Модификация структуры биологических мембран α-токоферолом в широком диапазоне концентраций тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Белов, Василий Викторович

• Белов, Василий Викторович
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Белов, Василий Викторович

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. а-Токоферол (а-ТФ) и особенности его действия.

1.1.1. Структура, номенклатура, транспорт и локализация витамина Е.

1.1.2. Функции а-ТФ.

1.1.2.1. Антиоксидантная роль токоферолов.

1.1.2.1.1. Антиокислительные способности а-ТФ.

1.1.2.1.2. Участие а-ТФ в регуляция пероксидного окисления липидов в биологических мембранах.

1.1.2.2. Структурные и динамические особенности мембран и модификация их а-ТФ.

1.2. Действие биологически активных веществ в сверхмалых дозах - новая область исследований.

1.2.1. Общие закономерности действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах и существующие теории, объясняющие их.

1.2.1.1. Роль специфических (рецепторных) взаимодействий в механизме действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах.

1.2.1.2. Особенности структуры жидкой воды и их роль в механизме действия биологически активных веществ в сверхмалых дозах.

1.2.2. Действие биологически активных веществ в сверхмалых дозах на биологические мембраны.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Методика приготовления растворов а-ТФ в спирте и вазелиновом масле.

2.2. Выделение мембран эндоплазматического ретикулума и плазматических мембран из клеток печени мышей.

2.3. Определение концентрации белка в мембранах.

2.4. Применение метода спинового зонда для изучения структурно-динамического состояния микросомальных и плазматических мембран.

2.4.1. Измерение вязкостных характеристик различных областей липидного бислоя мембран.

2.4.2. Определение термоиндуцированных структурных переходов в липидном бислое мембран и расчет эффективной энергии их активации.

2.5. Статистическая обработка данных.

2.5.1. Интервальные оценки распределения средних показателей.

2.5.2. Сравнение двух средних показателей.

2.5.2.1. /-Тест или /-критерий Стьюдента (параметрический критерий).

2.5.2.2. Критерий Уилкоксона (непараметрический критерий).

2.5.3. Корреляционный анализ.

2.5.4. Сравнение двух стандартных отклонений (F-критерий Фишера).

2.5.5. Вычисление суммарной ошибки в определении эффекта.

2.6. Использование инфракрасной спектроскопии для изучения структурно-динамического состояния водных растворов а-ТФ.

2.6.1. Измерения флуктуаций показателей пропускания тонких слоев водных растворов в средней части ИК-спектра.

2.6.2. Использование расстояния Махаланобиса в качестве формального критерия происходящих в воде изменений.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Влияние а-ТФ на структурное состояние глубоколежащих областей микросомальных мембран клеток печени мышей in vitro.

3.1.1. Изменение микровязкости глубоколежащих областей липидного бислоя микросомальных мембран под действием а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10'4-10"25М) при температуре 293 К.

3.1.2. Температурные зависимости тс и термоиндуцированные структурные переходы в глубоколежащих областях микросомальных мембран.

3.1.3. Эффективная энергия активации термоиндуцированных структурных переходов в глубоколежащих областях липидов микросомальных мембран.

3.2. Влияние а-ТФ на структурное состояние поверхностных областей микросомальных мембран клеток печени мышей in vitro.

3.2.1. Изменение жесткости поверхностных областей липидного бислоя микросомальных мембран под действием а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25М) при температуре 293 К.

3.2.2. Температурные зависимости S и термоиндуцированные структурные переходы в поверхностных областях микросомальных мембран.

3.3. Влияние а-ТФ на структурное состояние глубоколежащих областей плазматических мембран клеток печени мышей in vitro.

3.3.1. Изменение микровязкости глубоколежащих областей липидного бислоя плазматических мембран под действием а-ТФ в широком диапазоне концентраций (Ю^-Ю'^М) при температуре 293 К.

3.3.2. Температурные зависимости тс и термоиндуцированные структурные переходы в глубоколежащих областях плазматических мембран.

3.3.3. Эффективная энергия активации термоиндуцированных структурных переходов в глубоколежащих областях липидов плазматических мембран.

3.4. Влияние а-ТФ на структурное состояние поверхностных областей плазматических мембран клеток печени мышей in vitro.

3.4.1. Изменение жесткости поверхностных областей липидного бислоя плазматических мембран под действием а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25М) при температуре 293 К.

3.4.2. Температурные зависимости S и термоиндуцированные структурные переходы в поверхностных областях плазматических мембран.

3.5. Роль полярности растворителя, в частности, воды в эффектах сверхнизких и «мнимых» концентраций а-ТФ.

3.5.1. Сравнительное изучение эффекта полярных (водно-спиртовых) и неполярных (в вазелиновом масле) растворов а-ТФ на вязкостные свойства микросомальных мембран.

3.5.2. Влияние а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25М) на показатели ИК-спектра тонких слоев воды.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Модификация структуры биологических мембран α-токоферолом в широком диапазоне концентраций»

Актуальность исследования.

Одним из самых поразительных открытий последних двух десятилетий является обнаружение действия биологически активных веществ (БАВ) -гормонов, пептидов, пестицидов, ядов, антиоксидантов (АО) и других аген

11 'JO тов, в сверхнизких концентрациях (10' -10" М) на живые системы различной степени сложности (от ферментов и мембран до целостных организмов и популяций) [126-128,133]. Каждому из веществ может соответствовать своя специфическая мишень, свои особенности метаболизма, но при действии их в сверхмалых дозах (СМД) наблюдается ряд общих свойств [128,133]:

• Немонотонная, нелинейная полимодальная зависимость "доза-эффект". В большинстве случаев максимумы активности наблюдаются в определенных интервалах концентраций, разделенных между собой так называемой "мертвой зоной", где эффект не проявляется или минимален;

• Изменения чувствительности (как правило, увеличение) биообъекта к действию разнообразных агентов, как эндогенных, так и экзогенных;

• Проявление кинетических парадоксов, а именно возможность уловить эффект СМД БАВ, когда в клетке или в организме имеется то же вещество в концентрациях, на несколько порядков превышающих вводимую дозу. Влияние на рецептор вещества в концентрациях, на порядки более низких, чем константы диссоциации комплекса лиганд-рецептор;

• Зависимость "знака" эффекта от начальных характеристик объекта;

• "Расслоение" свойств БАВ по мере уменьшения его концентрации, при котором еще сохраняется активность, но исчезают побочные эффекты.

Несмотря на лавинообразное увеличение количества фактов разнообразного характера о действии БАВ в СМД, механизм этого явления до конца не установлен. Природа таких общих закономерностей действия БАВ в СМД может быть связана с общностью критических мишеней. На основании ряда работ [155,158-163,233,256] можно было полагать, что в качестве таких мишеней могут выступать клеточные и субклеточные мембраны. Именно в биологических мембранах локализованы важнейшие регуляторные системы, отвечающие за функционирование клетки и организма: системы вторичных посредников и пероксидного окисления липидов (ПОЛ) [1,48,59], которые находятся в тесном взаимодействии и оказывают влияние друг на друга [161,165,166,264]. Система регуляции ПОЛ контролирует скорость пероксидного окисления липидов в биомембранах, и ее параметрами являются: состав липидов, их способность к окислению и радикалообразованию, скорость выхода из мембраны, а также ее структурно-динамическое состояние [57-59]. Существенную роль в регуляции ПОЛ играют и природные антиоксиданты, встроенные в мембрану и ингибирующие ПОЛ как за счет обменных реакций со свободными радикалами в липидах, так и благодаря созданию более компактной структуры, уменьшающей доступ кислорода к липидам [59,98]. Одним из наиболее известных и эффективных природных АО является а-токоферол (а-ТФ), принадлежащий к группе витамина Е и являющийся его наиболее активной формой, чем и обусловлена его витаминная и физиологическая активность [3-6], недостаток которой приводит к тяжелым биохимическим нарушениям [2,7-9]. Благодаря своей липофильности и строению, а-ТФ сосредоточен в липидном бислое мембраны и поэтому способен непосредственно влиять на ее структурные и динамические свойства [91,98], в частности образуя домены с определенной стехиометрией и фосфолипидным составом [15,104], а также связываясь с продуктами гидролиза липидов, оказывающих детергентно-подобное действие на мембрану [99,100]. Однако, как уже указывалось выше, состав и структурно-динамическое состояние липид-ного бислоя являются одними из наиболее важных факторов для клеточного метаболизма, занимающими центральное место в цепи регуляции ПОЛ, изменение которых влияет на активность и чувствительность мембранно-связанных и липид-зависимых регуляторных белков, ферментов и рецепторов. До недавнего времени действие а-ТФ как на химических, так и биологических моделях, исследовалось в интервале относительно высоких концентраций 10"6-10'3М. Однако в последние годы появились биохимические исследования, в которых достоверно установлено влияние а-ТФ на ПОЛ

155,168] и на активность одного из ключевых ферментов фосфоинозитидного цикла, являющегося одновременно пероксилипид-зависимым, протеинки

18 назы С (пк-С), в ультранизких концентрациях ( вплоть до 10" М) [164,165].

В связи с вышесказанным, изучение взаимодействия а-ТФ с различными регионами липидного бислоя биологических мембран, отличающихся по своим биохимическим и регуляторным свойствам, может приблизить нас к решению весьма актуального и важного вопроса о механизме действия БАВ в сверхнизких концентрациях.

Цели и задачи исследования.

Цель данной работы состоит в изучении влияния природного АО а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25 М) на структурные характеристики различных регионов липидного бислоя биологических мембран клеток печени мышей in vitro.

В качестве объектов исследования использовались: а) мембраны эндо-плазматического ретикулума (ЭР), которые являются традиционной моделью для исследования процессов ПОЛ и влияния на него анти- и прооксидантов; б) плазматические мембраны (ПМ), в которых локализованы регуляторные системы вторичных посредников.

Конкретными задачами исследования являлись:

1. Исследование методом спиновых зондов ЭПР влияния а-ТФ в интервале концентраций (10"4-10"25М) на жесткость поверхностных (~8А) и микровязкость глубоколежащих (~20А) областей липидного бислоя мембран ЭР и ПМ клеток печени мышей при температуре 293 К. Получение зависимостей доза-эффект.

2. Изучение методом спинового зонда ЭПР влияния концентраций а-ТФ, соответствующих экстремумам на дозовой зависимости и не влияющих на определяемые параметры, на термоиндуцированные структурные переходы в различных областях липидного бислоя, а также эффективную энергию их активации в глубоколежащих областях липидов мембран ЭР и ПМ.

3. Конкретизация механизмов действия различных концентраций а-ТФ на исследуемые структурно-динамические параметры мембран ЭР и ПМ.

4. Выяснение роли полярности растворителя а-ТФ в механизме действия его «мнимых» концентраций (10"18-10'25 М) путем сравнительного изучения влияния а-ТФ, приготовленного в полярном (спирт-водные растворы) и неполярном (в вазелиновом масле) растворителях, на вязкостные свойства глубоколежащих (~ 20 А) и поверхностных (~ 8 А) областей ЭР in vitro.

5. Выяснение роли динамических характеристик воды в механизме полу

1Q лс Q ченных ранее эффектов «мнимых» (10"'М0"" М) и сверхмалых (10""—10" 18М) концентраций а-ТФ на структуру биологических мембран путем изучения различия на основе многомерного критерия Махаланобиса флуктуаций показателей пропускания тонких слоев воды в 9 областях ИК-спектра: 3500-3200, 3085-2832, 2120-1880, 1710-1610, 1600-1535, 1543-1425, 1430-1210, 1127-1057, 1067-963 см"1 в водно-спиртовых растворах а-ТФ в широком спектре концентраций (10"4-10"25 М) по сравнению с соответствующими спиртовыми растворами в бидистиллированной деионизованной воде, взятыми в качестве эталонов.

Научная новизна.

Впервые показано, что природный АО а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25М), включающем сверхмалые (10'9-10'18 М) и даже так называемые «мнимые» концентрации (<10'18 М), существенно модифицирует структурно-динамические параметры различных липидных регионов биологических мембран, выделенных из печени мышей. При этом зависимость эффекта от дозы водимого вещества имеет нелинейный полимодальный характер с максимумами в каждой из указанных областей и разделяющими их «мертвыми зонами», где эффект отсутствует.

Впервые обнаружено, что а-ТФ в концентрациях, вызывающих максимальные изменения в параметрах микровязкости и упорядоченности липид-ной компоненты, индуцирует появление дополнительного термоиндуциро-ванного структурного перехода липидов в области физиологических температур (307-314 К, 34-41 °С).

Впервые установлено, что каждый из наблюдаемых максимумов на кривых доза-эффект обусловлен своим особым механизмом взаимодействия а-ТФ с биомембранами: в области «физиологических» концентраций (10"4-10" 7М) - ограничением при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи молекулы а-ТФ за счет его неспецифического встраивания в мембрану и взаимодействия с окружающими молекулами фосфолипидов (ФЛ); в области

Q 1 Q

СМД (10" -10" М) - высокоэффективным специфическим взаимодействием со связывающими центрами на мембране (в частности, с пк-С), инициированием а-ТФ образования новых высокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране (в частности, рафтов) или модификацией уже имеющихся; в области «мнимых» концентраций а-ТФ (<10"18 М) - опосредованным влияние на мембрану через изменение структурно-динамических характеристик воды. В связи с этим впервые экспериментально установлено, что именно полярные свойства растворителя (воды) играют основную роль в механизме действия «мнимых» концентраций БАВ вообще и а-ТФ в частности.

Таким образом, вода представляет собой не только некую среду, в которой могут находиться молекулы действующего вещества, но и является активным участником происходящих в ней процессов «записи» и «передачи» информации о веществе в том или ином виде на пути к его мишени. Учитывая, что живые организмы состоят в основном из воды (по массе), полученные в данной работе сведения могут существенно дополнить имеющиеся представления о механизмах функционирования многих БАВ in vivo.

Научно-прикладное значение работы.

Изменение структурно-динамических характеристик биологических мембран может быть использовано в качестве чувствительной модели для скрининга БАВ, действующих в ультранизких концентрациях.

Обнаружение эффекта а-ТФ в СМД на структурное состояние липид-ной компоненты биологических мембран, являющейся одним из важнейших параметров системы регуляции ПОЛ, весьма существенно для возможного снижения терапевтической дозы а-ТФ при использовании его для коррекции ряда заболеваний, протекающих на фоне нарушения или изменения функционирования данной системы.

Апробация диссертационной работы.

Материалы работы докладывались на ежегодных молодежных конференциях ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2002, 2004, 2005), XIV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), VI и VII Международных конференциях «Биоантиоксидаит» (Москва, 2002, 2006), III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), XLVII Научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (Москва-Долгопрудный, 2004), First Dijon International Workshop on Lipids "Recent Advances in Lipid Metabolism and Related Disorders " (Dijon, France, 2005), 46-th International Conference on the Bioscience of Lipids (Ajaccio, Corsica, France, 2005), Всероссийской конференции молодых ученых и II школе им. академика Н.М. Эмануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, 2006), IV Международном Конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2006), 4th Euro Fed Lipid Congress «Oils, Fats and Lipids for a Healthier Future» (Madrid, Spain, 2006).

Публикации.

Основные положения диссертационной работы опубликованы в 19 печатных работах (6 журнальных статьях и 13 тезисах докладов) и 2 статьи поданы в печать.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, 4 глав, основных выводов и списка литературы. Работа изложена на 193 страницах, иллюстрирована 4 схемами, 50 рисунками и 6 таблицами. Библиография включает список из 288 работ.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Белов, Василий Викторович

ВЫВОДЫ

1. Изучено действие природного АО а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10'25 М) на структурные характеристики мембран ЭР и ПМ клеток печени мышей in vitro. Установлено, что для мембран ЭР и ПМ, несмотря на их биохимические и функциональные отличия, характерны полимодальные дозовые зависимости эффектов а-ТФ на жесткость поверхностных (~8 А) и микровязкость глубоколежащих (-20 А) областей липидного бислоя, имеющие во многом аналогичный характер и типичные для БАВ, проявляющих активность в широком диапазоне концентраций, включающем СМД.

2. Показано, что полимодальность полученных дозовых зависимостей связана с наличием статистически достоверных эффектов а-ТФ в трех областях концентраций, каждый из которых обусловлен преобладающим вкладом одного из возможных механизмов действия а-ТФ. А именно: а) в области традиционных «физиологических» концентраций (10"4-10"9 М) - ограничения при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи молекулы а-ТФ за счет его неспецифического встраивания в мембрану и взаимодействия с окружающими молекулами ФЛ;

Q 1Я б) в области СМД (10" -10" М) - специфического связывания а-ТФ с лигандами на мембране (в частности, получена высокая корреляция изменения жесткости поверхностных областей липидов мембран ЭР и ПМ и степени ингибирования активности мембранно-связанного фермента пк-С (рецептора а-ТФ)); инициирования а-ТФ'ом образования новых высокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране (в частности, рафтов) или модификации уже имеющихся; to лг в) в области «мнимых» концентраций (10" -10* М) - изменения структурно-динамических характеристик воды, выступающей в роли полярного растворителя а-ТФ и среды окружающей мембраны.

3. Изучены температурные зависимости вязкостных характеристик различных по глубине областей липидов и обнаружено, что те концентрации а

ТФ в том числе и СМД, которым соответствовали максимумы на дозовых зависимостях при температуре 293 К, по сравнению с контролем вызывают появление дополнительного термоиндуцированного структурного перехода в области физиологических температур 307-314 К (34-41 °С).

4. Установлена принципиальная роль полярности растворителя (воды) а-ТФ

18 25 в механизме действия его «мнимых» концентраций (10" -10" М) путем сравнительного изучения эффектов полярных (спирто-водных) и неполярных (в вазелиновом масле) растворов а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25 М) на вязкостные характеристики различных регионов мембран ЭР.

5. С помощью нового типа ИК-спектрометра - аппаратно-программного комплекса ЖАР - на основе критерия Махаланобиса обнаружены значительные изменения в структурном динамическом состоянии водного растворителя при введении как «мнимой» (10"2° М), так и СМД (10'15 М) а-ТФ, в окрестностях которых ранее наблюдались изменения структурных характеристик микросомальных и плазматических мембран;

6. Выявлены две узкие области в ИК-спектре, в которых дисперсии показателей пропускания 10"15 М и Ю'20 М растворов а-ТФ по отношению к эталону и 10"9 М раствору были гораздо выше, чем в остальной области спектра.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

4.1. Особенности и возможные механизмы действия а-ТФ на структуру микросомальных и плазматических мембран в трех областях концентраций.

Основная цель данного исследования состояла в изучении in vitro особенностей действия природного АО а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10"4-10"25 М) на структурно-динамическое состояние поверхностных (~8А) и глубоколежащих (~20А) областей микросомальных и плазматических мембран клеток печени мышей, а также в выяснении механизмов, лежащих в основе этого действия.

В результате были обнаружены следующие закономерности. Несмотря на различный состав липидов используемых биологических мембран и их функциональные особенности, зависимости изменений жесткости поверхностных и микровязкости глубоколежащих областей липидного бислоя от концентрации вводимого а-ТФ при температуре 293 К в обоих типах мембран имеют в значительной степени аналогичный немонотонный, полимодальный характер, связанный с наличием эффектов в трех областях доз: области «физиологических» концентраций а-ТФ (10"4-10"9 М), в которых он обычно дей

Q 18 ствует в организме, его СМД (10' -10' М) и даже «мнимых» концентраций

18 25

10" -10* М), при которых вероятность нахождения хотя бы одной молекулы а-ТФ в мембранной суспензии близка к нулю (рис. 12, 19, 28, 37). Максимумы и минимумы разделены так называемыми «молчащими» или «мертвыми» зонами, где эффект а-ТФ на исследуемые структурно-динамические характеристики мембран отсутствовал. Таким образом, а-ТФ по характеру своего воздействия на мембраны может быть отнесен к типу БАВ, проявляющих эффект в СМД.

При изучении температурных зависимостей характеристик микровязкости глубоколежащих и жесткости поверхностный областей липидов как микросомальных, так и плазматических мембран (рис. 13, 14, 20-22, 29-31,

38, 39; табл. 3-6) оказалось, что концентрации а-ТФ, соответствующие максимумам и минимумам на дозовых кривых, вызывают появление дополнительных (а в глубоколежащих областях липидов микросом также более высококооперативных) по сравнению с контролем термоиндуцированных структурных переходов липидного бислоя, большинство которых обнаруживается в области физиологических температур (307-314 К, 34-41 °С) [268]. Учитывая большое значение в жизнедеятельности клетки фазовых переходов в липидах биологических мембран [75,265-267], этот факт может иметь важное регуляторное значение при действии не только «физиологических», но и сверхнизких и даже «мнимых» концентраций а-ТФ.

Одинаковый полимодальный характер дозовых зависимостей эффектов а-ТФ на вязкостные характеристики поверхностных и глубоколежащих областей липидного бислоя микросомальных и плазматических мембран может быть связан с преобладанием в определенных интервалах доз роли различных механизмов действия а-ТФ, общих для разного типа биологических мембран.

4.1.1. Неспецифическое встраивание а-ТФ в мембрану как механизм его действия в «физиологических» концентрациях (10~4-10"9 М).

Упорядочивание поверхностных и глубоколежащих областей липидного бислоя микросомальных и плазматических мембран при введении в них а-ТФ в «физиологических» концентрациях (10"4-10"9М) обусловлено, прежде всего, ограничениями при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи молекулы а-ТФ, что снижает их конформационную подвижность [98]. Во многом эти процессы могут быть связаны с взаимодействием а-ТФ с молекулами ФЛ [120], приводящим к образованию комплексов с определенной стехиометрией [15,104,114,120]. Их распределение в плоскости мембраны может иметь произвольный характер, а также они могут образовывать домены и вызывать фазовое разделение [111], что проявляется в виде дополнительных термоиндуцированных структурных переходов в различных областях липидного бислоя микросомальных и плазматических мембран печени (табл. 3-6). Увеличение вязкости или снижение текучести мембраны при встраивании в нее а-ТФ в «физиологических» концентрациях было не раз показано различными физическими методами в опытах на биологических (см., например, [96,97]) и модельных мембранах, в том числе и методом спиновых зондов ЭПР [98,269,270], и наши данные согласуются с их результатами.

4.1.2. Специфическое взаимодействие а-ТФ со связывающими центрами на мембране и инициирование образования микродоменных структур в ней в качестве возможных механизмов действия а-ТФ в СМД (10"9-1018 М).

Одним из возможных объяснений эффектов СМД а-ТФ на вязкостные свойства поверхностных и глубоколежащих областей микросомальных и плазматических мембран может являться его специфичное, высокоэффективное взаимодействие со связывающими центрами на мембране, изменяющее их конформационное состояние. В качестве такого связывающего центра в данном случае мы предполагаем поверхностный мембранно-связанный фермент пк-С, поскольку ранее в работах Мальцевой E.JI. и соавторов [164] показано ингибирование его активности а-ТФ в СМД. В пользу высказанного предположения говорит и высокая степень корреляции, полученная при сопоставлении этих данных с изменением жесткости поверхностных областей, как микросомальных (рис. 26), так и плазматических (рис. 42) мембран. В этой связи стоит отметить, что содержание активной формы пк-С в микросомальных мембранах печени значительно ниже, чем в плазматических [271,272], при этом и эффект а-ТФ в СМД на вязкостные характеристики поверхностных областей микросом в 3 раза меньше по величине, чем в плазматических мембранах (ср. рис. 19 и 37).

Другим вероятным объяснением упорядочивания липидного бислоя плазматической и микросомальной мембран при действии а-ТФ в СМД, по нашему мнению, может являться инициирование им образования новых вы-сокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране или модификация уже имеющихся. В плазматической мембране в их роли могут выступать рафты, которые представляют собой особые области в мембране, значительно более упорядоченные по сравнению со своим микроокружением из-за повышенного содержания холестерина, сфингомиелина и ганглиозидов, а также преимущественно насыщенного характера жирнокислотных цепей ФЛ [66,67]. Высказанное предположение основывается на том, что многие белки, участвующие в передаче сигналов в клетке, способны локализоваться в раф-тах, в том числе и пк-С [67]. Время жизни таких комплексов невелико (меньше 1 мс), однако действие внешних сигналов (в роли которых могут выступать лиганды), вызывающих конформационные изменения в белковых молекулах, может его значительно увеличить (вплоть до нескольких минут) и, кроме того, привести к объединению отдельных рафтов в более крупный домен [67,68]. Поэтому мы предполагаем, что подобные процессы сопровождают взаимодействие а-ТФ в СМД с пк-С в процессе ингибирования ее активности.

Присутствие а-ТФ в мембране, как в «физиологических», так и в сверхнизких концентрациях может влиять и на сам процесс формирования рафтов. Так, в качестве одного из механизмов их образования в литературе рассматривается пространственная несовместимость в жидкокристаллической фазе между твердой стерольной структурой молекулы холестерина и жестким изгибом ненасыщенной углеводородной цепи соседней молекулы фософлипида, имеющей г/мс-двойную связь в положении С9-С10 [68]. Такая затрудненность во взаимной упаковке молекул приводит к выталкиванию холестерина из областей с ненасыщенными фосфлипидами, с последующей его концентрацией и стабилизацией в областях с преимущественно насыщенным характером жирнокислотных цепей ФЛ. В этой связи стоит отметить, что а-ТФ, в свою очередь, с большим предпочтением взаимодействует с полиненасыщенными ФЛ [99,114], способствуя, таким образом, вытеснению холестерина и облегчая образование рафтов при действии а-ТФ как в «физиологических» концентрациях, так и в СМД.

Предложенные механизмы с участием рафтов могут быть рассмотрены с определенной долей вероятности и в микросомах печени, если принять во внимание, что существуют работы, в которых высказываются серьезные предположения об их существовании там [279-281].

4.1.3. Роль полярных свойств растворителя (воды) в механизме

18 25 действия «мнимых» концентраций а-ТФ (10" -10" М).

Концентрации а-ТФ в диапазоне 10'18-10"25 М называются «мнимыми», поскольку вероятность нахождения хотя бы одной молекулы а-ТФ в мембранной суспензии близка к нулю. В связи с этим для объяснения механизмов действия а-ТФ в этой области, по нашему мнению, имеет смысл обратиться к свойствам растворителя. Для выяснения, насколько важна при этом его полярность, мы провели сравнительное изучение действия а-ТФ, приготовленного в полярном (спирт-водные растворы) и неполярном (в вазелиновом масле) растворителе, на вязкостные свойства глубоколежащих (~ 20 А) и поверхностных 8 А) областей микросомальных мембран in vitro. В результате для обоих растворителей были получены полимодальные дозовые зависимости, имеющие фазовый характер, противоположный в поверхностных и в глубоколежащих областях липидного бислоя. Оказалось, что если в областях «физиологических» (10"4-10"9М) и сверхмалых (10"9-10'18М) концентраций статистически достоверными (р<0.05) эффектами обладают растворы а

1 о с

ТФ в обоих растворителях, то в области «мнимых» (10' -10" М) концентраций достоверный эффект на вязкостные свойства поверхностных и глубоко-лежащих областей липидов имеют только растворы а-ТФ в полярном растворителе, в данном случае водном, что говорит о существенной роли полярности растворителя в механизме передачи «информации» о веществе в том или ином виде в процессе приготовления растворов. Полярные свойства воды связывают, прежде всего, со способностью ее молекул образовывать водородные связи друг с другом, что приводит в итоге к формированию коротко-живущих водных ассоциатов (кластеров) небольшого размера [286,287]. Мы предположили, что их динамические характеристики (например, параметры флуктуаций, а также взаимодействия между ними) могут играть особую роль в процессе хранения и передачи информации о веществе, причем изменение их будет сказываться на целостной динамической структуре полярной среды. В качестве показателей, характеризующих структуру и динамику, а, следовательно, состояние воды в определенных условиях и при различных воздействиях, в частности БАВ, могут использоваться флуктуации показателей пропускания воды в РЖ-области спектра [196,213-216].

В связи с вышесказанным с целью выяснения роли динамических характеристик воды в механизме полученных нами ранее эффектов «мнимых» и сверхмалых концентраций а-ТФ на структуру биологических мембран мы совместно с сотрудниками кафедры общей и биоорганической химии Тверской государственной медицинской академии изучили различие флуктуаций показателей пропускания тонких слоев воды (20 мкм) в девяти диапазонах ИК-области спектра: 3500-3200, 3085-2832, 2120-1880, 1710-1610, 1600-1535, 1543-1425, 1430-1210, 1127-1057, 1067-963 см"1 в водно-спиртовых растворах а-ТФ в широком диапазоне концентраций (10-10" М) по сравнению с соответствующими спиртовыми растворами в бидистиллированной деионизован-ной воде, взятыми в качестве эталонов. В качестве формальной характеристики изменений структурно-динамического состояния воды при отсутствии и в присутствии различных количеств а-ТФ использовался многомерный дискриминантный анализ на основе критерия Махаланобиса, который учитывает корреляции и дисперсии инфракрасных показателей эталона и образца, что позволило использовать его в качестве целостного показателя. В результате изучения влияния различных концентраций а-ТФ (10"4-10"25 М) на структурное динамическое состояние водного растворителя, оцененное по критерию Махаланобиса, была получена полимодальная дозовая зависимость с наибольшими отклонениями при действии а-ТФ в СМД 10'15 и «мнимой» концентрации 10'20 М. Дальнейший анализ позволил выявить две узкие области ИК-спектра, в которых а-ТФ не поглощает, соответствующие деформационным и деформационно-либрационным колебаниям молекулы воды, в которых дисперсии показателей пропускания 10"15 и Ю"20М растворов а-ТФ по отношению к эталону и 10"9 М раствору были гораздо выше, чем в остальной области спектра.

Учитывая, что в окрестности указанных концентраций а-ТФ происходили изменения вязкостных параметров поверхностных и глубоколежащих областей липидного бислоя микросомальных мембран, которые при смене растворителя а-ТФ с полярного на неполярный в области СМД модифицировались, а в области «мнимых» концентраций пропадали вовсе, мы предполагаем и разделяем мнение других авторов [213-216], что изменения структурного динамического состояния воды играют основную роль в механизме действия «мнимых» концентраций а-ТФ и могут вносить определенный вклад при действии СМД а-ТФ.

Таким образом, основными результатами нашего экспериментального исследования являются:

S обнаружение нелинейной дозовой зависимости влияния а-ТФ при постоянной температуре на структурно-динамическое состояние различных ли-пидных регионов, типичной для действия БАВ в СМД и имеющей во многом аналогичный характер в мембранах ЭР и ПМ; S доказательство преобладания различных механизмов действия а-ТФ в определенных областях концентраций:

• в области традиционных «физиологических» концентраций а-ТФ (lO^-lO"9 М) - ограничения при упаковке углеводородных цепей липидов вблизи молекулы а-ТФ за счет его неспецифического встраивания в мембрану и взаимодействия с окружающими молекулами ФЛ;

О 1Q

• в области СМД (10" -10* М) - специфического связывания с лиган-дами на мембране (в частности, пк-С), либо инициирования образования новых высокоупорядоченных микродоменных комплексов в мембране (в частности, рафтов) или модификации уже имеющихся;

18 25

• в области «мнимых» концентраций (10" -10' М) - опосредованного влияния на мембрану путем изменения структурно-динамических характеристик воды (оцененных по флуктуациям ее показателей пропускания в ИК-области), выступающей в роли растворителя а-ТФ и среды окружающей мембраны. ^ обнаружение образования дополнительных термоиндуцированных структурных переходов в липидном бислое в области физиологических температур при действии концентраций а-ТФ, вызывающих при температуре 293 К статистически достоверные изменения вязкостных характеристик мембран ЭР и ПМ в указанных трех областях концентраций.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Белов, Василий Викторович, 2007 год

1. Артюхов В.Г., Наквасина М.А. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами: Учеб. пособие. Воронеж: Издательство Воронежского государственного университета, 2000. - 296 с.

2. Pentyuk A. A., Yakovleva О. А. // Int. Conf. Regul. Free Radical React., Varna, 13-16 Sept., 1989, P.85.

3. Nair P.P., Kayden H.J. // Annal NY Acad. Sci. 1972. V.203. P. 1-247.

4. Machlin L.J. Vitamin E. New York: Marcel Dekker, 1980.

5. Patniac P.N., Nair P.P. //Arch. Biochem. Biophys. 1977. V.178. P.333-341.

6. Cangill C.P.J., Lucy J.A., Diplock A.T. //Biochem. J. 1971. V.125. P.407-416.

7. Sigounas G., Anagnostou A., Steiner M. // Nutr. Cancer. 1997. V.28. P.30-35.

8. Pratico D., Tangirala R.K., Rader D.J., Rokach J., FitzGerald G.A. // Nature Med. 1998. V.4. P.l 189-1192.

9. Keaney J.F, Jr., Simon D.I., Freedman J.E. // FASEB J. 1999 V.13. P.965-975.

10. Evans H.M., Bishop K.S. // Science. 1922. V.56. P.650-654.

11. Sato Y., Arai H., Myata A., Tokita S., Yamamoto K., Tanabe Т., Inoue K. // J. Biol. Chem. 1993. V.268. P.l7705-17710.

12. Wolf G. //Nutr Rev. 1994. V.52. P.97-98.

13. Dutta Roy AK, Gordon MJ, Campbell FM, Duthie GG, James WPT. // J. Nutr. Biochem. 1994. V.5. P.562-570.

14. Buttriss J.L., Diplock A.T. // Biochim Biophys Acta. 1988. V.963. P.61-69.

15. Kagan V.E., Quinn P.J. //Eur. J. Biochem. 1988. V.171. P.661-667.

16. Salgado J., Villalian J., Gomez-Fernandez J.C. // Eur. Biophys. J. 1993. V.22. P.151-155.

17. Fukuzawa K., Ikebata W., Shibata A., Kumadaki I., Sakanaka Т., and Urano S. // Chem. Phys. Lipids. 1992. V.63. P.9-75.

18. Azzi A., Stocker A. // Prog. Lipid Res. 2000. V.39. P.231-255.

19. Azzi A., Gysin R., Kempna P., Ricciarelli R., Villacorta L., Visarius Т., Zingg J.-M. // Mol. Asp. Med. 2003. V.24. P.325-336.

20. Kempna P., Zingg J.-M., Ricciarelli R., Hierl M., Saxena S., Azzi A. // Free Radical Biol. Med. 2003. V.34. P.1458-1472.

21. Бурлакова Е.Б., Крашаков С.А., Храпова Н.Г. // Биологические мембраны. 1998. Т. 15. №.2. С.137-168.

22. Эмануэль Н. М., Денисов Е. Т., Майзус З.К. Цепные реакции окисления углеводородов в жидкой фазе, М.: Наука, 1965, 375с.

23. ЭмануэльН.М. //Успехи химии. 1981. Т.50. №.10. С.1721-1809.

24. Рогинский В.А., Фенольные антиоксиданты, М., Наука, 1988, 247с.

25. Barclay L.R.C., Baskin К.А., Locke S.J., Schaefer T.D. // Canad J. Chem. 1987. V.65. P.2529-2540.

26. Lambelet P., Loliger J. // Chem. Phys. Lipids. 1984. V.35. P. 185-198.

27. Mukai K., Fukuda K., Tajima K., Ishizu K. // J.Org.Chem. 1988. V.53. P.430-432.

28. Howard J.A., IngoldK.U. // Canad. J. Chem. 1963. V.41. P.l744-1751.

29. Howard J.A., Ingold K.U. // Canad. J. Chem. 1963. V.41. P.2800-2806.

30. Шамовский И.Л., Яровская И.Ю. //Хим.-фарм. ж. 1990. Т.24. №.2. С. 100103.

31. Бурлакова Е.Б., Бушелев С.И., Шамовский И.Л. // Хим. физика. 1989. Т.8. №.11. С.1471-1474.

32. Machlin L.J. Vitamin Е. In: Handbook of Vitamins. (Ed. Machlin L.J.) Dekker: New-York Bazel, 1984, 99-145.

33. Kanno C., Hayashi M., Yamauchi K. et al. // Agr. Biol. Chem. 1970. V.34. P.878-885, 886-890.

34. Kanno C., Hayashi M., Yamauchi K. et al. // Agr. Biol. Chem. 1970. V.34. P.1652-1657.

35. Храпова Н.Г. // Биофизика. 1977. T.22. №.3. C.436-442.

36. Kagan V.E., Serbinova E.A., Bakalova R.A. et al. // Biochem. Pharmacol. 1990. V.40. P.2403-2413.

37. Serbinova E.A., Bakalova R.A., Stoichev T.S., Kagan V.E. // Buill. Eksp. Biol. Med. 1986. V. 102. P.419-421.

38. Kagan V., Serbinova E., Novikov K., Ritov V., Kozlov Y., Stoytchev T. // Arch. Toxicol. Suppl. 1986. V.9. P.302-305.

39. Terao J., Matsushita M. // Lipids. 1986. V.21. P.255-260.

40. Bohm F., Edge R., McGarrey D.J., Truscott T.G. // FEBS Lett. 1998. V.436. P.387-389.

41. Constantimescu A., Plan D., Packer L. // J. Biol. Chem. 1993. V.268. P. 1090610913.

42. Kagan V.E., Serbinova E., Fork Т., Scita G., Packer L. // J. Lipid Res. 1992. V.33. P.385-397.

43. Dola Т., Burton G.W., Ingold K. // Biochim. Biophys. Acta. 1985. V.835. P.298-303.

44. Ingold K.U., Bowry V.W., Stocker R., Walling C. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. V.90. P.45-52.

45. Ernster L., Forsmark P., Nordenbrand K. // J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1992. V.548. P.41-46.

46. Neuzil J., Stocker R. //J. Biol. Chem. 1994. V.269. P. 16712-16719.

47. Карпухина Г.В., Эмануэль H.M. // Доклады АН СССР. 1984. Т.276. №.5. С.1163-1167.

48. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах, М.: Наука, 1972, 252 с.

49. Козлов Ю.П., Данилов B.C., Каган В.Е., Ситковский М.В. Свободноради-кальное окисление липидов в биологических мембранах, М.: МГН, 1972, 88 с.

50. Воскресенский О.Н., Левитский А.П. // Вопросы медицинской химии. 1970. Т.16. С.563.

51. Slater T.F. // Agents Actions. 1987. V.22. Р.ЗЗЗ.

52. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. // Усп. химии. 1985. Т.54. С. 1540.

53. Бурлакова Е.Б. Роль липидов мембран в передаче информации, в сб.: «Биохимия липидов и их роль в метаболизме клетки», М.: Наука, 1981, с.23.

54. Byczowski I.L., Gessner Т. // Int. J. Biochem. 1988. V.20. P.8569.

55. Mavelli J., Antonri R., Dini L., Spinedi A., Cirolo M., Rorilio G. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981. V.102. P.911.

56. Ланкин В.З. Метаболизм липопероксидов в тканях млекопитающих, в сб.: «Биохимия липидов и их роль в метаболизме клетки», М.: Наука, 1981, с.75.

57. Burlakova Ye.B., Molochkina Ye.M., and Pal'mina N.P. Role of membrane lipids in control of enzymatic activity, in "Advances in Lipid Research", Ed.: J. Weber, Pergamon Press, New York, 1980, 163.

58. Мальцева E.JI., Бурлакова Е.Б. // Биологические мембраны. 1986. Т.З. С.773.

59. Burlakova Е.В., Pal'mina N.P., Mal'tseva E.L. // Membrane Lipid Oxidation Vol.III / Eds. Carmen Vigo-Pelfrey. Boca Raton; Ann Arbor; Boston: CRC Press, 1991. P. 209-237.

60. Singer S.J., and Nicolson G.L. // Science. 1972. V.175. P.720-731.

61. Cullis P.R., Hope M.J., Tilcock C.P.S. // Chem. Phys. Lipids. 1986. V. 40. P. 127-144.

62. Tanford C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles in Biological Membranes. 1973. John Wiley, New York.

63. Boggs J.M. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 906. P. 353-404.

64. Jocobson K. // Cell Motility. 1983. V. 3. P. 367-373.

65. W. Dowhan and M. Bogdanov. Functional roles of lipids in membranes. In:xL

66. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes (4 Edn). Eds.: D.E. Vance and J.E. Vance. Amsterdam; Boston; London; New York; Oxford; Paris; San Diego; San Francisco; Singapore; Sydney; Tokyo: Elsevier, 2002. P. 1-35.

67. Lommerse P.H.M., Spaink H.P., Schmidt T. // Boichim. Biophys. Acta. 2004. V. 1664. P. 119-131.

68. Pike L.J. // J. Lipid Res. 2003. V. 44. P. 655-667.

69. Subczynski W.K., Kusumi A. // Boichim. Biophys. Acta. 2003. V. 1610. P. 231-243.

70. Kurzchalia Т., Parton R. // Curr. Opin. Cell Biol. 1999. V.l 1. P.424-431.

71. Chun M., Liyanage U.K., Lisanti M.P., and Lodish H.F. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V.91. P.l 1728-11732.

72. Wu C., Butz S., Ying Y-S., and Anderson R.G.W. // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.3554-3559.

73. Simons K., and Toomre D. //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2000. V.l. P.31-41.

74. Smart E.J., Graf G.A., McNiven M.A., Sessa W.C., Engelman J.A., Scherer P.E., Okamoto Т., and Lisanti M.P. // Mol. Cell. Biol. 1999. V.l9. P.7289-7304.

75. Zajchowski L.D., and Robbins S.M. // Eur. J. Biochem. 2002. V.269. P.737-752.

76. Геннис P. Биомембраны: молекулярная структура и функции: Пер. с англ. М.: Мир, 1997. 624 с.

77. Рубин А.Б. Биофизика, Т.2.: Учебник. М.: МГУ, Наука, 2004. 469 с.

78. Thewke D., Kramer М., Sinensky M.S. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V.273.P.1-4.

79. Sukharev S. // FASEB J. 1999. V.13. P.S55-S61.

80. Wood J.M. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. V.63. P.230-262.

81. Hohmann S. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. V.66. P.300-372.

82. Tokishita S., Mizuno T. // Mol. Microbiol. 1994. V.13. P.435-444.

83. Sugiura A., Hirokawa K., Nakashima K., Mizuno T. // Mol. Microbiol. 1994. V.14. P.929-938.

84. Gudi S., Nolan J.P., Frangos J.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. V.95. P.2515-2519.

85. Los D.A., MurataN. // Boichim. Biophys. Acta. 2004. V.1666. P. 142-157.

86. Hazel J.R. // Annu. Rev. Physiol. 1995. V.57. P. 19-42.

87. Okuyama H., Okajima N., Sasaki S., Higashi S., Murata N. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V.1084. P.13-20.

88. Mikami К., Suzuki I., Murata N. // Topics in Current Genetics, vol.4, Plant Responses to Abiotic Stress / Eds. Hirt H., Shinozaki K., Berlin: Springer-Verlag, 2003,103-119.

89. Xiong L., Schumaker K.S., Zhu J.K. // Plant Cell. 2002. S165-S183 (Suppl.).

90. Causton H.C., Ren В., Koh S.S., Harbison C.T., Kanin E., Jennings E.G., Lee T.I., True H.L., Lander E.S., Young R.A. // Mol. Biol. Cell. 2001. V.12. P.323-337.

91. Curtis M.T., Gilfor D., and Farber J.L. // Arch. Biochem. Biophys. 1984. V.235. P.644-649.

92. Quinn P.J. // Biochemistry (Moscow). 2004. V.69. P. 58-66.

93. Ahkong Q.F., Fisher D., Tampion W.,Lucy J.A. // Biochem. J. 1972. V.136. P.147-155.

94. Steiner M., Anastasi I. // J.Clin. Invest. 1976. V.57. P.732-737.

95. Steiner M„ Mower . // Ann. NY. Acad. Sci. 1982. V.393. P.289-299.

96. Fukuzawa K., Hayashi K., Suzuki A. // Chem. Phys. Lipids. 1977. V.18. P.39-48

97. Steiner M. // Biochim. Biophys. Acta. 1981. V.640. P. 100-105.

98. Urano S., Inomori Y. et al. //J. Biol. Chem. 1992. V.267. P.18365-18370.

99. Wassail S.R., Wang L„ McCabe R.C., Ehringer W.D., Stillwell W. // Chem. Phys. Lipids. 1991. V.60. P.29-37.

100. Erin A.N., Spirin M.M., Tabidze L.V., Kagan V.E. // Biochim. Biophys. Acta. 1984. V.l 1. P.96-102.

101. Kagan V.E. // Annal NY. Acad. Sci. 1989. V.570. P.121-135.

102. Mukherjee A.K., Ghosal S.K., Maity C.R. // Cell Mol. Life Sci. 1997. V.53. P.152-155.

103. Urano S., Matsuo M., Sakanaka Т., Ucmura I., Koyama M., Kumadaki I., Fukuzawa K. // Archiv Biochem. Biophys. 1993. V.303. P. 10-14.

104. Massey J.B., She H.S., Pownall H.J. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. V.106. P.842-847.

105. Quinn P.J. //Eur. J. Biochem. 1995. V.233. P.916-925.

106. McMurchie E.J., and Mcintosh G.H. // J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1986. V.32. P.557-558.

107. Sanchez-Migallon M.P., Aranda F.J., and Gomez-Fernandez J.C. // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V.1279. P.251-255.

108. Fukuzawa K., Ikeno H., Tokumura A., and Tsukatani H. // Chem. Phys. Lipids. 1979. V.23. P.13-22.

109. Kagan V.E., Quinn P.J. // Eur. J. Biochem. 1988. V.171. P.661-667.

110. Wang X, and Quinn P.J. //Biochim. Biophys. Acta. 2002. V.1567. P.6-12.

111. Wang X., Semmler K., Richter W., and Quinn P.J. // Arch. Biochem. Biophys. 2000. V.377. P.301-314.

112. Wang X., Takahashi H., Hatta I., and Quinn P.J. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V.1418. P.343-355.

113. Wang X., and Quinn P.J. // Chem. Phys. Lipids. 2002. V.l 14. P. 1-9.

114. Ortiz A., Aranda F.J.,and Gomez-Fernandez J.C. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V.898. P.214-222.

115. Stillwell W., Dallman Т., Dumaual A.C., Crump F.T., and Jenski L.J. // Biochemistry. 1996. V.35. P.13353-13362.

116. Wang X., and Quinn P.J. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V.1509. P.361-372.

117. Wang X., and Quinn P.J. // Eur. J. Biochem. 2000. V.267. P.6362-6368.

118. Diplock A.T., and Lucy J.A. // FEBS Lett. 1973. V.29. P.205-210.

119. Urano S., Iida M., Otani I. and Matsuo M. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. V.146. P.1413-1418.

120. Erin A.N., Skrypin V.V. and Kagan V.E. // Biochim. Biophys. Acta. 1985. V.815. P.209-214.

121. Gomez-Fernandez J.C., Villalain J., Aranda F.J. et al. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1989. V.570. P.109-120.

122. Saigado J., Villalian J., and Gomez-Fernandez J.C. // Eur. Biophys. J. 1993. V.22. P.151-155.

123. Духович Ф.С., Горбатова Е.Н., Курочкин В.К., Петрунин В.А. // Российский химический журнал. 1999. T.XLIII. №.5. С. 12-15.

124. Zaitsev S.V., Khegai L.A., Kim В.В. е.а. // Immunol. Letters. 1992. V.32. Р.27-30.

125. Song J.C. et al. // Blood. 2004. V.104. P.2065-2072.

126. Cunha J.M. et al. // Br. J. Pharmacol. 2003. V.139. P. 1135-1145.

127. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Лелекова T.B. // Российский химический журнал. 1999. T.XLIII. №.5. С.21-28.

128. Зайцев С.В., Ефанов A.M., Сазанов Л.А. // Российский химический журнал. 1999. T.XLIII. №.5. С.28-33.

129. Бурлакова Е.Б. // Российский химический журнал. 1999. T.XLIII. №.5. С.3-11.

130. Будников Г.К. // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т.6. С. 4551.

131. Бурлакова Е.Б., Греченко Т.Н., Соколов Е.Н., Терехова С.Ф. // Биофизика. 1986. Т.31. С.921-922.

132. Бурлакова Е.Б., Хохлов А.П. //Биол. Мембраны. 1985. Т.2. С.557.

133. Е. Davenas, F. Beauvais, J. Amara, M. Oberbaum, В. Robinzon, A. Miadonnai, A. Tedeschi, B. Pomeranz, P. Fortner, P. Belon, J. Sainte-Laudy, B. Poitevin & J. Benveniste // Nature. 1988. V.333. P.816.

134. Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А., Мальцева Е.Л. // Химическая физика. 2003. T.22. C.21-40.

135. Сазанов Л.А., Зайцев С.В. // Биохимия. 1992. Т.57. С.1443-1460.

136. Faith R.E., Liang H.J., Murgo A.J., Plotnikoff N.P. // Clin. Immunol, and Immunopathol. 1984. V.31. P.412-418.

137. Rola-Pleszczynski M. // J. Lipid Mod. 1990. V.2. P.577-582.

138. Reibman J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88. P.6805.

139. Zaitsev S.V., Sazanov L.A., Koshkin A.A. et al. // FEBS Lett. 1991. V.291. P.84-86.

140. Efanov A.M., Koshkin A.A., Sazanov L.A. et al. // FEBS Lett. 1994. V.355. P.114-116.

141. Deliconstantinos G., Kopelkina-Tslboukidou L., Villotou V. // Biochem. Pharm. 1987. V.36. P.l 153-1191.

142. Пынзарь Е.И., Богданова Н.Г., Пальмина Н.П. // Биологические мембраны. 1995. Т.12. С.279-287.

143. Williamson S.A., Knight R.A., Lightman S.L., Hobbs J.R. // Brain Beh. Immun. 1985. V.l. P.329-335.

144. Zakharova L.A., Belevskaya R.G., Yanovskii O.G. // Biomed. Sci. 1990. V.l. P.139-143.

145. Williamson S.A., Knight R.A., Lightman S.L., Hobbs J.R. // Immunology. 1989. V.65.P.47-51.

146. Crain S.M., Shen K.-F. // Brain Res. 1996. V.741. P.275-283.

147. Marotta D., Marini A., Banaudha K., Maharaj S., Ives J., Morrissette C.R., Jonas W.B. // Neurotoxicology. 2002. V.23. P.307-312.

148. Jonas W., Lin Y., Tortella F. //Neuroreport. 2001. V.l2. P.335-339

149. Sergeeva M.Y., Gonchar M.V., Chistyakov V.V., Mevkh A.T. // Appl. Biochemistry and Biotechnology. 1996. V.61. P. 167-171.

150. Богатыренко Т.Н., Редкозубова Г.П., Конрадов А.А. и др. // Биофизика. 1989. Т.34. С.327-329.

151. Гладышева Т.Б., Конрадов А.А., Лебедев К.А. // Биофизика. 1989. Т.34. С.833-834.

152. Молочкина Е.М., Озерова И.Б. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т. 43. С.294-300.

153. Молочкина Е.М., Озерова И.Б., Бурлакова Е.Б. // Российский химический журнал. 1999. T.XLIII. №.5. С.63-71.

154. Трещенкова Ю.А., Голощапов А.Н., Бурлакова Е.Б. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. С.320-323.

155. В.В. Белов, Е.Л. Мальцева, Н.П. Пальмина // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. С.306-309.

156. Н.П. Пальмина, JI.B. Кледова, Т.В. Панкова, E.JI. Мальцева, В.В. Белов,

157. B.Е. Жерновков // Вопросы биохимической, медицинской и фармакологической химии. 2004. №4. С.31-37.

158. N.P. Palmina, V.V. Belov, E.L. Maltseva // Chemistry and Physics of Lipids. 2005. V.136. P.141-142.

159. Белов B.B., Мальцева E.JI., Пальмина Н.П. // Труды V ежегодной международной молодежной конференция ИБХФ РАН ВУЗЫ «Биохимическая физика», 14-16 декабря 2006 г., Москва, с. 22-30.

160. Жерновков В.Е., Богданова Н.Г., Пальмина Н.П. // Биологические мембраны. 2005. Т.22. С.388-395.

161. Жерновков В.Е., Богданова Н.Г., Лелекова Т.В., Пальмина Н.П. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. С.ЗЗ 1-333.

162. Жерновков В.Е., Пальмина Н.П. // Труды V ежегодной международной молодежной конференция ИБХФ РАН ВУЗЫ «Биохимическая физика», 14-16 декабря 2006 г., Москва, с. 12-17.

163. Пальмина Н.П., Богданова Н.Г., Мальцева Е.Л., Пынзарь Е.И. // Биологические мембраны. 1992. Т.9. С.810-820.

164. Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П. // Биологические мембраны. 1992. Т.9.1. C. 1023-1025.

165. Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. С.301-305;

166. Пальмина Н.П., Мальцева Е.Л., Курнакова Н.В., Бурлакова Е.Б. // Биохимия. 1994. Т.52. С. 193-203.

167. Пальмина Н.П., Мальцева Е.Л., Пынзарь Е.И., Бурлакова Е.Б. // Российский химический журнал. 1999. T.XLIII. №.5. С.55-63.

168. Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П., Бурлакова Е.Б. // Биологические мембраны. 1998. Т.15. С.199-212.

169. Kraft A.S., Anderson W.B. //Nature. 1983. V.301. P.621-625.

170. Пальмина Н.П., Кледова Л.В., Панкова Т.В., Гаинцева В.Д. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. С.310-314.

171. Фомина М.М., Островская Л.А., Корман Д.Б., Бурлакова Е.Б. // Изв. АН. Сер. биол. 1995. С.430-434.

172. Dubinin K.V., Zakharova L.A., Khegai L.A., Zaitsev S.V. // Immunopharmacol. Immunotoxicol. 1994. V.16. P.463-472.

173. Safrit J., Tsuchitani Т., Zighuboim J., Bonavida B. // In: Ultra-Low Doses. Ed. C. Doutrempuich. Univ. Bordeaux, France, 1991,27-43.

174. Крутова T.B., Островская Л.А., Рыкова В.А., Корман Д.Б. // Изв. АН. Сер. биол. 1994. №5. С.738-744.

175. Бурлакова Е.Б. //Вестн. РАН. 1994. Т.64. С.425-431.

176. Голденков В.А., Дикий В.В., Лизунова Г.В. // Росс. хим. журнал. 2002. T.XLVI. С.39-45.

177. Голденков В.А., Дикий В.В., Лошадкин Н.А. // Тез. докл. 1-го съезда токсикологов России. М. 1998. С.40.

178. Воронина Т.А., Молодавкин Г.М. // Российский химический журнал. 1999. T.XLIII. №5. С.89-96.

179. Патент РФ № 2102986, 1998.

180. Blumenfeld L.A., Grosberg A.Yu., Tikhonov A.N. // J. Chem. Phys. 1991. V.95. P.7541-7544.

181. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. Практический курс. М., 1999.

182. Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А., Худяков И.В. // Известия АН СССР. Сер. биол. 1990. №2. С. 184.

183. Kaissling К.Е., Priesner Е. //Naturwissenschaften. 1970. V.57. Р.23.

184. Gilles R., Gilles С., Jaemicke L. // Z. Naturforsch. 1984. V.39. P.584-592.

185. Гуревич К.Г., Варфоломеев С.Д. //Биохимия. 1999. Т.64. С.83.

186. Гуревич К.Г. //Вестн. Моск. ун-та, Сер.2. Химия. 2001. Т.42. С.131-134.

187. Robertson A.D.J., Grutsch J.F. //J. Theor. Biol. 1987. V.125. P.41-60.

188. KatzL.S., Marquis J.K. //Toxicol. Appl. Pharm. 1989. V.101. P.l 14-123.

189. Хохлов А.П., Ярыгин K.H. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1988. Т.105. С.545.

190. Митчелл Дж. Акваметрия / Дж. Митчелл, Д. Смит: Пер. с англ. М., 1980.-600 с.

191. Самойлов О.Я., Носова Т.А. // Журн. структ. химии. 1956. вып.6. С.798-808.

192. Эйзенберг Д., Кауцман В. Структура и свойства воды. Л.: Гидрометео-издат, 1975. 280 с.

193. Bjerrum N. // Kan. Mat. Phys. Med. 1951. V.27. P. 1.

194. Кочнев И.Н., Винниченко М.Б., Смирнова Л.Б. Молекулярная физика и биофизика водных систем. Л. 1986. вып.6. С.53-62.

195. РодниковаМ.Н. //Журн. физ. химии. 1993. Т.67. С.275.

196. Родникова М.Н. // Сб. избранных трудов IV Международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 3-7 июля 2006, с.100-108.

197. Frank H.S. // Science. 1970. V.196. Р.635.

198. Фесенко Е.Е., Терпугов Е.Л. // Биофизика. 1999. Т.44. С.5-9.

199. J.-W. Shin et al. // Science. 2004. V.304. P.l 137-1140.

200. M. Miyazaki et al. // Science. 2004. V.304. P.l 134-1137.

201. T.S. Zwier// Science. 2004. V.304. P.l 119-1120.

202. Антонченко В.Я., Давыдов A.C., Ильин B.B. Основы физики воды. -К.: Наукова Думка, 1994, 667с.

203. Смирнов А.Н., Сыроешкин А.В. // Российский Химический Журнал. 2004. T.XLVIII. №2. С.125-135.

204. Домрачеев Г.А., Родыгин Ю.Л., Селивановский Д.А. // ЖФХ. 1992. Т.66. №3. С.851-855.

205. Ikeda S., Takata Т., Komoda М., Нага М., Kondo J.N., Domen К., Tanaka A., Hosono Н., Kawazoe Н. // Phys. Chem. Chem. Phys. 1999. V.l. P.4485-4491.

206. Домрачев Г.А., Родыгин Ю.Л., Селивановский Д.А. // Доклады АН СССР. 1993. Т.329. №2. С.186-188.

207. Домрачев Г.А., Селивановский Д.А., Родыгин Ю.Л., Диденкулов И.Н. // Журн.Физ.Химии. 1998.1.12. №2. С.347-352.

208. Домрачев Г.А., Селивановский Д.А., Диденкулов И.Н., Родыгин Ю.Л., Стунжас П.А. // Журн. Физ. Химии. 2001. Т.75. №2. С.363-368.

209. Voeikov V.L., Reactive oxygen species, water, photons, and life // Rivista di Biologia/Biology Forum. 2001. V.94, p.193-214.

210. Воейков В.Л. Регуляторные функции активных форм кислорода в крови и в водных модельных системах. // Дисс. д.б.н., Москва, 2003.

211. Воейков В.Л., Колдунов В.В., Кононов Д.С. // Кинетика и катализ. 2001. Т.42. №5. С.670-672.

212. Каргаполов А.В., Плигин A.M., Зубарева Г.М., Шматов Г.П. Патент РФ № 2137126 // Бюл. изобр., 1999, №25.

213. Каргаполов А.В., Зубарева Г.М. Патент РФ № 2164685 // Бюл. изобр., 1999, №9.

214. Каргаполов А.В., Зубарева Г.М. Новые подходы к определению целостного состояния биологически активных систем. Тверь, 2006, с. 184.

215. Зубарева Г.М., Каргаполов А.В., Ягужинский Л.С. // ДАН. 2003. Т.388. №4. С.549-551.

216. Зубарева Г.М., Каргаполов А.В., Ягужинский Л.С. // Биофизика. 2003. Т.48. вып.2. С. 197-200.

217. Зубарева Г.М., Каргаполов А.В., Ягужинский Л.С. // Биофизика. 2003. Т.48. вып.4. С.581-584.

218. Черников Ф.Р. Экспериментальные исследования структурной динамики жидких гомеопатических средств // Проблемы сверхмалых концентраций в гомеопатии и структура воды / Отв. ред. Л.В. Космодемьянский. М.: Индрик, 2002, с. 17-24.

219. Черников Ф.Р. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. №3. С.367-369.

220. Черников Ф.Р. //Биофизика. 1986. Т.31. С.695.

221. Черников Ф.Р., Сорокин В.Н. // Гомеопатический ежегодник. М.: Ва-ланг, 1998, с.93.

222. Черников Ф.Р. // Гомеопатический ежегодник. М.: Валанг, 2002, с.34.

223. Черников Ф.Р. //Биофизика. 1991. Т.36. С.741.

224. Lobyshev V.I., Shikhlinskaya R.E., Ryzhikov B.D. // J. Mol. Liquids, 1999. V.82. P.73-81.

225. Лобышев В.И. // Тез. докл. II Междунар. Конгр. «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», С-Пб., 2000, с.99.

226. Лобышев В.И., Томкевич М.С., Петрушанко И.Ю. // Биофизика. 2005. Т.50. №3. С.464-469.

227. Зенин С.В., Тяглов Б.В. // ЖФХ. 1994. Т.68. №4. С.636.

228. Зенин С.В. // «Структурированное состояние воды как основа управления поведением и безопасностью живых систем», Автореф. дисс. д-ра биол. наук. М., 1999.

229. Аксенов С.И., Булычев А.А., Грушина Т.Ю. и др. // Тезисы 2-го съезда биофизиков России, Москва, 1999,750.

230. Arad D., Moss К., Elias Y., Aubar J. // World Scientific / Eds.C. Faddei-Ferretti, P.Marotta. Singapore New-Jersey - London - Hong-Hong, 1999, p.313-325.

231. Lester D.S. //Biochim. Biophys. Acta. 1990. V.1054. P.297-303.

232. Полезина А.С. и др. Некоторые особенности действия малых доз азидо-тимидина (AZT) и фактора активности тромбоцитов (PAF) на мембранутромбоцита. // Материалы II Международного симпозиума: Механизмы действия сверхмалых доз, 23 26 мая 1995, Москва.

233. Полезина А.С., Аникиенко К.А., Курочкин В.К. // Российский химический журнал. 1999. T.XLIII. №5. С.72-79.

234. Гендель Л.Я. Яковлева Н.Е., Лелекова Т.В. и др. Влияние тиролиберина на структурные особенности эритроцитов крыс. // Известия РАН. Серия биологическая. 1997. №1. С. 103-106.

235. Ашмарин И.П., Лелекова Т.В., Санжиева Л.Ц. // Изв. АН. 1992. №4. С.531- 536.

236. Торчинский А.А., Пальмина Н.П. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. №3. С.328-330.

237. Ашмарин И.П., Асанова Л.М., Аббасова К.Р., Чепурнова Н.Е., Косова Г.В., Чепурнов С.А., Инюшкин А.Н., Гончаров О.Б. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43. №3. С.324-327.

238. Hostetler K.Y., Zenner D.B., Morris Н.Р. // Biochim. Biophys. Acta., 1976. V.441. P.231-238.

239. Loten E.G., Redshaw-Loten J.C. // Analitical Biochem., 1986. V. 154. P. 183185.

240. Lowry O., Rosenbrouch N., Barr A., Randall R. // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.

241. Коварский А.Л. Метод спиновых зондов и меток // Применение электронного парамагнитного резонанса для исследования биологических систем / Отв. ред. Коварский А.Л. М.: МАКС Пресс, 2005, с. 31-49.

242. Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда. М.: Наука, 1976. 210 с.

243. Гриффит О., Джост П. // Метод спиновых меток. Теория и применение / Ред. Л. Берлинер. М.: Мир, 1979. С. 489-569.

244. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н. Метод спиновых зондов (проблемы и перспективы), под ред. Жданова Р.И. М.: Наука, 1986, с. 212-225.

245. Мальцева Е.Л. Спиновые зонды в изучении биологических мембран // Применение электронного парамагнитного резонанса для исследованиябиологических систем / Отв. ред. Коварский A.JI. М.: МАКС Пресс, 2005, с. 102-121.

246. Butterfield D.A., Whismant С.С., Chesnut D.B. // Biochem. Biophys. Acta. 1976. V.426. P.697.

247. Sauerherber R.D., Gordon L.M., Grosland R.D., Kuwahara M.D. // J. Membr. Biol. 1977. V.31.P.131.

248. Griffith O.H., Dehlinger P.J., and Van S.P. // J. Membrane Biol. 1974. V.15. P.159-192.

249. Рууге Э.К., Герасимова E.H. Метод спиновых зондов (проблемы и перспективы), под ред. Жданова Р.И. М.: Наука, 1986, с. 225-239.

250. Whetton A.D., Houslay M.D., Dodd N.J.F., Evans W.H. // Biochem. J. 1983. V. 214. #3. P. 851-854.

251. M. Shinitzky and M. Inbar // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 433. P.133-149.

252. S.M. Mahler, P.A. Wilce and B.C. Shanley // Int. J. Biochem. 1988. V.20. P.613 619.

253. Кухлинг X. Справочник по физике. М.: Мир, 1983.

254. Chapman D. // Quart. Rev. Biophys. 1975. V.8. P.185 191.

255. F. Severcan and S. Cannistraro // Chem. Phys. Lipids. 1990. V.53. P.17-26.

256. Рихирева Г.Т., Голубев И.Н., Прудченко И.А., Михалева И.И. // Биологические мембраны. 2003. Т.20. №5. С.409-418.

257. Азизова О.А., Торховская Т.Н. Метод спиновых зондов (проблемы и перспективы), под ред. Жданова Р.И. М.: Наука, 1986, с. 239-250.

258. Дерффель К. Статистика в аналитической химии, М.:Мир, 1994, 268 с.

259. Welch B.L. // Biometrika. 1947. V.34. Р.28.

260. Бронштейн И.Н., Семендяев К.А. Справочник по математике для инженеров и учащихся втузов М.: Наука, 1986, 544 с.

261. Захарова Т.В. и др. Патент РФ № 21464350 // Бюл. изобр. 2001. №8.

262. Каргаполов А.В., Зубарева Г.М., Бордина Г.Е. Патент РФ № 2148257 // Бюл. изобр., 2000, №12.

263. Сошникова Л.А., Тамашевич В.Н. Многомерный статистический анализ. М.: Юнита-Дана, 1999, с. 350.

264. Пальмина Н.П., Мальцева Е.Л., Бурлакова Е.Б. // Химическая физика. 1995. Т. 14. №11. С.47-60.

265. Антонов В.Ф., Смирнова Е.Ю., Шевченко Е.В. Липидные мембраны при фазовых превращениях. М.: Наука, 1992. Гл.4.

266. Харакоз Д.П. //Успехи биологической химии. 2001. Т.41. С.333-364.

267. Шноль С.Э. Физико-химические факторы биологической эволюции. М.: Наука, 1979. Гл. 11.

268. Prosser C.L. // In: Comparative Animal Physiology / Ed. Prosser C.L. Philadelphia-London-Toronto: W.B. Saunders Company, 1973. Chap. 9.

269. Cushley R.J., Forrest B.J., Gillis A. and Tribe J. // Canad. J. Chem. 1979. V.57. P.458-465.

270. Schmidt D., Steffen H. and C. von Planta // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V.443. P. 1-9.

271. Jergil В., SommarinM. //Biochim. Biophys. Acta. 1983. V.758. P.10-16.

272. Azhar S., Butte J., Reaven E. // Biochemistry. 1987. V.26. P.7047-7057.

273. Fridriksson E.K., Shipkova P.A. et al. // Biochemistry. 1999. V.38. P.8056-8063.

274. Schneiter R., Brugger В., Sandhoff R. et al. // J. Cell. Biol. 1999. V.146. P.741-754.

275. Lange Y., Swaisgood M.H. et al. // J. Biol. Chem. 1989. V.264. P.3786-3793.

276. Sankaram M.B., and Thompson Т.Е. // Biochemistry. 1990. V.29. P. 1067010675.

277. Ramstedt В., and Slotte J.P. // FEBS Lett. 2002. V.531. P.33-37.278. van Meer G. // Trends Cell Biol. 1998. V.8. P.29-33.

278. Simons K., Ikonen E. // Nature. 1997. V.387. P.569-572.

279. Mayor S., Sabharanjak S., Maxfield F. // EMBO J. 1998. V.l7. P.4626-4638.

280. Muniz M., Mosomme P., Riezman H. // Cell. 2001. V. 104. P.313-320.

281. Бульенков Н.А. // Тезисы 2-го съезда биофизиков России. Москва, 1999, с. 761.

282. Лобышев В.И., Соловей А.Б., Бульенков Н.А. // Биофизика. 2003. Т. 48. №6. С.1011-1021.

283. Anagnostatos G.S. // High dilution effects on cells and integrated systems / Eds. Faddei-Ferretti C., Marotta P. Singapore; New-Jersey; London; Hong-Hong: World Scientific, 1998. P. 326 334.

284. Лященко A.K., Родштат И.В., Новскова T.A. // Сборник докладов 13-го Российского симпозиума «Миллиметровые волны в медицине и биологии». М., 2003. С. 157-164.

285. Saykally R.P., Blake G.A. // Science. 1993. V.259. P.1570-1575.

286. Liu K, Brown M.G., Cruzan J.D., Saykally R.P. // Science. 1996. V.271. P.62-64.

287. Ямсков И.А., Ямскова В.П., Даниленко A.H., Клеменкова З.С., Антипов Б.Г., Черников Ф.Р., Гусынина М.М., Рыбакова Е.Ю. // Российский Химический Журнал. 1999. T.XLIII. С.34-39.