов по

случаям насильственной смерти из архива СПб ГБУЗ «БСМЭ», а также 5009 судебно-медицинских молекулярно-генетических заключений эксперта и специалиста из архива отделения (молекулярно-генетической идентификации) филиала № 2 ФГКУ «111 ГГЦСМиКЭ» МО.

Проанализированы и обобщены данные отечественной и зарубежной литературы по избранной теме исследования. Выполнено планирование и проведены экспериментальные исследования, статистическая обработка и анализ полученных данных.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 208 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, их обсуждение, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который содержит 274 источника (94 отечественных и 180 зарубежных). Работа иллюстрирована одним приложением, 15 рисунками и 48 таблицами.

Диссертационное исследование выполнено при поддержке Федерального государственного бюджетного учреждения «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» (Фонда содействия инновациям) в рамках грантов по программам: «УМНИК» (тема «Разработка способа комплексной молекулярно-генетической и дерматоглифической идентификации потожировых следов», договор № 3138ГУ2/2014 от 06 августа 2014 года), «СТАРТ-1» и «СТАРТ-2» (тема «Разработка систем изъятия и длительного хранения ДНК-содержащего биологического материала», договоры № 1372ГС1/21619 от 23 июня 2016 года и № 2474ГС2/21619 от 10 апреля 2018 года).

Глава 1

ВОЗМОЖНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОТОЖИРОВЫХ СЛЕДОВ ЧЕЛОВЕКА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Объекты ДНК-идентификации личности

Молекулярно-генетический анализ, который также называют геномной дактилоскопией, является разновидностью судебно-медицинской идентификационной экспертизы. Исследование ДНК биологических следов считается высокодоказательным методом исследования в экспертной практике, так как позволяет установить индивидуальные генетические признаки конкретного человека [19, 30, 58, 62, 67, 71, 174].

Десятки триллионов клеток составляют организм человека. В каждой соматической клетке находится генетический материал, содержащийся внутри ядер и митохондрий. Соответственно ДНК, находящуюся в ядре клетки, называют ядерной или хромосомной (яДНК), а ДНК митохондрий - митохондриальной (мтДНК). В ядре клеток, помимо аутосом (неполовых хромосом), присутствуют половые хромосомы, определяющие пол человека. Для женского генетического профиля в норме характерно наличие двух «X» хромосом, а для мужского - «X» и «У» хромосом. Передача сперматозоидом при оплодотворении У-хромосомы определяет мужской пол зародыша, формируя определенный У-гаплотип отцовской линии (патрилинии), который остается неизменным вплоть до появления новых мутаций. Исследование У-гаплотипа наиболее информативно в случаях дифференциального анализа смешанных следов, когда стоит задача обнаружения ДНК мужчины в смеси с биологическим материалом женщины, а также при непрямой ДНК-идентификации как дополнение к анализу аутосомной ДНК, в особенности, если предполагается более отдаленное родство, чем родство типа «отец-сын». При выборе системы анализа биологического материала следует учитывать, что маркеры аутосомной ДНК имеют большую идентификационную значимость по сравнению с У-хромосомой и мтДНК [3, 27, 28, 64, 66, 103, 203].

В экспертной практике зачастую объектами молекулярно-генетического исследования выступают: кровь, сперма, мягкие ткани, кости, волосы, ногти. Наличие ДНК в эпителиальных клетках делает такие выделения человека, как слюна, моча, рвотные и каловые массы, вагинальная жидкость, пот и иные, пригодными для ДНК-анализа. Следы биологического происхождения могут быть оставлены на различных поверхностях: предметах быта, одежде, пищевых продуктах, окурках сигарет, кожных покровах человека и т.д. [14, 27, 30, 78, 86, 87, 132, 246].

Исследование ДНК в потожировом веществе позволяет установить факт наличия прямого или опосредованного контакта конкретного человека с изучаемыми объектами [40, 42, 254]. Однако экспертно-практическая работа со следами рук сопряжена с трудностями их выявления и отбора на месте происшествия [224, 250], в особенности, когда в качестве следовоспринимающей поверхности выступают кожные покровы человека, что может затруднять последующий анализ ДНК. И. О. Перепечиной (2012) выделены основные факторы, способные затруднять молекулярно-генетическое исследование и потенциально приводить к ошибкам при производстве экспертиз: малые количества исследуемого биологического материала, деградация ДНК, наличие ингибиторов, «смешанный» характер объекта и загрязнение объекта чужеродной ДНК (контаминация), что особенно характерно для контактных следов [77].

Идентификация личности по потожировым следам, оставленным на кожных покровах человека, представляет собой не только научно-методический, но и большой практический интерес. Разработка эффективных методик обнаружения, фиксации, сбора, пробоподготовки и хранения контактных следов, не исключающих комплексный подход к их изучению, позволит значительно расширить возможности и повысить информативность судебно-медицинских и криминалистических экспертиз, в особенности при расследовании преступлений, связанных с угрозой жизни и здоровью граждан [6, 19, 23, 24, 26, 30, 34, 35, 40, 58, 63, 71, 78, 87, 88, 151, 184, 213, 221, 224, 254].

1.2. Морфология кожи, физиология потоотделения и источники ДНК в

потожировом веществе человека

В коже человека выделяют эпидермис (эпителиальная ткань) и дерму (соединительнотканная основа). Подкожная клетчатка (гиподерма) соединяет кожу с подлежащими структурами организма.

Многослойный плоский ороговевающий эпителий образует наружный слой кожи - эпидермис, основная часть которого представлена кератиноцитами (около 95%). Клетки эпидермиса, продвигаясь от базальной мембраны к наружной поверхности, постепенно утрачивают ядра и органеллы и, по мере дифференцировки, формируют базальный, шиповатый, зернистый, блестящий и роговой слои.

Кожа ладоней и подошв стоп человека, в отличие от других участков, характеризуется значительной толщиной эпидермиса, доходящей до 1,5 мм и более. Здесь максимально выражены блестящий и роговой слои, что связано с наибольшим механическим воздействием, оказываемым на данные зоны. Ядра и органеллы разрушаются в кератиноцитах блестящего слоя и уже отсутствуют в роговых чешуйках, погруженных в плотный липидный матрикс, составляющий около 10% массы рогового слоя эпидермиса [85].

Поверхностные клетки рогового слоя подвержены периодической десквамации за счет воздействия на межклеточное цементирующее вещество (холестеринсульфат) липолитических ферментов [18]. Происходит отторжение не только биологически мертвых безъядерных клеток, но и ядросодержащих, однако в значительно меньших количествах [155]. Такие клетки служат источником генетического материала в потожировом веществе [6, 34, 151, 162, 195, 199, 230, 239]. При этом рядом авторов [93, 246, 261] выявлена способность отдельных людей к большему выделительству ДНК при контактах, а также были обнаружены вариации выделения ДНК из разных частей ладонной области [112, 247].

Дерма состоит из сосочкового и сетчатого слоев, не имеющих между собой четкой границы. Вглубь вслед за эпидермисом располагается сосочковый слой, являющийся рыхлой соединительной тканью. Именно данный слой определяет индивидуальный характер папиллярных узоров кожи ладоней и подошв, где находится максимальное скопление сосочков высотой до 0,2 мм. Установлено, что у женщин гребни папиллярных линий более тонкие и имеют большую плотность расположения на подушечках пальцев по сравнению с мужчинами [166, 233, 264].

Сетчатый слой образует плотная неоформленная соединительная ткань с сетью эластических и пучками коллагеновых волокон. В коже подушечек пальцев и ступней преобладает широкопетлистая, грубая сеть коллагеновых волокон, вслед за которой располагается хорошо развитая гиподерма, что обеспечивает защиту от значительного механического воздействия, свойственного данным участкам тела [10, 11, 18].

Слой потожирового вещества на коже человека является результатом функционирования потовых и сальных желез и представлен шариками диаметром 2-100 мкм [6]. Среди потовых желез выделяют эккриновые (мерокриновые) и апокриновые. Эккриновые железы располагаются в коже повсеместно и количество их в среднем составляет 130 на 1 см2. Наибольшее скопление этих желез отмечается в области подошв стоп и ладоней, где плотность достигает до 2500 на 1 см2. Их выводные протоки заканчиваются в базальном слое эпидермиса, состоящем из ростковых ядросодержащих клеток [42] (рис. 1).

Апокриновые железы располагаются в коже крыльев носа, век, наружного слухового прохода, подмышечных впадин, анальной области, промежности. В процессе секреции в них, в отличие от эккриновых желез, происходит разрушение секреторных клеток с высвобождением генетического материала из клеточных структур, что обуславливает наличие ДНК в формирующемся потожировом веществе.

98-99% секрета потовых желез составляет вода, а 1-2% представлено продуктами белкового обмена, аминокислотами, летучими жирными кислотами,

простыми органическими и неорганическими веществами. В состав основной массы растворенных соединений входят мочевина, аммиак, мочевая и молочная кислоты, фосфаты, хлорид натрия, соли кальция и калия [42, 85, 127]. В оставленных следах рук со временем происходит изменение состава основных компонентов потожирового вещества [95, 214].

Рисунок 1. Строение кожи ладоней и подошв стоп человека: I - эпидермис, II - дерма, III - гиподерма, 1 - роговой слой эпидермиса, 2 - ростковый слой эпидермиса, 3 - чувствительные тельца, 4 - сосочковый слой дермы, 5 - проток потовой железы, 6 - потовая железа, 7 - устье потовой железы (пора)

Ранее присутствие генетического материала в поте человека имело спорный характер [262]. Однако современные исследования доказывают наличие свободной ДНК в составе пота и потожирового вещества [34, 70, 93, 141, 147, 162, 165, 195, 197, 207, 234, 239, 246, 247, 261, 263]. В 1 мл пота в среднем содержится около 11,5 нг внеклеточных нуклеиновых кислот [215], а один отпечаток пальца может хранить от < 0,01 до 0,75 нг ДНК [230]. Рядом авторов доказана возможность успешного генотипирования потожировых следов, оставленных при

7

III

II

однократном контакте с объектом [141, 197, 261, 263]. Так, в экспериментальной работе J. Kopka et al. (2011) из следов, образованных подушечками пальцев, в 82,2% случаев (120 образцов) были получены полные, а в 11% случаев (16 образцов) частичные генетические профили [197]. Изучение P. Wiegand, M. Kleiber (1997) следов рук, оставленных на шее жертвы при удавлении, показало достаточное для идентификации количество экстрагированной из смывов ДНК (0,5-2 нг) [268].

Бактерицидность кожи обусловлена кислой средой пота (pH 3,8-6,2). За счет его протеолитической активности происходит лизис (разрушение) клеточных мембран, отдельных клеточных структур в составе как местнообразующегося потожирового вещества, так и привнесенного с других участков тела или находившегося на посторонних объектах.

Раздражение терморецепторов усиливает работу потовых желез всего кожного покрова. Однако активация потоотделения может быть вызвана не только повышением температуры, но и изменением гормонального статуса, психоэмоциональным напряжением. При психогенном потоотделении, в отличие от терморегуляционного, активируются потовые железы кожи ладоней, подошв стоп, лица, подмышек. Стресс приводит к вазоконстрикции сосудов кожи, а при потоотделении, связанном с необходимостью охлаждения организма, наоборот, происходит вазодилатация, что усиливает теплоотдачу [128].

Такая физиологическая особенность организма играет значительную роль в процессе следообразования при совершении преступления, когда стрессовая ситуация способствует усилению выделения пота, в особенности в области ладоней, чаще всего вступающих в контакт с объектами окружающей среды [6, 65].

Сальные железы относятся к голокриновым и процесс секреции сопровождается разрушением их клеток, что обуславливает образование ДНК в потожировом веществе [274]. Наиболее многочисленно они располагаются в коже головы, где их число составляет 400-900 на 1 см2 [208]. Секрет сальных желез и липидный матрикс рогового слоя эпидермиса формируют жировой компонент

потожирового вещества. Сальный секрет образован свободными жирными кислотами (15-30%), триглицеридами (30-50%), диглицеридами и моноглицеридами (5-10%), восками (12-16%), холестерином (1-3%), эфирами холестерина (1-3%), скваленом (10-12%), гидрокарбонатами (1-3%) [42, 177]. Основными компонентами внеклеточного матрикса являются церамиды (50%), холестерин (25%) и свободные жирные кислоты (15%) [152].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Фалеева Татьяна Георгиевна, 2022 год

- /

Я и

Я , и

и

20 25 30 35

Цикл

г

кривая ПЦР

¡у

■&4

а

о

з

рэ.501-|

=1111

10 15

20 25 30 35

Цикл

е

Рисунок 9. Графики накопления продуктов ПЦР, отражающие влияние на реакцию амплификации материала предмета-носителя при «прямой» ПЦР по гену Р-актина (а, в, д) и ВПК (б, г, е): а, б - бумага для хроматографии БШ00; в, г -хлопчатобумажная ткань с плотным плетением волокон; д, е - марля

Оценка результатов ПЦР-РВ по ВПК (флуорофор Су5) показала, что бумага для хроматографии БШ00 (ДО = 0,88, р = 0,002) и хлопчатобумажная ткань с плотным плетением волокон (ДС = -0,26, р = 0,485) не оказывают значимого ингибиторного влияния на энзиматическую амплификацию, что подтверждают графики кривых ПЦР на рис. 9 б, г. Во всех пробах с марлей по ВПК обнаружено полное ингибирование энзиматической амплификации (Ы/А) (табл. 17), проявляющееся отсутствием подъема кривых ПЦР на графике (рис. 9 е).

3.4. Исследование стабильности ДНК в смывах при хранении

Исследование сохранности генетического материала в выполненных смывах контактных следов имеет большое значение, поскольку такие объекты зачастую содержат малое количество ДНК, которая подвержена высокому риску деградации в условиях отсутствия стабилизирующих ее факторов. Нередко с момента сбора материала до проведения лабораторных исследований проходит значительное количество времени, а также такие объекты могут неоднократно подвергаться анализу в рамках дополнительных и повторных экспертиз. Поэтому генетический материал должен оставаться пригодным для ДНК-идентификации как можно дольше.

Оценку стабильности ДНК в смывах, выполненных с помощью деионизованной воды и ДНК-стабилизирующего раствора, хранившихся при комнатной температуре, проводили методом ПЦР-РВ с использованием в качестве ДНК-мишени участок гена Р-актина, что реализовано в наборе реагентов «ХУ-Детект» (Синтол, Россия). Результаты исследования обобщены в таблице 18, графически представлены на рис. 10.

Достоверность различий показателей концентрации ДНК в смывах, находившихся в сухом виде при комнатной температуре в течение 5, 7 и 30 суток, в зависимости от жидкой среды, использованной для смыва, представлена в таблице 19.

Таблица 18. Концентрация ДНК в смывах, хранящихся в сухом виде при комнатной температуре в течение 5, 7 и 30 суток

Срок инкубации Концентрация ДНК по Р-актину (нг/мкл)

Деионизованная вода ДНК-стабилизирующий раствор

N Ме Р25 (01) Р75 (03) N Ме Р25 (01) Р75 (03)

Контроль 7 0,220 0,132 0,305 7 0,337 0,161 0,354

5 суток 12 0,017 0,012 0,052 11 0,128 0,100 0,153

7 суток 16 0,013 0,009 0,029 16 0,060 0,041 0,116

30 суток 12 0,002 0,0003 0,006 12 0,037 0,024 0,044

Таблица 19. Различия показателей концентрации ДНК в смывах, выполненных при помощи деионизованной воды и ДНК-стабилизирующего раствора, хранящихся в течение 5, 7 и 30 суток, по Ц-критерию Манна-Уитни

Переменные N аи2о N днк-ср Ц Ъ асСу^её 2*ЫСеС ехаС: р

0 суток 7 7 16 -1,02 0,318

5 суток 12 11 12 -3,29 4х10-4

7 суток 16 16 19 -4,09 7х10-6

30 суток 12 12 8 -3,67 5х10-5

Согласно полученным данным статистически значимые различия (р < 0,05) в концентрации ДНК были выявлены при хранении ДНК в смывах, выполненных при помощи деионизованной воды в течение 5 суток (Ц = 12, Ъ = -3,29, р = 0,0004), 7 суток (Ц = 19, Ъ = -4,09, р = 0,000007) и 30 суток (Ц = 8, Ъ = -3,67, р = 0,00005) по сравнению с ДНК-стабилизирующим раствором.

Рисунок 10 отражает деградацию ДНК при её хранении в условиях комнатной температуры вне зависимости от среды, в которой она хранилась.

Однако в присутствии стабилизирующих компонентов, входящих в состав разработанного ДНК-стабилизирующего раствора, динамика деградации происходила плавно с сохранением активной ДНК-матрицы в течение 30 суток.

Деионизованная вода ДНК-стабилизирующий раствор

Рисунок 10. Графическое изображение данных концентрации ДНК в смывах, выполненных при помощи деионизованной воды и ДНК-стабилизирующего раствора, хранящихся в сухом виде при комнатной температуре в течение 5, 7 и 30 суток

Для наглядности различия в концентрации эффективной ДНК-матрицы исследуемых образцов далее представлены данные по смывам, хранившимся в течение 7 и 30 суток. Графики накопления продуктов энзиматической амплификации (рис. 11 а, б) демонстрируют подъем кривой ПЦР после 35 цикла в смывах ДНК, выполненных деионизованной водой спустя 7 и 30 суток хранения. При этом характер данных кривых нестабилен и в некоторых образцах отсутствует их подъем, что отражает крайне низкое содержание, либо отсутствие в этих образцах активной ДНК-матрицы. В смывах ДНК, проведенных ДНК-

стабилизирующим раствором, подъем кривых на графиках ПЦР всегда начинался до 35 цикла и характеризовался их относительной стабильностью (рис. 11 в, г). Кроме того, из графиков (рис. 11 б, г) видно, что на 30 сутки количества целевого продукта ПЦР в случае использования ДНК-стабилизирующего раствора было значительно больше, чем при использовании в качестве растворителя просто деионизованной воды.

кривая ПЦР кривая ПЦР

Рисунок 11. Графики накопления продуктов ПЦР, отражающие сохранность ДНК в смывах, выполненных при помощи деионизованной воды (а, б) и ДНК-стабилизирующего раствора (в, г), спустя 7 суток (а, в) и 30 суток (б, г)

Оценку деградации ДНК с течением времени при использовании различных растворителей (вода и ДНК-стабилизирующий раствор) проводили путем сравнения значений пороговых циклов (АС!) ПЦР опытных (5, 7 и 30 суток) и контрольных (0 суток) проб. Исследование показало, что при хранении в сухом виде ДНК на 5 сутки наблюдали достоверные отличия в активностях ДНК-матриц, что указывало на деградацию ДНК в опытных пробах (табл. 20). При использовании в качестве растворителя деионизованной воды наблюдалась более сильная корреляционная зависимость значений С! от времени инкубации -г8 = 0,91 (р = 0,088) против г8 = 0,81 (р = 0,195) (чем выше срок хранения ДНК на носителе, тем выше степень ее деградации и выше величина С!).

В случае использования в качестве растворителя ДНК-стабилизирующего раствора, в отличие от воды, разница в концентрациях ДНК между 7 и 30 сутками была недостоверной (и = 56, Ъ = -1,83, р = 0,066). Тогда как в случае с водой на 30 сутки эксперимента ДНК-матрица практически отсутствовала (Ме = 0,002, Р25 = 0,0003, Р75 = 0,006) (табл. 21).

Таблица 20. Оценка деградации ДНК с течением времени в различных растворителях

Растворитель Длительность инкубации, сут. N С! по гену Р-актина

Ме Р25 (01) Р75 (03) АС!

адо 0(контроль) 7 29,77 29,58 30,05 К1

5 12 33,49 32,34 34,05 -3,72

7 16 34,00 32,85 34,94 -4,23

30 11 36,90 34,98 38,88 -7,13

ДНК-СР 0(контроль) 7 29,44 29,37 29,56 К2

5 11 30,83 30,46 31,18 -1,39

7 16 31,87 30,98 32,65 -2,43

30 12 32,28 32,05 32,92 -2,84

Таблица 21. Различия показателей пороговых циклов ПЦР по гену Р-актина в смывах, выполненных деионизованной водой или ДНК-стабилизирующим раствором, хранившихся в течение 5, 7 и 30 суток, по Ц-критерию Манна-Уитни

Растворитель Переменные N х* N х** Ц Ъ асСу^её 2*ЫСеС ехаС: р

х1* и х2** 7 12 0 -3,51 4х10-5

х1* и х3** 7 16 0 -3,71 8х10-6

№0 х1* и х4** 7 11 0 -3,44 6х10-5

х2* и х3** 12 16 75 -0,95 0,347

х2* и х4** 12 11 19 -2,86 0,003

х3* и х4** 16 11 33 -2,69 0,006

х1* и х2** 7 11 7 -2,81 0,003

х1* и х3** 7 16 5 -3,37 2х10-4

ДНК-СР х1* и х4** 7 12 0 -3,51 4х10-5

х2* и х3** 11 16 30 -2,84 0,003

х2* и х4** 11 12 5 -3,72 3х10-5

х3* и х4** 16 12 56 -1,83 0,066

Примечание: хранение смывов 0 суток (контроль) (х1), 5 суток (х2), 7 суток (х3), 30 суток (х4)

При генотипировании хранящихся в условиях комнатной температуры смывов, выполненных деионизованной водой, с течением времени отмечалось уменьшение активной ДНК-матрицы. Так, спустя 7 суток в них удалось идентифицировать 8,3% исследованных локусов (п = 16), а по истечении 30 суток

- 2% (п = 12). В смывах, полученных с помощью ДНК-стабилизирующего раствора, хранившихся в аналогичных условиях, по прошествии 7 суток удалось идентифицировать аллели в 39% (п = 32) исследованных локусов, а через 30 суток

- в 32% (п = 24) (рис. 12).

Таким образом, данные эксперимента надежно подтверждают большую эффективность хранения ДНК на носителе (хлопчатобумажной ткани) при использовании в качестве растворителя ДНК-стабилизирующего раствора, а не деионизованной воды.

0%

85,7 96,0 50,1 45,5

22,5

10,9

39,0

32,0

6,0 8,3

Вода 7 суток

Вода 30 суток ДНК-СР 7 суток

■ «+» ■«+/-» I «-»

ДНК-СР 30 суток

Рисунок 12. Результаты генотипирования препаратов ДНК на основе деионизованной воды и ДНК-стабилизирующего раствора, хранившихся в сухом виде на хлопчатобумажном носителе в течение 7 суток и 30 суток: «+» - наличие всех аллельных состояний в локусах; «+/-» - выпадение одного из пары аллелей в локусах; «-» - отсутствие продукта амплификации (выпадение локуса)

3.5. Исследование жидкостей, применяемых для установления пота, его групповой принадлежности, и оценка их влияния на сохранность ДНК и ПЦР

В рамках судебно-биологических экспертных исследований для определения наличия пота в ходе экстракции применяют 0,9% раствор хлорида натрия или 10% раствор уксусной кислоты. В отличие от физиологического раствора, после 10% раствора уксусной кислоты дальнейшая оценка групповой принадлежности пота может быть затруднена. Несмотря на положительный опыт применения 0,9% раствора хлорида натрия в экспертной практике, следует признать, что он не обладает достаточным стабилизирующим действием на ДНК. В дальнейшем это может негативно сказаться на результатах генетического исследования.

Нами исследованы возможности применения ДНК-стабилизирующего раствора [54] для установления наличия пота и его групповой принадлежности в сравнении с деионизованной водой, 0,9% раствором хлорида натрия и 1 0% раствором уксусной кислоты. Проведена оценка сохранности ДНК в данных средах в сухом и жидком виде, а также их влияние на ПЦР.

При установлении наличия пота методом вертикальной тонкослойной хроматографии была получена положительная реакция на его присутствие. Во всех образцах вблизи линии старта или несколько выше нее наблюдали сиренево-розовое окрашивание, присущее аминокислотам пота, в частности, свободному серину. Полученный результат свидетельствует о возможности применения всех исследованных сред для осуществления смыва потожировых следов и экстракции пота (рис. 13).

1 2 3 4 5 6 7 8

т ~ • *

' А- Щ

Рисунок 13. Фотографическое изображение отрицательной («-») и положительной («+») реакции на пот, полученной методом вертикальной тонкослойной хроматографии в различных средах на силуфолевой пластине: «-» (1) и «+» (2) контроли в &И20; «-» (3) и «+» (4) контроли в 0,9% NaCl; «-» (5) и «+» (6) контроли в ДНК-СР; «-» (7) и «+» (8) контроли в 10% растворе УК

При определении групповой принадлежности пота были использованы смывы, полученные в ходе проведения экстракции пота в деионизованной воде,

0,9% растворе хлорида натрия, ДНК-стабилизирующем растворе и 10% растворе уксусной кислоты. Результаты на примере группы В представлены в табл. 22 и на рис. 14. В исследуемых образцах пота отмечалась агглютинация эритроцитов.

Таблица 22. Результаты определения групп системы АВ0 в вытяжках пота реакцией абсорбции-элюции

п/п № Исследуемые образцы Оценка реакции

1 Контроль марли —

2 Пот группы В +++

3 Пот группы 0 —

4 Вытяжка пота в деионизованной воде (кипячение) +++

5 Вытяжка пота в деионизованной воде (этанол) ++

6 Вытяжка пота в 0,9% растворе хлорида натрия (кипячение) ++

7 Вытяжка пота в 0,9% растворе хлорида натрия (этанол) +

8 Вытяжка пота в ДНК-стабилизирующем растворе (кипячение) +++

9 Вытяжка пота в ДНК-стабилизирующем растворе (этанол) ++

10 Вытяжка пота в 10% растворе уксусной кислоты (кипячение) +

11 Вытяжка пота в 10% растворе уксусной кислоты (этанол) +++

Примечание: «-» - отрицательная реакция, «+» - слабая положительная реакция, «++» - умеренная положительная реакция, «+++» - выраженная положительная реакция

1 2 3

8 9 10 11

Рисунок 14. Микрофотографии агглютинации эритроцитов при определении групповой принадлежности пота (увеличение в 100 раз): контроль марли (1); пот группы В (2); пот группы 0 (3); вытяжка пота в &И20 - кипячение (4), этанол (5); вытяжка пота в 0,9% №С1 - кипячение (6), этанол (7); вытяжка пота в ДНК-СР -кипячение (8), этанол (9); вытяжка пота в 10% растворе УК - кипячение (10), этанол (11)

Исследование сохранности ДНК и влияния применяемых жидких сред на ПЦР. Влияние исследуемых жидких сред (деионизованной воды, ДНК-

стабилизирующего раствора, 0,9% раствора хлорида натрия и 10% раствора уксусной кислоты) на сохранность ДНК в жидком и сухом виде при комнатной температуре по истечении суток, а также на энзиматическую амплификацию исследовали путем постановки ПЦР-РВ. Разницу пороговых циклов (АС!) по фрагменту Р-актина (флуорофор БАМ) и ВПК (флуорофор Су5) оценивали относительно данных препаратов ДНК на основе деионизованной воды в соответствии с группой наблюдений: препаратами, хранившимися в жидком (К1) или в сухом (фильтрат) (К2) виде.

Результаты по гену Р-актина показали отсутствие статистически значимых отличий концентрации ДНК и пороговых циклов кривых ПЦР проб на основе ДНК-стабилизирующего раствора (АС! = -0,04, р = 0,818), его фильтрата (АС! = 0,32, р = 0,394), а также на основе 0,9% раствора хлорида натрия (АС! = -0,14, р = 0,818) по сравнению с контролем. В фильтратах проб на основе 0,9% раствора хлорида натрия выявлено достоверное снижение эффективности энзиматической амплификации (АС! = -3,49, р = 0,002) по сравнению с контрольным препаратом.

Анализ изменений пороговых циклов кривых ПЦР проб ВПК показал отсутствие достоверных различий растворов (АС! = -0,47, р = 0,132) и фильтратов (АС! = -0,2, р = 0,132) проб на основе ДНК-стабилизирующего раствора по отношению к контролю. Растворы ДНК на основе 0,9% раствора хлорида натрия (АС! = -1,98, р = 0,002) и их фильтраты (АС! = -1,34, р = 0,394) проявили ингибирующее действие на энзиматическую амплификацию.

Во всех препаратах ДНК на основе растворов и фильтратов 10% раствора уксусной кислоты по гену Р-актина продукт энзиматической амплификации не был получен. Анализ данных по ВПК также показал полное ингибирование ПЦР (К/А) (табл. 23).

Таблица 23. Результаты исследования сохранности ДНК в сухом и жидком виде в исследуемых средах спустя сутки, а также влияния данных сред на ПЦР

Объекты исследования Растворитель N Концентрация ДНК (нг/мкл) по гену Р-актина С! по гену Р-актина С! ВПК

Ме Р25 (01) Р75 (03) Ме Р25 (01) Р75 (03) до Ме Р25 (01) Р75 (03) ДС!

Растворы diH2O 6 0,373 0,337 0,375 26,12 26,11 26,26 К1р 30,41 11,33 30,96 К2р

ДНК-СР 6 0,362 0,265 0,425 26,16 25,94 26,59 -0,04 30,88 30,76 31,28 -0,47

0,9% ша 6 0,337 0,326 0,404 26,26 26,01 26,30 -0,14 32,39 31,56 32,58 -1,98

10% УК 6 МЛ МЛ МЛ МЛ МЛ МЛ МЛ МЛ МЛ МЛ МЛ

Фильтраты diH2O 6 0,482 0,450 0,672 25,76 25,30 25,86 К1ф 30,13 29,89 30,17 К2ф

ДНК-СР 6 0,609 0,604 0,644 25,44 25,36 25,45 0,32 30,33 30,09 30,68 -0,2

0,9% Naа 6 0,039 0,029 0,159 29,25 27,30 29,66 -3,49 31,47 19,27 31,55 -1,34

10% УК 6 МЛ МЛ МЛ МЛ МЛ МЛ МЛ МЛ МЛ МЛ МЛ

0-1

Примечание: K - медианы пороговых циклов в препаратах с растворами (К1Р и К2Р) и фильтратами растворов (К1ф и К2ф) приняты за контроль (diH2O)

3.6. Сравнительная оценка эффективности методов выделения ДНК из объектов с

малым её содержанием

При проведении экстракции ДНК с использованием различных методов было отмечено заметное снижение концентрации хромосомной ДНК в препаратах, выделенных при помощи наборов реагентов «PrepFiler™ User Guide» (Applied Biosystems, США) и «DNA IQ™» (Promega, США), по сравнению с контрольным образцом ДНК, не подвергшимся процессу экстракции ДНК. В данных образцах (1 и 2 на рис. 15 а-в) установлена выраженная деградация и значительная потеря высокомолекулярной ДНК, что представлено в виде «шмера» низкомолекулярной ДНК. Экстракция ДНК с использованием ДНК-стабилизирующего раствора (образцы 3 и 4 на рис. 15 а-в) не привела к потере высокомолекулярной ДНК: в районе между полосами 21226 и 5148 отчетливо видна фракция мтДНК размером 16569 п.н.

а б в

Рисунок 15. Результаты электрофореза в 1% геле агарозы препаратов ДНК в трех параллелях (а, б, в), полученных при помощи наборов реагентов «PrepFiler™ User Guide» (1), «DNA IQ™» (2) и ДНК-СР (3, 4): М - размерный стандарт, контроль с инкубацией в течение 30 минут при 22°С (5) и при 70°С (6)

Благодаря компонентам, входящим в состав ДНК-стабилизирующего раствора, происходила стабилизация молекул ДНК и обеспечивалась её защита от деградации [29]: в лунках геля отчетливо видны полосы высокомолекулярной яДНК, в то время как в контрольном препарате, инкубировавшемся в при 70°С в течение 30 минут, ДНК не визуализируется, либо визуализируется слабо.

3.7. Исследование количества ДНК в потожировом веществе на кожных покровах

человека

Контактные следы, оставленные на теле человека, являются все более распространенным объектом экспертного исследования в рамках молекулярно-генетического анализа. Исходя из особенностей морфологического строения кожи различных областей тела человека и физиологии её выделения, практический интерес в плане ДНК-идентификации представляет изучение потожирового вещества на участках тела, которые наиболее часто подвергаются контакту в процессе преступных действий в отношении личности. Поэтому была поставлена задача определить количество генетического материала в потожировых выделениях шеи, подушечек пальцев, ладоней и передней поверхности предплечий мужчин и женщин.

При оценке полученных результатов следует принимать во внимание тот факт, что отбор потожирового вещества с поверхности кистей рук осуществлялся спустя 1-2 часа после мытья, а с поверхности предплечий и шеи по прошествии около 12 часов. Поэтому можно предполагать, что в потожировых наложениях ладоней рук содержится превалирующее количество как местнообразующегося генетического материала, так и привнесенного вследствие частого контакта с собственными участками тела и с посторонними объектами, по сравнению с предплечьями и шеей.

По результатам проведенных исследований установлено нормированное количество ДНК в потожировом веществе в пересчете на 1 см2 кожи подушечек пальцев рук, ладоней, передней поверхности предплечий и шеи (табл. 24).

Отмечено статистически достоверное преобладание количества ДНК (нг) в потожировых выделениях на квадратный сантиметр поверхности подушечек пальцев у женщин (Ме = 1,983, Р25 = 0,744, Р75 = 3,489, п = 46) по сравнению с мужчинами (Ме = 0,882, Р25 = 0,427, Р75 = 2,135, п = 46) (и = 785, Ъ = -2,13, р = 0,033). Достоверных различий в количестве ДНК в потожировом веществе на ладонях, предплечьях и шее в зависимости от пола не было обнаружено (р > 0,05) (табл. 25).

Таблица 24. Нормированное количество ДНК (нг) в потожировом веществе на квадратный сантиметр поверхности кожи различных участков тела мужчин и женщин

Участок тела Мужчины Женщины

Ме Р25 (01) Р75 (03) Ме Р25 (О1) Р75 (03)

х1 2,252 2,135 2,935 1,983 0,654 8,182

х2 1,109 0,438 1,985 1,601 0,587 3,107

х3 0,586 0,370 0,874 3,719 1,525 5,186

х4 0,648 0,316 1,614 2,057 0,990 2,470

х5 1,199 0,723 2,174 1,709 0,750 2,142

х1-х5 0,882 0,427 2,135 1,983 0,744 3,489

х6 0,661 0,515 2,940 2,053 1,027 3,446

х7 1,150 0,632 2,280 1,211 0,458 1,905

х8 1,771 0,441 2,687 2,405 1,223 3,433

Примечание: подушечки большого (х1), указательного (х2), среднего (х3), безымянного (х4) пальцев кисти и мизинца (х5), ладонь (х6), передняя поверхность предплечья (х7), шея (х8), «х1-х5» - усредненное значение количества ДНК в потожировом веществе на 1 см2 поверхности всех подушечек пальцев

Таблица 25. Сравнение количества ДНК в потожировом веществе на квадратный сантиметр поверхности кожи различных участков тела у мужчин и женщин по и-критерию Манна-Уитни

Переменные N мужчины N женщины И Ъ афш1её 2*Ыёеё ехаС: р

х1-х5 46 46 785 -2,13 0,033

х6 11 14 56 -1,12 0,267

х7 10 15 56 1,03 0,311

х8 12 9 43 -0,75 0,464

Примечание: подушечки большого (х1), указательного (х2), среднего (х3), безымянного (х4) пальцев кисти и мизинца (х5), ладонь (х6), передняя поверхность предплечья (х7), шея (х8), «х1-х5» - объединенные данные количества ДНК в потожировом веществе на 1 см2 поверхности всех подушечек пальцев правых и левых рук

Установлено отсутствие статистически значимых отличий в количестве генетического материала, содержащегося в потожировом веществе на правой и левой верхних конечностях, шее с обеих сторон (р > 0,05) (табл. 26), а также на подушечках различных пальцев (р > 0,05) (табл. 27) как у мужчин, так и у женщин. Полученные результаты позволили использовать объединенные данные по всем подушечкам пальцев, ладоням и предплечьям обеих рук, а также шее при сравнении количества ДНК в потожировых выделениях. При анализе количества ДНК в потожировом веществе на поверхности исследованных участков тела у мужчин не было обнаружено статистически значимых отличий (р > 0,05), в то время как у женщин наблюдалось лишь различие в количестве генетического материала на подушечках пальцев и предплечьях (И = 227, Ъ = 2,26, р = 0,023) (табл. 28).

Таблица 26. Оценка различия в количестве ДНК в потожировом веществе на квадратный сантиметр поверхности кожи различных участков тела (справа и слева) отдельно у мужчин и женщин по Ц-критерию Манна-Уитни

Пол Переменные N право N лево Ц Ъ афш1её 2*Ыёеё ехаС: р

х1 4 5 7 -0,61 0,556

х2 3 4 3 -0,88 0,400

х3 3 6 5 -0,90 0,381

мужчины х4 6 7 7 -1,93 0,051

х5 3 5 3 -1,19 0,250

х6 5 6 10 -0,82 0,429

х7 5 5 10 0,42 0,690

х8 6 6 18 0,00 1,000

х1 7 4 9 -0,85 0,412

х2 5 5 11 0,21 0,841

х3 4 4 7 0,14 0,886

женщины х4 4 4 4 1,01 0,343

х5 5 4 3 -1,59 0,111

х6 7 7 24 0,00 1,000

х7 8 8 28 0,37 0,721

х8 4 5 8 0,37 0,730

Примечание: подушечки большого (х1), указательного (х2), среднего (х3), безымянного (х4) пальцев кисти и мизинца (х5), ладонь (х6), передняя поверхность предплечья (х7), шея (х8)

Таблица 27. Сравнение количества ДНК в потожировом веществе на квадратный сантиметр поверхности кожи подушечек пальцев кистей рук отдельно у мужчин и женщин по U-критерию Манна-Уитни

Пол Переменные N x* N x** U Z adjusted 2*1sided exact р

мужчины x1* и x2** 9 7 21 1,06 0,299

x1* и x3** 9 9 22 1,59 0,113

x1* и x4** 9 13 33 1,67 0,096

x1* и x5** 9 8 24 1,11 0,277

x2* и x3** 7 9 18 1,38 0,174

x2* и x4** 7 13 33 0,95 0,351

x2* и x5** 7 8 27 -0,06 0,955

x3* и x4** 9 13 56 -0,13 0,896

x3* и x5** 9 8 20 -1,49 0,139

x4* и x5** 13 8 35 -1,19 0,238

женщины x1* и x2** 11 10 46 0,60 0,557

x1* и x3** 11 8 37 -0,54 0,600

x1* и x4** 11 8 40 0,29 0,778

x1* и x5** 11 9 42 0,53 0,603

x2* и x3** 10 8 27 -1,11 0,274

x2* и x4** 10 8 38 -0,13 0,897

x2* и x5** 10 9 44 0,04 0,968

x3* и x4** 8 8 16 1,63 0,105

x3* и x5** 8 9 20 1,49 0,139

x4* и x5** 8 9 32 0,34 0,743

Примечание: подушечки большого (х1), указательного (х2), среднего (х3), безымянного (х4) пальцев кисти и мизинца (х5), «х*» и «х**» - обозначение сравниваемых групп

Таблица 28. Сравнение количества ДНК в потожировом веществе на квадратный сантиметр поверхности кожи различных участков тела отдельно у мужчин и женщин по Ц-критерию Манна-Уитни

Пол Переменные N х* N х** Ц Ъ асСу^её 2*ЫСеС ехаС: р

мужчины х1-х5* и х6** 46 11 242 -0,21 0,834

х1-х5* и х7** 46 10 206 -0,50 0,620

х1-х5* и х8** 46 12 240 -0,68 0,500

х6* и х7** 11 10 50 -0,32 0,756

х6* и х8** 11 12 63 -0,15 0,880

х7* и х8** 10 12 56 -0,23 0,821

женщины х1-х5* и х6** 46 14 321 0,01 0,993

х1-х5* и х7** 46 16 227 2,26 0,023

х1-х5* и х8** 46 9 197 -0,22 0,832

х6* и х7** 14 16 65 1,93 0,052

х6* и х8** 14 9 57 -0,35 0,734

х7* и х8** 15 9 35 -1,91 0,055

Примечание: подушечки большого (х1), указательного (х2), среднего (х3), безымянного (х4) пальцев кисти и мизинца (х5), ладонь (х6), передняя поверхность предплечья (х7), шея (х8), «х1-х5» - объединенные данные количества ДНК в потожировом веществе на 1 см2 поверхности всех подушечек пальцев правых и левых рук, «х*» и «х**» - обозначение сравниваемых групп

3.8. ДНК-идентификация личности по потожировому веществу, оставленному

человеком на искусственной коже

Исследование количества активной ДНК-матрицы размерами 82 п.н. (фрагмент гена Р-актина) и 120 п.н. (фрагмент гена Р-глобина, ИБО) в потожировом веществе, оставленном подушечками пальцев на поверхности искусственной кожи, показало наличие статистически значимых различий у лиц разного пола. В следах мужчин (Ме = 0,394, Р25 = 0,152, Р75 = 1,087, п = 97)

наблюдалось большее количество ДНК (нг) по сравнению со следами женщин (Ме = 0,163, Р25 = 0,036, Р75 = 0,538, п = 45) (и = 1325, Ъ = 3,76, р = 0,0001).

Отмечено отсутствие различий в количестве коротких фрагментов ДНК (82 и 120 п.н.) в потожировых следах, отобранных путем смыва с использованием ДНК-стабилизирующего раствора [54] или деионизованной воды (р > 0,05), а также в зависимости от режима температурной инкубации проб в процессе пробоподготовки (22°С в течение 30 минут (контроль), или 70°С в течение 30 минут, или 99°С в течение 8 минут) (р > 0,05) как у мужчин (табл. 29), так и у женщин (табл. 30).

Таблица 29. Сравнение результатов количественной оценки коротких фрагментов ДНК в потожировом веществе, оставленном мужчинами на искусственной коже, в зависимости от жидкой среды, использованной для смыва, а также режима инкубации по и-критерию Манна-Уитни

Переменные N х* N х** и Ъ асСу^её 2*ЫСеС ехаС: р

х1* и х2** 23 10 84 1,19 0,237

х3* и х4** 22 21 219 -0,28 0,782

х3* и х5** 22 54 565 0,33 0,746

х4* и х5** 21 54 498 0,81 0,422

Примечание: х1 - ДНК-СР, х2 - &Н20, режимы инкубации: х3 - 22°С в течение 30 минут (контроль); х4 - 70°С в течение 30 минут; х5 - 99°С в течение 8 минут; «х*» и «х**» - обозначение сравниваемых групп

Таблица 30. Сравнение результатов количественной оценки коротких фрагментов ДНК в потожировом веществе, оставленном женщинами на искусственной коже, в зависимости от жидкой среды, использованной для смыва, а также режима инкубации по Ц-критерию Манна-Уитни

Переменные N х* N х** Ц Ъ аСуш:еС 2*ЫСеС ехаС: р

х1* и х2** 15 9 45 1,31 0,194

х3* и х4** 9 6 22 0,53 0,607

х3* и х5** 9 30 106 0,95 0,348

х4* и х5** 6 30 84 -0,23 0,820

Примечание: х1 - ДНК-СР, х2 - &И20, режимы инкубации: х3 - 22°С в течение 30 минут (контроль); х4 - 70°С в течение 30 минут; х5 - 99°С в течение 8 минут; «х*» и «х**» - обозначение сравниваемых групп

Поскольку в потожировом веществе генетический материал присутствует не только в свободном виде, но и в составе клеток, для наиболее эффективной экстракции ядерной ДНК применяли режим с наибольшим температурным воздействием в течение короткого промежутка времени (99°С в течение 8 минут), чего вполне достаточно для разрушения клеточных мембран [27]. Далее, в процессе пробоподготовки препаратов ДНК с целью последующего генотипирования использовали протокол № 1 (стр. 65). При проведении ПЦР-РВ и генотипировании холостых проб продукт амплификации не был получен.

Результаты типирования аутосомных полиморфных микросателлитных локусов ДНК потожирового вещества, оставленного на искусственной коже, показали наличие статистически значимых отличий в зависимости от пола и жидкой среды, использованной для смыва (табл. 31-33).

Применение ДНК-стабилизирующего раствора в качестве жидкой среды для проведения смыва контактных следов с поверхности искусственной кожи позволило идентифицировать больше генетических признаков (аллелей) доноров

обоего пола по сравнению с теми случаями, когда с данной целью использовали деионизованную воду (р < 0,05). В смывах потожирового вещества, выполненных при помощи ДНК-стабилизирующего раствора, процент локусов, в которых обнаружены аутентичные генотипу донора аллели, был выше у мужчин (Me = 56,25, P25 = 31,25, P75 = 62,5) по сравнению с женщинами (Me = 33,33, P25 = 8,33, P75 = 50) (табл. 32, 33).

Сравнительный анализ результатов типирования смывов, полученных с использованием ДНК-стабилизирующего раствора и при помощи деионизованной воды, показал существенные статистически значимые отличия в отношении процента выявления аутентичных аллелей, свойственных донору, и процента отсутствия продукта амплификации у лиц обоего пола (р < 0,05).

Результаты генотипирования ДНК в смывах следов подушечек пальцев, полученных при помощи ДНК-стабилизирующего раствора, по полу достоверно отличались в отношении процента обнаружения аутентичных донору аллелей (U = 84, Z = 2,81, р = 0,004) и процента отсутствия продукта амплификации (allelic drop-out) (U = 107, Z = -2,14, р = 0,032). Отбор контактных следов путем смыва с использованием деионизованной воды показал отсутствие статистически значимых отличий между мужчинами и женщинами в отношении процента выявления аутентичных аллелей, свойственных донору (р > 0,05), процента отсутствия продукта амплификации (р > 0,05), а также процента выявления несвойственных генотипу донора аллелей (р > 0,05). При этом во всех случаях появление неаутентичных аллелей в профилях не зависело ни от пола, ни от жидкой среды, которой осуществляли смыв (р > 0,05) (табл. 32, 33).

Таблица 31. Результаты генотипирования потожирового вещества, оставленного на искусственной коже, в зависимости от пола и жидкой среды, использованной для смыва (тест-система «COrDIS Plus»)

Локусы Lmax (п.н.) «+», % «-», % «++», %

Мужчины Женщины Мужчины Женщины Мужчины Женщины

ДНК-СР diH2O ДНК-СР diH2O ДНК-СР diH2O ДНК-СР diH2O ДНК-СР diH2O ДНК-СР diH2O

D3S1358 147 62,5 0 66,67 0 25 75 16,67 66,67 37,5 25 16,67 33,33

TH01 196 56,25 12,5 50 0 25 75 50 100 12,5 0 0 0

D12S391 264 56,25 0 0 0 25 100 83,33 100 50 0 16,67 0

D1S1656 324 31,25 12,5 0 0 62,5 75 83,33 100 0 0 16,67 0

D10S1248 390 50 0 16,67 0 50 100 83,33 100 0 0 0 0

D22S1045 450 25 0 0 0 75 100 100 100 0 0 0 0

D2S441 134 81,25 37,5 50 16,67 0 25 0 0 37,5 50 66,67 100

D7S820 181 68,75 37,5 58,33 33,33 0 0 33,33 66,67 25 25 16,67 0

D13S317 236 75 25 33,33 16,67 25 50 0 33,33 0 25 66,67 33,33

FGA 391 62,5 25 33,33 16,67 25 75 66,67 66,67 0 0 0 0

TPOX 113 56,25 25 41,67 0 37,5 75 50 100 0 0 0 0

D18S51 200 62,5 0 41,67 0 25 100 33,33 100 0 0 0 0

D16S539 256 50 0 33,33 0 50 100 66,67 100 0 0 0 0

D8S1179 314 12,5 0 8,33 0 87,5 100 83,3 100 0 0 0 0

CSF1PO 361 50 0 33,33 0 50 100 66,67 100 0 0 0 0

D5S818 413 31,25 0 0 0 62,5 100 100 100 0 0 0 0

vWA 155 68,75 12,5 50 0 12,5 75 33,33 100 12,5 0 0 0

D21S11 228 37,5 0 25 0 37,5 100 66,67 100 12,5 0 0 0

SE33 403 31,25 0 8,33 0 50 100 83,33 100 0 0 0 0

Примечание: Ьшах - максимальная длина фрагментов ДНК (п.н.), «+» - локусы с аутентичными аллелями донора,

«-» - локусы, в которых продукт амплификации отсутствовал, «++» - локусы с неаутентичными аллелями

Таблица 32. Идентификация профилей аутосомной ДНК потожирового вещества, оставленного на искусственной коже, в зависимости от пола и жидкой среды, использованной для смыва (тест-система «COrDIS Plus»)

Пол Результат Среда Me, % P25 (Q1), % P75 (Q3), %

+ ДНК-СР 56,25 31,25 62,5

diH2O 0 0 25

Мужчины ДНК-СР 37,5 25 50

diH2O 100 75 100

++ ДНК-СР 0 0 12,5

diH2O 0 0 0

+ ДНК-СР 33,33 8,33 50

diH2O 0 0 0

Женщины ДНК-СР 66,67 33,33 83,33

diH2O 100 66,67 100

++ ДНК-СР 0 0 16,67

diH2O 0 0 0

Примечание: «+» - локусы с аутентичными аллелями донора, «-» - локусы, в которых продукт амплификации отсутствовал, «++» - локусы с неаутентичными аллелями

Анализ результатов генотипирования ДНК потожирового вещества, оставленного на искусственной коже, показал наличие статистически значимой корреляционной связи между длиной исследуемых аутосомных полиморфных микросателлитных участков ДНК и процентом локусов, в которых были выявлены аутентичные аллели донора. Наибольшая сила связи отмечалась в пробах ДНК, полученных из следов подушечек пальцев доноров обоего пола, отобранного с поверхности искусственной кожи путем смыва с использованием ДНК-стабилизирующего раствора (табл. 34).

Таблица 33. Сравнение результатов генотипирования ДНК потожирового вещества, оставленного на искусственной коже, в зависимости от пола и жидкой среды, использованной для смыва, по U-критерию Манна-Уитни (тест-система «COrDIS Plus»)

Результат Переменные N x* N x** U Z adjusted 2*1sided exact р

+ x1* и x2** 19 19 17 4,83 7х10-8

x3* и x4** 19 19 59,5 3,77 2x10-4

x1* и x3** 19 19 84 2,81 0,004

x2* и x4** 19 19 141,5 1,36 0,258

— x1* и x2** 19 19 46 -3,98 3x10-5

x3* и x4** 19 19 73,5 -3,25 0,001

x1* и x3** 19 19 107 -2,14 0,032

x2* и x4** 19 19 153,5 -0,90 0,435

++ x1* и x2** 19 19 155 0,91 0,470

x3* и x4** 19 19 157 0,90 0,506

x1* и x3** 19 19 176 0,14 0,908

x2* и x4** 19 19 175 0,22 0,885

Примечание: «+» - локусы с аллелями, свойственными донору, «-» -локусы, в которых продукт амплификации отсутствовал, «++» - локусы с неаутентичными аллелями, х1, х2 - ПЖВ мужчин, х3, х4 - ПЖВ женщин, х1, х3 -ДНК-СР, х2, х4 - diH2O, «х*» и «х**» - обозначение сравниваемых групп

Так, у мужчин обнаружена отрицательная статистически значимая связь умеренной силы между процентом выявления свойственных донору аллелей и длиной локусов, максимальный размер которых превышал 300 п.н. (при длине до 350 п.н. ^ = -0,63, р = 0,021). С увеличением длин анализируемых локусов эта связь постепенно статистически достоверно усиливалась (при длине локусов до 400 п.н. ъ = -0,54, р = 0,032 и до 450 п.н. ъ = -0,68, р = 0,001). Соответственно, в отношении процента локусов, в которых отмечалось выпадение всех аллелей, наблюдалась умеренная при длине амплифицированных фрагментов (АФ) ДНК свыше 300 п.н. (до 350 п.н. ъ = 0,62, р = 0,024 и до 400 п.н. ъ = 0,59, р = 0,017) и

высокая при длине АФ до 450 п.н. (г8 = 0,70, р = 0,0008) положительная статистически значимая теснота корреляционной связи.

При использовании ДНК-стабилизирующего раствора в качестве жидкой среды для смыва потожирового вещества женщин доноров с поверхности искусственной кожи обнаружена высокая отрицательная статистически значимая теснота связи между процентом выявления свойственных донору аллелей и длиной локусов, максимальный размер которых превышал 250 п.н. (при 300 п.н. г8 = -0,73, р = 0,010). С увеличением длин анализируемых участков ДНК эта связь постепенно статистически достоверно усиливалась (при длине локусов до 450 п.н. составляла г8 = -0,81, р = 0,00002). Анализ локусов с выпадением всех аллелей показал умеренную (при длине локусов до 350 п.н. г8 = 0,69, р = 0,009) и высокую (при длине локусов до 400 п.н. г8 = 0,74, р = 0,001 и до 450 п.н. г8 = 0,84, р = 0,000009) положительную статистически значимую силу связи.

Применение деионизованной воды в качестве жидкой среды для проведения смыва потожирового вещества с поверхности искусственной кожи позволило выявить достоверную отрицательную корреляционную связь умеренной тесноты между длинами исследуемых локусов и результатом генотипирования только в случаях, когда донором выступали мужчины. Корреляция наблюдалась в отношении выявления свойственных донору аллелей при длине локусов до 450 п.н. (г8 = -0,49, р = 0,032), а в отношении выпадения всех аллелей - при длине участков ДНК до 400 п.н. (г8 = 0,51, р = 0,045) и до 450 п.н. (г8 = 0,61, р = 0,006).

Достоверная умеренная отрицательная корреляционная связь между длинами исследуемых локусов и процентом выявления несвойственных генотипам доноров аллелей отмечалась при ДНК-анализе потожирового вещества, оставленного только мужчинами, как в случае с пробами, полученными с использованием ДНК-стабилизирующего раствора (при длине локусов до 400 п.н. г8 = -0,52, р = 0,039 и до 450 п.н. г8 = -0,59, р = 0,008), так и с применением деионизованной воды (при длине локусов до 450 п.н. г8 = -0,51, р = 0,027) (табл. 34).

Таблица 34. Данные корреляционного анализа по Спирмену результатов генотипирования ДНК потожирового вещества, оставленного на искусственной коже, в зависимости от пола донора, жидкой среды, использованной для смыва, и длин исследуемых фрагментов ДНК (тест-система «COrDIS Plus»)

Пол Среда Результат Максимальная длина фрагментов ДНК, п.н.

200 (n = 7) 250 (n = 9) 300 (n = 11) 350 (n = 13) 400 (n = 16) 450 (n = 19)

Мужчины ДНК-СР + rs = -0,11, р = 0,814 rs = -0,10, р = 0,795 rs = -0,39, р = 0,233 rs = -0,63, р = 0,021 rs = -0,54, р = 0,032 rs = -0,68, р = 0,001

— rs = -0,09, р = 0,842 rs = 0,20, р = 0,602 rs = 0,36, р = 0,271 rs = 0,62, р = 0,024 rs = 0,59, р = 0,017 rs = 0,70, р = 8x10-4

++ rs = -0,28, р = 0,550 rs = -0,41, р = 0,277 rs = -0,11, р = 0,741 rs = -0,35, р = 0,238 rs = -0,52, р = 0,039 rs = -0,59, р = 0,008

О £ • 1-Н тз + rs = -0,42, p = 0,345 rs = -0,33, p = 0,378 rs = -0,53, p = 0,091 rs = -0,48, p = 0,098 rs = -0,38, p = 0,149 rs = -0,49, p = 0,032

— rs = 0,35, p = 0,435 rs = 0,27, p = 0,481 rs = 0,56, p = 0,072 rs = 0,52, p = 0,070 rs = 0,51, p = 0,045 rs = 0,61, p = 0,006

++ rs = -0,36, р = 0,430 rs = -0,19, р = 0,631 rs = -0,35, p = 0,289 rs = -0,43, p = 0,139 rs = -0,49, p = 0,055 rs = -0,51, p = 0,027

Женщины ДНК-СР + rs = -0,04, p = 0,937 rs = -0,54, p = 0,129 rs = -0,73, p = 0,010 rs = -0,83, p = 5x10-4 rs = -0,75, p = 7x10-4 rs = -0,81, p = 2x10-5

— rs = 0,21, p = 0,658 rs = 0,09, p = 0,827 rs = 0,50, p = 0,118 rs = 0,69, p = 0,009 rs = 0,74, p = 0,001 rs = 0,84, p = 9x10-6

++ rs = -0,36, p = 0,430 rs = -0,03, p = 0,944 rs = -0,03, p = 0,942 rs = -0,02, p = 0,945 rs = -0,25, p = 0,345 rs = -0,37, p = 0,122

о <N Д • 1-Н тз + rs = -0,09, p = 0,849 rs = 0,08, p = 0,839 rs = -0,13, p = 0,696 rs = -0,25, p = 0,418 rs = -0,09, p = 0,753 rs = -0,20, p = 0,406

— rs = 0,36, p = 0,430 rs = 0,09, p = 0,814 rs = 0,30, p = 0,377 rs = 0,40, p = 0,180 rs = 0,26, p = 0,341 rs = 0,35, p = 0,144

++ rs = -0,49, p = 0,264 rs = -0,17, p = 0,663 rs = -0,30, p = 0,367 rs = -0,37, p = 0,215 rs = -0,41, p = 0,110 rs = -0,43, p = 0,065

Примечание: «+» - локусы с аутентичными аллелями донора, «-» - локусы, в которых продукт амплификации отсутствовал, «++» - локусы с неаутентичными аллелями

Для АФ, размер которых не превышает 250 п.н., корреляционная связь между долей выявления аутентичных аллелей донора обоего пола и размерами исследуемых локусов отсутствовала. Такой результат объясняется тем, что в случае применения ДНК-стабилизирующего раствора любой из девяти локусов (D3S1358, TH01, D2S441, D7S820, D13S317, TPOX, D18S51, vWA, D21S11) системы «COrDIS Plus» (ГОРДИЗ, Россия) с максимальной длиной до 250 п.н. и менее практически одинаково успешно амплифицируется.

3.9. ДНК-идентификация личности по потожировому веществу, оставленному человеком на кожных покровах живых лиц

При контакте кожных покровов двух лиц и более происходит смешение потожирового вещества донора и реципиента. Следует отметить, что понятия «донор» и «реципиент» носят условный характер, поскольку при соприкосновении происходит взаимный перенос биоматериала на обе контактирующие поверхности. Идентификация лица, оставившего свои потожировые следы на коже другого человека, сопровождается определенными сложностями. Это связано с изначально малым количеством ДНК в следах, потерями генетического материала в процессе контакта, смешанным характером образованных следов, влиянием на активную ДНК-матрицу агрессивных факторов (ферменты ДНК-азы, уровень pH, микрофлора, влажность, инсоляция, температура внешней среды, косметические средства и т.п.).

Данные Федеральной службы государственной статистики за 2018 год свидетельствуют, что мужчины совершают преступления чаще, чем женщины в 5,4 раза. При этом жертвами преступлений примерно одинаково часто становятся как мужчины (54,25%), так и женщины (45,75%). Исходя из этих данных при постановке экспериментов в роли «доноров» выступали мужчины, а в роли «реципиентов» мужчины и женщины. Нами исследовано потожировое вещество в местах контакта подушечек пальцев и ладоней (рис. 1 -п в приложения) живых мужчин доноров с передней поверхностью предплечий (рис. 1 -п д приложения)

живых мужчин и женщин реципиентов (116 объектов от 32 мужчин и 20 женщин в возрасте от 22 до 48 лет).

Результаты генотипирования аутосомных микросателлитных локусов ДНК потожирового вещества, полученного из мест контакта доноров с кожными покровами живых реципиентов, по системе «COrDIS Plus» представлены в таблице 35. Анализ полученных данных показал отсутствие достоверных различий по проценту обнаружения генетических признаков донора в зависимости от пола реципиента (р > 0,05). Так, обнаружение всех аллельных комбинаций, присущих генотипам доноров, в потожировых следах на коже живых мужчин реципиентов установлено в 50% исследованных локусов, на коже живых женщин реципиентов - в 53,33%. Эффект выпадения аллелей («allele drop-out») доноров при контакте с кожными покровами живых мужчин реципиентов отмечали в 20% локусов, при контакте с женщинами в 16,67% локусов. В 26,67% локусов при контакте доноров с кожными покровами реципиентов обоего пола наблюдали эффект выпадения локусов («locus drop-out») [115].

В зависимости от половой принадлежности установлены достоверные различия по процентам локусов, в которых обнаружены характерные для профилей реципиентов аллели, а также случаи их выпадения. У мужчин и женщин реципиентов были выявлены все присущие их генотипам аллельные комбинации в 63,33% и в 53,33% локусов соответственно (U = 86, Z = 2,76, р = 0,005). Случаи выпадения аллелей у мужчин реципиентов отмечались в 10% локусов, у женщин реципиентов - в 16,67% (U = 88,5, Z = -2,70, р = 0,006). Отсутствие всех аллельных комбинаций, присущих генотипам реципиентов, не отличалось по полу и наблюдалось в 20% локусов у мужчин и в 26,67% локусов у женщин (р > 0,05). В 23,33% локусов в случаях контакта донора с мужчинами реципиентами и в 30% локусов и при контакте донора с женщинами реципиентами были выявлены неаутентичные, то есть несвойственные генотипам доноров и реципиентов, аллели, появление которых не зависело от половой принадлежности реципиента (р > 0,05) (табл. 36, 37).

Таблица 35. Результаты генотипирования аутосомной ДНК потожирового вещества из мест контакта кожных

покровов доноров с живыми реципиентами (тест-система «COrDIS Plus»)

Локусы Lmax (п.н.) Контакт мужчины донора и мужчины реципиента Контакт мужчины донора и женщины реципиента

Аллели донора, % Аллели реципиента, % +/+ % Аллели донора, % Аллели реципиента, % +/+ %

+ +/- — + +/- — + +/- — + +/- —

D3S1358 147 63,33 23,33 13,33 83,33 10 6,67 33,33 73,33 6,67 20 70 10 20 46,67

TH01 196 70 13,33 16,67 66,67 23,33 10 13,33 53,33 26,67 20 53,33 23,33 23,33 40

D12S391 264 50 23,33 26,67 76,67 6,67 16,67 40 63,33 16,67 20 50 20 30 50

D1S1656 324 43,33 16,67 40 50 20 30 30 33,33 16,67 50 46,67 26,67 26,67 43,33

D10S1248 390 50 13,33 36,67 60 10 30 6,67 46,67 10 43,33 46,67 16,67 36,67 16,67

D22S1045 450 20 16,67 63,33 36,67 3,33 60 6,67 36,67 10 53,33 26,67 20 53,33 10

D2S441 134 80 6,67 13,33 90 6,67 3,33 26,67 76,67 10 13,33 76,67 10 13,33 30

D7S820 181 80 6,67 13,33 63,33 30 6,67 20 50 23,33 26,67 63,33 16,67 20 36,67

D13S317 236 60 20 20 76,67 6,67 16,67 36,67 66,67 16,67 16,67 53,33 26,67 20 30

FGA 391 46,67 26,67 26,67 60 20 20 20 50 20 30 53,33 20 26,67 30

TPOX 113 80 16,67 3,33 90 3,33 6,67 33,33 80 0 20 56,67 26,67 16,67 30

D18S51 200 63,33 23,33 13,33 73,33 6,67 20 33,33 63,33 13,33 23,33 63,33 13,33 23,33 46,67

D16S539 256 46,67 20 33,33 73,33 3,33 23,33 3,33 63,33 6,67 30 53,33 13,33 33,33 16,67

D8S1179 314 50 20 30 63,33 3,33 33,33 13,33 43,33 20 36,67 60 13,33 26,67 20

CSF1PO 361 53,33 23,33 23,33 63,33 13,33 23,33 20 63,33 13,33 23,33 56,67 13,33 30 10

D5S818 413 36,67 23,33 40 43,33 10 46,67 13,33 26,67 26,67 46,67 50 10 40 13,33

vWA 155 70 23,33 6,67 80 13,33 6,67 36,67 63,33 13,33 23,33 66,67 10 23,33 40

D21S11 228 46,67 20 33,33 63,33 13,33 23,33 40 53,33 16,67 30 53,33 23,33 23,33 43,33

SE33 403 26,67 30 43,33 60 16,67 23,33 23,33 26,67 23,33 50 33,33 30 36,67 36,67

Примечание: Ьтах - максимальная длина фрагментов ДНК (п.н.), «+» - локусы с аутентичными аллелями, «+/-» -

локусы с выпадением аллелей, «-» - выпадение локусов, «++» - локусы с неаутентичными профилям аллелями

Таблица 36. Идентификация профилей аутосомной ДНК доноров и реципиентов (живых лиц) в местах контакт их кожных покровов (тест-система «COrDIS Plus»)

Анализируемый профиль Результат Me, % P25 (Q1), % P75 (Q3), %

Донор (реципиент мужчина) + 50 46,67 70

20 16,67 23,33

— 26,67 13,33 36,67

++ 23,33 13,33 33,33

Донор (реципиент женщина) + 53,33 43,33 63,33

16,67 10 20

— 26,67 20 43,33

++ 30 16,67 43,33

Реципиент мужчина + 63,33 60 76,67

10 6,67 16,67

— 20 6,67 30

Реципиент женщина + 53,33 50 63,33

16,67 13,33 23,33

— 26,67 20 33,33

Примечание: «+» - локусы с аутентичными аллелями, «+/-» - локусы с выпадением аллелей, «-» - выпадение локусов, «++» - локусы с неаутентичными профилям аллелями

Таблица 37. Сравнение результатов генотипирования аутосомной ДНК потожирового вещества из мест контакта кожных покровов доноров и живых реципиентов по U-критерию Манна-Уитни (тест-система «COrDIS Plus»)

Переменные Результат N x* N x** U Z adjusted 2*1sided exact р

х1* и х2** + 19 19 178 -0,06 0,954

19 19 120 1,77 0,080

— 19 19 146,5 -0,98 0,325

х3* и х4** + 19 19 86 2,76 0,005

19 19 88,5 -2,70 0,006