Микобионты эктомикориз Picea abies (L. ) Karst. в ельнике черничном Ленинградской области тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.24, кандидат биологических наук Иванов, Дмитрий Михайлович

• Иванов, Дмитрий Михайлович
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Иванов, Дмитрий Михайлович

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Термины, используемые в работе

1.2. Роль эктомикоризы в биоценозах

1.3. Методы, применяемые для изучения микоризообразующих грибов

Глава 2. Природные условия района исследований

2.1. Общая характеристика природных условий района исследований

2.2. Характеристика пробной площади

Глава 3. Материалы и методы исследования

3.1. Основные этапы подготовки эктомикоризных окончаний для анализа

3.3. Анализ изолятов молекулярными методами

Глава 4. Идентификация микобионтов эктомикоризных окончаний Picea abies

4.1. Типы эктомикоризных окончаний на пробной площади

4.2. Анализ ДНК микобионтов методом ITS риботипирования

4.3. Видоидентификация микобионтов методом секвенирования ДНК

Глава 5. Анализ пространственного распределения эктомикоризных грибов на пробной площади

5.1. Горизонтальное и вертикальное распределение идентифицированных 77 микобионтов в почве исследованной пробной площади

5.2. Сравнительный анализ данных молекулярной идентификации 83 микобионтов с результатами картирования спорокарпов

5.3. Реакция эктомикоризных грибов на изменения в растительном 87 сообществе

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Микобионты эктомикориз Picea abies (L. ) Karst. в ельнике черничном Ленинградской области»

Актуальность темы

История изучения эктотрофной микоризы насчитывает уже более ста лет. За это время накоплен огромный материал о данном явлении.

Исследованы физиологические процессы, сопровождающие эктомикоризный симбиоз (Келли, 1952; Лобанов, 1953; Шемаханова, 1962; Селиванов, 1981). Достигнуты большие успехи в изучении роли грибов в минеральном питании растений (Harley, 1989; Cairney, Smith, 1993; Dighton et al., 1993; McElhinney, Mitchell, 1993; Chalot et al., 1995; Prabhu et al., 1995).

Большое внимание уделялось применению искусственной микоризации для восстановления лесов (Келли, 1952; Чмыр, 1977; Сентяброва, 1988; Tosh et al., 1993; Работнов, 1994). Проводилось изучение биоценотических взаимодействий микоризообразующих грибов с другими компонентами биоценоза (Каламээс, 1977; Столярская, 1992,1998; Erland, 1995; Dahlberg et al., 1997).

До последнего времени представления о распространении мицелия эктомикоризных грибов в почве складывались на основе анализа частоты встречаемости и расположения плодовых тел. Попытки выявить виды микобионтов на основе анатомо-морфологических признаков эктомикоризных окончаний и сравнить с видовым разнообразием, установленным по плодовым телам, наталкиваются на определенные трудности.

В то время как многие виды почвенных микромицетов и бактерии можно определить после посева в культуру, идентифицировать эктомикоризообразующие грибы, выделенные из микоризных окончаний, чрезвычайно сложно, а часто и невозможно, так как они, за редким исключением (например виды родов Suillus, Xerocomus), не растут в культуре (Clint et al., 1991; Shaw et al, 1992; Leyval et al., 1997; Vodnik et al., 1998).

Исследователи неоднократно пытались классифицировать эктомикоризные окончания, используя различную степень детализации описаний. Это должно было привести к созданию определителей микоризообразующих грибов по анатомо-морфологическим признакам эктомикоризных окончаний. Но эта задача к настоящему времени не решена.

Современные методы молекулярного анализа позволяют выделить ДНК эктомикоризообразующего гриба из эктомикоризного окончания, нарастить целевой участок ДНК, используя метод полимеразной цепной реакции, проанализировать полученный фрагмент методом риботипирования (ITS/RFLP), провести секвенирование и идентифицировать полученную последовательность, сравнивая ее с международным банком данных (INSD) (Gardes et al., 1996; Dahlberg et al., 1997; Jonsson et al., 1999; Agerer et al., 2002; Haug, 2002).

Идентификация микобионтов непосредственно из эктомикоризных окончаний современными методами позволит составить более ясное представление о сложной пространственной структуре сообщества грибов в устойчивой экосистеме со сложившимися отношениями (Коваленко, 1998). Цель и задачи исследования

Цель работы - провести пилотное исследование по молекулярной идентификации и анализу распределения в почве микобионтов эктомикориз Picea abies (L.) Karst в ельнике черничном на пробной площади (Карельский Перешеек, Ленинградская область) и сравнить полученные данные с анатомо-морфологическими характеристиками микоризных окончаний и результатами ранее проведенного исследования по картированию спорокарпов на той же пробной площади.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:

1. Выявить основные анатомо-морфологические типы эктомикоризных окончаний на пробной площади в ельнике черничном и изучить их распределение по профилю почвы.

2. Экстрагировать геномную ДНК и амплифицировать в ПЦР ядерную рДНК микобионтов.

3. Провести риботипирование микобионтов (разбивку на группы путем рестрикционного анализа рДНК спейсеров).

4. Идентифицировать микобионты путем секвенирования (определения нуклеотидной последовательности) амплифицированных в ПЦР рДНК микобионтов и сравнения последовательностей, с использованием международной базы данных.

5. Установить соответствие выявленных видов эктомикоризообразующих грибов с морфологическими типами эктомикоризных окончаний и проанализировать их распределение по профилю почвы.

6. Провести сравнительный анализ полученных данных по молекулярной идентификации микобиоитов и типам микоризных окончаний с ранее полученными результатами по картированию спорокарпов микоризных грибов на той же пробной площади.

7. На основе полученных данных рассмотреть особенности колонизации субстрата эктомикоризными грибами и спрогнозировать их реакцию на локальные нарушения почвенного покрова.

Научная новизна

Впервые в России проведена молекулярная идентификация микобионтов из эктомикоризных окончаний путем секвенирования рДНК и сравнения с международной базой данных. Причем, для старовозрастного елового леса такое исследование проведено впервые в мире. В результате идентифицировано 3 вида микобионтов и определено родство с 6-ю видами или группами видов.

На основе полученной информации в работе впервые построены схемы вертикального и горизонтального распределения видов эктомикоризообразующих грибов по профилю почвы в сложной естественной системе.

Полученные данные о видовом составе микобионтов, обитающих на корнях, и типах эктомикоризных окончаний, ими образуемых, дали возможность впервые провести сравнение видового разнообразия макромицетов в почве с данными многолетнего картирования плодовых тел. Практическое значение

Результаты исследования являются вкладом в изучение такого сложного и многогранного явления как микосимбиотрофизм.

Состав выявленных микобионтов эктомикоризных окончаний в старовозрастном ельнике можно принять в качестве эталонного при исследовании других растительных сообществ, в том числе и нарушенных.

Разработан алгоритм идентификации микобионтов эктомикоризных окончаний из почвенных проб, который рекомендуется использовать при аналогичных исследованиях.

Полученные сведения, могут быть использованы при разработке мероприятий по восстановлению леса. Апробация работы

Результаты исследования были представлены на VI Молодежной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 12-16 мая 1997 г.), на конференции "Жизнь популяций в гетерогенной среде" (Йошкар-Ола, 16-20 февраля 1998 г.), на Международной конференции "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии" (Москва, апрель 1998 г.), на конференции "Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков", проводившейся в рамках Н(Х) съезда Русского ботанического общества (Санкт-Петербург, 26-29 мая 1998 г.), на Международной конференции "Биологические основы изучения, освоения и охраны животного и растительного мира, почвенного покрова восточной Фенноскандии" (Петрозаводск. 6-10 сентября 1999 г.), на Международной конференции "Микология и криптогамная ботаника в России: традиции и современность" (Санкт-Петербург, 24-28 апреля 2000 г.), на VII Молодежной конференций ботаников (Санкт-Петербург, 15-19 мая 2000 г.), на 1 Съезде микологов России (Москва, 11-13 апреля 2002 г.). Публикация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано десять работ. Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, пяти глав и выводов. Текст, включая приложения, изложен на 143 страницах и иллюстрирован 6 таблицами, 27 рисунками и 12 приложениями. Список используемой литературы включает 215 работ, из которых 112 на иностранных языках.

Заключение диссертации по теме «Микология», Иванов, Дмитрий Михайлович

Выводы

1. В результате исследования, проведенного на пробной площади размером 20x20 м в ельнике черничном (Карельский Перешеек, Ленинградская область) в 3 квадратах по 1 м2 выявлены эктомикоризные окончания Picea abies из гумусового-оподзоленного и иллювиального почвенных горизонтов. На основе морфологических признаков и анатомического строения чехла они разделены на пять типов (I- коричневая папоротниковидная с чехлом толщиной до 110 мкм.; II - коричневая простая с чехлом толщиной до 60 мкм; III - черная простая с чехлом 100-110 мкм и отходящими черными длинными щетинистыми гифами; IV - черная простая с двойным чехлом: снаружи стекловидный прозрачный слой толщиной до 40 мкм, далее черный - толщиной до 60 мкм; V - черная разветвленная гладкая с чехлом толщиной 150-160 мкм.). Максимальное количество (45%) эктомикоризных окончаний сосредоточено в верхней части гумусового оподзоленного горизонта А12.

2. Из 211 образцов выявленных эктомикоризных окончаний в 77 случаях (36.5%) успешно выделена и ПЦР амплифицирована рДНК. В - результате риботипирования 77 изолятов разбиты на 9 групп (31 изолят) в I квадрате, 7 групп (20 изолятов) во II квадрате и 7 групп (26 изолятов) в III квадрате.

3. Из 23 представителей «рибо-групп» в 19 случаях (82.6%) успешно определена последовательность области ITS1 и 5,8S рДНК. В результате идентифицировано 3 вида микобионтов (Rozites caperata, Suillus variegatus, Cortinarius traganus) и определено родство с известными видами или группами видов (Paxilhis involutus; Amanita fulva; Clavulina cinerea; Russula postiana и Russula integra; Russula foetens и Russula integra; Lactarius mitissimus, Lactarius fulvissimus и Arcangeliella borziana). Одну последовательность, представленную 3-я изолятами в III квадрате, не удалось однозначно приписать ни к. одному из известных грибов .

4. В 4 случаях - представляющих 25 изолятов - 32.5% от общего количества амплифицированных образцов, в основном выделенных из V типа эктомикоризных окончаний - микобионты идентифицировать не удалось из-за наложения хроматограмм при секвенировании, что может быть обусловлено присутствием в эктомикоризных окончаниях двух и более разных видов

5. Выявлена видоспецифичность некоторых типов эктомикоризных окончаний. Так, папоротниковидные эктомикоризные окончания I типа образованы видом

Paxillus involutus, черная эктомикориза с двойным чехлом IV типа - с видом Russula sp. I.

6. Количественно молекулярно-идентифицированные микобионты эктомикоризных окончаний (6-7 в разных квадратах) совпадают с числом видов, чьи плодовые тела отмечены в окрестностях 3x3 м у места отбора почвенных проб (6 видов). Однако, перекрывание списков составляет лишь два вида -Paxillus involutus и Amanita fulva. Молекулярно идентифицированы Clavulina cinerea, Suillus variegatus, Cortinarius traganus, плодовые тела которых не были обнаружены на пробной площади.

7. На основе полученных данных прогнозируется, что в случае выгорания верхнего слоя почвы в восстановлении леса прежде всего примут участие микобионты -Russula sp.I, Amanita fulva, Rozites caperata, Suillus variegatus, Clavulina cinerea -образующие эктомикоризные окончания Picea abies как в горизонте А12, так и в горизонте В, в отличии от видов - Paxillus involutus, образующего папоротниковидные эктомикоризные окончания I типа, Cortinarius traganus, Russula sp.II, обнаруженых только в почвенном горизонте Ап.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Иванов, Дмитрий Михайлович, 2003 год

1.Д., Юрковская Т.К. Геоботаническое районирование Нечерноземья европейской части РСФСР. J1.: Наука. 1989. 64 с.

2. Афанасьева М.М., Великанов Л.Л. Участие микромицетов в процессах биодеструкции лесного опада и их влияние на прорастание семян ели II Микол. и фитопатол. 1989. Т. 23, вып. 4. С. 305-306.

3. Афанасьева М.М., Великанов Л.Л., Сивочуб O.A. Макромицеты подстилки в лесных биогеоценозах // Вестник Моск. ун-та. Сер. Биология. 1991, № 1. С. 40-46.

4. Афанасьева М.М., Лысиков А.Б., Антонова Т.Я. Биодеструкция лесной подстилки под действием микромицетов // В сб.: Изучение грибов в биогеоценозах:' Тез. докл. IV Всесоюзной конференции, Пермь. Свердловск: Полиграфист. 1988. С. 4.

5. Ахромейко А.И. Роль микориз в жизни леса // Лесное хозяйство. 1950, № 5. С. 1825.

6. Баранова Е.В., Сорокина И.А. Флора окрестностей пос. Кузнечное (Ленинградская обл., Приозерский р-н.) // Вестник С.-Петербург/ ун-та. Сер. Биология. 1998. №3, вып. 1. С. 15-29.

7. Бархатова М.Р. Агроклиматический справочник по Ленинградской области. Л.: Гидрометеоиздат. 1959. 176 с.

8. Белкин И.Н., Погодин В.Л. Природа Ленинградской области. СПб: Образование. 1995. 80 с.

9. Белова Н.И., Сивочуб O.A. Макромицеты-симбиотрофы в отечественных и зарубежных коллекциях // В сб.: Экология и плодоношение макромицетов-симбиотрофов древесных растений. Тез. докл. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН. 1992. С. 22-23.

10. Биологический энцеклопедический словарь. М.: Советская энциклопедия. 1989. 864 с.

11. Бисько Н.А, Билай В.Т. Влияние бактерий рода Bacillus на жизнедеятельность вешенки обыкновенной Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. в частично замкнутой искуственной экосистеме // Микол. и фитопатол. Т. 29. 1995, вып. 5-6. С. 1-7.

12. Булат С.А., Мироненко Н.В. Идентификация грибов и анализ их генетической изменчивости методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с геноспецифичными и неспецифичными праймерами // Генетика. 1996. Т. 32, № 2.13