Моделирование индукции и репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках млекопитающих при воздействии рентгеновского излучения с различными мощностями доз тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.01, кандидат наук Озеров Иван Витальевич

• Озеров Иван Витальевич
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Озеров Иван Витальевич

Список сокращений

Введение

ГЛАВА I. Обзор литературы

11 Место двунитевых разрывов в ряду различных повреждений ДНК

12 Основные механизмы репарации двунитевых разрывов

13 Флуоресцентные методы исследования репарации ДР

13.1 Фосфорилированный вариант гистона H2AX как маркер ДР

13.2 Фокусы белка Rad51 как маркеры гомологической рекомбинации

13.3 Подходы к количественному анализу фокусов белков репарации

14 Предшествующие модели индукции и репарации ДР ДНК

ГЛАВА II. Разработка алгоритма автоматического анализа флуоресцентных изображений с фокусами белков репарации ДНК

II. 1 Обзор составленного алгоритма

П.2 Разработка и валидация алгоритма детекции ядер клеток

П.3 Разработка и валидация алгоритма детекции фокусов

П.4 Графический интерфейс для запуска расчётов и анализа результатов . 52 ГЛАВА III. Получение экспериментальных данных по кинетике

формирования и деградации фокусов белков y-H2AX и

Ш.1 Материалы и методы

Ш.2 Анализ флуоресценции гистона уН2АХ в клетках линии V79

Ш.3 Анализ флуоресценции гистона уН2АХ в клетках ПФЧ

Ш.4 Анализ флуоресценции белка

ГЛАВА IV. Построение кинетической модели индукции и репарации ДР ДНК

ГУ\1 Общий вид кинетической модели

ГУ\2 Замена переменных, подбор коэффициентов и валидация модели

]У.3 Результаты моделирования

Заключение

Выводы

Библиографический список

Благодарности

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИИ Ионизирующее излучение

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

ДР ДНК Двунитевые разрывы ДНК

ДНК-ПК ДНК-зависимая протеинкиназа

ДНК-ПКкс Каталитическая субъединица ДНК-ПК

ПНКФ Полинуклеотид 3ч-фосфат киназа

НГСК Негомологичное соединение концов

ГР Гомологическая рекомбинация

ФРА Фактор репликации А

ПФЧ Первичные фибробласты человека

ФИСК Родственное фосфоинозитол-3 киназам семейство киназ

ЛОГ Лапласиан от Гауссиана

ПГЭ Пульсгель электрофорез

МДК Метод ДНК комет

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Моделирование индукции и репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках млекопитающих при воздействии рентгеновского излучения с различными мощностями доз»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Воздействие ионизирующего излучения (ИИ) на живые клетки приводит к образованию целого спектра разнообразных повреждений ДНК, включая двунитевые и однонитевые разрывы ДНК, повреждения азотистых оснований и сахаро-фосфатного остова молекулы ДНК [Teoule R., 1987; O'Neill et al., 1993; Nakajima et al., 1996]. Двунитевые разрывы (ДР) составляют относительно небольшую часть этих повреждений, но именно они являются основным триггером, определяющим дальнейшую судьбу клетки [Hoeijmakers, 2001; Wyman et al., 2006; Harper et al., 2007; Jackson et al., 2009]. Клеточный ответ на воздействие ионизирующей радиации напрямую зависит от числа накопленных ДР ДНК и может включать такие процессы, как остановка клеточного цикла, активация процессов репарации ДНК и запуск программ клеточной гибели по путям апоптоза или автофагии [Goodarzi et al., 2010; Rodriguez-Rocha et al., 2011]. Таким образом, число ДР ДНК в конкретной клетке, как и среднее значение этого параметра в целом по клеточной популяции, является принципиальным показателем, знание которого позволяет оценить текущее состояние повреждённых клеток и сделать прогноз развития радиационно-индуцированного ответа и выживаемости клеток в клеточной популяции, подвергшейся действию ИИ.

В связи с этим в последнее время активно развиваются экспериментальные методы детекции и оценки числа ДР ДНК в клетках. Классическими методами, позволяющими оценить степень фрагментации ДНК и, таким образом, число ДР, являются метод пульсгель электрофореза и метод ДНК комет [Ostling et al., 1984; Olive et al., 1990; Wojewodzka et al., 2002; Osipov et al., 2014]. Кроме того, в связи с развитием индустрии флуоресцентно меченых антител широкое распространение получили методы, основанные на анализе изображений ядер клеток с флуоресцентными метками, закрепленными на антителах к различным белкам-маркерам ДР ДНК. В качестве таких маркеров, как правило, используют

белки репарации ДНК (Ku70/80, ДНК-ПКкс, 53BP, Rad51 и др.) [Douglas et al., 2007; Sakasai et al., 2010; Stephan et al., 2010; Chatterjee et al., 2013; Muñoz et al., 2014] или гистоновые белки, претерпевающие определённые модификации в зоне непосредственной близости от двунитевого разрыва ДНК, среди которых наиболее изученным является гистон H2AX. Считается, что его фосфорилиро-ванная по остатку серина 139 форма y-H2AX является специфическим маркером ДР [Rogakou et al., 1999; Sedelnikova et al., 2002; Löbrich et al., 2010; Sharma et al., 2012]. Флуоресцирующие скопления флуоресцентно меченых антител к исследуемым белкам на полученных изображениях принято называть фокусами соответствующих белков.

Большим преимуществом методов оценки числа ДР ДНК, основанных на анализе флуоресценции меченых антител к анализируемым белкам, является возможность оценки числа и распределения ДР внутри отдельно взятой клетки и, как следствие, анализа распределения клеток в популяции по числу ДР, что открывает широкие возможности для исследования последствий воздействия ИИ. Тем не менее, при использовании таких методов требуется анализ большого числа изображений, который является весьма нетривиальной задачей. Поскольку ручной подсчёт параметров флуоресценции занимает неприемлемо много времени, в настоящее время активно развиваются алгоритмы автоматического анализа флуоресцентных изображений [Böcker et al., 2006; Cai et al., 2009; Jucha et al., 2010; Ivashkevich et al., 2012; Runge et al., 2012; Hernández et al., 2013].

Однако, точность оценки числа ДР и анализа параметров фокусов белков репарации, проведенных с помощью таких алгоритмов, оставляет желать лучшего [Wiesmann et al., 2014]. Наибольшие сложности при разработке и использовании алгоритмов автоматического анализа флуоресценции вызывает тот факт, что в большинстве случаев обрабатываемые изображения имеют невысокое качество: являются сильно зашумлёнными и имеют неравномерный фон. Кроме того, показано, что зачастую недостаточно анализировать одно лишь число фокусов белков репарации, поскольку не меньшее значение при исследо-

вании репарации ДР и других процессов, протекающих в повреждённой клетке, имеют такие параметры, как площадь фокусов и интенсивность их флуоресценции [Mistrik et al., 2009; Bee et al., 2013]. Таким образом, разработка новых алгоритмов анализа флуоресцентных изображений является одной из крайне актуальных проблем в области изучения последствий воздействия ИИ на живые клетки.

Принципиальные механизмы индукции и репарации ДР ДНК, образованных в результате воздействия острого облучения с мощностью более 200 мГр/мин [Международная комиссия по радиационным единицам и измерениям, 1985], подробно изучены в широком диапазоне доз [Alloni et al., 2012; Grudzen-ski et al., 2010; Mladenov et al., 2011; Mosconi et al., 2011]. Однако, намного чаще в условиях повышенного природного радиационного фона, в зоне радиационных аварий или в случае работы на предприятиях и в лабораториях, условия труда в которых связаны с искусственно повышенным радиационным фоном, клетки людей и других млекопитающих подвергаются длительному воздействию излучения с низкой мощностью дозы [Кошурникова c соавт., 1998; Василенко, 2001; Пелевина с соавт., 2006]. В то же время данные, касающиеся индукции и репарации ДНК при воздействии пролонгированного излучения с малой мощностью дозы, весьма противоречивы и требуют дальнейшего изучения [Шибкова с соавт., 2006; Osipov et al., 2013; Озеров с соавт., 2013]. В частности, важнейшим вопросом является выявление отличий в механизмах и кинетике накопления и репарации ДР ДНК в случае пролонгированного излучения по сравнению с острым.

Более того, в недавних работах показана прямая связь между соотношением долей основных путей репарации в поврежденных клетках, негомологического соединения концов и гомологической рекомбинации, и дальнейшим соотношением путей клеточной гибели, а также возникновением отдалённых последствий облучения, таких как хромосомные аберрации, микроделеции и разнообразные эпигенетические эффекты [Bitomsky et al., 2009; Strozyk et al., 2013]. Однако, большинство работ в этой области по-прежнему сконцентриро-

вано на исследовании зависимостей от дозы и энергии редкоионизирующих излучений, в то время как такой важный фактор, как мощность дозы, в большинстве случаев остаётся за кадром. Иногда облучение с высокой и низкой мощностью дозы может иметь разнонаправленные эффекты на одни и те же клеточные процессы [Ross et al., 1997]. Несмотря на очевидное влияние интенсивности излучения на формирование непосредственного клеточного ответа и возникновение отдалённых последствий в облучённых клетках, мощность дозы до сих пор не учитывается в нормах радиационной безопасности и гигиены труда в условиях повышенного радиационного фона [IAEA Safety Standards, 2011].

В связи со стремительным накоплением численных данных по кинетике индукции и репарации ДР ДНК, а также по кинетике формирования отдельных комплексов, участвующих в этом процессе, в последнее время стали появляться работы по математическому моделированию процессов репарации ДР в клетках различных типов и при различных параметрах облучения. Как правило, такие модели представляют собой системы дифференциальных уравнений различной сложности. Простейшие из них основаны на учёте эмпирических закономерностей формирования и репарации повреждений ДНК и включают всего 2-3 уравнения [Tobias, 1985; Guerrero et al., 2002; Metzger et al., 1991; Ponomarev et al., 2014], в то время как более сложные основаны на уравнениях химической кинетики, описывающих поведение отдельных молекул-участниц репарационных комплексов (ATM, ДНК-ПК, XRCC4, ФРА, Artemis и др.), и включают десятки уравнений [Cucinotta et al., 2000; Cucinotta et al., 2008; Taleei et al., 2013].

Вне зависимости от сложности подавляющее большинство моделей индукции и репарации ДР ДНК учитывают зависимость кинетики этих процессов от накопленной дозы облучения. Некоторые из существующих моделей учитывают такие факторы как энергия излучения, фаза клеточного цикла облучаемых клеток, положение ДР в гетеро- или эухроматине, характер ДР (простые, сложные, кластерные) и различие в кинетике репарации ДР по различным механизмам. Тем не менее, ни одна из существующих на данный момент моделей не учитывает зависимость процессов репарации от мощности дозы облучения и не

может быть использована для прогноза последствий действия пролонгированного излучения. Разработка такой модели могла бы существенно улучшить понимание происходящих в поврежденных клетках процессов в зависимости от мощности дозы облучения и в дальнейшем помочь в выявлении оптимальных режимов радиотерапии онкологических заболеваний. Кроме того, создание кинетических моделей часто позволяет пролить свет на молекулярные механизмы и роль отдельных молекул-участниц в моделируемых процессах.

Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы является проведение сравнительного исследования особенностей репарации дву-нитевых разрывов ДНК в клетках млекопитающих, подверженных воздействию редкоионизирующего излучения, в зависимости от мощности дозы излучения с использованием метода кинетического моделирования.

Для достижения поставленной цели сформулированы и решены следующие задачи:

- разработать эффективный алгоритм автоматического анализа фокусов белков репарации на флуоресцентных изображениях ядер клеток, подверженных действию редкоионизирующего излучения с различной мощностью дозы

- получить экспериментальные данные по кинетике формирования и деградации фокусов белков репарации у-И2ЛХ и Яаё51 в клетках линии У79 фибробластов лёгкого китайского хомяка и первичных фибробластах кожи человека при воздействии у- и рентгеновских лучей в зависимости от мощности дозы

- на основе полученных экспериментальных данных и данных из литературы построить статистически достоверную кинетическую модель индукции и репарации ДР ДНК в условиях действия редкоионизирующего излучения в широком диапазоне доз (0,25 - 5 Гр) и мощностей доз (1 - 400 мГр/мин)

- исследовать дозовые кривые интенсивности флуоресценции белков у-Н2АХ и в зависимости от мощности поглощенной дозы

- используя данные моделирования, оценить вклад репарации ДР ДНК по путям НГСК и ГР в клетках млекопитающих в зависимости от накопленной дозы и мощности дозы редкоионизирующего излучения

Положения, выносимые на защиту:

1) Кинетика образования и деградации фокусов белков репарации ДР ДНК имеет принципиальные различия в случае пролонгированного и острого режимов облучения клеток млекопитающих.

2) Вклады основных механизмов репарации ДР ДНК, гомологической рекомбинации и негомологичного соединения концов, нелинейным образом зависят от мощности дозы облучения.

Теоретической и методологической основой диссертационной работы являются разработки отечественных и зарубежных ученых в области радиобиологии, биофизики, математического моделирования динамики сложных систем и алгоритмов анализа изображений.

Информационную базу составляют материалы научных конференций, объекты интеллектуальной собственности, статьи в периодических изданиях и научных сборниках по исследуемой проблеме.

При проведении исследований были использованы:

- у- и рентгеновские установки для облучения исследуемых клеток;

- флуоресцентные методы детекции фокусов белков репарации в облученных клетках линии V79 китайского хомяка и первичных фибробластов человека;

- численные алгоритмы детекции и сегментации объектов на изображениях, реализованные в проектах с открытым кодом;

- методы математической теории эксперимента (математической статистики, планирования активного эксперимента, регрессионного и корреляционного анализа), реализованные в специализированном программном обеспечении;

- методы подбора параметров и интегрирования систем обыкновенных дифференциальных уравнений, реализованные в свободном программном обеспечении.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе работы создан принципиально новый алгоритм автоматического учёта числа и параметров фокусов белков репарации ДР ДНК в ядрах клеток с удобным графическим интерфейсом взаимодействия с пользователем. В отличие от предшествующих алгоритмов, описанный алгоритм заточен под анализ флуоресцентных изображений с высокой степенью шума и неравномерным фоном без дополнительного предпроцессинга. Кроме того, указанный алгоритм можно легко адаптировать для решения задач из других областей биологии, связанных с анализом флуоресцентных изображений.

Впервые получены кинетики образования и деградации фокусов белков репарации ДР ДНК у-И2ЛХ и Яаё51 для клеток млекопитающих в течение суток после окончания острого и пролонгированного воздействия редкоионизи-рующего излучения, проанализирована колокализация фокусов белков у-И2ЛХ и Яаё51. Построена кинетическая модель индукции и репарации ДР ДНК, которая, в отличие от моделей других авторов, учитывает структурный характер образованных ДР и различия в кинетике репарации ДР, происходящей по различным механизмам.

Продемонстрировано различие в кинетике образования фокусов белков у-Н2ЛХ и Яаё51 при различных значениях мощности дозы (1 - 400 мГр/мин), впервые построена кинетическая модель репарации ДР ДНК, учитывающая не только интегральную накопленную дозу, но и мощность дозы излучения. С помощью модели исследованы различия в характере дозовых зависимостей накопления и деградации фокусов у-Н2ЛХ и ДР ДНК при различной мощности до-

зы, показан нелинейный характер изменения вклада ГР в репарацию ДР ДНК при переходе от острого облучения к пролонгированному с наличием максимума в районе 5-20 мГр/мин .

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы представлялись и докладывались на следующих научно-практических конференциях:

V Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов-на-Дону, октябрь 2013.

VI международная школа молодых ученых по молекулярной генетике «Ге-номика и системная биология», Москва - Звенигород, ноябрь 2014. Доклад диссертанта на тему «Моделирование процессов репарации двунитевых разрывов ДНК» был удостоен награды в номинации «лучший устный доклад».

Достоверность результатов работы обеспечивается проведением экспериментов с достаточной воспроизводимостью; статистической обработкой полученных данных с заданной вероятностью и необходимым количеством повторных испытаний; использованием отдельных тестовых и тренировочных наборов данных и методов кросс-корреляции для построения и подтверждения статистической достоверности математических моделей; сопоставлением результатов, полученных разными методами, а также сравнением с аналогичными результатами, полученными другими авторами.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 4х глав, заключения, выводов, списка использованных источников и благодарностей. Содержит 121 страницу машинописного текста, 31 рисунок и 2 таблицы. Библиография включает 185 наименований.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I.1 Место двунитевыхразрывов в ряду различных повреждений ДНК

ДНК является высокостабильной макромолекулой. Даже несмотря на то, что N-гликозидные связи с пуриновыми основаниями обладают относительно невысокой энергией, депуринизация одного отдельно взятого пуринового основания происходит не чаще, чем раз в 1000 лет. Дезаминирование цитозина с образованием урацила происходит и того реже - раз в 70000 лет [Shapiro et al., 1981]. Тем не менее, даже такие редкие события могут оказаться важными в контексте поддержания генетической стабильности. Если учесть, что средний размер генома млекопитающих составляет порядка нескольких миллиардов пар нуклеотидов, то получится что при воздействии естественного радиационного фона и внутренних повреждающих факторов в каждой клетке в течение только одного часа образуется порядка 300 депуринизированных сайтов и происходит дезаминирование четырех цитозинов. Кроме того, ДНК содержит сайты, подверженные гидролитическим и оксидативным повреждениям, в том числе атомы азота и углерода азотистых оснований и дезоксирибозы, фосфодиэфирные связи [Greer et al., 1962; Masuda et al., 2012]. В результате действия активных форм кислорода образуются первичные окисленные аддукты ДНК, обладающие высокой реакционной способностью. Такие соединения быстро деградируют с образованием большого числа вторичных повреждений ДНК. На данный момент известно более чем 100 видов таких повреждений [Dizdaroglu et al., 1992 ;Breen et al., 1995]. Более того, было показано, что в результате возникновения окислительных повреждений ДНК в каждой клетке человека в среднем происходит от двух до десяти тысяч разнообразных модификаций пуриновых оснований [Lindahl et al., 1993]. Кроме окислительных повреждений, ДНК подвержена и ряду других видов нежелательных модификаций. В частности, нуклео-фильные центры оснований, включая почти все атомы азота и кислорода, а

также фосфатные группы, являются мишенями для алкилирования [Singer et al., 1982].

Воздействие ионизирующего излучения интересно тем, что помимо прямого действия, вызываемого происходящими в молекуле ДНК актами ионизации, существуют и косвенные механизмы действия, в первую очередь обусловленные образованием АФК за счёт радиолиза воды. Такой косвенный механизм повреждения ДНК при действии ионизирующей радиации во многом схож с описанными выше механизмами возникновения повреждений в естественных условиях, но при этом многократно усилен. Было подсчитано, что число повреждений ДНК, образующихся за счёт эндогенных факторов за одни сутки, приблизительно равно числу повреждений при воздействии у-излучения в дозе 10 Гр. Таким образом, мощность дозы такого излучения соответствовала бы 7 мГр/мин [Cosman et al., 1992]. Тем не менее, имеют место существенные отличия повреждений, возникающих при действии ИИ, от тех, которые обусловлены действием эндогенных АФК. Наиболее важным из таких отличий является высокая вероятность образования двунитевых разрывов ДНК. Окисление остатка дезоксирибозы в цепи ДНК приводит к образованию однонитевого разрыва. Если такой процесс одновременно происходит в остатках дезоксирибозы на антипараллельных цепях ДНК, стоящих друг напротив друга, происходит образование ДР.

Наиболее высокий выход двунитевых разрывов наблюдается при действии плотноионизирующего излучения, поскольку такие повреждения, обычно, локализованы кластерами вдоль трека частицы, и повреждение двух соседних нуклеотидов с образованием ДР имеет высокую вероятность. Более того, часто происходит образование кластерных повреждений, при которых несколько ДР лежат непосредственной близости друг от друга [Goodhead et al., 1994]. Повреждения, вызываемые действием так называемого редкоионизирующего излучения, включающего у-лучи и высокоэнергетическое рентгеновское излучение с энергией квантов более 10 кэВ, имеют принципиально другой характер. Такие повреждения более равномерно распределены по всему объему ядерной ДНК,

при этом число образующихся двунитевых разрывов заметно меньше по сравнению с плотноионизирующим излучением. Воздействие у -излучения на клетки человека в дозе 1 Гр приводит к образованию 600 - 1000 однонитевых разрывов и всего 16 - 40 двунитевых [Ward et al., 1988; Vilenchik et al., 2000]. Тем не менее, именно редкоионизирующее излучение составляет основу естественного радиационного фона, что делает изучение этого вида ИИ крайне важной задачей. Кроме того, редкоионизирующее ИИ обладает высокой проникающей способностью, что обусловливает его использование для радиотерапии раковых опухолей глубокого залегания [Bencokova et al., 2008; Heppner et al., 2008; Го-ланов с соавт., 2007].

Возникающие ДР ДНК неоднородны по своей химической структуре, поскольку нарушения сахарофосфатного остова молекулы и сопутствующее образование реакционноспособных нерелаксированных или окиленных структур часто приводит к появлению дополнительных повреждений ДНК в области двунитевого разрыва. Такие ДР получили в литературе название «сложных». Репарация сложных ДР имеет более медленную кинетику по сравнению с репарацией простых, для которых специальный процессинг не требуется [Metzger et al., 1991; Michalik et al., 1994; Gultson et al., 2002]. Другой причиной различий в скорости репарации ДР может служить их положение в структуре хроматина. По некоторым данным репарация ДР, локализованных в гетерохроматине, имеет более медленную кинетику по сравнению с эухроматином [Goodarzi et al., 2009, 2010].

Несмотря на относительно невысокую частоту по сравнению с другими видами повреждений ДНК, возникновение ДР ДНК является ключевым триггером, определяющим дальнейшую судьбу поврежденной клетки [Hoeijmakers, 2001; Wyman et al., 2006; Harper et al., 2007; Jackson et al., 2009]. Клеточный ответ на возникновение ДР может включать остановку клеточного цикла, активацию репарации ДНК и клеточную гибель по путям апоптоза или автофагии [Goodarzi et al., 2010; Rodriguez-Rocha et al., 2011]. Механизмы развития клеточного ответа хорошо изучены при действии острого облучения с высокой

мощностью дозы, в то время как действие пролонгированного излучения с малой мощностью изучено недостаточно. Тем не менее, очень часто клетки подвергаются именно такому режиму облучения и достоверно известно, что мощность дозы является важным фактором, влияющим на процессы образования ДР в клетках млекопитающих [Кошурникова c соавт., 1998; Василенко, 2001; Пелевина с соавт., 2006; Mughal et al., 2012].

I.2 Основные механизмы репарации двунитевыхразрывов

Как было сказано выше молекулы ДНК клеток всех живых организмов, и млекопитающих в частности, постоянно подвергаются повреждениям, среди которых наибольшую опасность для генетической стабильности несут ДР ДНК. Тем не менее, возникновение таких повреждений не является летальным для клетки, поскольку в ходе эволюции были выработаны эффективные механизмы репарации ДР ДНК. Эти же механизмы включаются при воздействии ИИ на клетки. Основными путями репарации ДР являются негомологичное соединение концов (НГСК) и гомологическая рекомбинация (ГР). Наибольший вклад в репарацию вносит процесс НГСК, ответственный за процессинг более чем 80 % всех ДР, образованных в результате действия редкоионизирующего излучения [Kakarougkas et al., 2014]. Поскольку кроме некоторых особых случаев для протекания ГР необходима сестринская хроматида, которая используется в качестве матрицы для репарации поврежденной хроматиды, содержащей ДР, этот путь репарации активен только в S и G2 фазах клеточного цикла. В этих фазах клеточного цикла клетки млекопитающих наряду с НГСК активно используют ГР для репарации двунитевых разрывов [Shrivastav et al., 2005; Lisby et al., 2009]. Молекулярные механизмы обоих путей репарации ДР ДНК достаточно хорошо исследованы [Kass et al., 2010; Lieber, 2010; Mazon et al., 2010; Moyna-han et al., 2010]. Тем не менее, по-прежнему остаётся ряд вопросов. В частности, некоторые авторы считают, что НГСК представляет собой совокупность двух практически независимых процессов, имеющих сходную кинетику, так на-

зываемых прямого и альтернативного НГСК, реализация которых осуществляется различными белковыми комплексами [Iliakis, 2009; Neal et al., 2011].

В классическом представлении процесс НГСК начинается с присоединения гетеродимера белка Ku70/80 к поврежденной ДНК по обе стороны от образованного ДР (Рисунок I.1). Этот процесс имеет крайне быструю кинетику за счёт невероятно высокого сродства данного белка к двунитевым концам ДНК и его постоянно высокой концентрации в ядрах клеток. Связанный с ДНК Ku70/80 защищает концы поврежденной ДНК от действия экзонуклеаз и служит сигналом для автофосфорилирования и активации ключевой киназы семейства ФИСК ATM [Liang et al., 1996]. Кроме того, ДНК-связанный Ku70/80 напрямую взаимодействует с другим белком этого семейства, каталитической субъединицей ДНК протеинкиназы (ДНК-ПКкс), формируя комплекс ДНК про-теинкиназы (ДНК-ПК). В процессе формирования такого комплекса происходит автофосфорилирование и активация киназной активности ДНК-ПКкс [Gottlieb et al., 1993]. Киназная активность активированных ATM и ДНК-ПКкс является основным фактором, определяющим формирование лигирующего комплекса, состоящего из ДНК лигазы IV, а также белков XRCC4 и XLF [Cot-tarel et al., 2013]. Участие некоторых дополнительных белков является необходимым в случае наличия сопутствующих повреждений и репарации сложных ДР, включая MRN комплекс, Artemis и полинуклеотид 3ч-фосфат киназу (ПНКФ) [Riballo et al., 2004; Bernstein et al., 2009]. Таким образом, НГСК является компактно-локализованным в пространстве вокруг ДР процессом с быстрой кинетикой и характерными временами порядка 30-40 минут для простых и 3-4 часов для репарации сложных ДР.

Рисунок I.1. Схема основных путей репарации двунитевых разрывов ДНК.

В отличие от НГСК, в процессе ГР для восстановления поврежденного участка ДНК, содержащего ДР, в качестве матрицы используется неповрежденная сестринская хроматида. На первом этапе ГР происходит процессинг, или так называемая резекция, свободных 3Ч концов ДНК по краям разрыва в направлении от 5Ч к 3Ч с образованием однонитевых участков (липких концов) [Symington et al., 2011]. Процесс резекции может быть условно разделён на два этапа, первый из которых называется инициацией и происходит с участием белка CtIP и MRN (Mre11-Rad50-Nbs1) комплекса. На этом этапе происходит образование и удлинение липких концов. Второй этап включает имеющий очень высокую скорость процесс связывания Фактора репликации А (ФРА) с

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Озеров Иван Витальевич, 2015 год

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Василенко И.Я. Радиация. Источники, нормирование облучения. // Природа. 2001. №4. С.10-16.

2. Голанов А.В., Коновалов А.Н., Корниенко В.Н., Ильялов С.Р., Костю-ченко В.В., Пронин И.Н., Маряшев С.А., Яковлев С.Б., Лубнин А.Ю., Серова Н.К., Никонова Н.Г. Первый опыт применения установки «Гамма-нож» для радиохирургического лечения интракраниальных объемных образований. // Журнал «Вопросы нейрохирургии». 2007. №1. С.3-11.

3. Кошурникова Н.А.; Шильникова Н.С.; Окатенко П.В.; Креслов В.В.; Болотникова М.Г.; Сокольников М.Э.; Романов С.А.; Хохряков В.Ф.; Суслова К.Г. Характеристика когорты рабочих атомного предприятия ПО «Маяк». // Вопросы радиационной безопасности. 1998. №3. С.48-58.

4. Озеров И.В., Пустовалова М.В., Осипов А.Н. Индукция и репарация двунитевых разрывов ДНК в клетках линии V79 при длительном возде-ствии низкоинтенсивного у-излучения. // Саратовский научно-медицинский журнал. 2013. Т. 9. № 4. С. 787-791.

5. Пелевина И.И.; Готлиб В.Я.; Конрадов А. А. 20 лет изучения последствий Чернобыльской аварии - это много или мало для оценки их характера и масштабов? // Радиобиология. 2006. Т.46. №2. С.240-247.

6. Шибкова Д.З; Аклеев А.В. Адаптационно-компенсаторные реакции системы кроветворения при хроническом радиационном воздействии. // Челябинск: Изд-во ЧГПУ. 2006. Монография.

7. Alessio N., Del Gaudio S., Capasso S., Di Bernardo G., Cappabianca S., Cipollaro M., Peluso G., Galderisi U. Low dose radiation induced senescence of human mesenchymal stromal cells and impaired the autophagy process. // Oncotarget. 2014 (в печати).

8. Alloni D.; Campa A.; Friedland W.; Mariotti L.; Ottolenghi A. Track structure, radiation quality and initial radiobiological events: Considerations based on the PARTRAC code experience. // Int. J. Radiat. Biol. 2012, T.88. C.77-86.

9. Anderson J.A., Harper J.V., Cucinotta F.A., O'Neill P. Participation of DNA-PKcs in DSB repair after exposure to high- and low-LET radiation. // Radiat. Res. 2010. T. 174. № 2. C. 195-205.

10. Asaithamby A., Chen D.J. Cellular responses to DNA double-strand breaks after low-dose gamma-irradiation. // Nucleic Acids Res. 2009. T. 37. №12. C.3912-3923.

11. Asaithamby A., Uematsu N., Chatterjee A., Story M.D., Burma S., Chen D.J. Repair of HZE-particle-induced DNA double-strand breaks in normal human fibroblasts. // Radiat Res. 2008. T. 169. C.437-446.

12. Aylon Y., Liefshitz B., Kupiec M. The CDK regulates repair of doublestrand breaks by homologous recombination during the cell cycle. // EMBO J. 2004. T.23. №24. C.4868-4875.

13. Badie N.F.C., Alsbeih G., Fertilt B. A New Model Describing the Curves for of both DNA Repair Breaks and Chromosome Damage // Radiat Res. 1996. T. 146. № 1. C. 53-60.

14. Bakkenist C.J., Kastan M.B. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation. // Nature. 2003. T. 421. C. 499-506.

15. Banáth J.P., Klokov D., MacPhail S.H., Banuelos C.A., Olive P.L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. // BMC Cancer. 2010. T.10. C.4. doi: 10.1186/1471-2407-10-4.

16. Bassing C.H., Chua K.F., Sekiguchi J., Suh H., Whitlow S.R., Fleming J.C., Monroe B.C., Ciccone D.N., Yan C., Vlasakova K., Livingston D.M., Ferguson D.O., Scully R., Alt F.W. Increased ionizing radiation sensitivity and genomic instability in the absence of histone H2AX. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002. T.99. C. 8173-8178.

17. Bee L., Fabris S., Cherubini R., Mognato M., Celotti L. The efficiency of homologous recombination and non-homologous end joining systems in repairing double-strand breaks during cell cycle progression. // PLOS One. 2013. T. 8(7). C. e69061.

18. Belli M.; Cherubini R.; Dalla Vecchia M.; Dini V.; Moschini G.; Signoretti C.; Simone G.; Tabocchini M.; Tiveron P. DNA DSB induction and rejoining in V79 cells irradiated with light ions: a constant field gel electrophoresis study. // Int J Rad Biol. 2000. T.76. №8. C.1095-1104.

19. Bencokova Z., Balosso J., Foray N. Radiobiological features of the anticancer strategies involving synchrotron X-rays. // J Synchrotron Radiat.

2008. T.15. №1. C.74-85.

20. Bernstein N.K., Hammel M., Mani R.S., Weinfeld M., Pelikan M., Tainer J.A., Glover J.N. Mechanism of DNA substrate recognition by the mammalian DNA repair enzyme, Polynucleotide Kinase. // Nucleic Acids Res. 2009. T.37. №18. C. 6161-6173. doi: 10.1093/nar/gkp597.

21. Beucher A., Birraux J., Tchouandong L., Barton O., Shibata A., Conrad S., Goodarzi A.A., Krempler A., Jeggo P.A., Löbrich M. ATM and Artemis promote homologous recombination of radiation-induced DNA double-strand breaks in G2. // EMBO J. 2009. T.28. C.3413-427.

22. Beucher S., Meyer F. The morphological approach to segmentation: the watershed transformation. // Mathematical Morphology in Image Processing, 1993, 433-481.

23. Bitomsky N., Hofmann T.G. Apoptosis and autophagy: Regulation of apop-tosis by DNA damage signalling - roles of p53, p73 and HIPK2. // FEBS J.

2009. T.276. №21. C.6074-6083.

24. Botrugno O.A., Robert T., Vanoli F., Foiani M., Minucci S. Molecular pathways: old drugs define new pathways: non-histone acetylation at the crossroads of the DNA damage response and autophagy. // Clin Cancer Res. 2012. T.18. №9. 2436-2442.

25. Brenner D.J. The linear-quadratic model is an appropriate methodology for determining isoeffective doses at large doses per fraction. // Semin. Radiat. Oncol. 2008. T. 18. № 4. C. 234-239.

26. Bryant P. The signal model: a possible explanation for the conversion of DNA double-strand breaks into chromatid breaks // Int. J. Radiat. Biol. 1998. T. 73. № 3. C. 243-51.

27. Bryant P.E., Blocher D. Measurement of the kinetics of DNA double strand break repair in Ehrlich ascites tumour cells using the unwinding method. // Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 1980. T.38. №3. C.335-47.

28. Burma S., Chen B.P., Murphy M., Kurimasa A., Chen D.J. ATM phosphory-lates histone H2A.X in response to DNA double-strand breaks. // J Biol Chem. 2001. T.276. C.42462-42467.

29. Bocker W., Iliakis G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. // Radiat Res. 2006. T.165. №1. C.113-124.

30. Cai Z., Vallis K.A., Reilly R.M. Computational analysis of the number, area and density of gamma-H2AX foci in breast cancer cells exposed to (111)In-DTPA-hEGF or gamma-rays using Image-J software. // Int J Radiat Biol. 2009. T.85. №3. C.262-271.

31. Canny J. A Computational Approach To Edge Detection. // IEEE Trans. Pattern Analysis and Machine Intelligence. 1986. T. 8. №6. C. 679-698.

32. Celeste A., Fernandez-Capetillo O., Kruhlak M.J., Pilch D.R., Staudt D.W., Lee A., Bonner R.F., Bonner W.M., Nussenzweig A. Histone H2AX phosphorylation is dispensable for the initial recognition of DNA breaks. // Nat Cell Biol. 2003. T.5. C.675-679.

33. Celeste A., Petersen S., Romanienko P.J., Fernandez-Capetillo O., Chen H.T., Sedelnikova O.A., Reina-San-Martin B., Coppola V., Meffre E., Di-filippantonio M.J., Redon C., Pilch D.R., Olaru A., Eckhaus M., Camerini-Otero R.D., Tessarollo L., Livak F., Manova K., Bonner W.M., Nussenzweig M.C., Nussenzweig A. Genomic instability in mice lacking histone H2AX. // Science. 2002. T.296. C. 922-927.

34. Chan D.W., Chen B. P., Prithivirajsingh S., Kurimasa A., Story M. D., Qin J., Chen D. J. Autophosphorylation of the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit is required for rejoining of DNA double strand breaks. // Genes Dev. 2002. T.16. C.2333-2338.

35. Chatterjee P., Choudhary G.S., Sharma A., Singh K., Heston W.D., Ciezki J., Klein E.A., Almasan A. PARP inhibition sensitizes to low dose-rate radiation TMPRSS2-ERG fusion gene-expressing and PTEN-deficient prostate cancer cells. // PLoS One. 2013. T.8. №4. C.e60408. doi: 10.1371/journal.pone.0060408.

36. Chen G., Yuan S.S., Liu W., Xu Y., Trujillo K., Song B., Cong F., Goff S.P., Wu Y., Arlinghaus R., Baltimore D., Gasser P.J., Park M.S., Sung P., Lee E.Y. Radiation-induced assembly of Rad51 and Rad52 recombination complex requires ATM and c-Abl. // J. Biol. Chem. 1999. T. 274. №18.

C.12748-12752. doi:10.1074/jbc.274.18. 12748

37. Chowdhury D., Keogh M.C., Ishii H., Peterson C.L., Buratowski S., Lieber-man J. gamma-H2AX dephosphorylation by protein phosphatase 2A facilitates DNA double-strand break repair. // Mol Cell. 2005. T.20. №5. C.801-809.

38. Chowdhury D., Xu X., Zhong X., Ahmed F., Zhong J., Liao J., Dykxhoorn

D.M., Weinstock D.M., Pfeifer G.P., Lieberman J. A PP4-phosphatase complex dephosphorylates gamma- H2AX generated during DNA replication. // Mol Cell. 2008. T.31. №1. C.33-46.

39. Conway A.B., Lynch T.W., Zhang Y., Fortin G.S., Fung C.W., Symington L.S., Rice P.A. Crystal structure of a Rad51 filament. // Nat Struct Mol Biol. 2004. T.11. №8. C.791-796. doi:10.1038/nsmb795.

40. Cosman M., de los Santos C., Fiala R., Hingerty B.E., Singh S.B., Ibanez V., Margulis L.A., Live D., Geacintov N.E., Broyde S., Patel D.J. Solution conformation of the major adduct between the carcinogen (+)-anti-benzo[a]pyrene diol epoxide and DNA. // Proc Natl Acad Sci USA. 1992. T.89. C.1914-1918.

41. Cottarel J., Frit P., Bombarde O., Salles B., Negrel A., Bernard S., Lieber M.R., Modesti M., Calsou P. A noncatalytic function of the ligation complex during nonhomologous end joining. // J. Cell Biol. 2013. T. 200. C. 173-186.

42. Cucinotta F.A., Nikjoo H., O'Neill P., Goodhead D.T. Kinetics of DSB rejoining and formation of simple chromosome exchange aberrations. // Int. J. Radiat. Biol. 2000. T. 76. № 11. C. 1463-1474.

43. Cucinotta F.A., Pluth J.M. Anderson J.A. Harper J.V. O'Neill P. Biochemical kinetics model of DSB repair and induction of gamma-H2AX foci by non-homologous end joining. // Radiat. Res. 2008. T. 169. № 2. C. 214-222.

44. Cui X., Yu Y., Gupta S., Cho Y. M., Lees-Miller S., Meek K. Autophos-phorylation of DNA-dependent protein kinase regulates DNA end processing and may also alter double-strand break repair choice. // Mol. Cell Biol. 2005. T.25. C. 10842-10652.

45. Curtis S.B. Lethal and potentially lethal lesions induced by radia- tion—A unified repair model. // Radiat. Res. 1986. T.106. C.252-270.

46. Dale R. G. The application of the linear-quadratic model to fractionated radiotherapy when there is incomplete normal tissue recovery between fractions, and possible implications for treatments involving multiple fractions per day. // Br J Radiol. 1986.T.59. №705. C.919-927.

47. Dikomey E., Franzke J. Three classes of DNA strand breaks induced by X-irradiation and internal beta-rays. // Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 1986. T.50. №5. C.893-908.

48. Dikomey E., Lorenzen J. Saturated and unsaturated repair of DNA strand breaks in CHO cells after X-irradiation with doses ranging from 3 to 90 Gy. // Int J Radiat Biol. 1993 T.64. №6. C.659-667.

49. Douglas P., Cui X., Block W.D., Yu Y., Gupta S., Ding Q., Ye R., Morrice N., Lees-Miller S.P., Meek K. The DNA-dependent protein kinase catalytic subunit is phosphorylated in vivo on threonine 3950, a highly conserved amino acid in the protein kinase domain. // Mol. Cell Biol. 2007. T.27. №5. C.1581-1591.

50. Douglas P., Zhong J., Ye R., Moorhead G.B., Xu X., Lees-Miller S.P. Protein phosphatase 6 interacts with the DNA-dependent protein kinase catalytic

106

subunit and dephosphorylates gamma-H2AX. // Mol Cell Biol. 2010. T.30. №6. C.1368-1381.

51. Dupre A., Boyer-Chatenet L., Gautier J. Two-step activation of ATM by DNA and the Mre11-Rad50-Nbs1 complex. // Nature structural & molecular biology. 2006. T. 13. C. 451-457.

52. Fernandez-Capetillo O., Celeste A., Nussenzweig A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. // Cell Cycle. 2003. T.2. №5. C.426-427.

53. Fernandez-Capetillo O., Lee A., Nussenzweig M., Nussenzweig A. H2AX: the histone guardian of the genome. // DNA Repair (Amst). 2004. T. 3. № 89. C. 959-67.

54. Firsanov D.V., Solovjeva L.V., Svetlova M.P. H2AX phosphorylation at the sites of DNA double-strand breaks in cultivated mammalian cells and tissues. // Clin. Epigenetics. 2011. T. 2. № 2. C. 283-97.

55. Frankenberg-Schwager M. Review of repair kinetics for DNA damage induced in eukaryotic cells in vitro by ionizing radiation. // Radio therapy and Oncology. 1989. T.14. C.307-320.

56. Friedland W., Jacob P., Kundrat P. Stochastic simulation of DNA doublestrand break repair by non-homologous end joining based on track structure calculations. // Radiat. Res. 2010. T. 173. C. 677-688.

57. Gill P.E., Murray W. Algorithms for the solution of the nonlinear least-squares problem. // SIAM Journal on Numerical Analysis. 1978. T. 15. №5. C. 977-992.

58. Goodarzi A.A., Noon A.T., Jeggo P.A. The impact of heterochromatin on DSB repair. // Biochem. Soc. Trans. 2009. T. 37. C. 569-576.

59. Goodarzi A.A., Jeggo P., Lobrich M. The influence of heterochromatin on DNA double strand break repair: Getting the strong, silent type to relax. // DNA Repair (Amst.). 2010. T. 9. C. 1273-1282.

60. Goodhead D.T. Initial events in the cellular effects of ionising radiation: clustered damage in DNA. // Int. J. Radiat. Biol. 1994. T. 65. C. 7-17.

61. Gottlieb T.M., Jackson S.P. The DNA-dependent protein kinase: requirement of DNA ends and association with Ku Antigen. // Cell. 1993. T.72. C.131-42.

62. Greer S., Zamenhof S. Studies on depurination of DNA by heat. // J Mol Biol. 1962 T. 4. C. 123-141.

63. Graeser M., McCarthy A., Lord C.J., Savage K., Hills M., Salter J., Orr N., Parton M., Smith I.E., Reis-Filho J.S., Dowsett M., Ashworth A., Turner N.C. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. // Clin Cancer Res. 2010. T. 16. №24. C. 6159-6168.

64. Grudzenski S., Raths A., Conrad S., Rube C.E., Lobrich M. Inducible response required for repair of low-dose radiation damage in human fibroblasts. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. T.107. C.14205-14210.

65. Guerrero M., Stewart R.D., Wang J.Z., Li X.A. Equivalence of the linear-quadratic and two-lesion kinetic models // Phys. Med. Biol. 2002. T. 47. C. 3197-3209.

66. Gulston M., Fulford J., Jenner T., de Lara C, O'Neill P. Clustered DNA damage induced by y-radiation in human fibroblasts (HF19), hamster (V79-4) cells and plasmid DNA is revealed as Fpg and Nth sensitive sites. // Nucleic Acids Res. 2002. T. 30. C. 3464-3472.

67. Harper J.W., Elledge S.J. The DNA damage response: ten years after. // Mol. Cell. 2007. T. 28. C.739-745.

68. Henning W., Stürzbecher H.W. Homologous recombination and cell cycle checkpoints: Rad51 in tumour progression and therapy resistance. // Toxicology. 2003. T. 193. №1-2. C. 91-109.

69. Heppner P.A., Sheehan J.P., Steiner L.E.. Gamma knife surgery for low-grade gliomas. // Neurosurgery. 2008. C. 755-62. doi: 10.1227/01 .neu.0000316279.22371 .b8.

70. Hernández L., Terradas M., Martín M., Tusell L., Genesca A. Highly Sensitive Automated Method for DNA Damage Assessment: Gamma-H2AX Foci

Counting and Cell Cycle Sorting. // International Journal of Molecular Sciences. 2013. T.14. C. 15810-15826.

71. Hoeijmakers, J.H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. // Nature. 2001. T.411. C.366-374.

72. Iliakis G. Backup pathways of NHEJ in cells of higher eukaryotes: cell cycle dependence. // Radiother. Oncol. 2009. T. 92. C. 310-315.

73. International Atomic Energy Agency (IAEA) Safety Standards, Radiation Protection and Safety of Radiation Sources: International Basic Safety Standards // 2011. ISBN 978-92 -0-120910-8.

74. International Commission on Radiation Units and Measurements. Dose and volume specification for reporting intracavitary therapy in gynecology. // Report 38. 1985. Bethesda.

75. Ira G., Pellicioli A., Balijja A., Wang X., Fiorani S., Carotenuto W., Liberi G., Bressan D., Wan L., Hollingsworth N.M., Haber J.E., Foiani M. DNA end resection, homologous recombination and DNA damage checkpoint activation require CDK1. // Nature. 2004. T.431. №7011. C.1011-1017.

76. Ishikawa A., Yamauchi M., Suzuki K., Yamashita S. Image-based quantitative determination of DNA damage signal reveals a threshold for G2 checkpoint activation in response to ionizing radiation. // Genome Integr. 2010. T. 1. C. 10.

77. Ishizaki K., Hayashi Y., Nakamura H., Yasui Y., Komatsu K., Tachibana A. No induction of p53 phosphorylation and few focus formation of phosphory-lated H2AX suggest efficient repair of DNA damage during chronic low-dose-rate irradiation in human cells. // J Radiat Res. 2004. T. 45. №4. C. 521525.

78. Ivashkevich A.N., Martin O.A., Smith A.J., Redon C.E., Bonner W.M., Martin R.F., Lobachevsky P.N. yH2AX foci as a measure of DNA damage: a computational approach to automatic analysis. // Mutat Res. 2011. T. 711. №1-2 C. 49-60.

79. Jackson S.P.; Bartek J. The DNA-damage response in human biology and disease. // Nature. 2009. T.461. C.1071-1078.

80.Jin S., Weaver D. T. Double-strand break repair by Ku70 requires het-erodimerization with Ku80 and DNA binding functions. // EMBO J. 1997. T.16. C. 6874-6885.

81. Johnson R.D., Jasin M. Sister chromatid gene conversion is a prominent double-strand break repair pathway in mammalian cells. // EMBO J. 2000. T. 19. №13. C.3398-3407.

82. Jovanovic M., W. S. Dynan. Terminal DNA structure and ATP influence binding parameters of the DNA-dependent protein kinase at an early step prior to DNA synapsis. // Nucleic Acid Res. 2006. T. 34. C. 1112-1120.

83. Jucha A., Wegierek-Ciuk A., Koza Z., Lisowska H., Wojcik A., Wojewodzka M., Lankoff A. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. // Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2010. T. 696. C. 16-20.

84. Kakarougkas A., Jeggo P.A. DNA DSB repair pathway choice: an orchestrated handover mechanism. // Br J Radiol. 2014. T.87. №1035. C.20130685. doi: 10.1259/bjr.20130685.

85. Kass E.M., Jasin M. Collaboration and competition between DNA doublestrand break repair pathways. // FEBS letters. 2010. T. 584. C. 3703-3708.

86. Kirkby C., Ghasroddashti E., Poirier Y., Tambasco M., Stewart R.D. RBE of kV CBCT radiation determined by Monte Carlo DNA damage simulations. // Phys Med Biol. 2013. T. 58. №16. C. 5693-5704. doi: 10.1088/00319155/58/16/5693.

87. Kobayashi J. Molecular mechanism of the recruitment of NBS1/hMRE11/hRAD50 complex to DNA double-strand breaks: NBS1 binds to gamma-H2AX through FHA/BRCT domain. // Journal of radiation research. 2004. T. 45. C. 473-478.

88. Kraxenberger F., Weber K.J., Friedl A.A., Eckardt-Schupp F., Flentje M., Quicken P., Kellerer A.M. DNA double-strand breaks in mammalian cells exposed to gamma-rays and very heavy ions. Fragment-size distributions determined by pulsed-field gel electrophoresis. // Radiat Environ Biophys. 1998. T. 37. №2. C.107-15.

89. Kuwahara Y., Oikawa T., Ochiai Y., Roudkenar M.H., Fukumoto M., Shi-mura T., Ohtake Y., Ohkubo Y., Mori S., Uchiyama Y., Fukumoto M. Enhancement of autophagy is a potential modality for tumors refractory to radiotherapy. // Cell Death Dis. 2011. T.2. C.e177.

90. Kuzmina N., Borisov N. Handling Complex Rule-Based Models of Mito-genic Cell Signaling (on the Example of ERK Activation upon EGF Stimulation) // Int Proc Chem Biol Environ Eng. 2011. T. 5. C. 76-82.

91. Kysela B.P., Arrand J.E., Michael B.D. Relative contributions of levels of initial damage and repair of double-strand breaks to the ionizing radiationsensitive phenotype of the Chinese hamster cell mutant, XR-V15B. Part II. Neutrons. // Int. J. Radiat. Biol. 1993. T. 64. №5. C. 531-538.

92. Leatherbarrow E.L., Harper J.V., Cucinotta F.A.; O'Neill P. Induction and quantification of gamma-H2AX foci following low and high LET-irradiation. Int J Radiat Biol. 2006. T. 82. №2. C. 111-118.

93. Liang F., Jasin M. Ku80-deficient cells exhibit excess degradation of extrachromosomal DNA. Journal of Biological Chemistry. 1996. T. 271. C. 14405-11.

94. Lieber M.R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. // Annu Rev Biochem. 2010. T. 79. C. 181-211. doi: 10.1146/annurev.biochem.052308.093131.

95. Lim Y.C., Roberts T.L., Day B.W., Stringer B.W., Kozlov S., Fazry S., Bruce Z.C., Ensbey K.S., Walker D.G., Boyd A.W., Lavin M.F.. Increased sensitivity to ionizing radiation by targeting the homologous recombination pathway in glioma initiating cells. // Mol Oncol. 2014. T. 8. №8. C. 16031615.

96. Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA. // Nature. 1993. T. 362. C. 709-715.

97. Löbrich M., Cooper P., Rydberg B. Joining of correct and incorrect DNA ends at double-strand breaks produced by high-linear energy transfer radiation in human fibroblasts. // Radiat Res. 1998. T.150. №6. C. 619-626.

98. Löbrich M., Rief N., Kühne M., Heckmann M., Fleckenstein J., Rübe C., Uder M. In vivo formation and repair of DNA double- strand breaks after computed tomography examinations. // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. T. 102. №25. C.8984-8989.

99. Löbrich M., Shibata A., Beucher A., Fisher A., Ensminger M., Goodarzi A.A., Barton O., Jeggo P.A. yH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: strengths, limitations and optimization. // Cell Cycle. 2010. T. 9. C. 662-669.

100. Macûrek L., Lindqvist A., Voets O., Kool J., Vos H.R., Medema R.H. Wip1 phosphatase is associated with chromatin and dephosphorylates gam-maH2AX to promote checkpoint inhibition. // Oncogene. 2010. T. 29. №15. C. 2281-2291.

101. Mannironi C., Bonner W.M., Hatch C.L. H2A.X. a histone isoprotein with a conserved C-terminal sequence, is encoded by a novel mRNA with both DNA replication type and polyA 3' processing signals. // Nucleic Acids Res. 1989. T.17. C. 9113- 9126.

102. Markovâ E., Schultz N., Belyaev I.Y. Kinetics and dose-response of residual 53BP1/gamma-H2AX foci: co-localization, relationship with DSB repair and clonogenic survival. // Int J Radiat Biol. 2007. T.83. №5. C.319-329.

103. Masuda Y., Kamiya K. Molecular nature of radiation injury and DNA repair disorders associated with radiosensitivity. // Int. J. Hematol. 2012. T. 95. № 3. C. 239-45.

104. Mari P.O., Florea B.I., Persengiev S.P., Verkaik N.S., Brüggenwirth H.T., Modesti M., Giglia-Mari G., Bezstarosti K., Demmers J.A., Luider T.M, Houtsmuller A.B., van Gent D.C. Dynamic assembly of end-joining

complexes requires interaction between Ku70/80 and XRCC4. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. T. 103. №49. C. 18597-18602.

105. Marquardt D. An Algorithm for Least-Squares Estimation of Nonlinear Parameters. // SIAM Journal on Applied Mathematics. 1963. T. 11. №2. C.431-441.

106. Mazon G., Mimitou E.P., Symington L.S. SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair. //Cell. 2010. 142:646, 46 e1.

107. Metzger L., Iliakis G. Kinetics of DNA double-strand break repair throughout the cell cycle as assayed by pulsed field gel electrophoresis in CHO cells. // Int. J. Radiat. Biol. 1991. T. 59. № 6. C. 1325-39.

108. Michalik V., Frankenberg D. Simple and complex double-strand breaks induced by electrons. // Int J Radiat Biol. 1994. T. 66. № 5. C. 467-470.

109. Millman K.J., Aivazis M. Python for Scientists and Engineers. // Computing in Science & Engineering. 2011. T. 13. C. 9-12.

110. Mistrik M., Oplustilova L., Lukas J., Bartek J. Low-dose DNA damage and replication stress responses quantified by optimized automated single-cell image analysis. // Cell Cycle. 2009. T. 8. C. 2592-599.

111. Mladenov E., Iliakis G. Induction and repair of DNA double strand breaks: The increasing spectrum of non-homologous end joining pathways. // Mutat. Res. 2011. T.711. C.61-72.

112. Moon S.H., Nguyen T.A. Darlington Y., Lu X., Donehower L.A. Dephosphorylation of gammaH2AX by WIP1: an important homeostatic regulatory event in DNA repair and cell cycle control. // Cell Cycle. 2010. T. 9. № 11. C. 2092-2096.

113. Mosconi M., Giesen U., Langner F., Mielke C., Dalla Rosa I., Dirks W.G. 53BP1 and MDC1 foci formation in HT-1080 cells for low- and high-LET microbeam irradiations. // Radiat. Environ. Biophys. 2011. T.50. C.345-352.

114. Moynahan M.E., Jasin M. Mitotic homologous recombination maintains genomic stability and suppresses tumorigenesis. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2010. T. 1. C. 196-207.

115. Mughal S.K., Myazin A.E., Zhavoronkov L.P., Rubanovich A.V., Du-brova Y.E. The dose and dose-rate effects of paternal irradiation on transgen-

erational instability in mice: a radiotherapy connection. // PLoS One. 2012. T. 7. № 7. C. e41300.

116. Mukherjee B., Kessinger C., Kobayashi J., Chen B.P., Chen D.J., Chat-terjee A., Burma S. DNA-PK phosphorylates histone H2AX during apoptotic DNA fragmentation in mammalian cells. // DNA Repair (Amst). 2006. T. 5. C.575-590.

117. Muñoz M.C., Yanez, D.A., Stark, J.M. An RNF168 fragment defective for focal accumulation at DNA damage is proficient for inhibition of homologous recombination in BRCA1 deficient cells. // Nucleic Acids Res. 2014. T.42. №12. C.7720-7733.

118. Nakajima M., Takench, T., Takeshita T., Morimoto K. 8 - Hydroxydeoxyguanosine in human leukocyte DNA and daily health practice factors: effects of individual alcohol sensitivity. // Environ. Health Per-spect. 1996. T.104. C.1336-1338.

119. Nakamura H., Yasui Y., Saito N., Tachibana A., Komatsu K. et al. DNA repair defect in AT cells and their hypersensitivity to low-dose-rate radiation. // Radiat Res. 2006. T. 165. C. 277-282.

120. Neal J.A.; Mee, K. Choosing the right path: does DNA-PK help make the decision? // Mutat Res. 2011. T. 711. № 1-2. C. 73-86.

121. Nikjoo H, Lindborg L. RBE of low energy electrons and photons. // Phys Med Biol. 2010. T. 55. № 10. C. 165-109.

122. Nikjoo H., O'Neill P., Wilson W. E., Goodhead D. T. Computational Approach for Determining the Spectrum of DNA Damage Induced by Ionizing Radiation // Radiat. Res. 2001. T. 156. № 5. C. 577-583.

123. Olive P.L.; Banáth J.P.; Durand R.E. Heterogeneity in Radiation-Induced DNA Damage and Repair in Tumor and Normal Cells Measured Using the "Comet" Assay. // Radiation Research. 1990. T.122, №1, C.86-94.

124. Osipov A., Arkhangelskaya, E., Vinokurov A., Smetanina N., Zhavoronkov A., Klokov D. DNA Comet Giemsa Staining for Conventional Bright-Field Microscopy. // International Journal of Molecular Sciences. 2014. T.15. №.4. C.6086-6095.

125. Osipov A.N., Buleeva G., Arkhangelskaya E., Klokov D. In vivo y-irradiation low dose threshold for suppression of DNA double strand breaks below the spontaneous level in mouse blood and spleen cells. // Mutat Res. 2013. T. 756. C. 141-5.

126. Ostling O., Johanson K.J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1984. T.123. №1. C.291-298.

127. O'Neill P., Fielden E.M. Primary free radical processes in DNA. // Adv. Radiat. Biol. 1993. T.17. C.53-120.

128. Paull T.T., Rogakou E.P., Yamazaki V., Kirchgessner C.U., Gellert M., Bonner W.M. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. // Curr Biol. 2000. T. 10. № 15. C. 886-895.

129. Pellegrini L., Yu D.S., Lo T., Anand S., Lee M., Blundell T.L. et al. Insights into DNA recombination from the structure of a RAD51-BRCA2 complex. // Nature. 2002. T. 420. C. 287-93.

130. Petersen S., Casellas R., Reina-San-Martin B., Chen H.T., Difil- ippan-tonio M.J., Wilson P.C., Hanitsch L., Celeste A., Muramatsu M., Pilch D.R., Redon C., Ried T., Bonner W.M., Honjo T., Nussenzweig M.C., Nus-senzweig A. AID is required to initiate Nbs1/gamma-H2AX focus formation and mutations at sites of class switching. // Nature. 2001. T. 414. C. 660-665.

131. Pham D.L., Xu Ch., Prince J.L. Current Methods in Medical Image Segmentation. // Annual Review of Biomedical Engineering. 2000. T. 2. C. 315-337.

132. Pielou E. An introduction to Mathematical Ecology. Wiley-Interscience, New York, 1969.

133. Polo S.E., Jackson S.P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. // Genes Dev. 2011. T. 25. C. 409-433.

134. Ponomarev A.L., George K., Cucinotta F.A. Computational model of chromosome aberration yield induced by high- and low-LET radiation exposures. // Radiat Res. 2012. T. 177. C. 727-37.

135. Ponomarev A.L., George K., Cucinotta F.A. Generalized time-dependent model of radiation-induced chromosomal aberrations in normal and repair-deficient human cells. // Radiat Res. 2014. T. 181. № 3. C. 284-92.

136. Radford I.R. Effect of cell-cycle position and dose on the kinetics of DNA double-strand breakage repair in X-irradiated Chinese hamster cells. // Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 1987.T. 52. № 4. C. 555-64.

137. Redon C., Pilch D., Rogakou E., Sedelnikova O., Newrock K., Bonner W. Histone H2Avariants H2AX and H2AZ. // Curr Opin Genet Dev. 2002. T. 12. № 2. C. 162-169.

138. Reina-San-Martin B,, Difilippantonio S., Hanitsch L., Masilamani R.F., Nussenzweig A., Nussenzweig M.C. H2AX is required for recombination between immunoglobulin switch regions but not for intra-switch region recombination or somatic hypermutation. // J. Exp. Med. 2003. T. 197. C. 17671778.

139. Riballo E.1., Kühne M., Rief N., Doherty A., Smith G.C., Recio M.J., Reis C., Dahm K., Fricke A., Krempler A., Parker A.R., Jackson S.P., Gen-nery A., Jeggo P.A., Löbrich M. A pathway of double-strand break rejoining dependent upon ATM, Artemis, and proteins locating to gamma-H2AX foci. // Mol Cell. 2004.T. 16. № 5. C. 715-24.

140. Robert T1., Vanoli F., Chiolo I., Shubassi G., Bernstein K.A., Rothstein R., Botrugno O.A., Parazzoli D., Oldani A., Minucci S., Foiani M. HDACs link the DNA damage response, processing of double-strand breaks and autophagy. Nature. 2011. T. 471. № 7336 C.74-9.

141. Rodriguez-Rocha H., Garcia-Garcia A., Panayiotidis M., Franco R. DNA damage and autophagy. // Mutat. Res. 2011. T.711. № 1-2. C.158-166.

142. Rogakou E.P., Boon C., Redon C., Bonner W.M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. // J Cell Biol. 1999. T. 146. C. 905-16.

143. Rogakou E.P., Pilch D.R., Orr A.H., Ivanova V.S., Bonner W.M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. // J Biol Chem. 1998. T. 273. № 10. C. 5858-5868.

144. Rothkamm K., Löbrich M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2003. T. 100. C. 5057-5062.

145. Runge R., Hiemann R., Wendisch M., Kasten-Pisula U., Storch K., Zoephel K., Fritz C., Roggenbuck D., Wunderlich G., Conrad K., Kotzerke J.. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced yH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES // Int J of Radiat Biol. 2012. T. 88. C. 439-447.

146. Sachs R.K., Hahnfeld P., Brenner D.J. The link between low-LET dose-response relations and the underlying kinetics of damage produc-tion/repair/misrepair // Int. J. Radiat. Biol. 1997. T. 72. № 4. C. 351-374.

147. Sakasai R., Teraoka H., Takagi M., Tibbetts R.S. Transcription-dependent activation of ataxia telangiectasia mutated prevents DNA-dependent protein kinase-mediated cell death in response to topoisomerase I poison. // J. Biol. Chem. 2010. T.285. №20. C. 15201-15208.

148. Sasaki M.S1., Takata M., Sonoda E., Tachibana A., Takeda S. Recombination repair pathway in the maintenance of chromosomal integrity against DNA interstrand crosslinks. // Cytogenet Genome Res. 2004. T. 104. № 1-4. C. 28-34.

149. Sedelnikova O.A., Pilch D.R., Redon C., Bonner W.M. Histone H2AX in DNA damage and repair. // Cancer Biol Ther. 2003. T.2. №3. C.233- 235.

150. Sedelnikova O.A., Rogakou E.P., Panyutin I.G., Bonner W.M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. // Radiat Res. 2002. T.4. C. 486-492.

151. Shapiro R. Damage to DNA caused by hydrolysis. // Chromosome damage and repair. 1982. T.40. C. 3-18.

152. Sharma, A., Singh, K., Almasan, A. Histone H2AX phosphorylation: A marker for DNA damage. // Methods Mol. Biol. 2012. T. 920. C. 613-626.

153. Shrivastav M., De Haro L.P., Nickoloff J.A. Regulation of DNA doublestrand break repair pathway choice. // Cell Res. 2008. T.18. № 1. C. 134147.

154. Sigurdsson S., Stephen V.K., Petukhova G., Sung P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. // J. Biol. Chem. 2002. T. 277. № 45. C. 42790-4.

155. Siino J.S., Nazarov I.B., Svetlova M.P., Solovjeva L.V., Adamson R.H., Zalenskaya I.A., Yau P.M., Bradbury E.M., Tomilin N.V. Photobleaching of GFP-labeled H2AX in chromatin: H2AX has low diffusional mobility in the nucleus. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. T. 297. C. 1318-1323.

156. Singer B., Kusmierek J.T. Chemical mutagenesis. // Ann Rev Biochem. 1982. T.51. C. 655-93.

157. Solovjeva L.V., Pleskach N.M., Firsanov D.V., Svetlova M.P., Serikov V.B., Tomilin N.V. Forskolin decreases phosphorylation of histone H2AX in human cells induced by ionizing radiation. // Radiat Res. 2009. T.171. № 4. C. 419-424.

158. Stanescu R.S., Bordeianu G., Stoica B., Ungureanu D., Rusu M., Petrescu-Danila E. Rad51 overexpression and resistance to genotoxic agents.

A study in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. // Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2014. T.118. № 1. C. 133-40.

159. Stephan H., Concannon C., Kremmer E., Carty M.P., Nasheuer H.P. Ionizing radiation-dependent and independent phosphorylation of the 32-kDa subunit of replication protein A during mitosis. // Nucleic Acids Res. 2009. T.37. №18. 6028-6041.

160. Stewart R.D. Two-lesion kinetic model of double-strand break rejoining and cell killing. // Radiat. Res. 2001. T. 156. № 4. C. 365-78.

161. Stiff, T., O'Driscoll, M., Rief, N., Iwabuchi, K., Lobrich, M., Jeggo P.A. ATM and DNA-PK function redundantly to phosphorylate H2AX after exposure to ionizing radiation. // Cancer Res. 2004. T.64. №7. C.2390-2396.

162. Strozyk E., Kulms D. The role of AKT/mTOR pathway in stress response to UV-irradiation: implication in skin carcinogenesis by regulation of apoptosis, autophagy and senescence. // Int J Mol Sci. 2013. T.14. №8. C.15260-15285.

163. Svetlova M., Solovjeva L., Nishi K., Nazarov I., Siino J., Tomilin N. Elimination of radiation-induced gamma-H2AX foci in mammalian nucleus can occur by histone exchange. // Biochem Biophys Res Commun. 2007. T.358. № 2. C.650-654.

164. Swedlow J.R. Quantitative fluorescence microscopy and image deconvo-lution. // Methods in cell biology. 2013. T. 114. C. 407-426.

165. Symington L.S., Gautier J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. // Ann Rev Genet. 2011. T.45. C. 247-271.

166. Taccioli G.E., Amatucci A.G., Beamish H.J. et al. Targeted disruption of the catalytic subunit of the DNA-PK gene in mice confers severe combined immunodeficiency and radiosensitivity. // Immunity. 1998. T.9. C. 355-66.

167. Takata M., Sasaki M., Sonoda E., Morrison C., Hashimoto M., Utsumi H., Yamaguchi-Iwai Y., Shinohara A., Takeda S. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. // EMBO J. 1998. T.17. № 18. C. 5497-508.

168. Taleei R., Weinfeld M., Nikjoo H. A kinetic model of single-strand annealing for the repair of DNA double-strand breaks. // Radiat. Prot. Dosimetry. 2011. T. 143. № 2-4. C. 191-5.

169. Taleei R., Nikjoo H. Biochemical DSB-repair model for mammalian cells in G1 and early S phases of the cell cycle. // Mutat. Res. 2013a. C. 1-7.

170. Taleei R., Nikjoo H. The non-homologous end-joining (NHEJ) pathway for the repair of DNA double-strand breaks: I. A mathematical model. // Radiat. Res. 2013b. T. 179. № 5. C. 530-9.

171. Thames H. D. An vincomplete-repair' model for survival after fractionated and continuous irradiations. // Int J of Radiat Biol. 1985. T.47. C. 319 -339.

172. Tobias C. The repair-misrepair model in radiobiology: comparison to other models. // Radiat Res Suppl. 1985. T.8. C. 77-95.

173. Teoule R. Radiation-induced DNA Damage and Its Repair. // Int J of Radiat Biol. 1987. T.51, №4 , C.573-589.

174. Vilenchik M., Knudson A. Jr. Inverse radiation dose-rate effects on somatic and germ-line mutations and DNA damage rates. // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. T.97. C. 5381-6.

175. Ward J. DNA damage produced by ionizing radiation in mammalian cells: identities, mechanisms of formation, and reparability. // Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1988. T.35. C. 95-125.

176. West M.H., Bonner W.M. Histone 2A, a heteromorphous family of eight protein species. // Biochemistry. 1980. T.19. C. 3238-3245.

177. Wiesmann V., Franz D., Held C., Munzenmayer C., Palmisano R., Wittenberg T. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. // J Microsc. 2014. T. 257. № 1. C. 39-53.

178. Wojewodzka M., Buraczewska I., Kruszewski M. A modified neutral comet assay: Elimination of lysis at high temperature and validation of the assay with anti-single-stranded DNA antibody. // Mutat. Res. 2002. T. 518. C. 9-20.

179. Wu R.S., Panusz H.T., Hatch C.L., Bonner W.M. Histones and their modifications. // CRC Crit. Rev. Biochem. 1986. T. 20. C. 201-263.

180. Wyman, C., Kanaar R. DNA double strand break repair: all's well that ends well. // Ann. Rev. Genet. 2006. T.40. C.363-383.

181. Xie A., Hartlerode A., Stucki M., Odate S., Puget N., Kwok A., Naga-raju G., Yan C., Alt F., Chen J., Jackson S., Scully R. Distinct roles of chro-matin-associated proteins MDC1 and 53BP1 in mammalian double-strand break repair. // Mol Cell. 2007. T.28. № 6. C. 1045-1057.

182. Yan C., Lu J., Zhang G., Gan T., Zeng Q., Shao Zh., Duerksen-Hughes PJ., Yang J. Benzo[a]pyrene induces complex H2AX phosphorylation pat-

terns by multiple kinases including ATM, ATR, and DNA-PK. // Toxicol In Vitro. 2002. T.25. № 1. C. 91-99.

183. Yan T1., Seo Y., Kinsella TJ. Differential cellular responses to prolonged LDR-IR in MLH1-proficient and MLH1-deficient colorectal cancer HCT116 cells. // Clin Cancer Res. 2009. T.15. № 22. C. 6912-20.

184. Yoshida M., Hosoi Y., Miyachi H., Ishii N., Matsumoto Y., Ono T. et al. Roles of DNA-dependent protein kinase and ATM in cell-cycle-dependent radiation sensitivity in human cells. // Int J Radiat Biol. 2002. T.78. C. 503512.

185. Yuan J., Chen J. MRE11-RAD50-NBS1 complex dictates DNA repair independent of H2AX. // J Biol Chem. 2010. T.285. №2. C. 1097-1104.

БЛАГОДАРНОСТИ

Хочу выразить благодарность за ценные советы и помощь в работе над диссертацией своим научным руководителям, а также коллективам лаборатории радиационной биофизики ФМБЦ им. А.И.Бурназяна и кафедры биофизики биологического факультета МГУ. Кроме того, хочу выразить признательность Максимовой О.А. за помощь в облучении клеток и планировании экспериментов и Армееву Г.А. за активное участие в создании программного пакета для анализа флуоресценции клеток. Также хочу поблагодарить студентов кафедры биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Цветкову А.Д. и Гусеву С.С. за хорошее настроение и проявленный к моей работе интерес.

Отдельной благодарности заслуживают мои родственники и друзья за проявленные ими терпение и поддержку. Без их участия выполнение данной работы было бы невозможным.