Роль фосфорилирования в активации и праймировании респираторного взрыва нейтрофилов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Габдулхакова, Аида Габрахмановна

• Габдулхакова, Аида Габрахмановна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Габдулхакова, Аида Габрахмановна

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1.Нейтрофил и его функция в организме.

1.1.1. Основные реакции нейтрофила.

1.1.2. Хемотаксические агенты.

1.1.3. Рецепторы нейтрофшое.

1.1.4. Различные состояния нейтрофшое в организме: покой, праймироеание, активация и гиперактивация.

1.1.5. Изменение функций нейтрофила при патологиях.

1.2. Молекулярные основы респираторного взрыва.

1.2.1. Компоненты ЫАОРН оксидазы, образование активных форм кислорода.

1.2.2. Цитохром в558.

1.2.3. Цитозолъные факторыр47рЬш ир67рНох.

1.2.4. О-белки, входящие в состав МАВРН оксидазы.

1.3. Активация респираторного взрыва нейтрофилов хемотаксическим пептидом ФМЛФ.

1.3.1. "Классическая " последовательность передачи сигнала.

1.3.2. Роль фосфорилирования в передача сигнала.

1.4. Праймироеание респираторного взрыва физиологическими агентами.

1.4.1. Рецепторы исследуемых праймирующих агентов.

1.4.2. Механизмы праймирования.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Материалы.,.,.,,.,.,

2.2. Биологический объект.

2.3. Регистрация хемилюминесценции.

2.4. Специфическое связывание125 1-инсулипа.

2.5. Измерение /Са ]цит.

2.6. Обработка результатов.

Глава3. Результаты исследований.

3.1. Активация и праймирование респираторного взрыва нейтрофилов, вызванного хемотаксическим пептидом ФМЛФ.

3.1.1. Праймирование респираторного взрыва нейтрофилов, активируемого ФМЛФ, через рецепторы разного типа.

3.1.2. Специфичность связывания 125 1-инсулина.

3.2. Определение условий для наблюдения усиленного респираторного взрыва нейтрофилов, вызванного ФМЛФ.

3.2.1. Зависимость модулирующего действия праймирующш агентов от температуры преинкубацж.

3.2.2. Зависимость модулирующего эффекта праймирующш агентов от времени прешкубацж.

3.2.3. Роль генотипа и фенотипа в праймировании респираторного взрыва нейтрофилов.

3.2.4. Концентрационные зависимости праймирующего эффекта инсулина.

3.3. Сравнительный анализ действия ингибиторов на респираторный взрыв нейтрофилов> вызванный ФМЛФ.

3.3.1. Действие ингибиторов на респираторный взрыв нейтрофилов, вызванный ФМЛФ в низких концентрациях.

3.3.2. Особенности действие ингибиторов на респираторный взрыв нейтрофилов, вызванный ФМЛФ в высокой концентрации,,

3.4. Механизмы праймирования респираторного взрыва нейтрофилов

3.4.1. Исследование роли [Са ]цит.

3.4.2. Роль синтеза белка de novo в праймиротнии респираторного взрыва нейтрофилов.

3.5. Сравнительный анализ действия ингибиторов на вызванный ФМЛФ респираторный взрыв нейтрофилов при праймировании инсулином, липополисахаридом и ФМЛФ.

3.5.1. Праймированиереспираторного взрыва нейтрофилов инсулином: роль тирозиновых киназ и фосфатаз.

3.5.2. Роль цитоскелета в праймировании.

3.5.3. Исследование роли тирозиновых киназ и фосфатаз в праймировании липополисахаридом.

3.5.4. Роль тирозиновых киназ и фосфатаз в праймирования респираторного взрыва нейтрофилов ФМЛФ в подпороговой концентрации.

Глава 4. Обсуждение результатов.

4.1. Роль фосфорилирования в активации респираторного взрыва.

4.2. Роль фосфорилирования в праймировании.

4.3. Вариабельность праймирования респираторного взрыва.

4.4. Дивергенция и перекрестное взаимодействие путей активации ФМЛФ и праймирующих агентов.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль фосфорилирования в активации и праймировании респираторного взрыва нейтрофилов»

Актуальность проблемы. Генерация активных форм кислорода является одной из основных цитотоксических функции нейтрофилов, обеспечивающих наиболее быстрые защитные реакции организма против инфекции. Респираторный взрыв происходит в результате фосфорилирования и сборки компонентов NADPH оксидазного комплекса. Нейтрофилы способны воспринимать множество сигналов и отвечать на них разнообразными реакциями, в основе чего лежит многообразие типов рецепторов на мембране и сложность внутриклеточной сигнальной системы. В результате интенсивных исследовании внутриклеточной сигнализации в нейтрофилах становятся понятными механизмы развития реакций на такие физиологические стимулы, как иммунные комплексы [Watson F., Edwards S.W., 1998], цитокины [Ahlers A, et al,, 1994; Kitagawa S, et al,, 1996; Waterman W,H, et al,, 1996;], ростовые факторы [Foltz I.N. et al,, 1997].; хемотаксические пептиды [McColl S,R, et al,, 1990; Thelen M, et al,, 1993].- однако, нет четкого представления о последовательности проведения сигнала от рецептора к эффекторным молекулам,

Нейтрофил в организме, как правило, подвергается параллельному и/или последовательному воздействию интермедиатов, его активация чаще всего происходит на фоне измененного, "праймированпого", состояния, Праймирующий стимул вызывает метаболическую перестройку, не приводящую к активации клетки, следствием его влияния является усиление ответа на последующую активацию. Представление о механизме праймирования респираторного взрыва нейтрофилов в настоящее время находится в стадии формирования. По литературным данным можно выделить 5 возможных механизмов: синтез белка de novo, усиление экспрессии плазматических мембранных рецепторов, модушнщя уровня [Ca модуляция активности фосфолипаз, тирозиновое 5 фосфорилирование [Hallett М.В., Lloyds D.? 1997], Авторы рассматривают каждый механизм как самодостаточный для реализации праймирования. Мы предполагаем, что праймирование реализуется в результате перекрестного взаимодействии сигнальных путей, задействованных в праймировании и активащш NADPH оксидазы, Предположение о перекрестном взаимодействии тирозинового и серин/треонинового фосфорилирования при праймировании респираторного взрыва нейтрофилов кажется нам наиболее привлекательным [Hallett М,В,,, Lloyds D,? 1997], В пользу этого механизма говорит то, что 1) воздействие на нейтрофилы факторов роста [McColl S,R, et al.5 1991] и цитокинов [Akimaru К, et al., 1992: Minakami К, et al., 1993 Ahlers A, et al., 1994: Foltz I.N. et al.,, 1997] приводит к фосфорилированию по тирозину некоторых сигнальных ключевых молекул: 2) многие праймирующие агенты не способны вызывать повышение уровня [Са2*]^; 3) процессы синтеза белка, экспрессии плазматических мембранных рецепторов и модуляции активности фосфолипаз, вероятнее всего, являются вторичными событиями по отношению к фосфорилированию.

Ввиду сложности регуляции функций нейтрофила интересны причины возникновения нарушений в его регуляции при развитии патологий,, когда избыточные дегрануляция и продукция активных форм кислорода ведут к поражению тканей и углублению патологического процесса. В последнее время появляется все больше работ с комплексным подходом к исследованию праймирования респираторного взрыва нейтрофилов,, однако, обнаруживаются противоречивые данные,, возможно,, обусловленные различиями экспериментальных условий. Изучение эффектов физиологических медиаторов на функционирование нейтрофилов,, в частности, инсулина, это малоисследованная область, связанная с актуальной проблемой дисфункции нейтрофилов при патологиях.

Цель и основные задачи исследования. Цель работы заключалась в исследовании взаимодействия сигнальных путей, участвующих в опосредованных рецепторами активации и праймировании респираторного взрыва нейтрофилов, и роль фосфорилирования в этих процессах,

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи; экспериментально подобрать оптимальные условия для исследования усиленного ответа перитонеальных нейтрофилов мыши на хемотаксический пептид М-формил-метиоиил-дейцил-фенилаланин (ФМЛФ), Исследовать зависимость модулирующего действия инсулина,-липополисахарида и ФМЛФ в низких концентрациях от времени и температуры преинкубации, от генотипа и условий содержания животных, от сочетания концентраций активирующего и праймирующего агентов:

- провести сравнительный анализ действия ингибиторов на респираторный взрыв нейтрофилов при его активации ФМЛФ в низких и высоких концентрациях;

- установить специфичность действия инсулина на нейтрофилы и основные внутриклеточные мишени его праймирующего действия;

- определить роль тирозиновых киназ и фосфатаз в праймировании респираторного взрыва нейтрофилов инсулином, липополисахаридом и ФМЛФ в низкой концентрации;

Научная новизна. Впервые установлена связь гетерогенности физиологического ответа нейтрофилов с дивергенцией и перекрестным взаимодействием сигнальных путей. Впервые показана генетическая детерминированность реакции нейтрофилов на праймирование. Показана роль тирозиновых киназ и фосфатаз,, обнаружено, что тирозиновые киназы и фосфатазы участвуют в активации респираторного взрыва хемотаксическим пептидом и его модуляции инсулином, липополисахаридом и ФМЛФ в низкой концентрации.

Научно-практическая ценность. Результаты работы вносят существенный вклад в понимание вопроса о вариабельности действия модулирующих факторов на функциональный ответ нейтрофилов, В методическом плане полученные результаты дают возможность оптимального выбора условий для наблюдения эффектов праймирующих агентов,

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на I - III Путинских конференциях молодых ученых (Пущино, 1997-98); на конференциях: 11 Фундаментальные науки и альтернативная медицина11 (Пущино, 1997); "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 1998); на отчетной годичной научной конференции ИБК РАН (Пущино,

1998); 11 Дни иммунологии в Санкт-Петербурге^11 (Санкт-Петербург^

1999); 25th Silver Jubilee FEBS Meeting (Дания, 1998); 43d Annual Meeting of the Biophysical Society (США, 1999); FASEB Meetings (США, 1998-99); международной летней школе "Molecular Mechanisms of Signal Transduction11 (Греция, 1999),

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них 4 статьи (1 статья в печати).

Список сокращений. ФМЛФ = N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин; АФК = активные формы кислорода; ХЛ = люминол-зависимая хемилюминесцекция; ЛПС - липополисахарид; [Са2+]пит = концентрация свободного цитозольного кальция; ДА Г - диацилглицерол; ПКС, ПКА - протеинкиназы С и А, соответственно; IGF-1 - инсулино-подобный фактор роста-1; МАРКиназы - митоген-активируемые протеинкиназы (mitogen-activated protein kinases); ERKs- киназы, регулируемые внеклеточным сигналом (extracellular signal-regulated kinases); NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный; GM-CSF - гранулоцит-макрофагколониестимулирующий фактор; G-CSF - гранулоцит8 колониестимулирующий фактор; GAP - белок,, активирующий ГТФазу (GTPase- activating protein): ÍI -3, IL-8 - интерлейкины; TNF-a - фактор некроза опухолей-a (tumor necrosis factor-a), Р13-киназа фосфатидилинозитол-3-киназа,, IPj - инозитол 1 ?455-трифосфат; ФАТ -фактор активации тромбоцитов, ФМА = форбол 12-миристат 13-ацетат: ФЛС, ФЛЛ2, ФЛО - фосфолипазы; АЦ - аденилатциклаза.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Габдулхакова, Аида Габрахмановна

Выводы:

1, Модуляция респираторного взрыва нейтрофилов, вызванного М-формил-метионил-лейцил-фенилаланином (ФМЛФ), зависит от температуры и времени преинкубации с праймирующим агентом, генотипа и условий содержания животных, сочетания концентраций праймирующего и активирующего агентов.

2, Модулирующее действие инсулина на вызванный ФМЛФ респираторный взрыв нейтрофилов опосредовано специфическим связыванием.

3, С помощью ингибиторного анализа показана дивергенция сигнальных путей рецептора ФМЛФ.

4, Существенный вклад в реализацию вызванного ФМЛФ респираторного взрыва и его праймирование вносят тирозиновые киназы.

5, Показано, что вклад протеинфосфатаз в праймирование респираторного взрыва нейтрофилов инсулином незначителен; в праймировании ЛПС существенно участие тирозиновых фосфатаз, в праймировании ФМЛФ -серин/треониновых фосфатаз,

6, Праймирование респираторного взрыва нейтрофилов является результатом перекрестного взаимодействия сигнальных путей рецепторов ФМЛФ и праймирующего агента, происходящего с участием тирозинового и серин/треонинового фосфорилирования и дефосфорилирования.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Габдулхакова, Аида Габрахмановна, 2000 год

1.А,, Габдулхакова А.Г,, Дедкова Е,Н,, Сафронова В,Г, 11 Мед. Иммунол., 1999, т. 1, с. 7.3, Аловская А.А. / Исследование роли ионов

2. Foltz I,N.j Lee J,C, Young P.R., Schrader J.W, / Hemopoietic growth factors with the exception of interleukin-4 activate the p38 mitogen-activated protein kinase pathway. 11 J. Biol. Chem. 1997. 272(6): 3296-3301,

3. Fouda S.I., Molski T.F., Ashour M.S., Sha'afi R.I. / Effect of lipopolysaccharide on mitogen-activated protein kinases and cytosolic phospholipase A2.11 Biochem. J. 1995. 308(3):815-822.

4. Fruhwirth M., Ruedl C, Ellemunter H,5 Bock G., Wolf H. / Flow-cytometric evaluation of oxidative burst in phagocytic cells of children with cystic fibrosis. //Int. Arch. Allergy Immunol. 1998. 117(4):270-275.

5. Fu Y.-K., Arkins S., Wang B.S., Kelley K.W. / A novel role of growth hormone and insulin-like growth factor-1. Priming neutrophils for superoxide anion secretion. //J. Immunol. 1991. 146(5): 1602-1608.

6. Fuchs A., Dagher M.C. / Activation of the CVgenerating NADPH oxidase in a semi recombinant cell-free system, assessment of the function of Rac in the activation process. 11 Eur. J. Biochem. 1994. 224:587-595.

7. Hall A. / The cellular functions of small OTP-binding proteins. // Science, 1990. 249:635-640.

8. Hallett M.B., Lloyds D, / The molecular and ionic signaling of neutrophils, //Landes Bioscience, Austin, Texas. USA. 1997, 211 p,

9. Hallett M.B., Lloyds D, / Neutrophil priming: the cellular signals that say 'amber' but not 1green\ // Immunology Today. 1995.16(6):264-268,

10. Harvath L, Leonard EJ / Two neutrophil populations in human blood with different chemotactic activity: separation and chemotactic binding. // Infect. Immun. 1982. 36:443-448.

11. Haydek JM, Keshavarzian A / Circulating neutrophils from patients with ulcerative colitis have a normal respiratory burst. // Inflammation. 1995. 19(6):701-15.

12. Her JH, Lakhani S5 Zu K5 Vila J, Dent P5 Sturgill TW5 Weber MJ / Dual phosphorylation and autophosphorylation in mitogen-activated protein (MAP) kinase activation. //Biochem. J. 1993. 296(1): 25-31.

13. Hirano T. I Molecular basis underluing functional pleotropy of cytokines and growth factors. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. 260:303-308.

14. Hoffman J.F., Keil M.L., Riccobene T.A., Omann G.M., Linderman J J. / Interconverting receptor states at 4 degrees for neutrophil N-formyl peptide receptor. //Biochemistry. 1996. 35(40):!3047-55.

15. Hu T.H., Bei L., Qian Z.M., Shen X. / Intracellular free calcium regulates the onset of the respiratory burst of human neutrophils activated by phorbol myristate acetate. //Cell Signal. 1999. ll(5):355-60.

16. Huang C.-K. / Protein kinases in neutrophils: a review. // Membrane Biochemistry. 1989. 8:61-79.

17. Hughes D.A., Smith G.C., Davidson J.E., Murphy A.V., Beattie T.J. / The neutrophil oxidative burst in diarrhaea-associated haemolytic uraemic syndrome. //Pediatr. Nephrol. 1996. 10(4):445-7.

18. Hurst JK, Loehr T.M, Curnutte J.T., Rosen H. / Resonance Raman and electron paramagnetic resonance structural investigations of neutrophil cytochrome b558. //J. Biol. Chem. 1991. 266:1627-1634.

19. Iyer S.S., Pearson D.W. I Evidance for a readily dissoable complex of p47phox and p67phox in cytosol of unstimulated human neutrophils. 11 J. Biol. Chem. 1994. 269: 22405-22411.

20. Iacono V.J., Singh S., Golub L.M., Ramamurthy N.S., Kaslick R. / In vivo assay of crevicular leukocyte migration. Its development and potential applications. //J. Periodontol. 1985.56(11):56-62.

21. Ye R.D., Quehenberger O., Thomas K.M., Navarro J., Cavanagh S.L., Prossnitz E.R., Cochrane C.G. / The rabbit neutrophil N-formyl peptide receptor. cDNA cloning, expression, and structure/function implications. 11 J. Immunol. 1993.150(4): 1383-94,

22. Zhang H., Garlichs C.D., Mugge A., Daniel W.G, / Involvement of tyrosine kinases, Ca2+ and PKC in activation of mitogen=activated protein (MAP) kinase in human polymorphonuclear neutrophils. If J. Physiol. (Lond). 1998. 513(2):359-67.

23. Zu Y.L., Ai Y., Gilchrist A., Labadia M.E., Sha'afi R.I,, Huang C.K. / Activation of MAP kinase-activated protein kinase 2 in human neutrophils after phorbol ester or fMLP peptide stimulation. // Blood. 1996. 87 (12): 5287-5296.

24. The Committee on standardized genetic nomenclature for mice. Standardized nomenclature for inbred strains of mice. Second listing. Cancer Research. 1960. 20(2): 145-169.1. Благодарности