Регуляция синтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius в стационарной фазе роста рекомбинантных штаммов Bacillus subtilis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Частухина, Инна Борисовна

• Частухина, Инна Борисовна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Частухина, Инна Борисовна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Механизмы регуляции биосинтеза внеклеточных ферментов у грамположительных бактерий.

• 1. Общие положения.

1.1. РНК-полимераза.

1. 2. Сигма факторы транскрипции.

1.3. Регуляция экспрессии генов B.subtilis на уровне транскрипции.

2. Регуляция синтеза катаболических ферментов.

3. Регуляция экспрессии генов бактерий в стационарной фазе роста.

3.1. Общие механизмы ответа бактериальных клеток на стресс.

3.2. Участие двухкомпонентных систем сигнальной трансдукции в клеточной дифференцировке.

3.3. Регуляция экспресии генов при спорообразовании.

3.3.1. Механизмы инициации спорообразования.

3.3.2.Факторы транскрипции и механизм дифференциальной экспрессии генов.

3.3.3. Регуляция процесса прорастания спор.

II. Глутамилэндопептидазы бацилл.

1. Принципы классификации протеиназ.

2. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов - новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ.

J. Структура и свойства глутамилэндопептидаз.

4. Глутамилэндопептидаза B.intermedius: характеристика и особенности синтеза фермента.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция синтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius в стационарной фазе роста рекомбинантных штаммов Bacillus subtilis»

Актуальность проблемы. Представители рода Bacillus в ходе эволюции выработали сложную и разветвленную регуляторную систему, которая включает транскрипционную модификацию группы генов, контролирующих клеточную дифференцировку, индукцию ряда стрессовых белков, а также синтез ферментов деградации (рибонуклеаз, протеиназ, фосфатаз и др.). В основе формирования бактериями адаптивных ответов лежит механизм сигнальной трансдукции, а именно, двухкомпонентная система регуляции экспрессии генов. Определенные гены активируются регуляторными белками разных двухкомпонентных систем. Сложные взаимодействия между двухкомпонентными системами, образующими сеть сигнальной трансдукции, контролируются на более высоком уровне, объединяющем все генетические ответы клетки. Вклад разных систем регуляции в контроль экспрессии гена можно оценить с помощью модельных систем с мутациями в регуляторных белках. Определение молекулярных механизмов регуляции синтеза гидролитических ферментов позволит направленно влиять на уровень продукции тех из них, которые интересны в практическом отношении. Протеиназы бацилл широко используются в медицине: при лечении ожоговых поражений, для ускорения заживления ран, при защите организма от вирусных инфекций и роста раковых клеток, а также в производстве моющих средств, кожевенной и пищевой промышленности.

Бактерии B.intermedius наряду с рибонуклеазой и фосфатазой секретируют сериновые протеиназы, одна из которых относится к группе глутамилэндопептидаз - ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные карбоксильными группами глутаминовой и аспарагиновой кислот (Leschinskaya et al., 1997). Клонирование и секвенирование гена глутамилэндопепидазы B.intermedius (Rebrikov et al., 1999) открыло возможность изучения механизмов регуляции биосинтеза фермента. В связи с тем, что бациллярные ферменты имеют практическую значимость, результаты исследования регуляции их синтеза могут быть использованы в биотехнологии, например, для повышения выхода ферментов путем клонирования и модификации генов с эффективными регуляторными элементами.

Целью работы явилось выяснение молекулярных механизмов регуляции биосинтеза глутамилэндопептидазы В. intermedins, синтезируемой рекомбинантными штаммами B.subtilis в стационарной фазе роста.

В работе решались следующие задачи:

1. Исследование закономерностей биосинтеза глутамилэндопептидазы B.intermedius рекомбинантными штаммами B.subtilis под влиянием различных экзогенных факторов в стационарной фазе роста бактерий.

2. Анализ структуры промоторной области гена глутамилэндопептидазы B.intermedius.

3. Выяснение роли регуляторных белков двухкомпонентной сигнально-сенсорной системы KinA/SpoOF/SpoOA в регуляции экспрессии гена глутамилэндопептидазы В. intermedius.

4. Исследование влияния спороспецифичных о-факторов транскрипции на экспрессию гена глутамилэндопептидазы B.intermedius.

5. Определение вклада регуляторных Ger-белков, активных в период прорастания спор, на регуляцию экспрессии гена глутамилэндопептидазы B.intermedius.

Научная новизна. К началу настоящей работы интерес исследователей был направлен на изучение регуляции синтеза бациллярной внеклеточной сериновой протеиназы - глутамилэндопептидазы - факторами внешней среды. Новизна данной работы заключается в качественно новом уровне изучения регуляторных механизмов биосинтеза данного фермента Впервые проведено изучение регуляции синтеза глутамилэндопептидазы B.intermedius на молекулярном уровне в связи с процессом клеточной дифференцировки. Выяснены основные закономерности биосинтеза глутамилэндопептидазы B.intermedius рекомбинантными штаммами B.subtilis в стационарной фазе роста бацилл. Впервые установлено, что в стационарной фазе экспрессия гена глутамилэндопептидазы не регулируется по типу катаболитной репрессии, в отличие от стадии вегетативного роста бактерий. Получены приоритетные данные, свидетельствующие о том, что экспрессия гена глутамилэндопептидазы B.intermedius подвергается позитивной регуляции со стороны основных регуляторных белков системы SpoOA-фосфопереноса, спороспецифичных а-факторов транскрипции, регуляторных Ger-белков. Полученные результаты позволили установить, что контроль активности гена gse Bi осуществляется по перекрестному типу регуляции.

Практическая ценность работы. Разработана питательная среда, обеспечивающая высокий уровень продукции глутамилэндопептидазы B.intermedius рекомбинантными штаммами B.subtilis в стационарной фазе роста, которая может быть использована для препаративного получения фермента. Сведения об установленных механизмах контроля экспрессии гена глутамилэндопептидазы в стационарной фазе роста могут быть полезны при разработке стратегии направленного синтеза протеолитических ферментов промышленными штаммами спорообразующих бактерий. Данные о механизмах функционирования регуляторных систем поздних белков бацилл могут • послужить основой для направленной модификации промоторной области гена с целью получения высокопродуктивных штаммов в условиях ограниченного роста бацилл.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на Международном конгрессе по микробиологии FEMS "Bacillus-2003" (Словения, 2003), 7-ом Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов в области биотехнологии "Биотехнология-2003" (Пущино, 2003), ежегодных научных конференциях молодых ученых, ф аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003, 2004) и ежегодных школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003, 2004), 3-й Междисциплинарной конференции с международным участием ("НБИТТ-21") (Петрозаводск, 2004), Всероссийской научной конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. Механизмы регуляции биосинтеза внеклеточных ферментов у грам-положительных бактерий 1. Общие положения

1.1. РНК-полимераза

В геноме бактерий содержится информация о тысячах различных белков, необходимых для функционирования клетки и адаптации к изменениям условий окружающей среды. Присутствие того или иного белка в необходимом количестве на определенном этапе развития клетки обеспечивается за счет разнообразных регуляторных механизмов, выработанных в процессе эволюции. Наиболее важный вклад в регуляцию биосинтеза белков вносят механизмы контроля уровня экспрессии генов, кодирующих эти белки. Регуляция экспрессии генов осуществляется, главным образом, на этапе инициации транскрипции (Klier et al., 1992) и ключевым ферментом этого процесса является ДНК-зависимая РНК-полимераза.

Для инициации синтеза РНК с ДНК-матрицы требуется наличие дополнительного полипептида - о-фактора транскрипции, "узнающего" промотор - консервативную последовательность нуклеотидов, расположенную выше стартовой точки транскрипции (Wosten, 1998). Сигма факторы - это се*мейство родственных белков малого размера, способных к обратимой ассоциации с кор-ферментом РНК-полимеразы. Такая ассоциация приводит к образованию комплекса, именуемого холоферментом РНК-полимеразы (Wosten, 1998). Взаимодействие фермента с промотором приводит к образованию "закрытого" комплекса, который превращается в "открытый" при "расплавлении" короткого участка ДНК внутри последовательности, связанной РНК-пол имеразой. После этого РНК-полимераза начинает продуцировать маленькие, состоящие из 2-12 нуклеотидных остатков, молекулы РНК, но остается при этом в области промотора. После диссоциации сг-субъединицы фермент приобретает способность двигаться вдоль ДНК, синтезируя полноценную молекулу РНК. Фермент и вновь синтезированная молекула РНК отделяются друг от друга в момент встречи с терминаторной структурой или фактором терминации.

ДНК при этом полностью возвращается в состояние дуплекса (Record et al., 1996).

Большинство видов бактерий синтезируют несколько а-факторов, различающихся между собой по аминокислотному составу и способности связывать те или иные промоторы бактериальных генов. Это позволяет РНК-полимеразе узнавать разные классы промоторов, отличающиеся друг от друга наличием специфических консервативных последовательностей. Такое разнообразие а-факторов и промоторов способствует более тонкой регуляции процессов метаболизма в клетке, что обеспечивает адекватный ответ микроорганизмов на постоянно меняющиеся условия окружающей среды (Wosten, 1998).

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Частухина, Инна Борисовна

выводы

1. Рекомбинантные штаммы B.subtilis AJ73, несущие плазмиды pV и А58.21, выделяют в среду глутамилэндопептидазу в период стационарной фазы роста с максимальной активностью на 48-й и 78-й часы роста культур, соответствующей V и VII стадиям спорообразования. Синтез фермента на этой стадии роста активируется в присутствии в среде белковых субстратов, ионов кальция, неорганического фосфата и не подавляется глюкозой.

2. В промоторной области гена глутамилэндопептидазы B.intermedius выявлены нуклеотидные последовательности, гомологичные сайту связывания со SpoOA-регуляторным белком, участвующим в инициации споруляции (71-86%), последовательности для взаимодействия с регуляторным белком AbrB - плейотропным репрессором ранних генов споруляции (81%) и участки, с гомологией к консенсусному сайту связывания с белком катаболитного контроля СсрА (71-78%). Обнаружены участки ДНК с гомологией к сайтам связывания с вегетативными и спороспецифичными сигма-факторами транскрипции

3. Регуляторные белки двухкомпонентной системы SpoOA-фосфопереноса участвуют в позитивной регуляции экспрессии гена gse Bi: уровень экспрессии гена в штаммах, мутантных по SpoO-белкам снижается на 1575%. Регуляторный белок AbrB участвует в негативной регуляции экспрессии гена gse Bi.

4. Регуляция экспрессии гена gse Bi со стороны спороспецифических факторов транскрипции не является выраженной: при инактивации аЕ, oF, о0, ок и ан факторов транскрипции уровень экспрессии гена глутамилэндопептидазы B.intermedius снижается на 20-65%.

5. Экспрессия гена gse Bi подвергается позитивной регуляции со стороны Ger-белков, вовлеченных в процесс прорастания спор: уровень экспрессии гена глутамилэндопептидазы B.intermedius в штаммах, мутантных по Ger-бвлкам снижается на 25-50 %.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из условий выживания бактерий является способность быстро реагировать на вне- и внутриклеточные сигналы, отражающие изменения в окружающей среде. Первичная реакция на стресс у микроорганизмов заключается в индукции синтеза группы новых белков, ответственных за общий и специфический клеточный ответ. Адаптация бактерий к меняющимся условиям1 существования включает в себя широкий круг явлений: индукция подвижности и компетентности клеток, синтез и секреция гидролитических ферментов, продукция антибиотиков и, наконец, образование спор. Регуляция сложных процессов, происходящих в бактериальной клетке в обычных условиях и в условиях стресса, происходит на уровне инициации транскрипции определенных генов. В случае перехода бактериальной культуры к спорообразованию запускается программа дифференциальной генной экспрессии, некоторые из регуляторных механизмов которой установлены. Другие аспекты развития этой программы остаются неясными, в том числе вопрос о вкладе в ее реализацию гидролитических ферментов, продуцируемых бациллами в период спорообразования.

Протеолитические ферменты выполняют в бактериальной клетке ряд жизненно важных функций: участвуют в деструктивных катаболических процессах и в клеточной дифференцировке, функционируют на этапе посттрансляционного процессинга белков, осуществляют селективный протеолиз белков, связанный с изменением метаболизма. В настоящее время достаточно хорошо изучены структура, физико-химические и каталитические свойства глутамилэндопептидаз - внеклеточных ферментов подсемейства сериновых протеиназ, относящееся к семейству химотрипсина. Сведения об их локализации, клеточном топогенезе в процессе секреции и механизмах освобождения в среду отсутствуют. Остаются неясными функции этих ферментов и пути их регуляции. В настоящее время в литературе накапливаются данные о корегуляции экспрессии генов, отвечающих за синтез внеклеточных протеиназ, с физиологическими событиями, происходящими с клетками бацилл. Синтез протеиназ и спорогенез связаны на уровне регуляции и Цаходятся под контролем катаболитной репрессии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. В качестве штамма-реципиента для плазмид с геном глутамилэндопептидазы B.intermedius использовали штамм B.subtilis AJ73 (amyE4, npr512, dpr73), из хромосомы которого делетированы гены с/ с/ внеклеточных протеиназ, любезно предоставленный проф. И.Иомантасом, ГНИИ Генетика. Бактериальные штаммы B.subtilis, дефектные по spo-, kin- и ger-генам, получены из коллекции Bacillus Genetic Stock Center (BGSC) и перечислены в табл.2.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Частухина, Инна Борисовна, 2004 год

1. Балабан Н.П. Щелочная внеклеточная протеиназа Bacillus intermedius. Выделение, очистка и некоторые свойства фермента / Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, A.M. Усманова, Е.А. Ицкович, И.Б. Лещинская // Биохимия. -1993. Т.58. - №. 12. - С. 1923-1928.

2. Балабан Н.П. Секретируемая протеиназа спорообразующих бактерий Bacillus intermedius / Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, Е.А. Ицкович, И.Б. Лещинская, Г.Н. Руденская // Биохимия. 1994. - Т.59. - №. 9. - С. 10331037.

3. Гловер Д.М. Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ./ Д.М. Гловер. — М.: Мир, 1988.- 538 с.

4. Головлев Е.Л. Введение в биологию стационарной фазы бактерий: механизм общего ответа на стрессы / Е.Л. Головлев // Микробиология. 1999. -Т. 68.-№5.-С. 623-631.

5. Гусев М.В. Микробиология. / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. -М.: Изд. Московского университета, 1985. 376с.

6. Демина Н.Н. Сенсорно-регуляторные системы бактерий / Н.Н. Демина, С.Г. Камзолова // Успехи современной биологии. 1992. - Т.26. - С. 13381349.

7. Ерохина Л.И. Щелочные протеиназы рода Bacillus / Л.И. Ерохина, Е.О. Добржанская // Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. Под. ред. Имшнецкого А.А. М.: Мир, 1979. - С. 244 - 280.

8. Иваница В.А. Влияние аминокислот как единственного источника азота на биосинтез экзопротеаз Aspergillus candidus / В.А. Иваница, Н.С. Егоров, М.А. Аль-Нури // Микробиология. 1978. - Т. 47. - №3. - С. 424-429.

9. Ицкович Е.Л. Биосинтез щелочной внеклеточной протеиназы Bacillus intermedius / Е.Л. Ицкович, Л.В. Знаменская, Н.П. Балабан, Т.А. Ершова, И.Б. Лещинская // Микробиология. 1995. - Т.64. - №.5. - С. 623-629.

10. Колев Д.А. Репрессия синтеза у штамма 90-11-формы Bacillus mesentericus аминокислотами / Д.А. Колев // Микробиология. 1986. - Т. 55. - №4. - С 295-300.1

11. Костров С.В. Структурные детерминанты, существенные для функционирования и стабильности протеолитических ферментов: Автореферат дис. . д-ра хим. наук / С.В. Костров; Ин-т молекулярной генетики РАН. М., 2001.-44с.

12. Льюин Б. Гены.: В 3 т. Т.2. М.: Мир, 1987. 544 с.

13. Мосолова О.В. Glu, Asp-специфичная протеиназа актиномицетов / О.В. Мосолова, Г.Н. Руденская, В.М. Степанов, О.М. Ходова, И.А. Цаплина // Биохимия. 1987. - Т.52. - №3. - С. 414-422.

14. Нестерова Н.Г. Субстратная специфичность ферментов Bacillus mesentericus / Н.Г. Нестерова, Г.В. Чернесова, Н.Ф. Кириллова // Микробиология. 1989. - Т.58. - №.4. - С. 553-556.

15. Новикова Т.М. Внеклеточная протеаза Bacillus alvei В-724 / Т.М. Новикова, С.Н. Выборных, Н.С. Егоров, Ж.К. Лория // Прикл. биохимия и микробиология. 1986. - Т. ,22. - №6. - С. 772-777.

16. Павлова И.Н. Сериновая протеиназа с литическими свойствами / И.Н. Павлова, М.Г. Жолнер, И.Я. Захарова, Н.З. Тиньянова, Г.Г. Честухина, В.М. Степанов // Микробиология. 1988. - Т. 57. - №. 3. - С. 398-405.

17. Прист Ф. Промышленные продукиы бацилл и их применение / Ф. Прист // Бациллы. Генетика и биотехнология. Под. ред. Харвуда К. М.: Мир, 1992.-С. 236-298.

18. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизиров / Г.Н. Руденская // Биоорг. химия. 1994. - Т.20. - №5. - С.475-484.

19. Руденская Г.Н. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ / Г.Н. Руденская // Биоорг. химия. -1998. - Т.24. - №4. - С.256-261.

20. Серкина А.В. Структура и функции предшественников бактериальных протеиназ / А.В. Серкина, А.Б. Шевелев, Г.Г. Честухина // Биоорг. химия. 2001. - Т. 27. - №5. - С. 323-346.

21. Хайдарова Н.В. Glu, Asp-специфичная протеиназа из Streptomyces thermovulgaris I Н.В. Хайдарова, Г.Н. Руденская, Л.П. Ревина, В.М. Степанов, Н.С. Егоров // Биохимия. -1989. Т.54. -№.1.-С. 4б-52.

22. Хайдарова Н.В. Тиолзависимая сериновая протеиназа Streptomycesthermovulgaris / Н.В.'Хайдарова, Г.Н. Руденская, Л.П. Ревина, В.М. Степаtнов, Н.С. Егоров // Биохимия. 1990. - Т.55. - №.6. - С. 1110-1118.

23. Цаплина И.А. Синтез нейтральных протеаз микроорганизмами / И.А. Цап-лина // Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. Под. ред. Имш-нецкого А.А. М.: Мир, 1979.- С. 197-244.

24. Шарипова М.Р. Гидролазы Bacillus intermedins: выделение, свойства, локализация: Дис. . д-ра биол. наук / М.Р. Шарипова; Казанский государственный университет. Казань, 2000. - 224с.

25. Шарипова М.Р. Локализация протеолитических ферментов в клетках Bacillus intermedins / М.Р. Шарипова, Е.В. Шакиров, Н.П. Балабан, JI.A. Габ-драхманова, М.А. Шилова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. 2000. - Т. 69. - № 5. - С. 660-667.

26. Шарипова М.Р. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedins / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова, М.А. Шилова, Ю.М. Кадырова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. 2002. - Т.71. - №4. - С. 494-499.

27. Alba В.М. DegS and YaeL participate sequentially in the cleavage of RseA to activate the sigma(E)-dependent extracytoplasmic stress response / B.M. Alba, J.A. Leeds, C. Onufiyk, C.Z. Lu, C.A. Gross // Genes Dev. 2002. - V. 16. -№16.-P. 2156-2168.

28. Banerjee A. Induction of secretory acid proteinase in Candida albigans / A. Banerjee, K. Ganesan, A. Datta // J. Gen. Microbiol. 1991. - V. 137. - P. 24552461.

29. Barlass P.J. Germination of Bacillus cereus spores in response to L-alanine and to inosine: the roles of gerL and gerQ operons / P.J. Barlass, C.W. Houston, M.O. Clements, A. Moir // Microbiology. 2002. - V.148. - P. 2089-2095.

30. Behravan J. Mutations in the gerP locus of Bacillus subtilis and Bacillus cereus affect the access of germinants to their target in the spore / J. Behravan, H. Chi-rakkal, A. Masson, A. Moir//J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 1987-1994.•

31. Bruckner R. Carbon catabolite repression in bacteria: choice of the carbon source and autoregulatory limitation of sugar utilization / R. Bruckner, F. Tit-gemeyer // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - V. 209. - P. 141-148.

32. Burbulys D. The initiation of sporulation in Bacillus subtilis is controlled by a multicomponent phosphorelay / D. Burbulys, K.A. Trach, J.A. Hoch // Cell. -1991.-V.64.-P. 545-552.

33. Carmona C. Nucleotide sequence of the serine protease of St.aureus strain V8 /

34. C. Carmona, G.L. Cray //Nucl. Acid. Res. 1987. - V. 15. - №6. - P. 6757.

35. Cazemier A.E. Effect of sporulation and recovery medium on the heat resistance and amount of injury of spores from spoilage bacilli / A.E. Cazemier, S.F. Wagenaars, P.F. ter Steeg // J. Appl. Microbiol. 2001. - V.90. - № 5. -P.761-770.

36. Clements M.O. Role of the gerl operon of Bacillus cereus 569 in the response of spores to germinants / M.O. Clements, A. Moir // J. Bacteriol. 1998. -V.180. - №24. - P. 6729-6735i

37. Coleman G. A model for the regulation of bacterial extracellular enzyme and toxin biosynthesis / G. Coleman, S. Brown, D.A. Stormonth // J. Theor. Biol. -1975. V.52. - №1. - P.143-148.

38. Corfe B.M. The gerB region of the Bacillus subtilis 168 chromosome encodes a homologue of the gerA spore germination operon / B.M. Corfe, R.L. Sammons,

39. D.A. Smith, C. Mauel // Microbiology. 1994. - V.140. - P. 471-478.

40. Cutting S. The nucleotide sequence and the transcription during sporulation of I the gerE gene of Bacillus subtilis / S. Cutting, J. Mandelstam // J. Gen. Microbiol. 1986. - V. 132. - P. 3013-3024.

41. Dartois V. Characterization of a novel member of the DegS-DegU regulon affected by salt stress in Bacillus subtilis / V. Dartois, M. Debarbouille, F. Kunst, G. Rapoport // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - №7. - P. 1855-1861.

42. Demidyuk I.V. Modification of substrate-binding site of glutamyl endopepti-dase from Bacillus intermedius / I.V. Demidyuk, D.V. Romanova, E.A. Nosovskaya, G.G. Chestukhina, I.P. Kuranova, S.V. Kostrov // Prot. Eng. — 2004. -in press.

43. Drapeau G.R. Purification and properties of an extracellular protease of Staphylococcus aureus / G.R. Drapeau, Y. Boily, J.J. Houmard // J. Biol. Chem. -1972. -V.247. №20.-P.6720-6726.

44. Dubnau D. Genetic competence in Bacillus subtilis / D. Dubnau // Microbiol. Rev. 1991. - V. 55. - №3. - P. 395-424.

45. Eder S. A Bacillus subtilis secreted phosphodiesterase/alkaline phosphatase is the product of a Pho regulon gene, phoD / S. Eder, L. Shi, K. Jensen, K. Ya-mane, F.M. Hulett//Microbiology. 1996. - V. 142. - P. 2041-2047.

46. Engelmann S. Impaired oxidative stress resistance of Bacillus subtilis sigB mutants and the role of katA and katE / S. Engelmann, M. Hecker // FEMS Microbiol. Lett. 1996. - V. 145. - P. 63-69.

47. Errington J. Bacillus subtilis: regulation of gene expression and control of morphogenesis / J. Errington // Microboil. Rev. 1993. - V. 57. - №1. - P. 1-33.

48. Errington J. Establishment of cell-specific transcription during sporulation in Bacillus subtilis / J. Errington, N. Illing // Mol. Microbiol. 1993. - V.6. - №6. -P. 689-695.

49. Eymann C. Induction of sigma(B)-dependent general stress genes by amino acid starvation in a spoOH mutant of Bacillus subtilis / C. Eymann, M. Hecker // FEMS Microbiol. Lett. 2001. - V. 199. - №2. - P.221-227.

50. Fabret C. Two-component signal transduction in Bacillus subtilis: how one organism sees its world / C. Fabret, V.A. Feher, J.A. Hoch // J. Bacteriol. 1999. - V.181. -P.1975-1983.

51. Feavers I.M. The nucleotide sequence of a spore germination gene (gerA) of Bacillus subtilis 168 / I.M. Feavers, J.S. Miles, A. Moir // Gene. 1985. -V.38. -P. 95-102.

52. Feavers I.M. The regulation of transcription of the gerA spore germination op-eron of Bacillus subtilis / I.M. Feavers, J. Foulkes, B. Setlow, D. Sun, W. Nich

53. Nicholson, P. Setlow, A. Moir // Mol. Microbiol. 1990. - V. 4. - №2. - P. 275-282.

54. Ferrari E. Trancription of Bacillus subtilis subtilisin and expression of subtil-isin in sporulation mutants / E. Ferrari, D. Henner, M. Perego, J.A. Hoch // J. Bacterid. 1988.- V. 170. -P.289-295.

55. Gabdrakhmanova L.A. Biosynthesis and localization of glutamylendopeptidase from Bacillus intermedius3-\9 / L.A. Gabdrakhmanova, E.V. Shakirov, N.P. Balaban, M.R. Sharipova, G.N. Rudenskaya, I.B. Leshchinskaya // Microbios. -1999. V.100. -P.97-108.

56. Georgiou G. Optimizing the production of recombinant proteins in microorganisms / G. Georgiou // AICHE J. 1988. - V.34. - P. 1233-1248.

57. Guidi-Rontani C. Identification and characterization of a germination operon on the virulence plasmid pXOl of Bacillus anthracis / C. Guidi-Rontani, Y. Pereira, S. Ruffle, J-C. Sirard, M. Weber-Levy, M. Mock // Mol. Microbiol. -1999.-V. 33.-P. 407-414.

58. Haldenwang W.G. The sigma factors of Bacillus subtilis / W.G. Haldenwang // Microb. Rev. 1995. - V.59. - №1. - P.l-30.

59. Hamoen L.W. The Bacillus subtilis transition state regulator AbrB binds to the -35 promoter region of comK / L.W. Hamoen, D. Kausche, M.A. Marahiel, D.van Sinderen, G. Venema, P. Serror //FEMS Microbiol. Lett. 2003. - V.218. -№2. - P. 299-304.

60. Hartley B.S. Proteolytic enzymes / B.S. Hartley // Ann. Rev. Biochem. 1960. -V.29. - P. 45-72.

61. Hecker M. General stress response of Bacillus subtilis and other bacteria / M. Hecker, U. Volker // Adv. Microb. Physiol. 2001. - V. 44. - P. 35-91.

62. Helmann J.D. Compilation and analysis of Bacillus subtilis сгА-dependent promoter sequences: evidence for extended contact between RNA polymerase and upstream promoter DNA / J.D. Helmann // Nucleic Acids Res. 1995. - V.23. -P. 2351-2360.

63. Helmann J.D. Alternate sigma factors and the regulation of flagellar gene expression / J.D. Helmann // Mol. Microbiol. 1991. - V.5. - P. 2875-2882.

64. Helmann J.D. Homologous metalloregulatory proteins from both Gram-positive and Gram-negative bacteria control transcription of mercury resistance operons / J.D. Helmann, Y. Wang, I. Mahler, C.T. Walsh // J. Bacteriol. 1989. - V.171.-№l.-P. 222-229.

65. Henkin T.M. The role of CcpA transcriptional regulator in carbon metabolism in Bacillus subtilis / T.M. Henkin // FEMS Microbiol. Lett. 1996. - V. 135. - P. 9-15.

66. Henner DJ. Location of targets of the hpr-91, sacU32 (Ну), and sacQ36 (Ну) mutations in upstream region of the subtilisin promoter / D.J. Henner, E. Ferrari, M. Perego, J.A. Hoch // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - №1. - P. 296-300.

67. Hoch J.A. Keeping signals straight in phosphorelay signal transduction / J.A. Hoch, K.I. Varughese // J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - №17. - P.4941-4949.

68. Horsburgh M.J. Transcriptional responses during outgrowth of Bacillus subtilis endospores / M.J. Horsburgh, P.D. Thackray, A. Moir // Microbiology. 2001. -V.147.-P. 2933-2941.

69. Huang X. The Bacillus subtilis sigma (X) protein is an extracytoplasmatic function sigma factor contributing to survival at high temperature / X. Huang, A. Decatur, A. Sorokin, J.D. Helmann // J. Bacteriol. 1997. - V.179. - P.2915-2921.

70. Hudson K.D. Localization of GerAA and GerAC germination proteins in the Bacillus subtilis spore / K.D. Hudson, B.M. Corfe, E.H. Kemp, I.M. Feavers, P.J. Coote, A. Moir// J. Bacteriol. 2001. - V.183. - №14. - P. 4317-4322.

71. Hullet F.M. Sequential action of two-component genetic switches regulates the PHO regulon in Bacillus subtilis / F.M. Hulett, J. Lee, L. Shi, G. Sun, R. Ches-nut, E. Sharkova, M.F. Duggan, N. Kapp // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - №5. -P.1348-1358.

72. Irie R. A germination mutant of Bacillus subtilis deficient in response to glucose / R. Irie, T. Okamoto, Y. Fujita. // J. Gen. Appl. Microbiol. 1982. -V.28.-P. 345-354.

73. Jacob F. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of protein / F. Jacob, J. Monod // J. Mol. Biol. 1961. - V.3. - P. 318-356.

74. Jenkinson H.F. Protease deficiency and its association with defects in spore coat structure, germination and resistance properties in a mutant of Bacillus subtilis / H.F. Jenkinson, H. Lord // J. Gen. Microbiol. 1983. - V.129. - P. 2727-2737.

75. Jin S. Bacillus subtilis genes that code for enzymes involved in acetyl-CoA metabolism. / S. Jin, A.L. Sonenshein // Presented at the Int. Conf. on Bacilli, 6th, Stanford, Caif. 1991.

76. Jonas R.M. The Bacillus subtilis spoIIG operon encodes both oE and gene necessary for oE activation / R.M. Jonas, E.A. Weaver, TJ. Kenney, C.P. Jr. Moran, W.G. Haldenwang //J. Bacteriol. 1988. - V.170. - P.507-511.

77. Klier A. Distinct control sites located upstream from the levansucrase gene of Bacillus subtilis / A. Klier, A. Fouet, M. Debarbouille, F. Kunst, G. Rapoport // Mol. Microbiol. 1987. - V.l. - №2. - P. 233-241.

78. Klier A. Positive regulation in the gram-positive bacterium: Bacillus subtilis / A. Klier, T. Msadek, G. Rapoport // Ann. Rev. Microbiol. 1992. - V.46. - P. 429-459.

79. Laemmli H.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / H.K. Laemmli // Nature. 1970. - V.227. - P. 680-685.

80. Lenski R.E. Stability of recombinant DNA and its effects on fitness / R.E. Lenski, T.T. Nguen // Trends Biotechnol. Ecol. Evol. 1988. - V.6. - P.51-53.

81. Lepesant Y.A. Chromosomal location of mutations affecting sucrose metabolism in Bacillus subtilis / Y.A. Lepesant, F. Kunst, J. Lepesant-Kejzlarova, R. Dedonder// Mol. Gen. Genet. 1972. - V.l 18. -№2. - P. 135-160.

82. Lonetto M. The ст'и family:sequence conservation and evolutionary relationships /M. Lonetto, M. Gribskov, C.A. Gross // J. Bacteriol. 1992. - V.l74. -P. 3833-3849.

83. Losick R. Cascades of sigma factors / R. Losick, J. Pero // Cell. 1981. -V.25. - P. 582-584.

84. Losick R. Crisscross regulation of cell-type-specific gene expression during development in Bacillus subtilis / R. Losick, P. Stragier // Nature. 1992. -V.355. - P.601-604.

85. Martin J. Identification of a new locus, sacV, involved in the regulation of le-vansucrase synthesis in Bacillus subtilis / J. Martin, M. Debarbouille, A. Klier // FEMS Microbiol. Lett. 1987. - V.44. - P. 39-43.

86. Masaki T. Purification and some properties of Achromobacter protease la from Achromobacter lyticus M497-1 / T. Masaki, H. Suzuki, M. Soejima // Agric. Biol. Chem. 1986. - V.50. - №12. - P.3087-3091.

87. Missiakas D. The extracytoplasmatic function sigma factors: role and regulation / D. Missiakas, S. Raina // Mol. Microbiol. 1998. - V.28. - №.6. -P.1059-1066.

88. Moir A. Germination properties of a spore coat-defective mutant of Bacillus subtilis / A. Moir // J. Bacteriol. 1981. - V. 146. - №.3. - P. 1106-1116.

89. Moir A. The genetics of bacterial spore germination / A. Moir, D. A. Smith // Annu. Rev. Microbiol. 1990. - V.44. - P. 531-553.

90. Moir A. Spore germination. / A. Moir // Biology of Bacilli, R. H. Doi, M. McGloughlin (ed.). London: Butterworth-Heinemann, 1992. - P. 23-38.

91. Moir A. Spore germination. / A. Moir, B.M. Corfe, J. Behravan // Cell. Mol. Life. Sci. 2002. - V. 59. - №3. - P. 403-409.

92. Moravcolova J. Repression of the synthesis of exocellular and intracellular proteinases in Bacillus megaterium / J. Moravcolova, J. Chaloupka // Folia Microbiol. 1984. - V.29. - P. 273-281.

93. Msadek T. Signal transduction pathway controlling synthesis of a class of de-gradative enzymes in Bacillus subtilis: expression of the regulatory genes and analysis of mutations in degS and degU / T. Msadek, F. Kunst, D. Henner, A.

94. Klier, G. Rapoport, R. Dedonder // J. Bacteriol. 1990. - V.172. - №2. - P. 824-834.

95. Nienaber V.L. A glutamic acid specific serine protease utilizes a novel his-tidine triad in substrate binding / V.L. Nienaber, K. Breddam, J.J. Birktoft // Biochemistry. 1993. -V.32. - №43. - P.l 1469-11475.

96. Ohara-Nemoto Y. Characterization and molecular cloning of a glutamyl endopeptidase from Staphylococcus epidermidis / Y. Ohara-Nemoto, Y. Ikeda, M. Kobayashi, M. Sasaki, S. Tajika, S. Kimura // Microb. Pathog. 2002. -V.33. -№1.-P. 33-41.

97. Paidhungat M. Localization of a germinant receptor protein (GerBA) to the inner membrane of Bacillus subtilis spores / M. Paidhungat, P. Setlow // J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - P. 3982-3990.р

98. Partridge S. The role of a in prespore-speciflc transcription in Bacillus subtilis / S. Partridge, D. Foulder, J. Errington // Mol. Microbiol. 1991. - V. 5. -P. 757-767.

99. Perego M. Pentapeptide regulation of aspartylphospate phosphatases / M. Perego, J.A. Brannigan // Peptides. 2001. - V.22. - P. 1541-1547.

100. Postma P.W. Phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase systems of bacteria / P.W. Postma, J.W. Lengeler, G.R. Jacobson // Microbiol. Rev. -1993.-V. 6.-P. 543-594.

101. Power S. Secretion and autoproteolytic maturation of subtilisin / S. Power,

102. R.M. Adams, J.A. Wells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V.83. - №5.7 •»1. P.3096-3100.

103. Pragai Z. Regulatory interactions between the Pho and sigma(B)-dependent general stress regulons of Bacillus subtilis / Z. Pragai, C.R. Harwood // Microbiology. 2002.- V. 148.-P. 1593-1602.

104. Predich M. Bacillus subtilis early sporulation genes kin A, spoF, and spoOA are transcribed by the RNA polymerase containing aH / M. Predich, G. Nair, I. Smith // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 2771-2778.

105. Priest F.G. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacilli / F.G. Priest // Bacteriol. Rev. 1977. - V. 41. - P. 711-753.

106. Qi Y. The pst operon of Bacillus subtilis has a phosphate-regulated promoter and is involved in phosphate transport but not in regulation of the pho regulon / Y. Qi, Y. Kobayashi, F.M. Hulett // J. Bacteriol. 1997. - V. 179. - №8. - P. 2534-2539.

107. Qian Q. AbrB is a regulator of the sigma(W) regulon in Bacillus subtilis / Q. Qian, C.Y. Lee, J.D. Helmann, M.A. Strauch // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - V. 211.- №2. -P.219-223.

108. Rather P.N. Negative regulator of oG-controlled gene expression in stationary-phase Bacillus subtilis / P.N. Rather, R. Coppolecchia, H. DeGrazia, C.P.Jr. Moran // J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 709-715.

109. Record M.D. Escherichia coli RNA polymerase (Ест ), promoters, and thetkinetics of the steps of transcription initiation / M.D. Record, W.S. Reznikoff,V

110. M.L. Craig // Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology. 1996.-P. 792-820.

111. Rufo G.A. Jr. Isolation and characterization of a novel extracellular metallo-^ protease from Bacillus subtilis / G.A. Jr. Rufo, B.J. Sullivan, A. Sloma, J.

112. Pero // J. Bacteriol. 1990. - V.172. - №2. - P. 1019-1023.

113. Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

114. Sampath P. Physiological and nutritional factor affecting biosyntesis of extracellular protease by Streptomyces sp. G-157 / P. Sampath, J. Chandrakasan //Microbiol. Rev. 1998. - V. 21. - №1. - P. 55-63.

115. Seto-Young D.L. Studies on calcium transport during growth and sporulation * / D.L. Seto-Young, D.J. Ellar// Microbios. 1981. - V.30. - P. 191-208.

116. Shafikhani S.H. ScoC mediates catabolite repression of sporulation in

117. Bacillus subtilis / S.H. Shafikhani, E. Nunez, T. Leighton // Curr. Microbiol. 2003. - V. 47. - P. 327-336.

118. Simonen M. Protein secretion in Bacillus species / M. Simonen, I. Palva // Micribiol. Rev. 1993. - V. 57. - P. 109-137.

119. Slynn G.M. Molecular genetical and phenotypical analysis of the gerM spore germination gene of Bacillus Bacillus subtilis 168 / G.M. Slynn, R.L. Sammons, D.A. Smith, A. Moir, B.M. Corfe // FEMS Microbiol. Lett. 1994.-V. 121. P. 315-320.

120. Smith I. The role of negative control in sporulation / I. Smith, I. Mandic-Mulec, N. Gaur // Res. Microbiol. 1991. - V. 142.-P. 831-839.

121. Stennicke H.R. Characterization of the SI binding site of the glutamic acid-specific protease from Streptomyces griseus / H.R. Stennicke, J.J. Birktoft, K. Breddam // Protein Sci. 1996. - V.5. - №11. - P. 2266-2275.

122. Stepanov V.M. A serine protease of an archaebacterium Halobacterium mediteerranei / V.M. Stepanov, G.N. Rudenskaya, L.A. Revina, Y.B. Gryaznova, E.N. lysogorskaya, I.Yu. Filippova, I.I. Ivanova // J. Biochem. -1992. V.285. - P.284-286.

123. Stragier P. Chromosomal rearrangement generating a composite gene for a developmental transcription factor / P. Stragier, B. Kunkel, L. Kroos, R.1.sick// Science. 1989. - V. 243. - P. 507-512.

124. Stragier P. Cascades of sigma factors revisited / P. Stragier, R. Losick // Mol. Microbiol. 1990. - V. 4. - P. 1804-1806.

125. Strauch M.A. The SpoOA protein of Bacillus subtilis is a repressor of the abrB gene / M. A. Strauch, V. Webb, G. Spiegelman, J. A. Hoch // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V.85. - №5.-P. 1801-1805.

126. Strauch M.A. SpoOA activates and represses its own synthesis by binding at its dual promoters / M.A. Strauch, K. Trach, J. Day, J. A. Hoch // Biochimie. -1992.-V. 174.-P. 619-626.I

127. Strauch M.A. AbrB modulates expression and catabolite repression of a Bacillus subtilis ribose transport operon / M.A. Strauch // J. Bacteriol. -1995a. V. 177. - P. 6727-6731.

128. Stulke J. Carbon catabolite repression in bacteria / J. Stulke, W. Hillen // Curr. Opin. Microbiol. 1999. - V. 2. - P. 195-201.

129. Stulke J. Regulation of carbon catabolism in Bacillus species / J. Stulke, W. Hillen // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - V. 54. - P. 849-880.

130. Sun D. Identification of a new sigma-factor involved in a compartmentalized gene expression during sporulation of a Bacillus subtilis / D. Sun, P. Stragier, P. Setlow // Genes Dev. 1989. - V. 3. - P. 141-149.

131. Svensden I. The primary structure of the glutamic acid-specific protease of Streptomyces griseus / I. Svensden, M.R. Jensen, K. Breddam // FEBS Lett. -1991. V.292. - P. 105-167.

132. Svensden I. Isolftion and aminoacid sequence of a glutamic acid specific endopeptidase from Bacillus licheniformis /1. Svensden, K. Breddam // Eur.J. Biochem. 1992. - V204. - P. 165-171.

133. Takagi M. Nucleotide sequence and cloning in Bacillus subtilis of thet

134. Bacillus stearothermophilus pleiotropic regulatory gene degT / M. Takagi, H. Takada, T. Imanaka // J. Bacteriol.'- 1990. V. 173. - P. 411-418.

135. Tanaka T. PrtR enhances the mRNA level of the Bacillus subtilis extracellular proteases / T. Tanaka, M. Kawata, J. Nagami, H. Uchivama // J. Bacteriol. -1987. V.169. - №7.,- P. 3044-3050.

136. Thackray P.D. GerN, an antiporter homologue important in the germination of Bacillus cereus endospores / P.D. Thackray, J. Behravan, T. W. South-worth, A. Moir // J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - P. 476-482.

137. Thomason P. Eukaryotic signal transduction via histidine- aspartate phos-phorelay / P. Thomason, R. Kay // J. Cell Sci. 2000. - V. 113. - P. 31413150.

138. Trach K.A. Multisensory activation of the phosphorelay initiating sporulation in Bacillus subtilis: identification and sequence of the protein kinase of the alternative pathway / K.A. Trach, J.A. Hoch // Mol. Microbiol. 1993. - V.8. -P.67-79.Щ

139. Varon D. Bacillus subtilis operon under the dual control of the general stress transcription factor sigma В and the sporulation transcription factor sigma H / D. Varon, M.S. Brody, C.W. Price // Mol. Microbiol. 1996. - V. 20. - №2. -P. 339-350.

140. Bacillus cereus. i R.J. Warburg, M.R. Davis, I. Mahler, DJ. Tripper, H.O. Halvorson // Molecular Biology of Microbial Differentiation. J.A.Hoch and P. Setlow (ed.). Washington, D. C. American Society for Microbiology, -1985.- -P. 67-70.

141. Weicket M.J. Site-directed mutagenesis of a catabolite repression operator sequense in Bacillus^ subtilis / MJ. Weicket, G.H. Chambliss // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 78. - P. 6238-6242.

142. Weiner M.A. Macrophage-mediated germination of Bacillus anthracis en* dospores requires the gerH operon / M.A. Weiner, P.C. Hanna // Infect Immun. 2003. - V.71. - №7. - P. 3954-3959.

143. Weir J. Regulation of SpoOH, a gene coding for the Bacillus subtilisaH factor

144. J. Weir, M. Predich, E. Dubnau, G. Nair, I. Smith // J. Bacteriol. 1991. -V.l73. - P.521-529.

145. Wells J.A. Cloning, sequensing and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis / J.A. Wells, E. Ferrari, G.J. Henner, D.A. Estell, E.Y. Chen// Nucl. Acids. Res. 1983. - V.l 1. - P. 7911-7925.

146. Wiegert T. Alkaline shock induces the Bacillus subtilis sigma (W) regulon / T. Wiegert, G. Homuth, S. Versteeg, W. Schumann // Mol. Microbiol. 2001.- V.41.-№l.-P. 59-71.

147. Wosten M.M. Eubacterial sigma-factors / M.M. Wosten // FEMS Microbiol. Rew. 1998. - V. 22. - P. 127-150.

148. Yazdi M.A. Characterization and cloning of the gerC locus of Bacillus subtilis 168 / M.A. Yazdi, A. Moir // J. Gen. Microbiol. 1990 - V.l36. - P. 1335-1342.

149. Yokoi K. Genetic and biochemical characterization of glutamyl endopeptidase of Staphylococcus warneri M / K. Yokoi, M. Kakikawa, H. Kimoto, K. Watanabe, H. Yasukawa, A. Yamakawa, A. Taketo, K.I. Kodaira

150. Gene. 2001.- V. 281.- P.l 15-122.>

151. York K. SpoOA controls the aA- dependent activation of Bacillus subtilis sporulation specific transcription unit spoIIE / K. York, T. J. Kenney, S. Satola, C. P. Moran, H. Poth, P. Youngman // J. Bacteriol. - 1992. - V. 174. -P. 2648-2658.

152. Zheng L. Cascade regulation of spore coat gene expression in Bacillus subtilis / L. Zheng, R. Losick // J. Mol. Biol. 1990. - V. 212. - P. 645-660.

153. Zuberi A.R. The nucleotide sequence and gene organization of the gerA spore germination operon of Bacillus subtilis 168 / A.R. Zuberi, A. Moir, I.M. Feavers // Gene. 1987. - V. 51. - №1. - P. 1-11.