Митоген-активируемые протеинкиназы в реализации респираторного ответа гранулоцитов, инициированного через рецепторы формилированных пептидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Филина Юлия Викторовна

• Филина Юлия Викторовна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Филина Юлия Викторовна

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Гранулоциты

1.1.1 Роль гранулоцитов в реализации врожденного иммунного ответа

1.1.2 Нарушения функций гранулоцитов

1.2 Респираторный взрыв

1.2.1 Структура НАДФН-оксидазного комплекса

1.2.1.1 Мембранные компоненты

1.2.1.2 Цитозольные компоненты

1.2.2 Механизмы активации НАДФН-оксидазы

1.2.2.1 Фосфорилирование субъединиц

1.2.2.2 Активация малых ГТФаз

1.2.2.3 Активация липидами

1.3 Рецепторы формилированных пептидов

1.3.1 БРЯ человека и мыши

1.3.2 Строение и свойства рецепторов формилированных пептидов

1.3.3 Передача сигнала от БРЯ к НАДФН-оксидазе

1.3.3.1 Фосфолипазы и протеинкиназа С

1.3.3.2 Фосфоинозитол-3-киназы

1.3.3.3 Mитоген-активируемые протеинкиназы

1.4 Заключение по обзору литературы

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Реагенты

2.2 Растворы

2.3 Методы

2.3.1 Выделение клеток

2.3.2 Оценка продукции АФК

2.3.3 Стимуляция клеток

2.3.4 Исследование эффекта ингибиторов и антагонистов

2.3.5 Фенотипирование клеток и исследование локализации внутриклеточных белков

2.3.6 Измерение уровня фосфорилирования МАРК

2.3.7 Статистическая обработка результатов

3 РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Респираторный взрыв, вызванный агонистами рецепторов формилированных пептидов в гранулоцитах мыши

3.1.1 Анализ способности агонистов рецепторов формилированных пептидов активировать респираторный взрыв гранулоцитов мыши

3.1.2 Вклад рецепторов mFPR1 и mFPR2 в респираторный взрыв гранулоцитов мыши в ответ на агонисты FPR

3.2 Вклад PI3K и PLC/PKC в респираторный ответ гранулоцитов мыши

3.2.1 Влияние ингибитора PI3K на респираторный взрыв гранулоцитов мыши

3.2.2 Влияние ингибиторов PLC и PKC на респираторный взрыв гранулоцитов мыши

3.3 Вклад митоген-активируемых протеинкиназ p38, ERK и JNK в респираторный ответ гранулоцитов мыши

3.3.1 Влияние ингибиторов MAPK на респираторный взрыв гранулоцитов

3.3.2 Фосфорилирование p38, ERK и JNK при развитии респираторного взрыва, вызванного агонистами рецепторов формилпептидов

3.3.2.1 Фосфорилирование ERK при стимуляции клеток провоспалительным и противовоспалительным агонистом FPR2

3.3.3 Взаимодействие ERK c субъединицами НАДФН-оксидазы pMphox и p67phox при стимуляции гранулоцитов мыши агонистами mFPR1 и mFPR2

74

3.4 Регуляция активности митоген-активируемых протеинкиназ, вызванной агонистами рецепторов формилированных пептидов

3.4.1 Роль РКС и Р13К в регуляции фосфорилирования МАРК

3.4.2 Роль фосфатазы БШРб в регуляции фосфорилирования БЯК и респираторного взрыва гранулоцитов

3.4.3 Роль АФК в регуляции фосфорилирования ЕЯК, вызванного стимуляцией mFPR2

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А

Тестирование ингибиторов в бесклеточной системе генерации АФК

ксантиноксидазой

ПРИЛОЖЕНИЕ Б

Выделение и фенотипическая характеристика изолированных гранулоцитов костного мозга мыши

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Митоген-активируемые протеинкиназы в реализации респираторного ответа гранулоцитов, инициированного через рецепторы формилированных пептидов»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Оксидазная активность клеток врожденной иммунной системы наряду с фагоцитозом и секреторной дегрануляцией обеспечивает противомикробную защиту организма. Неспособность фагоцитов к продукции активных форм кислорода (АФК), вызванная различными нарушениями в структуре НАДФН-оксидазного комплекса - причина развития хронической грануломатозной болезни (ХГБ), при которой организм подвержен частым повторяющимся бактериальным и грибковым инфекциям [Okura et al., 2015]. В то же время излишняя продукция АФК и/или сниженная антиоксидантная активность оказывает нейротоксичное и кардиотоксичное действие, способствуя развитию нейродегенеративных заболеваний, например, болезни Паркинсона и Альцгеймера и осложнений при инфаркте миокарда [Takaishi et al., 2021, Johnson et al., 2022]. Накопление АФК и их продуктов при хроническом воспалении разрушает ткани за счет реализации цитотоксических функций в чрезмерном объеме или без необходимости и может служить пусковым механизмом тяжелых воспалительных и аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка, ревматоидный артрит и сахарный диабет [Elumalai et al., 2021, Vermot et al., 2021]. Таким образом, защитная функция АФК в условиях излишней продукции превращается в мощный повреждающий фактор.

Гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы) являются основными продуцентами АФК в организме. В норме во время циркуляции по сосудам и при движении в очаг воспаления эти клетки синтезируют очень мало радикалов кислорода. В очаге воспаления, где концентрация воспалительных агентов максимальна, гранулоциты прикрепляются (иммобилизуются) и начинают вырабатывать АФК и высвобождать гидролизирующие ферменты. В зависимости от содержания в крови про- и противовоспалительных факторов, степень активации гранулоцитов в очаге воспаления может

варьировать. Функциональное состояние клеток регулируется как за счет связывания поверхностных рецепторов с различными лигандами, так и за счет активации регуляторных сигнальных путей с одного типа рецепторов [Liew et al., 2019].

Респираторный взрыв - быстрое массированное высвобождение активных форм кислорода - запускается преимущественно в результате активации рецепторов, сцепленных с G-белками [Mafi et al., 2022, Paclet et al., 2022]. Мембранные рецепторы FPR (англ. Formyl Peptide Receptors) отвечают за распознавание формилированных пептидов, которые образуются при деградации белков бактерий и митохондрий и, в зависимости от концентрации агониста, запускают хемотаксис, дегрануляцию или респираторный взрыв [Zhuang et al., 2022, Qin et al., 2022].

У человека обнаружено три типа рецепторов FPR: FPR1, FPR2, FPR3, клетки мыши экспрессируют ортологичные рецепторы mFPR1, mFPR2, mFPR3 [Winther et al., 2018, Zhuang et al., 2022]. Рецепторы семейства FPR имеют высокую степень гомологии, наиболее сильные отличия обнаружены в структуре экстраклеточного домена, отвечающего за распознавание лигандов [Dahlgren et al., 2016]. На сегодняшний день наиболее полно изучены структура, лиганды и функции FPR1, классического хемотаксического рецептора, обладающего высокой аффинностью к формилированным пептидам. Тем не менее, особый интерес представляет не FPR1, а FPR2 -рецептор, который распознает широкий спектр биологических лигандов и может активировать как воспалительные, так и противовоспалительные процессы. Взаимодействие FPR2 с хемотаксическими пептидами приводит к провоспалительному ответу, тогда как липидный медиатор липоксин А4 (LXA4) и аннексин A1 запускают противовоспалительный сигнал [Zhuang et al., 2022]. Благодаря своей двойственной природе FPR2 рассматриваются как потенциальные терапевтические мишени при сердечно-сосудистых заболеваниях [Garcia et al., 2019], нервно-психических расстройствах и заболеваниях ЦНС [Tylek et al., 2021, Gallo et al., 2014, Peritore et al., 2020],

вирусных инфекциях [Alessi et al., 2017, Schloer et al., 2019], астме [Ash et al., 2020], диабете [Maciuszek et al., 2021] и других патологиях.

Несмотря на интерес к фармакологическому применению лигандов и модуляторов FPR2, сигнальный путь рецептора мало изучен и чаще всего рассматривается как аналогичный FPR1 и другим Отцепленным рецепторам: свободные субъединицы гетеротримерного G-белка активируют фосфолипазу С (PLC) и фосфоинозитол-3-киназу (PI3K), которые катализируют образование сигнальных липидов, активирующих НАДФН-оксидазу напрямую и посредством протеинкиназы C (PKC). В то же время показано, что рецепторы FPR1 и FPR2 могут использовать разные ансамбли компонентов сигнальных путей для активации НАДФН-оксидазы и реализации других функций клетки: обнаружены различия во взаимодействии с белками цитоскелета, кальциевой сигнализации, чувствительности к ингибиторам Ga разных классов и других сигнальных компонентов [Southgate et al., 2012], однако до сих пор четко не определены сигнальные системы, вовлеченные в рецептор-зависимую продукцию АФК и регуляцию оксидазной активности при активации FPR1 и FPR2.

Известно, что FPR могут активировать серин/треониновые киназы MAPK (англ. mitogen-activated protein kinases, митоген-активируемые протеинкиназы), которые способны фосфорилировать субъединицы НАДФН-оксидазы [Broggi et al., 2017], но не совсем ясно, насколько необходима и как происходит активация МАРК при респираторном взрыве, опосредованном FPR. Считается, что MAPK усиливают активацию НАДФН-оксидазы и участвуют в праймировании ответа [Lee et al., 2020]. В то же время показано, что ингибирование митоген-активируемых протеинкиназ p38 и ERK значительно подавляет функциональные ответы клеток, вызванные агонистами FPR [Chedid et al., 2017, Chniguir et al., 2019]. Таким образом, остаётся неясным, какие именно МАР киназы, активируются через FPR разных типов и участвуют в реализации респираторного взрыва, а также механизмы регуляции активности MAPK в нормальных иммунных клетках.

Цели и задачи исследования

Целью работы была характеристика функции митоген-активируемых протеинкиназ в респираторном взрыве гранулоцитов, вызванном активацией рецепторов формилпептидов.

В работе решались следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ способности агонистов рецепторов формилированных пептидов активировать респираторный взрыв в гранулоцитах костного мозга мыши;

2. Оценить вклад фосфолипазы С, протеинкиназы С, фосфоинозитол-3-киназы в респираторный взрыв, вызванный агонистами рецепторов формилпептидов в гранулоцитах мыши;

3. Оценить вклад митоген-активируемых протеинкиназ р38, ЕЯК и JNK в респираторный взрыв, вызванный агонистами рецепторов формилпептидов в гранулоцитах мыши;

4. Изучить кинетику активации протеинкиназ р38, ЕЯК и JNK, вызванной агонистами рецепторов формилпептидов в гранулоцитах мыши;

5. Оценить взаимодействие между митоген-активируемыми протеинкиназами ЕЯК и субъединицами НАДФН-оксидазы p47phox и p67phox при инициации респираторного взрыва гранулоцитов мыши, вызванного агонистами рецепторов формилпептидов;

6. Определить возможные механизмы регуляции активности митоген-активируемых протеинкиназ р38 и ERK, вызванной агонистами рецепторов формилированных пептидов.

Научная новизна работы

Определен вклад рецепторов тБРЯЛ и тРРЯ2 в респираторный взрыв в гранулоцитах костного мозга мыши, активированный пептидными и синтетическими агонистами WKYMVM, ТС-БРЯ43. Впервые

исследована кинетика кратковременного фосфорилирования протеинкиназ р38, ERK и JNK и ее связь с кинетикой активации НАДФН-оксидазы при стимуляции гранулоцитов агонистами рецепторов тБРЯЛ и тРРЯ2. Показано,

что JNK не вовлечена в передачу сигнала mFPR2, а р38 и ЕЯК активируются и участвуют в поддержании активности НАДФН-оксидазы, вызванной WKYMVM, пептидным агонистом mFPR2. В результате исследования механизмов активации ЕЯК и р38 при стимуляции mFPR2 впервые показано, что фосфорилирование ЕЯК происходит с участием нескольких сигнальных путей, зависящих от активности Р13К, РКС, а также АФК как вторичного регулятора активации ЕЯК. Выявлено, что активация р38 при передаче сигнала шРРЯ2 не зависит от РКС и Р13К.

Методология исследования

Для решения поставленных задач применяли биохимические и биофизические методы и подходы, а также методы клеточной биологии. Выделение клеток проводили методом центрифугирования в градиенте плотности. Для фенотипической характеристики изолированных клеток, а также для анализа локализации внутриклеточных белков использовали иммунофлуоресцентное окрашивание с последующей детекцией сигнала методами лазерной конфокальной/флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии. Анализ респираторного взрыва изолированных гранулоцитов проводили методом люминол-зависимой хемилюминесценции. Для оценки активации МАРК применяли ИФА и иммуноблот с окрашиванием антителами против фосфорилированных форм р38, БЯК и ЖК. Вклад рецепторов шБРКЛ и шБРК2 и компонентов сигнальных путей в респираторный взрыв и активацию МАРК оценивали при помощи фармакологического подхода с использованием набора агонистов, антагонистов и ингибиторов исследуемых сигнальных путей.

Достоверность результатов

Представленные результаты получены при помощи современных экспериментальных подходов и проанализированы с использованием соответствующих статистических методов. Результаты являются воспроизводимыми, опубликованы в Российских и международных журналах,

индексируемых WoS, Scopus и РИНЦ и представлены на научных конференциях и семинарах.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Респираторный взрыв гранулоцитов мыши, вызванный стимуляцией рецепторов формилпептидов, зависит от активности фосфоинозитол-3-киназы, фосфолипазы С, протеинкиназы С и митоген-активируемых протеинкиназ.

2. Митоген-активируемая протеинкиназа ERK участвует в поддержании активного состояния НАДФН-оксидазы при респираторном взрыве, вызванном стимуляцией mFPR2.

3. Активация ERK, вызванная агонистом mFPR2 WKYMVM, регулируется при помощи фосфоинозитол-3-киназы, протеинкиназы С, фосфатазы DUSP6 и зависит от продукции активных форм кислорода.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты работы демонстрируют роль митоген-активируемых протеинкиназ в регуляции респираторного взрыва гранулоцитов и указывают на различный вклад MAPK в передачу сигнала от рецепторов mFPRl и mFPR2 к НАДФН-оксидазе, что имеет теоретическую значимость для формирования представлений о регуляции ее активности. Разработанный подход к дифференцированной стимуляции рецепторов формилированных пептидов двух типов, mFPRl и mFPR2 может быть использован в практике фармакологического поиска терапевтических агентов, направленных на регуляцию респираторного взрыва и других опосредованных рецепторами FPR функций нативных иммунных клеток. Выявленные механизмы регуляции активности митоген-активируемых протеинкиназ в клетках врожденного иммунитета могут быть использованы для разработки методов коррекции патологических состояний: воспаления и окислительного стресса.

Место выполнения работы и личный вклад диссертанта

Работа выполнена в НИЛ OpenLab Генные и клеточные технологии ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» и

лаборатории Клеточной нейробиологии ИБК РАН ФИЦ ПНЦБИ РАН (г. Пущино). Экспериментальные данные получены непосредственно автором, автором проведена первичная и статистическая обработка полученных данных, планирование и обсуждение результатов проводилось совместно с научным руководителем и соавторами публикаций.

Связь работы с базовыми научными программами

Работа поддержана грантами РФФИ 12-04-31803 RhoA в активации MAPK при стимуляции высоко- и низкоаффинных рецепторов формилированных пептидов (руководитель), 13-04-90855 Роль белков Rho в хемотаксисе нейтрофилов при аутоиммунном воспалении (руководитель), 1934-90144 Роль протеиновых фосфатаз DUSP в регуляции респираторного ответа гранулоцитов (исполнитель), а также субсидией, выделенной в рамках Программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета.

Апробация результатов

Материалы диссертационного исследования были представлены в форме устных и стендовых докладов на Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, Россия, 2010, 2011, 2012, 2019), 1 -й Международной научно-технической конференции «Компьютерная биология - от фундаментальной науки к биотехнологии и биомедицине» (Пущино, Россия, 2011), 56th Annual Meeting of the Biophysical Society (Сан-Диего, США, 2012), 2-ой Всероссийской школе-конференции молодых ученых Биохимия -основа наук о жизни (Казань, Россия, 2019), Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, Россия, 2011, 2021).

Публикация результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 5 статей в научных журналах, индексируемых в базах данных Scopus и Web of Science и РИНЦ, и 12 тезисов докладов на международных и российских научных и научно-практических конференциях.

Структура и объем диссертационной работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы и двух приложений. Текст изложен на 127 страницах и содержит 31 рисунок (включая 2 в Приложениях) и 3 таблицы; список литературы включает 165 библиографических источников.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Гранулоциты

1.1.1 Роль гранулоцитов в реализации врожденного иммунного ответа

Первая линия защиты организма от разнообразных инфекционных агентов обеспечивается барьерными механизмами кожи и слизистых и клетками врожденной иммунной системы. Клетки врожденной иммунной системы представлены широким спектром миелоидных, лимфоидных и эпителиальных клеток, которые, в отличие от клеток адаптивной иммунной системы, лишены соматически рекомбинированных рецепторов и иммунологической памяти [Gasteiger et в1., 2017]. Они играют решающую роль в инициации и последующем направлении адаптивной иммунной реакции, а также участвуют в удалении патогенов при реализации адаптивного иммунного ответа. Более того, врожденный иммунный ответ полностью отвечает за борьбу с инфекциями в течение первых 4-7 дней после инфицирования - это время необходимо для развертывания адаптивного иммунного ответа [Liew et б1., 2019].

Гранулоциты, макрофаги и дендритные клетки относятся к группе фагоцитов - клеток, способных к хемотаксису, захвату инфекционных агентов, их перевариванию внутри фаголизосом и продукции цитотоксических факторов. Гранулоциты - нейтрофилы, эозинофилы и базофилы - представляют первую, наиболее реактивную, линию защиты организма от микробных инфекций. Они обладают набором свойств, обеспечивающих выполнение защитных функций: способностью к миграции и адгезии, реализации бактерицидных механизмов (фагоцитоз, дегрануляция, продукция цитотоксических веществ), синтезу цитокинов и апоптозу в очаге воспаления. Цитотоксическая функция гранулоцитов не ограничивается микробами, они также участвуют в уничтожении поврежденных и трансформированных клеток [Raabe et б1., 2019].

Гранулоциты и их предшественники составляют около 60% всех ядерных клеток в костном мозге и кровотоке, 50-70% всех лейкоцитов в крови человека составляют нейтрофилы [Takizawa et al., 2022]. Нейтрофилы -полиморфноядерные клетки с зернистой нейтрально окрашивающейся цитоплазмой. Зрелые нейтрофилы в крови человека живут около 24 часов и синтетически малоактивны. В процессе жизнедеятельности наблюдается два пика синтетической активности: при созревании в костном мозге формируются гранулы, содержащие основные цитотоксические компоненты, а при выходе из кровотока и миграции в ткани синтезируются цитокины, хемокины и другие белки и пептиды, участвующие в реализации иммунного ответа. Некоторые рецепторы и белки экспрессируются на клеточной мембране при созревании, другие находятся на мембранах везикул и транспортируются к поверхности клетки в ответ на стимул [Buzas, 2022].

При получении сигнала о наличии патогена гранулоциты начинают движение из кровеносного русла в ткани. Сигналом служат разнообразные хемоаттрактанты, микробные или продуцируемые другими клетками [Долгушин и др., 2019]. Активация нейтрофилов при распознавании хемотаксического стимула включает несколько этапов: адгезия на клетках эндотелия (захват), перекатывание по поверхности сосуда, замедление перекатывания, остановка (арест, заякоривание) и трансмиграция (рисунок 1). В очаге воспаления нейтрофилы используют набор микробицидных средств для уничтожения инфекционных агентов. К кислород-зависимым микробицидным средствам относятся АФК, кислород-независимые механизмы включают дегрануляцию и высвобождение литических ферментов и бактерицидных пептидов [Dinauer, 2020]. Помимо фагоцитоза, продукции АФК и дегрануляции, крайне активированные нейтрофилы способны выбрасывать сеть из нитей ДНК с протеазами и антибактериальными молекулами, так называемые нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ, англ. neutrophil extracellular traps, NET) [Порембская и др., 2021].

Рисунок 1 - Активация нейтрофила (по [Kruger et а1., 2015] с изменениями): захват - связывание селектина нейтрофила с рецептором селектина клеток эндотелия; перекатывание и медленное перекатывание - связывание интегринов нейтрофила с рецепторами интегринов клеток эндотелия (белками адгезии LFA-1 и 1САМ-1) и рецепторами хемоаттрактантов (СХСЬ1 и CXCR2); арест (заякоривание) - остановка движения; миграция (трансмиграция) через клетки эндотелия в очаг воспаления

Ранее гранулоциты рассматривались как клетки, которые высвобождают антимикробные агенты в очаге воспаления, пока более специализированные клетки не прибудут туда и не запустят эффективную атаку на патогены. Однако современные исследования доказывают, что функции нейтрофилов гораздо сложнее. Они играют важную роль в развитии заболеваний, популяция нейтрофилов гетерогенна фенотипически и функционально [Dinauer, 2020]. Показано, что нейтрофилы участвуют в запуске, регуляции и прекращении воспалительных реакций, вовлечены в заживление ран и поддержание гомеостаза тканей, регуляции функций других иммунных клеток и способны к презентации антигена [Wang, 2018].

1.1.2 Нарушения функций гранулоцитов

Врожденные нарушения функций нейтрофилов являются причиной около 20 % первичных иммунодефицитных состояний, которые сопровождаются частыми рецидивирующими инфекциями, трудно

поддающимися лечению. Описаны следующие дефекты клеточных функций нейтрофилов:

1) нарушения процессов адгезии и хемотаксиса: дефицит адгезии лейкоцитов I, II и III типа, мутации Rac2;

2) расстройства процессов поглощения и дегрануляции: синдром Чедиака-Хигаси, дефицит специфических гранул;

3) расстройства метаболизма: хроническая грануломатозная болезнь, дефицит миелопероксидазы, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [Dinauer, 2020].

Хроническая грануломатозная болезнь (ХГБ; англ. chronic granulomatous disease, CGD) - врожденное заболевание, для которого характерна неспособность фагоцитов к продукции АФК и фагоцитозу, вызванная нарушениями в структуре НАДФН-оксидазного комплекса. Вследствие недостаточной функции фагоцитов организм подвержен частым повторяющимся бактериальным и грибковым инфекциям; болезнь сопровождается гнойным поражением лимфоузлов и развитием множественных гранулом, имеет генетический характер и встречается с частотой около 1:200 000 [Okura et al., 2015]. Чаще всего наблюдаются нарушения в гене CYBB, кодирующем субъединицу gp91phox (70 %), и аутосомно-рецессивные мутации в гене NCF1, кодирующем субъединицу p47phox (25-30 %). До 10 % случаев болезни связано с дефектами генов CYBA (p22phox) и NCF2 (p67phox), также известно несколько вариантов ХГБ, ассоциированных с нарушениями в структуре гена NCF4, кодирующего p40phox [van de Geer et al., 2018, Dinauer, 2020].

При излишней продукции АФК превращается в мощный повреждающий фактор, провоцирующий развитие различных заболеваний и их осложнений [Krishna et al., 2021]. Гидроксил-радикал способен запускать процесс перекисного окисления липидов, что приводит к разрушению липидных компонентов клетки, в первую очередь, мембраны. И гидроксил-радикал, и

синглетный кислород могут взаимодействовать с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот, повреждая ДНК [Бпшуав et а!., 2019].

1.2 Респираторный взрыв

Респираторный взрыв (респираторный ответ, дыхательный взрыв) гранулоцитов - быстрое потребление кислорода с образованием супероксидного радикала [Впй et а!., 2022]. Супероксид-анион-радикал Ю2-, продукт фермента НАДФН-оксидазы - первое звено образования синглетного кислорода 102, гидроксил-радикала ОН и окисленных галогенов (рисунок 2).

Рисунок 2 - Продукция и утилизация активных форм кислорода (по [Nguyen

et al., 2017] c изменениями): НАДФН-оксидаза катализирует образование супероксид-анион-радикала, который превращается в пероксид водорода при помощи супероксиддисмутазы, и гидроксил-радикал в реакции Фентона; пероксид водорода используется в реакции образования гипохлорита, катализируемой миелопероксидазой

•O2- может использоваться для производства оксида азота, которое катализируется NO-синтазой. Миелопероксидаза катализирует образование галогенизированных производных, например, гипохлорита, из АФК и ионов галогенов [Zabrodskaya et al., 2022]. В кислой среде значительная часть Ю2-превращается в пероксид водорода, при нейтральном pH спонтанная реакция дисмутации идет значительно медленнее, но может катализироваться металлосодержащим ферментом супероксиддисмутазой [Winterbourn et al., 2013] (рисунок 2). Фермент каталаза катализирует превращение пероксида водорода в воду, а глутатионпероксидаза - окисление пероксидом водорода глутатиона.

Наличие в клетках немитохондриального биохимического пути образования супероксида известно с первой половины XX века. Показано, что активированная НАДФН-оксидаза присоединяет электрон НАДФН к кислороду с образованием супероксид-аниона согласно уравнению реакции: 2Ü2 + НАДФН ^ 2Ю2-,+ НАДФ+ + H+ [Taylor et al., 2021]. Процесс проходит несколько стадий: сначала электрон переносится на ФАД, ассоциированный с цитохромом, затем на гем и на кислород (рисунок 3) [Decoursey et al., 2005].

Рисунок 3 - Продукция АФК НАДФН-оксидазой: 1 - синтез НАДФН, 2 -

связывание НАДФН с gp91phox, 3 - высвобождение НАДФ+; перенос электрона: 4 - к ФАД, 5 - от ФАД к внутреннему гему, 6 - от внутреннего гема к внешнему гему, 7 - от гема к O2; 8 - связывание O2 с gp91phox, 9 -высвобождение Ю2-, 10 - дисмутация Ю2- в H2O2 [Decoursey et al., 2005]

НАДФН-оксидаза обладает наибольшей активностью при нейтральном pH в присутствии ионов Mg2+, для работы также нужны АТФ и ГТФ [Decoursey et al., 2005]. Помимо синтеза АФК в клетке при респираторном взрыве запускается окисление Ci-атома глюкозы до CO2 в реакциях пентозофосфатного пути [Britt et al., 2022]. Пентозофосфатный путь (гексозомонофосфатный шунт) выступает как источник восстановленного НАДФН, который является донором электрона [Brandes et al., 2014, Panday et al., 2015]. Активность шунта, экспрессия потенциал-зависимых протонных каналов и продукция супероксида в эозинофилах значительно выше, чем в

нейтрофилах [Kovacs et al., 2014], но значительное количественное преимущество нейтрофилов (более 70% всех гранулоцитов человека) делает их основными продуцентами АФК в организме.

Респираторный взрыв может происходить в комплексе с фагоцитозом и дегрануляцией или независимо от них [Nguyen et al., 2017]. При добавлении растворимых стимулов, запускающих активацию рецепторных сигнальных путей или напрямую действующих на НАДФН-оксидазу, развитие ответа обычно занимает менее минуты. При стимуляции опсонизированными частицами респираторный взрыв, который сопровождает фагоцитоз, может развиваться в течение 90 минут и более.

1.2.1 Структура НАДФН-оксидазного комплекса

Основная каталитическая субъединица НАДФН-оксидазы, gp91phox, принадлежит к семейству Nox, которое объединяют ферменты (КФ 1.6.99.6), способные переносить электроны от НАДФН через плазматическую мембрану и генерировать супероксид и другие активные формы кислорода. АФК как побочный продукт может синтезироваться при функционировании других ферментов и клеточных систем: митохондрий, пероксисом, цитохрома Р-450, но только для ферментов семейства Nox функция генерации АФК является основной [Vermot et al., 2021].

По структуре большой каталитической субъединицы у человека и других млекопитающих выделяют семь гомологов Nox: Nox 1-5, Duox1 и Duox2. Белки семейства Nox экспрессируются во многих клетках: Nox1, главным образом, в эпителии кишечника, мышцах, ЦНС, Nox3 во внутреннем ухе и эндотелии легких, Nox4 в почках, Nox5 в лимфатических клетках, эндотелии, Duox1/Duox2 в клетках щитовидной железы, эпителии дыхательных путей. Nox2/gp91phox встречается также в ЦНС, эндотелии, мышечных клетках, фибробластах, клетках печени, гемопоэтических стволовых клетках [Begum et al., 2022].

Каталитическая субъединица Nox неактивна в виде несвязанного мономера, для формирования зрелого фермента необходимо взаимодействие с гемом и стабилизация структуры. Noxl, Nox2, Nox3, Nox4 взаимодействуют с p22phox, Nox5 образует гомомультимеры. Активность Noxl, Nox2 и Nox3 также зависит от взаимодействия с цитозольными белками [Brandes et al., 2014]. НАДФН-оксидаза фагоцитов - мультифермент, состоящий из пяти основных субъединиц: p40phox, p47phox, p67phox, p22phox и gp91phox (таблица 1).

Таблица 1 - Субъединицы НАДФН-оксидазы фагоцитов

Субъединица Особенности структуры и функция

gp91phox Р-субъединица цитохрома Ь558, содержит гликопротеин, два гема, ФАД. Каталитический компонент, связывается с НАДФН и р67ркох

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Филина Юлия Викторовна, 2023 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Долгушин, И. И. Нейтрофил как «многофункциональное устройство» иммунной системы / И. И. Долгушин, Е. А. Мезенцева, А. Ю. Савочкина, Е. К. Кузнецова // Инфекция и иммунитет. - 2019. - T. 9, № 1. - C. 9-38.

2. Порембская, О. Нейтрофильные экстрацеллюлярные ловушки: жизнь нейтрофила после смерти / О. Порембская, К. В. Лобастов, В. Н. Кравчук [и др.] // Хирург. - 2021. № 3-4. - C. 25-35.

3. Alessi, M. C. FPR2: A Novel Promising Target for the Treatment of Influenza / M. C. Alessi, N. Cenac, M. Si-Tahar, B. Riteau // Front Microbiol. -2017. - T. 8. - С. 1719.

4. Altenhofer, S. Evolution of NADPH Oxidase Inhibitors: Selectivity and Mechanisms for Target Engagement / S. Altenhofer, K. A. Radermacher, P. W. Kleikers [et al.] // Antioxid Redox Signal. - 2015. - T. 23, № 5. - C. 406-427.

5. Ammendola, R. Pro-Resolving FPR2 Agonists Regulate NADPH Oxidase-Dependent Phosphorylation of HSP27, OSR1, and MARCKS and Activation of the Respective Upstream Kinases / R. Ammendola, M. Parisi, G. Esposito, F. Cattaneo // Antioxidants (Basel). - 2021. - T. 10. - № 1. - С. 134.

6. Ash, S. Y. Estimated Ventricular Size, Asthma Severity, and Exacerbations: The Severe Asthma Research Program III Cohort / S. Y. Ash, G. V. Sanchez-Ferrero, M. L. Schiebler [et al.] // Chest. - 2020. - T. 157, № 2. - C. 258-267.

7. Ashraf, M. A. Biochemistry of Platelet Activating Factor [Электронный ресурс] / M. A. Ashraf, V. Nookala. - Treasure Island (FL): StatPearls Publishing, 2022. - Режим доступа: https: //www. ncbi .nlm. nih. gov/books/NBK557392/.

8. Baek, S. H. Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Met activates mitogen-activated protein kinase via a PI-3 kinase-mediated pathway independent of PKC / S. H. Baek, Y. S. Bae, J. K. Seo [et al.] // Life Sci. - 1999. - T. 65, № 17. - C. 1845-1856.

9. Beaumel, S. Down-regulation of NOX2 activity in phagocytes mediated by ATM-kinase dependent phosphorylation / S. Beaumel, A. Picciocchi, F. Debeurme [et al.] // Free Radic Biol Med. - 2017. - T. 113. - C. 1-15.

10. Begum, R. NADPH oxidase family proteins: signaling dynamics to disease management / R. Begum, S. Thota, A. Abdulkadir [et al.] // Cell Mol Immunol. - 2022. - T. 19, № 6. - C. 660-686.

11. Belambri, S. A. NADPH oxidase activation in neutrophils: Role of the phosphorylation of its subunits / S. A. Belambri, L. Rolas, H. Raad [et al.] // Eur J Clin Invest. - 2018. - T. 48 Suppl 2. - C. e12951.

12. Belambri, S. A. Impaired p47phox phosphorylation in neutrophils from patients with p67phox-deficient chronic granulomatous disease / S. A. Belambri, V. Marzaioli, M. Hurtado-Nedelec [et al.] // Blood. - 2022. - T. 139. - № 16. - C. 2512-2522.

13. Bill, C. A. Phospholipase C / C. A. Bill, C. M. Vines // Adv Exp Med Biol. - 2020. - T. 1131. - C. 215-242.

14. Bokoch, G. M. Current molecular models for NADPH oxidase regulation by Rac GTPase / G. M. Bokoch, B. A. Diebold // Blood. - 2002. - T. 100. - № 8. - C. 2692-2696.

15. Boxio, R. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils / R. Boxio, C. Bossenmeyer-Pourie, N. Steinckwich [et al.] // J Leukoc Biol. - 2004. - T. 75. - № 4. - C. 604-611.

16. Brandenburg, L. O. Role of phospholipase d in g-protein coupled receptor function / L. O. Brandenburg, T. Pufe, T. Koch // Membranes (Basel). -2014. - T. 4. - № 3. - C. 302-18.

17. Brandes, R. P. Nox family NADPH oxidases: Molecular mechanisms of activation / R. P. Brandes, N. Weissmann, K. Schroder // Free Radic Biol Med. -2014. - T. 76. - C. 208-26.

18. Brechard, S. New insights into the regulation of neutrophil NADPH oxidase activity in the phagosome: a focus on the role of lipid and Ca(2+) signaling

/ S. Brechard, S. Plancon, E. J. Tschirhart // Antioxid Redox Signal. - 2013. - T. 18.

- № 6. - C. 661-76.

19. Britt, E. C. Switching to the cyclic pentose phosphate pathway powers the oxidative burst in activated neutrophils / E. C. Britt, J. Lika, M. A. Giese [et al.] // Nat Metab. - 2022. - T. 4. - № 3. - C. 389-403.

20. Broggi, A. IFN-lambda suppresses intestinal inflammation by non-translational regulation of neutrophil function / A. Broggi, Y. Tan, F. Granucci, I. Zanoni // Nat Immunol. - 2017. - T. 18. - № 10. - C. 1084-1093.

21. Bufe, B. The sensing of bacteria: emerging principles for the detection of signal sequences by formyl peptide receptors / B. Bufe, F. Zufall // Biomol Concepts. - 2016. - T. 7. - № 3. - C. 205-214.

22. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system / E. I. Buzas // Nat Rev Immunol. - 2022. - C. 1-15.

23. Castaldo, M. NOX2-Dependent Reactive Oxygen Species Regulate Formyl-Peptide Receptor 1-Mediated TrkA Transactivation in SH-SY5Y Cells / M. Castaldo, C. Zollo, G. Esposito [et al.] // Oxid Med Cell Longev. - 2019. - T. 2019.

- C. 2051235.

24. Cattaneo, F. Distinct signaling cascades elicited by different formyl peptide receptor 2 (FPR2) agonists / F. Cattaneo, M. Parisi, R. Ammendola // Int J Mol Sci. - 2013. - T. 14. - № 4. - C. 7193-230.

25. Cattaneo, F. Cell-surface receptors transactivation mediated by g protein-coupled receptors / F. Cattaneo, G. Guerra, M. Parisi [et al.] // Int J Mol Sci.

- 2014. - T. 15. - № 11. - C. 19700-19728.

26. Chandra, M. Classification of the human phox homology (PX) domains based on their phosphoinositide binding specificities / M. Chandra, Y. K. Chin, C. Mas [et al.] // Nat Commun. - 2019. - T. 10. - № 1. - C. 1528.

27. 24. Chedid, P. Vasoactive intestinal peptide dampens formyl-peptide-induced ROS production and inflammation by targeting a MAPK-p47(phox) phosphorylation pathway in monocytes / P. Chedid, T. Boussetta, P. M. Dang [et al.] // Mucosal Immunol. - 2017. - T. 10. - № 2. - C. 332-340.

28. 25. Chen, H. F. Regulation of Dual-Specificity Phosphatase (DUSP) Ubiquitination and Protein Stability / H. F. Chen, H. C. Chuang, T. H. Tan // Int J Mol Sci. - 2019. - T. 20. - № 11. - C. 2668.

29. Chen, T. Structural basis of ligand binding modes at the human formyl peptide receptor 2 / T. Chen, M. Xiong, X. Zong [et al.] // Nat Commun. - 2020. -T. 11. - № 1. - C. 1208.

30. Chen, X., S. Fpr2 Deficiency Alleviates Diet-Induced Insulin Resistance Through Reducing Body Weight Gain and Inhibiting Inflammation Mediated by Macrophage Chemotaxis and M1 Polarization / X. Chen, S. Zhuo, T. Zhu [et al.] // Diabetes. - 2019. - T. 68. - № 6. - C. 1130-1142.

31. Chniguir, A. Eugenol prevents fMLF-induced superoxide anion production in human neutrophils by inhibiting ERK1/2 signaling pathway and p47phox phosphorylation / A. Chniguir, C. Pintard, D. Liu [et al.] // Sci Rep. - 2019. - T. 9. - № 1. - C. 18540.

32. Christophe, T. Phagocyte activation by Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Met, acting through FPRL1/LXA4R, is not affected by lipoxin A4 / T. Christophe, A. Karlsson, M. J. Rabiet [et al.] // Scand J Immunol. - 2002. - T. 56. - № 5. - C. 470476.

33. Cicenas, J. JNK, p38, ERK, and SGK1 Inhibitors in Cancer / Cicenas, J., E. Zalyte, A. Rimkus [et al.] // Cancers (Basel). - 2017. - T. 10. - № 1. - C. 1.

34. Cooray, S. N. Ligand-specific conformational change of the G-protein-coupled receptor ALX/FPR2 determines proresolving functional responses / S. N. Cooray, T. Gobbetti, T. Montero-Melendez [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2013. - T. 110. - № 45. - C. 18232-18237.

35. Costantini, T. W. Pentoxifylline modulates p47phox activation and downregulates neutrophil oxidative burst through PKA-dependent and -independent mechanisms / T. W. Costantini, J. Deree, C. Y. Peterson [et al.] // Immunopharmacol Immunotoxicol. - 2010. - T. 32. - № 1. - C. 82-91.

36. Dahlgren, C. Basic characteristics of the neutrophil receptors that recognize formylated peptides, a danger-associated molecular pattern generated by

bacteria and mitochondria / C. Dahlgren, M. Gabl, A. Holdfeldt [et al.] // Biochem Pharmacol. - 2016. - T. 114. - C. 22-39.

37. Dang, P. M. The NADPH oxidase cytosolic component p67phox is constitutively phosphorylated in human neutrophils: Regulation by a protein tyrosine kinase, MEK1/2 and phosphatases 1/2A / P. M. Dang, H. Raad, R. A. Derkawi [et al.] // Biochem Pharmacol. - 2011. - T. 82. - № 9. - C. 1145-1152.

38. Decoursey, T. E. Regulation and termination of NADPH oxidase activity / T. E. Decoursey, E. Ligeti // Cell Mol Life Sci. - 2005. - T. 62. - № 1920. - C. 2173-2193.

39. DeCoursey, T. E. The intimate and controversial relationship between voltage-gated proton channels and the phagocyte NADPH oxidase / T. E. Decoursey // Immunol Rev. - 2016. - T. 273. - № 1. - C. 194-218.

40. Dennis, E. A. Allosteric regulation by membranes and hydrophobic subsites in phospholipase A2 enzymes determine their substrate specificity / E. A. Dennis // J Biol Chem. - 2022. - T. 298. - № 5. - C. 101873.

41. Dewas, C. The mitogen-activated protein kinase extracellular signalregulated kinase 1/2 pathway is involved in formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine-induced p47phox phosphorylation in human neutrophils / C. Dewas, M. Fay, M. A. Gougerot-Pocidalo, J. El-Benna // J Immunol. - 2000. - T. 165. - № 9. - C. 52385244.

42. Dietz, N. Structural basis for selective AMPylation of Rac-subfamily GTPases by Bartonella effector protein 1 (Bep1) / N. Dietz, M. Huber, I. Sorg [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2021. - T. 118. - № 12. - C. e2023245118.

43. Dinauer, M. C. Neutrophil Defects and Diagnosis Disorders of Neutrophil Function: An Overview / M. C. Dinauer // Methods Mol Biol. - 2020. -T. 2087. - C. 11-29.

44. Dufton, N. Anti-inflammatory role of the murine formyl-peptide receptor 2: ligand-specific effects on leukocyte responses and experimental inflammation / N. Dufton, R. Hannon, V. Brancaleone [et al.] // J Immunol. - 2010. - T. 184. - № 5. - C. 2611-2619.

45. Duits, D. E. M. hMRP8-ATTAC Mice: A New Model for Conditional and Reversible Neutrophil Ablation / D. E. M. Duits, C. Salvagno, E. A. M. Raeven [et al.] // Cells. - 2022. - T. 11. - № 15. - C. 2346.

46. Duru, E. A. Role of formic receptors in soluble urokinase receptor-induced human vascular smooth muscle migration / E. A. Duru, Y. Fu, M. G. Davies // J Surg Res. - 2015. - T. 195. - № 2. - C. 396-405.

47. Elumalai, S. NADPH Oxidase (NOX) Targeting in Diabetes: A Special Emphasis on Pancreatic beta-Cell Dysfunction / S. Elumalai, U. Karunakaran, J. S. Moon, K. C. Won // Cells. - 2021. - T. 10. - № 7. - C. 1573.

48. Filina, Y. V. Small G-proteins Ras, Rac and Rho in the regulation of the neutrophil respiratory burst induced by formyl peptide / Y. V. Filina, V. G. Safronova, A. G. Gabdoulkhakova // Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. - 2012. - T. 6. - № 1. - C. 67-74.

49. Forsman, H. Lipoxin A(4) metabolites/analogues from two commercial sources have no effects on TNF-alpha-mediated priming or activation through the neutrophil formyl peptide receptors / H. Forsman, C. Dahlgren // Scand J Immunol.

- 2009. - T. 70. - № 4. - C. 396-402.

50. Forsman, H. Stable formyl peptide receptor agonists that activate the neutrophil NADPH-oxidase identified through screening of a compound library / H. Forsman, C. Kalderen, A. Nordin [et al.] // Biochem Pharmacol. - 2011. - T. 81. -№ 3. - C. 402-411.

51. Fumagalli, L. Class I phosphoinositide-3-kinases and SRC kinases play a nonredundant role in regulation of adhesion-independent and -dependent neutrophil reactive oxygen species generation / L. Fumagalli, C. C. Campa, G. Germena [et al.] // J Immunol. - 2013. - T. 190. - № 7. - C. 3648-3660.

52. Gallo, I. Formyl peptide receptor as a novel therapeutic target for anxiety-related disorders / I. Gallo, L. Rattazzi, G. Piras [et al.] // PLoS One. - 2014.

- T. 9. - № 12. - C. e114626.

53. Garcia, R. A. Preservation of Post-Infarction Cardiac Structure and Function via Long-Term Oral Formyl Peptide Receptor Agonist Treatment / R. A.

Garcia, B. R. Ito, J. A. Lupisella [et al.] // JACC Basic Transl Sci. - 2019. - T. 4. -№ 8. - C. 905-920.

54. Gasteiger, G. Cellular Innate Immunity: An Old Game with New Players / G. Gasteiger, A. D'Osualdo, D. A. Schubert [et al.] // J Innate Immun. -2017. - T. 9. - № 2. - C. 111-125.

55. Girotti, S. Determination of superoxide dismutase in erythrocytes by a chemiluminescent assay / S. Girotti, F. Fini, E. Ferri [et al.] // Talanta. - 2000. - T. 51. - № 4. - C. 685-692.

56. Goldsmith, Z. G. G protein regulation of MAPK networks / Z. G. Goldsmith, D. N. Dhanasekaran // Oncogene. - 2007. - T. 26. - № 22. - C. 312242.

57. Gonzalez-Perilli, L. Arachidonic Acid and Nitroarachidonic: Effects on NADPH Oxidase Activity / L. Gonzalez-Perilli, C. Prolo, M. N. Âlvarez. // Bioactive Lipids in Health and Disease. - Cham: Springer International Publishing, 2019. - C. 85-95.

58. Gonzalez, A. Impact of helix irregularities on sequence alignment and homology modeling of G protein-coupled receptors / A. Gonzalez, A. Cordomi, G. Caltabiano, L. Pardo // Chembiochem. - 2012. - T. 13. - № 10. - C. 1393-1399.

59. Gresset, A. The phospholipase C isozymes and their regulation / A. Gresset, J. Sondek, T. K. Harden // Subcell Biochem. - 2012. - T. 58. - C. 61-94.

60. Groemping, Y. Activation and assembly of the NADPH oxidase: a structural perspective / Y. Groemping, K. Rittinger // Biochem J. - 2005. - T. 386. - № Pt 3. - C. 401-416.

61. Grubisha, M. J. Trio and Kalirin as unique enactors of Rho/Rac spatiotemporal precision / M. J. Grubisha, R. A. DeGiosio, Z. P. Wills, R. A. Sweet // Cell Signal. - 2022. - T. 98. - C. 110416.

62. Hanson, J. Heterologously expressed formyl peptide receptor 2 (FPR2/ALX) does not respond to lipoxin A(4) / J. Hanson, N. Ferreiros, B. Pirotte [et al.] // Biochem Pharmacol. - 2013. - T. 85. - № 12. - C. 1795-1802.

63. Hawkins, P. T. PI3K signaling in neutrophils / P. T. Hawkins, L. R. Stephens, S. Suire, M. Wilson // Curr Top Microbiol Immunol. - 2010. - T. 346. -C. 183-202.

64. Hawkins, P. T. PI3K signalling in inflammation / P. T. Hawkins, L. R. Stephens // Biochim Biophys Acta. - 2015. - T. 1851, № 6. - C. 882-97.

65. He, H. Q. Functional characterization of three mouse formyl peptide receptors / H. Q. He, D. Liao, Z. G. Wang [et al.] // Mol Pharmacol. - 2013. - T. 83. - № 2. - C. 389-398.

66. He, H. Q. Structural determinants for the interaction of formyl peptide receptor 2 with peptide ligands / H. Q. He, E. L. Troksa, G. Caltabiano [et al.] // J Biol Chem. - 2014. - T. 289. - № 4. - C. 2295-2306.

67. He, H. Q. The Formyl Peptide Receptors: Diversity of Ligands and Mechanism for Recognition / H. Q. He, R. D. Ye // Molecules. - 2017. - T. 22. - № 3. - C. 455.

68. Helfenberger, K. E. Subcellular distribution of ERK phosphorylation in tyrosine and threonine depends on redox status in murine lung cells / K. E. Helfenberger, N. M. Villalba, B. Buchholz [et al.] // PLoS One. - 2018. - T. 13. -№ 2. - C. e0193022.

69. Henriquez-Olguin, C. The Emerging Roles of Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Oxidase 2 in Skeletal Muscle Redox Signaling and Metabolism / C. Henriquez-Olguin, S. Boronat, C. Cabello-Verrugio [et al.] // Antioxid Redox Signal. - 2019. - T. 31. - № 18. - C. 1371-1410.

70. Hodge, R. G. Regulating Rho GTPases and their regulators / R. G. Hodge, A. J. Ridley // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2016. - T. 17. - № 8. - C. 496-510.

71. Hornbeck, P. V. PhosphoSitePlus, 2014: mutations, PTMs and recalibrations / P. V. Hornbeck, B. Zhang, B. Murray [et al.] // Nucleic acids research. - 2015. - T. 43. - № D1. - C. D512-D520.

72. Igumenova, T. I. Dynamics and Membrane Interactions of Protein Kinase C / T. I. Igumenova // Biochemistry. - 2015. - T. 54. - № 32. - C. 4953-68.

73. Inoue, A. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs / A. Inoue, F. Raimondi, F. M. N. Kadji [et al.] // Cell. - 2019. - T. 177. - № 7. - C. 1933-1947 e25.

74. Jean, S. Classes of phosphoinositide 3-kinases at a glance / S. Jean, A. A. Kiger // J Cell Sci. - 2014. - T. 127. - № Pt 5. - C. 923-928.

75. Johnson, J. Oxidative Stress in Neutrophils: Implications for Diabetic Cardiovascular Complications / J. Johnson, R. M. Jaggers, S. Gopalkrishna [et al.] // Antioxid Redox Signal. - 2022. - T. 36. - № 10-12. - C. 652-666.

76. Joshi, S. NADPH oxidase: a therapeutic target for hyperoxaluria-induced oxidative stress - an update / S. Joshi, S. R. Khan // Future Med Chem. -2019. - T. 11. - № 23. - C. 2975-2978.

77. Kallenborn-Gerhardt, W. NADPH Oxidases in Pain Processing / W. Kallenborn-Gerhardt, K. Schroder, A. Schmidtko // Antioxidants (Basel). - 2022. -T. 11 . - № 6.

78. Katti, S. Structural insights into C1-ligand interactions: Filling the gaps by in silico methods / S. Katti, T. I. Igumenova // Adv Biol Regul. - 2021. - T. 79. - C. 100784.

79. Kawakami, N. Indication of a protein kinase C-independent pathway for NADPH oxidase activation in human neutrophils / N. Kawakami, H. Takemasa, T. Yamaguchi [et al.] // Arch Biochem Biophys. - 1998. - T. 349. - № 1. - C. 8994.

80. Kawano, T. Activators and Inhibitors of Protein Kinase C (PKC): Their Applications in Clinical Trials / T. Kawano, J. Inokuchi, M. Eto [et al.] // Pharmaceutics. - 2021. - T. 13. - № 11. - C. 1748.

81. Kervin, T. A. Phosphoinositide Recognition Sites Are Blocked by Metabolite Attachment / T. A. Kervin, B. C. Wiseman, M. Overduin // Front Cell Dev Biol. - 2021. - T. 9. - C. 690461.

82. Khazen, R. Spatiotemporal dynamics of calcium signals during neutrophil cluster formation / R. Khazen, B. Corre, Z. Garcia [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2022. - T. 119. - № 29. - C. e2203855119.

83. Kidger, A. M. The regulation of oncogenic Ras/ERK signalling by dual-specificity mitogen activated protein kinase phosphatases (MKPs) / A. M. Kidger, S. M. Keyse // Semin Cell Dev Biol. - 2016. - T. 50. - C. 125-132.

84. Kim, Y. E. WKYMVm hexapeptide, a strong formyl peptide receptor 2 agonist, attenuates hyperoxia-induced lung injuries in newborn mice / Y. E. Kim, W. S. Park, S. Y. Ahn [et al.] // Sci Rep. - 2019. - T. 9. - № 1. -C. 6815.

85. Konstantinidis, D. G. Rac GTPase / D. G. Konstantinidis // Encyclopedia of Signaling Molecules - Cham: Springer International Publishing, 2018. - C. 4408-4414.

86. Kovacs, I. Comparison of proton channel, phagocyte oxidase, and respiratory burst levels between human eosinophil and neutrophil granulocytes / I. Kovacs, M. Horvath, T. Kovacs [et al.] // Free Radic Res. - 2014. - T. 48. - № 10.

- C. 1190-1199.

87. Koyasu, S. The role of PI3K in immune cells / S. Koyasu // Nat Immunol. - 2003. - T. 4. - № 4. - C. 313-319.

88. Krishna, S. M. Kallistatin limits abdominal aortic aneurysm by attenuating generation of reactive oxygen species and apoptosis / S. M. Krishna, J. Li, Y. Wang [et al.] // Sci Rep. - 2021. - T. 11. - № 1. - C. 17451.

89. Kruger, P. Neutrophils: Between host defence, immune modulation, and tissue injury / P. Kruger, M. Saffarzadeh, A. N. Weber [et al.] // PLoS Pathog.

- 2015. - T. 11. - № 3. C. C. e1004651.

90. Latorraca, N. R. GPCR Dynamics: Structures in Motion / N. R. Latorraca, A. J. Venkatakrishnan, R. O. Dror // Chem Rev. - 2017. - T. 117. - № 1.

- C. 139-155.

91. Lee, H. Y. Intracellular formyl peptide receptor regulates naive CD4 T cell migration / H. Y. Lee, Y. S. Jeong, M. Lee [et al.] // Biochem Biophys Res Commun. - 2018. - T. 497. - № 1. - C. 226-232.

92. Lee, J. Emodin 8-O-glucoside primes macrophages more strongly than emodin aglycone via activation of phagocytic activity and TLR-2/MAPK/NF-

kappaB signalling pathway / J. Lee, H. J. Kim, T. T. H. Nguyen [et al.] // Int Immunopharmacol. - 2020. - T. 88. - C. 106936.

93. Lewis, E. M. Phosphorylation of p22phox on threonine 147 enhances NADPH oxidase activity by promoting p47phox binding / E. M. Lewis, S. Sergeant, B. Ledford [et al.] // J Biol Chem. - 2010. - T. 285. - № 5. - C. 2959-2967.

94. Li, Y. Pleiotropic regulation of macrophage polarization and tumorigenesis by formyl peptide receptor-2 / Y. Li, L. Cai, H. Wang [et al.] // Oncogene. - 2011. - T. 30. - № 36. - C. 3887-3899.

95. Liew, P. X. The Neutrophil's Role During Health and Disease / P. X. Liew, P. Kubes // Physiol Rev. - 2019. - T. 99. - № 2. - C. 1223-1248.

96. Lind, S. Functional and signaling characterization of the neutrophil FPR2 selective agonist Act-389949 / S. Lind, M. Sundqvist, R. Holmdahl [et al.] // Biochem Pharmacol. - 2019. - T. 166. - C. 163-173.

97. Maciuszek, M. Recent advances in the design and development of formyl peptide receptor 2 (FPR2/ALX) agonists as pro-resolving agents with diverse therapeutic potential / M. Maciuszek, A. Cacace, E. Brennan [et al.] // Eur J Med Chem. - 2021. - T. 213. - C. 113167.

98. Macmillan, D. The phospholipase C inhibitor U-73122 inhibits Ca(2+) release from the intracellular sarcoplasmic reticulum Ca(2+) store by inhibiting Ca(2+) pumps in smooth muscle / D. Macmillan, J. G. McCarron // Br J Pharmacol. - 2010. - T. 160. - № 6. - C. 1295-1301.

99. Maehara, Y. A conserved region between the TPR and activation domains of p67phox participates in activation of the phagocyte NADPH oxidase / Y. Maehara, K. Miyano, S. Yuzawa [et al.] // J Biol Chem. - 2010. - T. 285. - № 41. - C. 31435-31445.

100. Mafi, A. The mechanism for ligand activation of the GPCR-G protein complex / A. Mafi, S. K. Kim, W. A. Goddard, 3rd // Proc Natl Acad Sci U S A. -2022. - T. 119. - № 18. - C. e2110085119.

101. Makni-Maalej, K. Zymosan induces NADPH oxidase activation in human neutrophils by inducing the phosphorylation of p47phox and the activation

of Rac2: involvement of protein tyrosine kinases, PI3Kinase, PKC, ERK1/2 and p38MAPkinase / K. Makni-Maalej, M. Chiandotto, M. Hurtado-Nedelec [et al.] // Biochem Pharmacol. - 2013. - T. 85. - № 1. - C. 92-100.

102. Manda-Handzlik, A. The influence of agents differentiating HL-60 cells toward granulocyte-like cells on their ability to release neutrophil extracellular traps / A. Manda-Handzlik, W. Bystrzycka, M. Wachowska [et al.] // Immunol Cell Biol. - 2018. - T. 96. - № 4. - C. 413-425.

103. McCormick, B. Cross-talk between Rho GTPases and PI3K in the neutrophil / B. McCormick, J. Y. Chu, S. Vermeren // Small GTPases. - 2019. - T. 10. - № 3. - C. 187-195.

104. McMahon, B. Lipoxin A4 antagonizes the mitogenic effects of leukotriene D4 in human renal mesangial cells. Differential activation of MAP kinases through distinct receptors / B. McMahon, C. Stenson, F. McPhillips [et al.] // J Biol Chem. - 2000. - T. 275. - № 36. - C. 27566-75.

105. Meijles, D. N. Molecular insights of p47phox phosphorylation dynamics in the regulation of NADPH oxidase activation and superoxide production / D. N. Meijles, L. M. Fan, B. J. Howlin, J. M. Li // J Biol Chem. - 2014. - T. 289. - № 33. - C. 22759-22770.

106. Mendell, A. L. The testosterone metabolite 3alpha-androstanediol inhibits oxidative stress-induced ERK phosphorylation and neurotoxicity in SH-SY5Y cells through an MKP3/DUSP6-dependent mechanism / A. L. Mendell, N. J. MacLusky // Neurosci Lett. - 2019. - T. 696. - C. 60-66.

107. Mutte, S. K. Deep Evolutionary History of the Phox and Bem1 (PB1) Domain Across Eukaryotes / S. K. Mutte, D. Weijers // Sci Rep. - 2020. - T. 10. -№ 1. - C. 3797.

108. Nguyen, G. T. Neutrophils to the ROScue: Mechanisms of NADPH Oxidase Activation and Bacterial Resistance / G. T. Nguyen, E. R. Green, J. Mecsas // Front Cell Infect Microbiol. - 2017. - T. 7. - C. 373.

109. Nosbisch, J. L. Mechanistic models of PLC/PKC signaling implicate phosphatidic acid as a key amplifier of chemotactic gradient sensing / J. L. Nosbisch,

A. Rahman, K. Mohan [et al.] // PLoS Comput Biol. - 2020. - T. 16. - № 4. - C. e1007708.

110. Okura, Y. Monocyte/macrophage-specific NADPH oxidase contributes to antimicrobial host defense in X-CGD / Y. Okura, M. Yamada, F. Kuribayashi [et al.] // J Clin Immunol. - 2015. - T. 35. - № 2. - C. 158-67.

111. Oldekamp, S. Lack of formyl peptide receptor 1 and 2 leads to more severe inflammation and higher mortality in mice with of pneumococcal meningitis / S. Oldekamp, S. Pscheidl, E. Kress [et al.] // Immunology. - 2014. - T. 143. - № 3. - c. 447-461.

112. Ong, W. Y. Role of formyl peptide receptor 2 (FPR2) in the normal brain and in neurological conditions / W. Y. Ong, J. J. E. Chua // Neural Regen Res. - 2019. - T. 14. - № 12. - C. 2071-2072.

113. Paclet, M. H. Regulation of Neutrophil NADPH Oxidase, NOX2: A Crucial Effector in Neutrophil Phenotype and Function / M. H. Paclet, S. Laurans, S. Dupre-Crochet // Front Cell Dev Biol. - 2022. - T. 10. - C. 945749.

114. Panday, A. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies / A. Panday, M. K. Sahoo, D. Osorio, S. Batra // Cell Mol Immunol. - 2015. - T. 12. - № 1. - C. 5-23.

115. Park, G. T. Formyl Peptide Receptor 2 Activation Ameliorates Dermal Fibrosis and Inflammation in Bleomycin-Induced Scleroderma / G. T. Park, Y. W. Kwon, T. W. Lee [et al.] // Front Immunol. - 2019. - T. 10. - C. 2095.

116. Park, H. S. Phosphorylation of the leucocyte NADPH oxidase subunit p47(phox) by casein kinase 2: conformation-dependent phosphorylation and modulation of oxidase activity / H. S. Park, S. M. Lee, J. H. Lee [et al.] // Biochem J. - 2001. - T. 358. - № Pt 3. - C. 783-90.

117. Peritore, A. F. The role of Annexin A1 and formyl peptide receptor 2/3 signaling on chronic corticosterone-induced depression-like behaviors and impairment in hippocampal-dependent memory / A. F.Peritore, R. Crupi, M. Scuto [et al.] // CNS Neurol Disord Drug Targets. - 2020. - T. 19. - №. 1. - C. 27-43.

118. Poque, E. Effects of radiofrequency fields on RAS and ERK kinases activity in live cells using the bioluminescence resonance energy transfer technique / E. Poque, D. Arnaud-Cormos, L. Patrignoni [et al.] // Int J Radiat Biol. - 2020. -T. 96. - № 6. - C. 836-843.

119. Prieto-Bermejo, R. Granuloma Formation in a Cyba-Deficient Model of Chronic Granulomatous Disease Is Associated with Myeloid Hyperplasia and the Exhaustion of B-Cell Lineage / R. Prieto-Bermejo, M. Romo-Gonzalez, A. Perez-Fernandez [et al.] // Int J Mol Sci. - 2021. - T. 22. - № 16. - C. 8701.

120. Qin, C. X. Formylpeptide receptor 2: Nomenclature, structure, signalling and translational perspectives: IUPHAR review 35 / C. X. Qin, L. V. Norling, E. A. Vecchio [et al.] // Br J Pharmacol. - 2022.10.1111/bph.15919.

121. Raabe, C. A. Biased perspectives on formyl peptide receptors / C. A. Raabe, J. Groper, U. Rescher // Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. - 2019. - T. 1866, № 2. - C. 305-316.

122. Raad, H. The protein kinase A negatively regulates reactive oxygen species production by phosphorylating gp91phox/NOX2 in human neutrophils / H. Raad, H. Mouawia, H. Hassan [et al.] // Free Radic Biol Med. - 2020. - T. 160. - C. 19-27.

123. Rice, C. M. Tumour-elicited neutrophils engage mitochondrial metabolism to circumvent nutrient limitations and maintain immune suppression / C. M. Rice, L. C. Davies, J. J. Subleski [et al.] // Nat Commun. - 2018. - T. 9. - № 1. - C. 5099.

124. Romano, M. Lipoxin receptors / M. Romano, I. Recchia, A. Recchiuti // ScientificWorldJournal. - 2007. - T. 7. - C. 1393-1412.

125. Roos, D. Hematologically important mutations: The autosomal forms of chronic granulomatous disease (third update) / D. Roos, K. van Leeuwen, A. P. Hsu [et al.] // Blood Cells Mol Dis. - 2021. - T. 92. - C. 102596.

126. Rynkiewicz, N. K. Gßy is a direct regulator of endogenous p101/p110gamma and p84/p110gamma PI3Kgamma complexes in mouse

neutrophils / N. K. Rynkiewicz, K. E. Anderson, S. Suire [et al.] // Sci Signal. -2020. - T. 13. - № 656. - C. eaaz4003.

127. Savla, S. R. Pharmacology of apocynin: a natural acetophenone / S. R. Savla, A. P. Laddha, Y. A. Kulkarni // Drug Metab Rev. - 2021. - T. 53. - № 4. -C. 542-562.

128. Schloer, S. The annexin A1/FPR2 signaling axis expands alveolar macrophages, limits viral replication, and attenuates pathogenesis in the murine influenza A virus infection model / S. Schloer, N. Hubel, D. Masemann [et al.] // FASEB J. - 2019. - T. 33. - № 11. - C. 12188-12199.

129. Shin, M. H. The synthetic chemoattractant peptide WKYMVm induces superoxide production by human eosinophils via the phosphoinositide 3-kinase-mediated activation of ERK1/2 / M. H. Shin, Y. A. Lee, Y. S. Bae [et al.] // Int Arch Allergy Immunol. - 2005. - T. 137 Suppl 1. - C. 21-26.

130. Southgate, E. L. Formyl Peptide Receptor // Encyclopedia of Signaling Molecules / E. L. Southgate, R. D. Ye - New York, NY: Springer New York, 2012. - C. 650-656.

131. Srinivas, U. S. ROS and the DNA damage response in cancer / U. S. Srinivas, B. W. Q. Tan, B. A. Vellayappan, A. D. Jeyasekharan // Redox Biol. -2019. - T. 25. - C. 101084.

132. Subramanian, B. C. The role of the LTB4-BLT1 axis in chemotactic gradient sensing and directed leukocyte migration / B. C. Subramanian, R. Majumdar, C. A. Parent // Semin Immunol. - 2017. - T. 33. - C. 16-29.

133. Suire, S. Gbetagammas and the Ras binding domain of p110gamma are both important regulators of PI(3)Kgamma signalling in neutrophils / S. Suire, A. M. Condliffe, G. J. Ferguson [et al.] // Nat Cell Biol. - 2006. - T. 8. - № 11. - C. 1303-1309.

134. Takaishi, K. Human Vascular Smooth Muscle Function and Oxidative Stress Induced by NADPH Oxidase with the Clinical Implications / K. Takaishi, H. Kinoshita, S. Kawashima, S. Kawahito // Cells. - 2021. - T. 10. - № 8.

135. Takizawa, S. Neutrophil trogocytosis during their trans-endothelial migration: role of extracellular CIRP / S. Takizawa, Y. Lee, A. Jacob [et al.] // Mol Med. - 2022. - T. 28. - № 1. - C. 91.

136. Tang, X. Metabolite G-protein coupled receptor signaling: Potential regulation of eicosanoids / X. Tang, Y. Hou, T. W. Schwartz, J. Z. Haeggstrom // Biochem Pharmacol. - 2022. - T. 204. - C. 115208.

137. Tariq, K. Striking a balance: PIP2 and PIP3 signaling in neuronal health and disease / K. Tariq, B. W. Luikart // Explor Neuroprotective Ther. - 2021. - T. 1. - C. 86-100.

138. Taylor, J. P. The role of NADPH oxidases in infectious and inflammatory diseases / J. P. Taylor, H. M. Tse // Redox Biol. - 2021. - № 48. - C. 102159.

139. Teixeira-Nunes, M. Bacterial Nucleotidyl Cyclases Activated by Calmodulin or Actin in Host Cells: Enzyme Specificities and Cytotoxicity Mechanisms Identified to Date / M. Teixeira-Nunes, P. Retailleau, M. Comisso [et al.] // Int J Mol Sci. - 2022. - T. 23. - № 12. - C. 6743.

140. Torrisi, F. The Hallmarks of Glioblastoma: Heterogeneity, Intercellular Crosstalk and Molecular Signature of Invasiveness and Progression / F. Torrisi, C. Alberghina, S. D'Aprile [et al.] // Biomedicines. - 2022. - T. 10. - № 4. - C. 806.

141. Tsai, Y. R. p38 Mitogen-activated protein kinase and extracellular signal-regulated kinase signaling pathways are not essential regulators of formyl peptide-stimulated p47(phox) activation in neutrophils / Y. R. Tsai, Y. J. Wang, M. R. Lee [et al.] // Eur J Pharmacol. - 2013. - T. 701. - № 1-3. - C. 96-105.

142. Turk, J. iPLA2beta and its role in male fertility, neurological disorders, metabolic disorders, and inflammation / J. Turk, T. D. White, A. J. Nelson [et al.] // Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. - 2019. - T. 1864. - № 6. - C. 846860.

143. Tylek, K. Formyl peptide receptor 2, as an important target for ligands triggering the inflammatory response regulation: a link to brain pathology / K. Tylek,

E. Trojan, M. Regulska [et al.] // Pharmacol Rep. - 2021. - T. 73. - № 4. - C. 10041019.

144. UniProt Consortium. UniProt: a worldwide hub of protein knowledge / UniProt Consortium // Nucleic Acids Res. - 2019. - T. 47. - № D1. - C. D506-D515.

145. Van Bruggen, R. Continuous translocation of Rac2 and the NADPH oxidase component p67(phox) during phagocytosis / R. van Bruggen, E. Anthony, M. Fernandez-Borja, D. Roos // J Biol Chem. - 2004. - T. 279. - № 10. - C. 9097102.

146. van de Geer, A. Inherited p40phox deficiency differs from classic chronic granulomatous disease / A. van de Geer, A. Nieto-Patlan, D. B. Kuhns [et al.] // J Clin Invest. - 2018. - T. 128. - № 9. - C. 3957-3975.

147. Vermot, A. NADPH Oxidases (NOX): An Overview from Discovery, Molecular Mechanisms to Physiology and Pathology / A. Vermot, I. Petit-Hartlein, S. M. E. Smith, F. Fieschi // Antioxidants (Basel). - 2021. - T. 10. - № 6.

148. Wang, J. Neutrophils in tissue injury and repair / J. Wang // Cell Tissue Res. - 2018. - T. 371. - № 3. - C. 531-539.

149. Wang, Y. Cortistatin exerts antiproliferation and antimigration effects in vascular smooth muscle cells stimulated by Ang II through suppressing ERK1/2, p38 MAPK, JNK and ERK5 signaling pathways / Y. Wang, X. Zhang, L. Gao [et al.] // Ann Transl Med. - 2019. - T. 7. - № 20. - C. 561.

150. Wenzel, P. Monocytes as immune targets in arterial hypertension / P. Wenzel // Br J Pharmacol. - 2019. - T. 176. - № 12. - C. 1966-1977.

151. Winterbourn, C. C. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome / C. C. Winterbourn, A. J. Kettle // Antioxid Redox Signal. -2013. - T. 18. - № 6. - C. 642-60.

152. Winther, M. Formyl Peptide Receptors in Mice and Men: Similarities and Differences in Recognition of Conventional Ligands and Modulating Lipopeptides / M. Winther, C. Dahlgren, H. Forsman // Basic Clin Pharmacol Toxicol. - 2018. - T. 122. - № 2. - C. 191-198.

153. Wortzel, I. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles / I. Wortzel, R. Seger // Genes Cancer. - 2011. - T. 2. - № 3. - C. 195-209.

154. Xia, N. Regulation of NADPH Oxidase-Mediated Superoxide Production by Acetylation and Deacetylation / N. Xia, S. Tenzer, O. Lunov [et al.] // Front Physiol. - 2021. - T. 12. - C. 693702.

155. Yamaguchi, M. Hyperphosphorylated p47-phox lost the ability to activate NADPH oxidase in guinea pig neutrophils / M. Yamaguchi, S. Saeki, H. Yamane [et al.] // Biochem Biophys Res Commun. - 1995. - T. 216. - № 1. - C. 203-208.

156. Ye, R. D. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. LXXIII. Nomenclature for the formyl peptide receptor (FPR) family / R. D. Ye, F. Boulay, J. M. Wang [et al.] // Pharmacol Rev. - 2009. - T. 61. - № 2. - C. 119-161.

157. Zabrodskaya, Y. A. Caught red handed: modeling and confirmation of the myeloperoxidase ceruloplasmin alpha-thrombin complex / Y. A. Zabrodskaya, V. V. Egorov, A. V. Sokolov [et al.] // Biometals. - 2022. - C. 1-12.

158. Zandi, Z. Dual-specificity phosphatases: therapeutic targets in cancer therapy resistance / Z. Zandi, B. Kashani, Z. Alishahi [et al.] // J Cancer Res Clin Oncol. - 2022. - T. 148. - № 1. - C. 57-70.

159. Zhang, J. ROS and ROS-Mediated Cellular Signaling / J. Zhang, X. Wang, V. Vikash [et al.] // Oxid Med Cell Longev. - 2016. - T. 2016. - C. 4350965.

160. Zhang, X. Mitochondrial peptides cause proinflammatory responses in the alveolar epithelium via FPR-1, MAPKs, and AKT: a potential mechanism involved in acute lung injury / X. Zhang, T. Wang, Z. C. Yuan [et al.] // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. - 2018. - T. 315. - № 5. - C. L775-L786.

161. Zhou, B. The specificity of extracellular signal-regulated kinase 2 dephosphorylation by protein phosphatases / B. Zhou, Z. X. Wang, Y. Zhao [et al.] // J Biol Chem. - 2002. - T. 277. - № 35. - C. 31818-25.

162. Zhu, L.The Role of Phospholipase C Signaling in Macrophage-Mediated Inflammatory Response / L. Zhu, C. Jones, G. Zhang // Journal of Immunology Research. - 2018. - № 2018. - C. 5201759.

163. Zhuang, Y. Structure of formylpeptide receptor 2-Gi complex reveals insights into ligand recognition and signaling / Y. Zhuang, H. Liu, X. Edward Zhou [et al.] // Nat Commun. - 2020. - T. 11. - № 1. - C. 885.

164. Zhuang, Y. Molecular recognition of formylpeptides and diverse agonists by the formylpeptide receptors FPR1 and FPR2 / Y. Zhuang, L. Wang, J. Guo [et al.] // Nat Commun. - 2022. - T. 13. - № 1. - C. 1054.

165. Ziegler, C. S. Quantitative live-cell imaging and 3D modeling reveal critical functional features in the cytosolic complex of phagocyte NADPH oxidase / C. S. Ziegler, L. Bouchab, M. Tramier [et al.] // J Biol Chem. - 2019. - T. 294. - № 11. - C. 3824-3836.

124

ПРИЛОЖЕНИЕ А

Тестирование ингибиторов в бесклеточной системе генерации АФК ксантиноксидазой

Перед измерением эффекта ингибиторов на респираторный ответ гранулоцитов была протестирована их способность подавлять хемилюминесценцию в системе бесклеточной генерации АФК ксантиноксидазой [О1гоШ ^ а1., 2000]. Были проанализированы свойства липидного агониста БРК2 БМЬ-111, ингибитора Р13К Т0100713 (ТС) ингибитора РЬС и 73122 (Ш3), ингибитора РКС 0Б109203Х (ОБ), ингибиторов МАРК ББ203580 (ББ), БК180204 (БЯ), БР600125 (БР), РБ 098059 (РБ), ингибитора БШРб Б/2 БС1 (рисунок А.1). Анализ проводился в 3 повторах.

Было обнаружено, что снижение ХЛ вызывают: БМЬ, и73, ОБ в концентрации 10-5 М и более, БС1, ББ, БЯ и БР в концентрации 10-4 М и более. ТО в концентрации 10-5 М вызывал небольшое усиление ХЛ, а РБ в концентрации 10-9-10-5 М не оказывал значительного влияния на амплитуду КО-зависимой ХЛ (рисунок А.1). На основании полученных результатов была выбрана максимальная концентрация ингибиторов для исследования респираторного взрыва изолированных гранулоцитов методом ХЛ.

Рисунок А.1 - Эффект агониста БЫЬ-111 и ингибиторов исследуемых ферментов на амплитуду ХЛ в реакции продукции АФК ксантиноксидазой. Представлены средние и стандартные отклонения (п = 3); амплитуда ХЛ до добавления вещества в реакцию принята за 100% (* - снижение амплитуды ХЛ по сравнению с контролем, р<0,05, дисперсионный анализ и тест

Даннета)

126

ПРИЛОЖЕНИЕ Б

Выделение и фенотипическая характеристика изолированных гранулоцитов костного мозга мыши

Для выделения гранулоцитов из костного мозга мыши использовали метод центрифугирования в градиенте плотности перколла, описанный в работе Boxio и соавторов [Boxio et al., 2004], с некоторыми модификациями: изменение концентрации перколла (78%, 62,5%, 55% вместо 78%, 69% и 52%) и температуры центрифугирования (10 °С вместо комнатной температуры). Использование модифицированной методики центрифугирования в градиенте плотности позволило получить 35±15 млн клеток от одного животного с жизнеспособностью 95±5% по окраске трипановым синим (n = 86). Выделенные клетки имели размер 8±2 мкм (n = 100) и прикреплялись к стеклу или пластику в течение 10-30 мин; 94±5% клеток имели полиморфные ядра, экспрессировали маркер GR-1, характерный для зрелых гранулоцитов, некоторых моноцитов и дендритных клеток [Duits et al., 2022], и не экспрессировали маркер стволовых клеток CD34 (n = 6, рисунок Б.1). Выделенные клетки продуцировали АФК в ответ на агонисты рецепторов формилированных пептидов, PMA, иономицин, опсонизированный зимозан (данные не представлены). Таким образом, характеристики клеток, выделенных из костного мозга мыши методом центрифугирования на градиенте перколла, соответствуют характеристикам зрелых гранулоцитов: они имеют полиморфное ядро, экспрессируют маркер GR-1, не экспрессируют CD34 и продуцируют АФК в ответ на специфические стимулы.

А Б

Рисунок Б.1 - Фенотипическая характеристика клеток, выделенных из костного мозга мыши: А-В пример микрофотографий клеток в проходящем

свете с применением ДИК (А), окрашенных антителами против ОЯ-1, меченными РБ (красный канал) (Б) и БАР1 (фиолетовый канал) (В); пример результата цитофлуориметрического анализа экспрессии ОЯ-1 и СБ34 (Г)