Оптимизация экспрессии внеклеточных сериновых протеиназ бацилл и их практическое применение тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Корягина Анастасия Олеговна

• Корягина Анастасия Олеговна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Корягина Анастасия Олеговна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Цель и задачи исследования

Научная новизна полученных результатов

Методология и методы исследования

Достоверность результатов

Теоретическая и практическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту

Апробация работы

Место выполнения и личный вклад автора

Связь работы с научными программами

Публикация результатов исследования

Объем и структура диссертации

Благодарности

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика и генная инженерия микробных 14 протеиназ

1.1.1 Классификация и распространение протеиназ

1.1.2 Семейство субтилизиноподобных протеиназ

1.1.3 Субтилизиноподобная протеиназа В. рышИш

1.1.4 Семейство химотрипсиноподобных протеиназ

1.1.5 Глутамилэндопептидаза В. рышИш

1.2 Генная инженерия бацилл

1.2.1 Промоторы

1.2.2 Сигнальные пептиды

1.2.3 Разработка новых систем экспрессии

1.2.4 Геномная инженерия бацилл 48 1.3 Практическое применение протеаз 51 Заключение 56 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 58 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Штаммы бактерий и плазмиды

2.2 Олигонуклеотиды

2.3 Питательные среды и культивирование

2.4 Оптимизация LIKE системы экспрессии с помощью 63 рекомбинантных сигнальных пептидов

2.5 Клонирование генов протеиназ в экспрессионные векторы 65 pLIKE и pGP382

2.6 Полимеразная цепная реакция

2.7 Электрофорез ДНК

2.8 Трансформация бактерий E. coli DH5a

2.9 Трансформация бактерий B. subtilis

2.10 Трансформация бактерий B. subtilis

2.11 Определение протеолитической активности

2.12 Количественное определение протеиназ

2.12.1 Осаждение белков ТХУ

2.12.2 Определение количества белка по Лоури

2.12.3 Трипсинолиз в растворе

2.12.4 Удаление нерастворенных частиц

2.12.5 Масс-спектрометрический анализ

2.13 Очистка рекомбинантной протеиназы с помощью 73 ионообменной хроматографии

2.14 Белковый электрофорез

2.15 Энзиматические свойства протеиназы

2.15.1 рН-Оптимум и рН-стабильность

2.15.2 Температурный оптимум и температурная стабильность

2.15.3 Влияние ингибиторов на активность протеиназы

2.15.4 Влияние желчи на ферментативную активность

2.16 Тестирование субтилизиноподобной протеиназы в качестве 76 кормовой добавки к рациону цыплят бройлеров

2.16.1 Стабильность протеиназы в условиях желудочно- 76 кишечного тракта цыплят

2.16.2 Птицы, корма и условия эксперимента

2.17 Анализ микрофлоры слепого отростка кишечника цыплят

2.17.1 Подготовка образцов, выделение и секвенирование ДНК

2.17.2 Обработка данных секвенирования

2.18 Биоинформатика

2.19 Статистическая обработка результатов 82 3 РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Оптимизация системы экспрессии для получения 84 внеклеточных сериновых протеиназ B. pumilus

3.1.1 Подбор промотора

3.1.2 Подбор сигнальных пептидов

3.1.3 Клонирование сигнальных пептидов в LIKE систему 88 экспрессии

3.1.4 Клонирование генов протеиназ в оптимизированную LIKE 90 систему экспрессии

3.1.5 Динамика роста и активности рекомбинантных штаммов

3.2 Количественное определение секретируемых протеиназ B. 98 pumilus на основе разаботанного масс-спектрометрического

метода

3.2.1 Выбор протеотипических пептидов

3.2.2 Построение калибровочных графиков

3.2.3 Количественное определение протеиназ рекомбинантных 102 штаммов

3.3 Очистка протеиназы из рекомбинантного штамма

3.4 Изучение свойств рекомбинантной субтилизиноподобной 106 протеиназы

3.5 Тестирование субтилизиноподобной протеиназы В. рышИы8 110 3-19 в качестве кормовой добавки к рациону цыплят бройлеров

3.6 Метагеномный анализ слепого отростка кишечника цыплят 119 бройлеров при добавлении в рацион субтилизиноподобной протеиназы В. рышИы8

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Секретируемые белки составляют до 50% от общего количества белковых компонентов клеток бацилл, многие из них участвуют в гидролизе природных полипептидов и синтезируются в ответ на изменения в окружающей среде [Matkawala & а!., 2021]. Особое внимание привлекают протеиназы, которые вовлечены в важнейшие физиологические процессы клетки, участвуют в катаболизме субстратов, споруляции, регуляторном протеолизе, расщеплении и круговороте белков [Harwood & а!., 2022]. Бактериальные протеиназы имеют высокий потенциал для практического применения в качестве фармакологических препаратов, широко используются для производства моющих средств; в последнее десятилетие протеиназы применяют в животноводстве и птицеводстве, что привело к положительным результатам, таким как улучшение коэффициента конверсии корма, увеличение веса и повышение показателей роста.

В результате секвенирования геномов микроорганизмов и сравнительного биоинформатического анализа установлено, что в клетках бактерий до 4% генома представлено генами протеолитических ферментов [Rawlings & а!., 2018; Matkawala & а!., 2021]. Большое количество разных протеиназ обосновано важной ролью этих белков для функционирования живых организмов, среди них выделена и охарактеризована небольшая часть аннотированных ферментов. Использование омиксных технологий и исследования т яШев открыли перспективы для идентификации и использования новых микробных ферментов [Razzag в1 а!., 2019; Thapa & а!., 2019]. Одной из востребованных для практического применения групп протеолитических ферментов является класс сериновых протеиназ бацилл, которые стабильны, обладают широкой субстратной специфичностью, высокой молекулярной активностью, что позволяет их использование для выполнения практических задач. Многообещающим подходом в получении протеиназ является

применение современных генетических технологий [Chu et al., 2023]. Для разработки эффективных рекомбинантных штаммов и новых систем экспрессии необходимы знания о механизмах регуляции генов. Анализ регуляторных областей, выяснение промоторной специфичности, расшифровка механизмов секреции и экспрессии генов является основой для конструирования экспрессионных систем. Огромное преимущество Bacillus subtilis в способности секретировать рекомбинантные белки с использованием различных сигнальных пептидов. В процессе аннотации секвенированных геномов бацилл были разработаны и охарактеризованы генетические инструменты, включая различные типы плазмид, бактериальные промоторы, регуляторные элементы и сигнальные пептиды. Новые генетические элементы значительно ускорили генную инженерию в рекомбинантных системах B. subtilis. Современным подходом редактирования геномов микроорганизмов является CRISPR-Cas9 технология, которая позволяет осуществлять направленные изменения в геноме для создания реципиентных штаммов и широко используется, в том числе, в экспериментах по функциональному анализу генов. Новые генетические инструменты послужили основой для разработки системы экспрессии генов сериновых протеиназ Bacillus pumilus.

Цели и задачи исследования

Целью работы являлась оптимизация экспрессии генов внеклеточных сериновых протеиназ Bacillus pumilus и оценка потенциала использования субтилизиноподобной протеиназы в качестве кормовой добавки.

В работе решались следующие задачи:

1. Получение гетерологичных систем экспрессии внеклеточных сериновых протеиназ B. pumilus 3-19, субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы, путем подбора гетерологичных промоторов и сигнальных пептидов.

2. Разработка метода масс-спектрометрического анализа для количественной оценки рекомбинантного белка в культуральной жидкости бацилл.

3. Получение субтилизиноподобной сериновой протеиназы из культуральной жидкости рекомбинантного штамма B. subtilis в препаративном количестве и тестирование фермента в качестве кормовой добавки в экспериментах in vivo на цыплятах бройлерах.

4. Оценка влияния кормовой добавки на основе субтилизиноподобной сериновой протеиназы B. pumilus 3-19 на структуру и динамику формирования микробиоты слепых отростков кишечника цыплят бройлеров.

Научная новизна полученных результатов

Разработан подход для оптимизации экспрессии сериновых протеиназ бацилл на основе подбора промоторов и сигнальных пептидов. Впервые разработан масс-спектрометрический метод в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) для количественной оценки протеиназ B. pumilus. Получены приоритетные данные об эффективности применения субтилизиноподобной протеиназы B. pumilus в качестве кормовой добавки для цыплят бройлеров. Установлено, что добавление фермента к рациону цыплят приводит к увеличению коэффициента перевариваемости белка и уменьшению экскреции азота в окружающую среду, повышению продуктивности птицы и снижению потребления корма. Анализ микробиоты цыплят после применения протеиназы B. pumilus в качестве пищевой добавки показал, что фермент положительно влияет на микробное разнообразие, способствует увеличению количества представителей семейств Bacteroidaceae и Rikenellaceae, которые оказывают защитное действие против патогенов желудочно-кишечного тракта цыплят и способствуют выработке пищеварительных ферментов.

Методология и методы исследования

Теоретической базой диссертационной работы являлись публикации российских и зарубежных ученых, посвященные протеазам бацилл, микробным экспрессионным системам, биопрепаратам, применяемым в птицеводстве.

Экспериментальное решение задач диссертационной работы осуществлено с применением современных методов генной инженерии, молекулярной биологии, протеомики, биоинформатики, метагеномики, а также методов микробиологии, биохимии и зоотехники.

Достоверность результатов

Описанные в диссертационной работе результаты являются воспроизводимыми, получены с использованием современных микробиологических, молекулярно-генетических и биохимических методов. Представленные в работе результаты экспериментов являются достоверными, что подтверждается соответствующим статистическим анализом. Полученные результаты диссертации опубликованы в журналах, индексируемых в базах данных WoS, Scopus и РИНЦ, и доложены на всероссийских и международных научных конференциях.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость работы состоит в получении новых данных о функционировании систем экспрессии сериновых протеиназ B. pumilus и разработке алгоритма на основе масс-спектрометрического анализа в режиме MRM для точного количественного определения протеиназ B. pumilus 3-19. Полученные экспериментальные данные представляют основу для создания новых биопрепаратов и расширения рынка кормовых ферментов.

Практическая значимость работы заключается в том, что генно-инженерные штаммы, полученные в работе, могут служить для получения ряда гетерологичных белков, включая ферменты других бацилл. Оценка эффективности протеиназы в качестве кормовой добавки к рациону цыплят-бройлеров показала положительное влияние на продуктивность птицы, снижение потребления корма, увеличение перевариваемости органических веществ корма, а также снижения экскреции неусвоенного азота в окружающую среду. Полученные данные представляют основу для создания новых кормовых

биопрепаратов и расширения рынка микробных ферментов. Полученные результаты соответствуют п. 20(г) Стратегии научно-технологического развития РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Манипуляции гетерологичными сигнальными пептидами и промоторами улучшили характеристики систем экспрессии сериновых протеиназ В. рышИш. Для количественной оценки ферментов в культуральной жидкости разработан количественный масс-спектрометрический метод в режиме мониторинга множественных реакций (MRM).

2. Субтилизиноподобная протеиназа В. рышИш в качестве кормовой добавки к рациону цыплят бройлеров приводила к улучшению переваримости белка и снижению экскреция азота в окружающую среду, увеличению продуктивности птицы и снижению потребления корма. По основным характеристикам сериновая протеиназа В. рышИы8 может являться прототипом для разработки новой кормовой добавки для применения в птицеводстве.

3. Добавление субтилизиноподобной протеиназы В. рышИы8 к рациону птиц приводило к увеличению разнообразия микробиоты слепого отростка кишечника цыплят бройлеров и к росту количества микроорганизмов Bacteroidaceae и Шкепе11асеае, оказывающих защитное действие против заболеваний пищеварительного тракта и положительно влияющих на переваривание биополимеров в кишечнике.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Оптимизация экспрессии внеклеточных сериновых протеиназ бацилл и их практическое применение»

Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены на международных, всероссийских и региональных конференциях: Международной школе-конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Материалы и Технологии XXI Века» (Казань, 2014; 2015; 2018; 2023); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2013; 2014; 2015); Международной конференции молодых ученых: биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов (Новосибирск, 2015;

2019); Международной научно-практической конференции «Постеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицины» (Казань, 2014); Конференции молодых ученых «Молодежь и инновации Татарстана» (Казань, 2014); Всероссийском симпозиуме «Белки и Пептиды» (Сочи, 2015; 2017; 2019; 2021); Международном симпозиуме «Современные биотехнологии для науки и практики» (Санкт-Петербург, 2014; 2015; 2019; 2021); Международной конференции молодых ученых: биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов (Новосибирск, 2015; 2019); Всероссийской школе-конференции молодых ученых с международным участием «Биосистемы: организация, поведение, управление» (Нижный Новгород, 2016); Научно-практической конференции "Микробные технологии в птицеводстве и животноводстве" (Казань, 2018); Международном конгрессе Федерации европейских биохимических сообществ «FEBS» (Иерусалим, 2017; Прага 2018); на Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2018); Всероссийском конгрессе по медицинской микробиологии, клинической микологии и иммунологии (XXI Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2018); Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Биохимия - основа наук о жизни» (Казань, 2019); Международной конференции «Микробиология: вчера, сегодня, завтра» (Казань, 2019); Международной научно-практической конференции «Современное состояние, проблемы и перспективы развития аграрной науки» (Ялта, 2019).

Место выполнения работы и личный вклад автора

Работа выполнена лично автором на кафедре Микробиологи и в НИЛ «Агробиоинженерия» Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета. Автором диссертации совместно с научным руководителем разработаны главные направления научного исследования, сформулирована цель. Диссертантом лично поставлены задачи исследовательской работы, выполнена основная часть экспериментальных исследований, проведен анализ полученных результатов, сформулированы

выводы. Масс-спектрометрический анализ и секвенирование образцов ДНК выполняли на базе Междисциплинарного центра протеомных исследований КФУ и в коммерческой фирме «Литех» (Россия). Научно-практические эксперименты на цыплятах проводили в условиях вивария фермерского хозяйства КФК Алимчуевой З.И. (Россия, Республика Марий Эл, Медведевский район, деревня Среднее Азяково).

Связь работы с научными программами

Исследования выполнены при поддержке грантов: РНФ №16-16-0462 «Разработка новых подходов с применением бактериальных ферментов и пробиотиков для повышения усвояемости корма сельскохозяйственной птицы на основе изучения физиологии ее пищеварения»; РФФИ №19-08-00853 «Повышение продукции внеклеточных протеиназ у бацилл на основе модификации генов и редактирования генома CRISPR технологией» и молодежного гранта Академии Наук Татарстана № 10-49-Ч г 2019 «Новая система экспрессии для получения промышленно-важных белков». Работа выполнена в рамках Программы стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета.

Публикация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 51 научная работа, в том числе 9 статей в рецензируемых научных журналах, индексируемых в базах данных Web of Science и Scopus, и входящих в перечень ВАК, а также 41 тезис, из которых 3 опубликованы в журналах, входящих в перечень базы данных Web of Science и Scopus.

Структура и объем и диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, обсуждения результатов, заключения и списка цитируемой литературы. Текст изложен на 159 страницах, проиллюстрирован 27 рисунками,

включает 18 таблиц, список литературы содержит 146 библиографических источников. Приложение включает выписку из протокола № 22 П1.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н., профессору кафедры микробиологии КФУ М.Р. Шариповой за постановку проблемы, плодотворное обсуждение результатов и внимательное отношение к работе; д.б.н., профессору А.М.Мардановой за консультации, к.б.н., А.А. Тойменцевой за помощь в освоении теоретического материала, новых методических подходов и обсуждении результатов; д.б.н., профессору кафедры технологии производства продукции животноводства МарГУ С.Ю. Смоленцеву за помощь в организации экспериментов научно-хозяйственного опыта на цыплятах и обсуждении результатов экспериментов; к.б.н., м.н.с. М.Т. Лутфуллину и к.б.н., м.н.с. Г.Ф. Лутфуллиной за помощь в проведении экспериментов научнохозяйственного опыта; м.н.с. Д.С. Пудовой за консультации при проведении биоинформатического анализа данных секвенирования; к.б.н., с.н.с. НИЛ «Мультиомиксные технологии живых систем» А.В. Лайкову за помощь в проведении масс-спектрометрического анализа образцов; к.б.н., в.н.с., НИЛ «Молекулярная вирусология» Е.И. Шагимардановой и к.б.н., в.н.с. НИЛ «Экологическая метагеномика» Н.Е. Гоголевой за помощь в проведении секвенирования образцов.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика и генная инженерия микробных протеиназ

1.1.1 Классификация и распространение протеиназ

Среди множества белков, участвующих в жизнедеятельности живых организмов, важную роль играют протеолитические ферменты. Протеазы составляют неотъемлемую часть всех форм жизни на земле, включая растения, животных, микроорганизмы и вирусы. Протеазы представляют группу ферментов, гидролизующих белок до пептидов и аминокислот. Они относятся к классу 3 (гидролазы) и подклассу 4 (гидролизуют пептидные связи) по номенклатуре Международного союза биохимиков и молекулярных биологов ^С-Г^ЖВ) [Matkawala et а!., 2021]. Протеолитические ферменты классифицируют по трем основным критериям: 1) тип катализируемой реакции; 2) механизм катализа и структура активного центра; 3) гомология аминокислотной последовательности каталитического домена, отражающая эволюционное родство.

Разделение протеиназ по второму критерию основывается на порядке расположения функциональных групп каталитического центра ферментов. По этому признаку протеиназы разделяются на 4 основных класса: сериновые - S (КФ 3.4.21), цистеиновые - C (КФ 3.4.22), аспартатные - A (КФ 3.4.23) и металлопротеиназы - M (КФ 3.4.24). Существует также класс и (КФ 3.4.99), в который входит 21 семейство эндопептидаз с неизвестной структурой активного центра. Протеазы разделяются на 14 субподклассов по типу катализируемых реакций, объединённые в две большие группы: экзопептидазы, расщепляющие пептидную связь в концевых областях полипептида (субподклассы КФ 3.4.11-19), и эндопептидазы, действующие на связи внутри полипептидной цепочки (субподклассы КФ 3.4.21-24 и КФ 3.4.99) [Matkawala et а!., 2021].

Протеолитические ферменты присутствуют в клетках всех живых организмов и необходимы для роста, метаболизма, передачи клеточных сигналов,

дифференцировки и других физиологических функций [Zhou et al., 2020]. С развитием геномики и биоинформатики гены протеолитических ферментов идентифицированы в геномах про- и эукариот. Установлено, что 4,74% всех генов человека кодируют протеазы (известны 703 пептидазы и 443 непептидазных гомолога). В геномах прокариот не менее 2-4% всех генов кодируют протеолитические ферменты. В Базе данных MEROPS (https://www.ebi.ac.uk/merops/) на 01.2024 г. содержится информация о 1142788 последовательностях пептидаз, классифицированных в 281 семейство и 66 кланов. Протеазы считают наиболее важным классом промышленных ферментов, которые составляют почти 60% от общего объема продаж ферментов по всему миру. Большая группа бактерий и грибов продуцирует внеклеточные протеазы, однако большинство микроорганизмов-продуцентов, принадлежат к роду Bacillus [Leite et al., 2022]. Например, в геноме B. subtilis 168 обнаружено 230 протеаз (https://www.ebi.ac.uk/merops/cgi-bin/speccards?sp=sp000127;type=P). Гены,

кодирующие протеазы, встречаются с относительно высокой частотой в геномах прокариот, в пределах от 0,13% (Leptospira sp.) до 4,76% (Bacillus cereus) от общего количества генов, в среднем около 3%. Среди видов бактерий, патогенных для человека, количество функциональных генов протеаз колеблется от 9 до 15 в небольших геномах, таких как геномы Mycoplasma spp. (0.28-3.4% от общего числа генов) до 230 (3,9%) и 182 (3,37%) в геномах, таких как Pseudomonas aeruginosa (штамм UCBPP-PA14) и Escherichia coli (серовар O111:H- штамм 11128) соответственно. Часть экспрессируемых протеаз в патогеннных микроорганизмах оказывают вредное воздействие на человека-хозяина и рассматриваются как фактор вирулентности. По количеству протеазных генов рекордсменом в микробном мире является Bacillus cereus subspecies cytotoxis штамм NVH 391-98 - 183 потенциально функциональных гена протеаз из 3844 генов (4,76%).

Протеазы универсальны для всех организмов и считаются белками, функционирующими на ранних этапах биологической эволюции. Различные

классы протеаз связаны со специфическими биологическими путями, субстратами и каталитическими реакциями. Показано, что семейства протеаз неравномерно распределены среди микроорганизмов, так, например, аспарагиновые протеазы в основном обнаружены у микроскопических грибов, металлопротеазы и сериновые протеазы широко распространены у бактерий. Bacillus subtilis кодирует сериновые, цистеиновые, аспарагиновые и металлопротеазы. Протеазы B. subtilis выполняют множество специфических функций, которые можно разделить на три категории: (1) контроль качества — удаление неправильно свернутых или укороченных белков; (2) регуляция — активация или деградация белков, выполняющих временные функции, продукция регуляторных пептидов; (3) питание — расщепление клеточных белков и белков окружающей среды как источника аминокислот и пептидов [Harwood et al., 2022].

Источником протеаз для практического использования чаще являются микроорганизмы. Кроме того, предпочтение отдается внеклеточным ферментам, что значительно облегчает последующую обработку и снижает затраты на их производство [Bhatia et al., 2021]. Микроорганизмы, продуцирующие протеазы, выделены из различных источников: ризосферы, почвы, сточных вод, пищевых отходов, морских отложений, гиперсоленых озер, содовых озер и т.д. [Solanki et al., 2021]. Среди бактерий представители рода Bacillus занимают лидирующее место с точки зрения коммерческого производства протеаз. Некоторые бактериальные штаммы, продуцирующие промышленно-важные протеазы: Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus lentus, Pseudomonas fuorescens, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus circulans, Geobacillus SBS-4S, Bacillus alkalophilus, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Bacillus clausii, Bacillus licheniformis и др. Среди микроскопических грибов преобладают представители родов Aspergillus, Trichoderma, Penicillium. Помимо бактерий и микромицетов, протеазы продуцируются актиномицетами. Например, Streptomyces mutabilis продуцирует внеклеточную протеазу, которая перспективна для применения в промышленности [Mechri et al., 2022]. Многие исследования посвящены

изучению эндофитных грибов как продуцентов для производства протеаз различного назначения. Например, в эндофитном изоляте гриба Lasiodiplodia pseudotheobromae, полученном из стебля Aegle marmelos (Айва бенгальская), обнаружена протеолитическая и фибринолитическая активности [Meshram et al., 2016; Singh et al., 2023]. Идентифицированы и охарактеризованы различные вирусные протеазы; однако с коммерческой точки зрения они не приобрели большого значения, но часто служат мишенями для различных противовирусных препаратов. Так, цистеиновые протеазы идентифицированы в аденовирусах, альфавирусах; сериновая протеаза-описана в вирусе гепатита С [Zephyr et al., 2021].

Таким образом, изучение протеолитических ферментов является актуальной темой для исследований, что отражает не только их важную биологическую роль, но и высокий практический потенциал использования в различных областях.

1.1.2 Семейство субтилизиноподобных протеаз

Семейство субтилаз или субтилизиноподобных протеаз, определяемое в базе данных MEROPS как семейство S8, является вторым по величине семейством сериновых протеаз (после семейства химотрипсина) по количеству последовательностей и по охарактеризованным протеазам, которые представлены у эубактерий, архебактерий, эукариот и вирусов [Falkenberg et al., 2022]. Семейство S8 принадлежит к клану SB, который является одним из 13 кланов сериновых протеаз и, помимо семейства S8, также содержит семейство S53 (семейство седолизина). Каталитический центр субтилизинов образован триадой аминокислот: Asp, His и Ser. Два семейства (S8 и S53) в составе клана SB различаются по каталитическому механизму. Укладка белков членов семейства S53 похожа на укладку субтилизинов, однако каталитическая триада включает Glu, Asp и Ser. Семейство S8 подразделяется на два подсемейства S8A (типовой

белок - субтилизин Карлсберг Bacillus licheniformis) и S8B (типовой белок -кексин Sacharomyces cerevisiae) [Falkenberg et al., 2022].

Членами семейства S8 являются эндопептидазы, за исключением трипептидилпептидазы II, которая высвобождает трипептиды с N-конца белков. У большинства бактерий, архей и низших эукариот протеазы неспецифичны, ингибируются общими ингибиторами сериновых протеаз, такими как DFP (диизопропилфторфосфат) и PMSF (фенилметилсульфонилфторид), однако, например, кексин резистентен к PMSF и требует высоких концентраций DFP [Falkenberg et al., 2022]. Поскольку многие члены семейства связывают ионы кальция для стабилизации, они могут также ингибироваться этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) или эгтазиновой кислотой (ЭГТА), которые являются как правило ингибиторами металлопептидаз [Марданова, 2021].

Субтилазы представляют группу протеолитических ферментов с низким уровнем гомологии и консервативным активным центром. Два кальций-связывающих участка способствуют термостабильности многих членов семейства [Harwood et al., 2022]. Большинство членов семейства проявляют широкую субстратную специфичность. Бактериальные субтилизины синтезируются в виде препроферментов с аминоконцевым сигнальным пептидом для секреции, продоменом, который аутокаталитически расщепляется во время созревания фермента, и каталитическим доменом. Общая структура препропротеинов является характерной для бактериальных субтилизинов. Зрелые ферменты содержат до 1775 аминокислотных остатков, с N-концевыми каталитическими доменами в диапазоне от 268 до 511 остатков, а также сигнальными и/или активирующими пептидами в диапазоне от 27 до 280 остатков [Harwood et al., 2022]. Отличительной особенностью субтилизиноподобных ферментов является отсутствие остатков цистеина и, как следствие, дисульфидных связей в молекуле зрелого белка. Этим объясняется их термолабильность: инактивация наблюдается

при температуре выше 60 °C. Молекула стабилизируется за счет ионов

Ca

[Matkalawa et al., 2021].

Субтилизины у прокариот участвуют в различных процессах, таких как клеточное питание, инвазия хозяина, способствуют созреванию различных полипептидов, таких как бактериоцины, выступают в роли внеклеточных адгезинов и др. [Garcia-Moyano et al., 2021, Matkalawa et al., 2021; Shettar et al., 2023]. У эукариот они выполняют и другие функции: участвуют в процессах развития и иммунных реакциях растений, играют роль в метаболизме нейропептидов [Falkenberg et al., 2022]. Субтилизиноподобные протеазы широко представлены у всех прокариот, что свидетельствует о формировании этой группы ферментов на ранней стадии эволюции. Интересно отметить, что значительное количество субтилизиноподобных белков идентифицировано, например, у бактерии-паразита Bdellovibrio bacteriovorus (15 генных продуктов). Это очень мелкие грамотрицательные бактерии, которые являются облигатными паразитами, живущими в периплазматическом пространстве других грамотрицательных бактерий [Tripathi, Sowdhamini, 2008; Du Toit, 2024]. Установлено, что субтилизины участвуют в физиологических процессах, связанных с патогенезом, таких как инвазия хозяина, некоторые субтилизиноподобные протеазы могут функционировать как специфические компоненты гидролитического механизма, используемого B. bacteriovorus для лизиса других грамотрицательных бактерий. Наличие дополнительных доменов, связанных с протеазным доменом субтилизиноподобных белков, может обуславливать участие этих белков в различных метаболических путях и регуляции паразитического образа жизни B. bacteriovorus. Также, значительное количество субтилизиноподобных протеаз идентифицировано у бактерии Streptomyces avermitilis (15 генных продуктов), известной разнообразием вторичных метаболитов и обладающей многочисленными метаболическими путями для их биосинтеза. Показано, что субтилизины функционируют как протеазы созревания для нескольких ферментов и могут регулировать

компоненты различных метаболических путей у avermitШs [Tripathi, Sowdhamini, 2008; Khan et a!., 2022].

Среди субтилизиноподобных протеаз наиболее изученным ферментом является субтилизин Е В. subtШs 168 [Valbuzzi et a!., 1999]. Субтилизин Е обладает рядом важных свойств, таких как сохранение ферментативной активности при изменении рН или температуры, стабильность в органических растворителях и устойчивость к токсичным соединениям, что делает его самым продаваемым промышленным ферментом во всем мире [Harwood et a!., 2022] Этот секретируемый фермент обладает высокой каталитической активностью в широком диапазоне от рН 7,0 до рН 11,0 и содержит консервативные аминокислотные остатки гистидин, серин и аспарагиновую кислоту в активном центре. Структура фермента стабилизируется ионами кальция (Са ), а его пониженная термостабильность связана со слабым сродством к ионам Са2+ [Emameh et a!., 2021].

Субтилизин Е В. subtШs кодируется геном aprE и продуцируется клетками в стационарной фазе роста. Показано, что транскрипция гена происходит при участии сигма А фактора (аА), экспериментально установлены -10 и -35 области для взаимодействия с РНК полимеразой. Установлено, что для эффективной экспрессии гена необходима область протяженностью ~41 п.о. выше точки инициации транскрипции (+1). Кроме того, ген спорообразовани, экспрессируется через аА-зависимый промотор, как и ген aprE (Рисунок 1) [Emameh et a!., 2021].

1,090,000 1,092,000 1/394,000 1,036,000 1,09в,0(Ю

—I—I—I—г—I—:—I—I—I—I—|-1—I—I—!—I-1—I—I—I—I—!--—I—I—I—I—I—!-1—г-1—I—:—!—1—I—1—I—I—:-

1,122,000 1,124,000 1,126,000 1,128,000 1,130,000 1,132,000

Рисунок 1 - Организация геномного локуса с геном аргЕ [Emameh а!.,

2021]

Главная роль в позитивной регуляции гена аргЕ принадлежит двухкомпонентной системе DegS-DegU и транскрипционному фактору Spo0A, запускающему споруляцию [Harwood & а!., 2022]. Основываясь на геномном расположении генов спорообразования, таких как ук/Ы, ук/М, ук/О, ук/Р и yhfQ, ниже и выше гена аргЕ, промотор и фактор 5А могут использоваться как для генов аргЕ, так и для генов ук/Ы (Рисунок 1). Следовательно, ассоциация между экспрессией гена аргЕ и генами спорообразования, подчеркивает регуляторную роль генов спорообразования в экспрессии гена аргЕ [Emameh & а!., 2021].

На уровне транскрипции в фазе экспоненциального роста экспрессия генов протеаз репрессируется регуляторами переходного состояния АЬгВ, ScoC и SinR. Установлено, что при переходе в стационарную фазу концентрация фосфорилированного белка $ро0А~Р постепенно увеличивается до уровня, который способен подавлять эти регуляторы переходного состояния, способствуя увеличению продукции протеаз [Тоутейвеуа & а!., 2017; Harwood & а!, 2022]. Этот механизм активации основан как на непрямом антагонистическом, так и прямом конкурентном эффекте $ро0А~Р, где он прямо репрессирует активность АЬгВ и ScoC и опосредованно репрессирует активность SinR (Рисунок 2).

Рисунок 2 - Модель регуляции экспрессии гена протеазы несколькими регуляторами на разных стадиях роста В. яиЫШя. Схематическое изображение роста бацилл отмечено пунктирной линии. Стрелки и Т-образные столбцы указывают на активацию и ингибирование, соответственно. Участвующие регуляторные белки расшифрованы в тексте [Toymentseva в1 а!., 2017]

Одновременно с переходом в стационарную фазу и ограничением азота внутренние сигналы активируют DegS/U - двухкомпонентную систему. При достижении критического порогового уровня фосфорилированной формы регулятор ответа DegU~P запускает экспрессию гена экзопротеазы. Второй белок двухкомпонентной системы DegS/U фосфорилирует DegU. Более того, белок DegR действует совместно с системой DegS/U и положительно влияет на продукцию внеклеточных протеаз путем стабилизации фосфорилированной формы DegU~P. Еще одним фактором, вовлеченным в негативную модуляцию продукции протеазы, является белок RapG, который участвует в сигнальном пути кворума. Также повышенная концентрация соли может индуцировать продукцию экзопротеаз в бациллах [Harwood а1., 2022].

Исследования показали, что существует связь между продукцией субтилизина Е и вторичными метаболитами во время фазы спорообразования. Получены мутанты В. яиЫШя и В. ришйш, которые способны секретировать большее количество субтилизина E с более высокой гидролитической

активностью [Wang et al., 2016]. Кроме того, установлено, что после оптимизации условий роста и индукции промотора продукция субтилизина Е бактерией B. pumilus возрастает на 114% и 92%, соответственно [Kuppers et al., 2014]. В непосредственной близости от аспарагиновой кислоты (Asp) в активном центре субтилизина E находятся восемь неполярных аминокислот, включая цистеин (C), серин (S), треонин (T), глицин (G), аланин (A), валин (V), лейцин (L) и фенилаланин (P). Точечные мутации в перечисленных аминокислотах влияют на активность фермента. Изучение точечных мутаций показало, что наибольший стабилизирующий эффект достигался при замене аспарагина 123 (N123) на валин (V), лизин (L) или изолейцин (I) и серина 331 (S331) на лизин (L), метионин (M) или изолейцин (I). Этот результат показал, что связь между двумя гидрофобными остатками стабилизирует структуру белка. Таким образом, сайт-направленный мутагенез, может приводить к повышению стабильности белка и повышению выхода целевого продукта [Emameh et al., 2021].

Следующим фактором, влияющим на выход активного фермента, является сигнальный пептид. В эксперименте с использованием 393 сигнальных пептидов (173 гомологичных сигнальных пептида из B. subtilis и 220 гетерологичных сигнальных пептидов из B. licheniformis), которые были сшиты с N-концом субтилизина BPN из B. amyloliquefaciens, показали, что замена собственного сигнального пептида на рекомбинантные приводила к повышению внеклеточной протеолитической активности в 7 раз [Degering et al., 2010].

Субтилизиноподобные протеазы, большинство из которых секретируется в среду, являются объектом для практического использования. Обладая широкой субстратной специфичностью, стабильностью при высоких и низких температурах, высокой каталитической активностью в щелочных средах, субтилизины представляют основу для создания разнообразных биотехнологических продуктов. Изучение структурных особенностей субтилизиноподобных протеиназ и механизмов их участия в различных

метаболических процессах, необходимо для понимания функционирования этих белков.

1.1.3 Субтилизиноподобная протеиназа B. pumilus 3-19

Бактерии Bacillus pumilus характеризуются высокой способностью к секреции внеклеточных протеиназ. Штамм B. pumilus 3-19 представляет производное природного штамма B. pumilus 7P, выделенного из почв РТ (Патент RU 587156) и получен путем инокуляции штамма 7P на питательной среде с добавлением стрептомицина (до 500 мкг/мкл). Штамм 3-19 показал повышенную активность внеклеточных гидролаз: протеазы, РНКазы и фосфатазы (Патент RU 2384619). В геноме B. pumilus 3-19 аннотированы 148 протеаз различных каталитических классов. Сериновые протеазы являются наиболее распространенными протеолитическими ферментами (60 членов) [Pudova et al., 2022]. В геноме B. pumilus идентифицированы 10 генов секретируемых протеаз, среди них гены сериновых протеаз - субтилизиноподобной протеазы (aprBp) и глутамилэндопептидазы (gseBp). Субтилизиноподобная протеиназа (К.Ф. 3.4.21.62) доминирует в пуле внеклеточных протеиназ B. pumilus 3-19 и обусловливает более 80% внеклеточной активности [Sharipova et al., 2008; Toymentseva et al., 2020].

Субтилизиноподобная протеиназа B. pumilus 3-19 (AprBp) представляет собой белок с молекулярной массой 27 кДа. pH-оптимум составляет 9,5, интервал pH-стабильности 7,0 - 10,0. Стабильность протеиназы сохраняется при температурах 0 - 50 °C, с оптимумальным интервалом 30 °C - 45 °C. Ионы Ca2+ повышают активность фермента на 20-30%. Протеаза B. pumilus 3-19 обладает широкой субстратной специфичностью, проявляет максимальную активность в отношении субстратов, специфичных для субтилизинов: Glp-Ala-Ala-Leu-pNa и Z-Ala-Ala-Leu-pNa, эффективно гидролизует n-нитроанилиды, содержащие гидрофобные аминокислоты: лейцин и фенилаланин. Константа Михаэлиса

составляет 1,85 мМ. Значение pI = 6,64. На субтилизиноподобную протеиназу B. pumilus 3-19 не действуют ингибиторы трипсина, овомукоид, ингибитор морской анемоны, активность фермента полностью подавляется ингибитором PMSF [Балабан, 2008].

B. pumilus 3-19 секретируют внеклеточные протеазы во время фазы замедления и стационарной фазы роста. Известно, что двухкомпонентные системы трансдукции и глобальные регуляторные факторы участвуют в регуляции генов протеаз, тесно связанных с формированием биопленок и переходом клеток в стадию спорообразования. В геноме B. pumilus в окружении гена субтилизиноподобной протеазы идентифицирован ген глобального регулятора AbrB, ингибирующего экспрессию генов протеаз в фазе экспоненциального роста. В окружении гена aprBp идентифицированы гены белка компетентности ComK, ген барстара, гены транспортеров ABC и сигнальной пептидазы, связанные с биогенезом секретируемых белков (Рисунок 3) [Pudova et al., 2022].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Корягина Анастасия Олеговна, 2024 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1) Балабан, Н. П. Сериновые протеиназы: характеристика и применение [Текст] / Н.П. Балабан; Изд. Казан. гос. ун-та, 2008. - 140 с.

2) Лемеш, В. М. Методические указания по токсико-биологической оценке мяса, мясных продуктов и молока с использованием инфузорий Тетрахимена пириформис (экспресс-метод) [Текст] / В. М. Лемеш, П. И. Пахомов, А. Е. Янченко и др. // Витебск: ВГАВМ, 1997. - 13 с.

3) Лещинская, И. Б. Глутаминовая эндопептидаза Bacillus intermedius штамма 3-19. Очистка, свойства и кристаллизация [Текст] / И. Б. Лещинская, Е. В. Шакиров, Е. Л. Ицкович и др. // Биохимия. - 1997. - Т. 404. - №. 2-3. - С. 241-244.

4) Марданова, А. М. Новые протеиназы грамотрицательных и грамположительных бактерий: характеристика, свойства и практическое применение [Текст]: дис. доктора биол. наук: 03.02.03. - Казанский федеральный университет, Казань, 2021. - С. 263.

5) Михайлова, Е. О. Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста [Текст]: дис. канд. биол. наук: 03.00.07. - Казанский гос. университет, Казань, 2007. - С. 166.

6) Михайлова, Е. О. Биохимические свойства субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis в стационарной фазе роста [Текст] / Е. О. Михайлова, А. М. Марданова, Н. П. Балабан и др. // Биохимия. - 2009. - Т. 74. - № 3. - С. 380-388.

7) Мосолова, О. В. Glu, Asp-специфичная протеиназа актиномицетов [Текст] / О.В. Мосолова, Г.Н. Руденская, В.М. Степанов, О.М. Ходова, И.А. Цаплина // Биохимия. - 1987. - Т.52. - № 3. - С. 414 - 422.

8) Частухина, И. Б. Особенности биосинтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius рекомбинантными клетками Bacillus. subtilis в стационарной фазе

роста [Текст] / И. Б. Частухина, М. Р. Шарипова, Л. А. Габдрахманова и др. // Микробиология. - 2005. - Т. 74. - № 1. - С. 39 - 47.

9) Шамсутдинов, Т. Р. Выделение и характеристика глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста [Текст] / Т. Р. Шамсутдинов, Г. Н. Руденская, Н. П. Балабан и др. // Биоорганическая химия. - 2008. - Т. 34. - №3. - С. 322-326.

10) Шамсутдинов, Т. Р. Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста [Текст]: дис. канд. биол. наук: 03.00.07. - Казанский гос. университет, Казань, 2009. - С. 127.

11) Шашкова, А. В. Строение и функциональная роль CRISPR-системы бактерий [Текст] / А. В. Шашкова, А. А. Горяев, Н. И. Смирнова // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - Т. 2. - № 108. - С. 49-52.

12) Abaidullah, M. Current findings on gut microbiota mediated immune modulation against viral diseases in chicken [Text] / M. Abaidullah, S. Peng, M. Kamran, X. Song, Z. Yin // Viruses. - 2019. - V. 11 (8). - P. 681.

13) Abd El-Hack, M. E. The relationship among avian influenza, gut microbiota and chicken immunity: an updated overview [Text] / M. E. Abd El-Hack, M. T. El-Saadony, A. H. Alqhtani et al. // Poult Sci. - 2022. - V. 101 (9). - P. 102021.

14) Aguilar, J. G. D. S. Microbial proteases: Production and application in obtaining protein hydrolysates [Text] / J. G. D. S. Aguilar, H. H. Sato // Food Res Int. - 2018. -V. 103. - P. 253-262.

15) Altenbuchner, J. Editing of the Bacillus subtilis Genome by the CRISPR-Cas9 System [Text] / J. Altenbuchner // Appl Environ Microbiol. - 2016. - V. 82 (17). - P. 5421-5427.

16) Anagnostopoulos, C. Requirements for Transformation in Bacillus subtilis [Text] / C. Anagnostopoulos, J. Spizizen // J Bacteriol. - 1961. - V. 81 (5). - P. 741746.

17) Angel, C. R. Effects of a monocomponent protease on performance and protein utilization in 7- to 22-day-old broiler chickens [Text] / C. R. Angel, W. Saylor, S. L. Vieira, N. Ward // Poult Sci. - 2011. - V. 90 (10). - P. 2281-2286.

18) Ayala, F. R. The stress-responsive alternative sigma factor SigB of Bacillus subtilis and its relatives: an old friend with new functions [Text] / F. R. Ayala, M. Bartolini, R. Grau // Front Microbiol. - 2020. - V. 11. - P. 1761.

19) Azrin, N. A. M. Versatility of subtilisin: A review on structure, characteristics, and applications [Text] / N. A. M. Azrin, M. S. M. Ali, R. N. Z. R. A. Rahman, et al. // Biotechnol Appl Biochem. - 2022. - V. 69 (6). - P. 2599-2616.

20) Bahun, M. Insights into the maturation of pernisine, a subtilisin-like protease from the Hyperthermophilic Archaeon Aeropyrum pernix [Text] / M. Bahum, M. Snajder, D. Turk, N. P. Ulrih // Appl Environ Microbiol. - 2020. - V. 86 (17). -e00971-20.

21) Bai, H. A novel tool for microbial genome editing using the restriction-modification system [Text] / H. Bai, A. Deng, S. Liu et al. // ACS Synth Biol. - 2018. -V. 7 (1). - P. 98-106.

22) Baumgardt, K. The essential nature of YqfG, a YbeY homologue required for 3' maturation of Bacillus subtilis 16S ribosomal RNA is suppressed by deletion of RNase R [Text] / K. Baumgardt, L. Gilet, S. Figaro, C. Condon // Nucleic Acids Res. - 2018. -V. 46 (16). - P. 8605-8615.

23) Bhaita, R. K. Psychrophiles: A source of cold-adapted enzymes for energy efficient biotechnological industrial processes [Text] / R. K. Bhaita, S. Utlan, M. Z. Hoque et al. // J Environ Chem Eng. - 2021. - V. 9. - P. 104607.

24) Bongers, S. R. Development and characterization of a subtilin-regulated expression system in Bacillus subtilis: strict control of gene expression by addition of subtilin [Text] / R. S Bongers, J.-W. Veening, M. V. Wieringen et al. // Appl Environ Microbiol. - 2005. - V. 71 (12). - P. 8818-8824.

25) Borda-Molina, D. Effects of protease and phytase supplements on small intestinal microbiota and amino acid digestibility in broiler chickens. [Text] / D. Borda-Molina, T. Zuber, W. Siegert et al. // Poultry Sci. - 2019. - V. 98 (7). - P. 2906-2918.

26) Britton, H. T. K. Universal buffer solutions and the dissociation constant of veronal [Text] / H. T. K. Britton, R. A. Robinson // J Chem Soc. - 1931. - P. 14561462.

27) Brockmeier, U. systematic screening of all signal peptides from Bacillus subtilis: a powerful strategy in optimizing heterologous protein secretion in gram-positive bacteria [Text] / M. Caspers, R. Freudl, A. Jockwer, T. Noll, T. Eggert // J. Mol. Biol. -2006. - V. 3. - P. 393-402.

28) Bulgakova, R. S. The principal biochemical properties of highly purified Bacillus intermedius extracellular RNAase / R. S. Bulgakova, I. B. Leshchinskaya, N. P. Balaban, G. S. Egorova // Biochemistry. - 1974. - V. 39 (39). - P. 245-247.

29) Cai, D. A novel strategy to improve protein secretion via overexpression of the SppA signal peptide peptidase in Bacillus licheniformis [Text] / D. Cai, H. Wang, P. He et al. // Microb Cell Fact. - 2017. - V. 16 (1). - P. 70.

30) Cai, D. Enhanced production of poly-y-glutamic acid by improving ATP supply in metabolically engineered Bacillus licheniformis [Text] / D. Cai, Y. Chen, P. He et al. // Biotechnol Bioeng. - 2018. - V. 115 (10). - P. 2541-2553.

31) Caspi, R. The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes - a 2019 update [Text] / R. Caspi, R. Billington, I. M. Keseler et al. // Nucleic Acids Res. - 2020. -V. 48 (1). - P. 445-453.

32) Chen, J. Combinatorial Sec pathway analysis for improved heterologous protein secretion in Bacillus subtilis: identification of bottlenecks by systematic gene overexpression [Text] / J. Chen., G. Fu, Y. Gai et al. // Microb Cell Fact. - 2015. -V. 14. -P. 92.

33) Cheng, J. Enhancement of a high efficient autoinducible expression system in Bacillus subtilis by promoter engineering [Text] / J. Cheng, C. Guan, W. Cui et al. // Protein Expr Purif. - 2016. - V. 127. - P. 81-87.

34) Cheremin, A. M. Optimization of the expression of the subtilisin-like protease from Bacillus pumilus [Text] / A. M. Cheremin, Ch. Niamsuren, A. A. Toîmentseva, M. R. Sharipova // Bioorg Khim. - 2014. - V. 40 (6). - P. 752-757.

35) Chu, P. T. B. Potent IPTG-inducible integrative expression vectors for production of recombinant proteins in Bacillus subtilis [Text] / P. T. B. Chu, T. T. P. Phan, T. T. T. Nguyen, T. T. T. Truong, W. Schumann, H. D. Nguyen // World J Microbiol Biotechnol. - 2023. - V. 39 (6). - P. 143.

36) Commichau, F. M. Overexpression of a non-native deoxyxylulose-dependent vitamin B6 pathway in Bacillus subtilis for the production of pyridoxine [Text] / F. M. Commichau, A. Alzinger, R. Sande et al. // Metab Eng. - 2014. V. 25. - P. 38-49.

37) Contesini, F. J. An overview of Bacillus proteases: from production to application [Text] / F. J. Contesini, R. R. de Melo, H. H. Sato // Crit Rev Biotechnol. -2018. - V. 38 (3). - P. 321-334.

38) Correa, G. G. A modular autoinduction device for control of gene expression in Bacillus subtilis [Text] / G. G. Correa, M. R. da C. R. Lins, B. F. Silva et al. // Metab. Eng. - 2020. - V. 61. - P. 326-334.

39) Cowieson, A. J. Carbohydrases, protease, and phytase have an additive beneficial effect in nutritionally marginal diets for broiler chicks [Text] / A. J. Cowieson, O. Adeola // Poult Sci. - 2005. - V. 84 (12). - P. 1860-1867.

40) Cui, W. Exploitation of Bacillus subtilis as a robust workhorse for production of heterologous proteins and beyond [Text] / W. Cui, L. Han, F. Suo et al. // World J. Microbiol. Biotechnol. - 2018. - A. 145. - V. 34 (10). - P. 145.

41) Cupi, D. Efficacy and safety profile of a subtilisin protease produced by fermentation in Bacillus licheniformis to be used as a feed additive [Text] / D. Cupi, M. Thorsen, S. G. Elvig-Jorgensen et al. // Heliyon. - 2022. - V. 8 (8). - P. e10030.

42) Danilova, I. The practical potential of bacilli and their enzymes for industrial production [Text] / I. Danilova, M. Sharipova // Front Microbiol. - 2020. - V. 11. - P. 1782.

43) Degering, C. Optimization of protease secretion in Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis by screening of homologous and heterologous signal peptides [Text] / C. Degering, T. Eggert, M. Puls et al. // Appl Environ Microbiol. - 2010. - V. 76 (19). - P. 6370-6376.

44) Demidyuk, I. V. Glutamyl endopeptidases: the puzzle of substrate specificity [Text] / I. V. Demidyuk, K. N. Chukhontseva, S. V. Kostrov // Acta Naturae. - 2017. -V. 9 (2). - P. 17-33.

45) Demidyuk, I. V. Modification of substrate binding site of glutamyl endopeptidas from Bacillus intermedius [Text] / I. V. Demidyuk, D. V. Romanova, E. A. Nosovskaya, G. G. Chestukhina, I. P. Kuranova, S. V. Kostrov // Protein Eng, Des Sel.

- 2004. - V. 17 (5). - P. 411-416.

46) Diep, T. B. Screening streptomycin resistant mutations from gamma ray irradiated Bacillus subtilis B5 for selection of potential mutants with high production of protease [Text] / T. B. Diep, N. T. Thom, H. D. Sang et al. // J. Nat. Sci. - 2016. - V. 32. - P. 170-176.

47) Dixon, B. Evaluation of selected bacteria and yeast for probiotic potential in poultry production [Text] / B. Dixon, A. Kilonzo-Nthenge, M. Nzomo, Bhogoju, S. Nahashon // Microorganisms. - 2022. - V. 10 (4). - P. 676.

48) Dormeyer, M. A novel engineering tool in the Bacillus subtilis toolbox: inducer-free activation of gene expression by selection-driven promoter decryptification [Text] / M. Dormeyer, R. Egelkamp, M. J. Thiele et al. // Microbiology (Reading). - 2015. - V. 161 (2). - P. 354-361.

49) Dozier, W. A. Apparent metabolizable energy needs of male and female broilers from 36 to 47 days of age [Text] / W. A. Dozier, C. K. Gehring, A. Corzo, H. A. Olanrewaju // Poult Sci. - 2011. - V. 90 (4). - P. 804-814.

50) Drapeau, G. R. Purification and properties of an extracellular protease of Staphylococcus aureus [Text] / G. R. Drapeau, Y. Boily, J. J. Houmard // J. Biol. Chem.

- 1972. -V.247 (20). - P. 6720 - 6726.

51) Du Toit, A. Bdellovibrio bacteriovorus finds its prey [Text] / A. Du Toit // Nat. Rev. Microbiol. - 2024. - V. 22 (3). - P. 119

52) E, C. Switching promotor recognition of phage RNA polymerase in silico along lab-directed evolution path [Text] / C. E., L. Dai, J. Yu // Biophys J. - 2022. - V. 121 (4). - P. 582-595.

53) Ejaz, S. A review on recent advancement in expression strategies used in Bacillus subtilis [Text] / S. Ejaz, H. Khan, N. Sarwar, S. M. Aqeel, A. Al-Adeeb, S. Liu // Protein Pept Lett. - 2022. - V. 29 (9). - P. 733-743.

54) Emameh, R. Z. Bioinformatics analysis of extracellular subtilisin E from Bacillus subtilis [Text] / R. Z. Emameh, J. Kazokaite, B. Yakhchali // J. Biomol. Struct. Dyn. - 2022. - V. 40 (16). - P. 7183-7190.

55) Falkenberg, F. Phylogenetic survey of the subtilase family and a data-mining-based search for new subtilisins from Bacillaceae [Text] / F. Falkenberg, M. Bott, J. Bongaerts, P. Siegert // Front Microbiol. - 2022. - V. 26. - P. 13.

56) Freitas, D. M. Performance and nutrient utilization of broilers fed diets supplemented with a novel mono-component protease. [Text] / D. M. Freitas, S. L. Vieira, C. R. Angel, A. Favero, A. Maiorka // J Appl Poult Res. - 2011. - V. 20 (3). - P. 322-334.

57) Freudl, R. Signal peptides for recombinant protein secretion in bacterial expression systems [Text] / R. Freudl // Microb Cell Fact. - 2018. - A. 29. - V.17 (1). -P. 52.

58) Fu, G. An operator-based expression toolkit for Bacillus subtilis enables fine-tuning of gene expression and biosynthetic pathway regulation [Text] / G. Fu, J. Yue, D. Li, Y. Li, S. Y. Lee, D. Zhang // Proc Natl Acad Sci USA. - 2022. - V. 119(11). - P. e2119980119.

59) Garcia-Moyano, A. Two-step functional screen on multiple proteinaceous substrates reveals temperature-robust proteases with a broad-substrate range [Text] / A. Garcia-Moyano, Y. Diaz, J. Navarro et al. // Appl Microbiol Biotechnol. - 2021. - V. 105 (8). - P. 3195-3209.

60) Giannenas, I. Effects of protease addition and replacement of soybean meal by corn gluten meal on the growth of broilers and on the environmental performances of a broiler production system in greece [Text] / I. Giannenas, E. Bonos, V. Anestis et al. // PLoS One. - 2017. - V. 12 (1). - P. e0169511.

61) Goettig, P. Surface loops of trypsin-like serine proteases as determinants of function [Text] / P. Goettig, H. Brandstetter, V. Magdolen // Biochimie. - 2019. - V. 166. - P. 52-76.

62) Gu, Y. Advances and prospects of Bacillus subtilis cellular factories: from rational design to industrial applications [Text] / Y. Gu, X. Xu, Y. Wu et al. // Metab Eng. - 2018. - V. 50. - P. 109-121.

63) Gurumalles, P. A systematic reconsideration on proteases [Text] / P. Gurumalles, K. Alagu, B. Ramakrishnan, S. Muthusamy // Int J Biol Macromol. - 2019. - V. 128. - P. 254-267.

64) Hammami, A. Proteolytic and amylolytic enzymes from a newly isolated Bacillus mojavensis SA: Characterization and applications as laundry detergent additive and in leather processing [Text] / A. Hammami, N. Fakhfakh, O. Abdelhedi, M. Nasri, A. Bayoudh // Int J Biol Macromol. - 2018. - V. 108. - P. 56-68.

65) Han, L. Fabrication and characterization of a robust and strong bacterial promoter from a semi-rationally engineered promoter library in Bacillus subtilis [Text] / L. Han, F. Suo, C. Jiang et al. // Process Biochem. - 2017. - V. 61. - P. 56-62.

66) Harwood, C.R. The ins and outs of Bacillus proteases: activities, functions and commercial significance [Text] / C. R. Harwood, Y. Kikuchi // FEMS Microbiol. Rev. -2022. - V. 46 (1). - P. fuab046.

67) Itaya, M. The first high frequency of recombination-like conjugal transfer from an integrated origin of transfer sequence in Bacillus subtilis 168 [Text] / M. Itaya, M. Hasegawa, M. Tomita, M. Sato // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2017. - V. 82. - P. 356-362.

68) Jagadeesan, Y. Sustainable production, biochemical and molecular characterization of thermo-and-solvent stable alkaline serine keratinase from novel

Bacillus pumilus AR57 for promising poultry solid waste management [Text] / Y. Jagadeesan, S. Meenakshisundaram, V. Saravanan, A. Balaiah // Int J Biol Macromol. -2020. -V. 163. - P. 135-146.

69) Kang, Q. Research progress and industrial application of Bacillus subtilis in systematic and synthetic biotechnology [Text] / Q. Kang, M. Xiang, D. Zhang / Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. - V. 37 (3). - P. 923-938

70) Kerovuo, J. A new efficient expression system for Bacillus and its application to production of recombinant phytase [Text] / J. Kerovuo, N. von Weymarn, M. Povelaien, S. Auer, A. Miasnikov // Biotechnol Lett. - 2000. - V. 22. - P. 1311-1317.

71) Khan, Z. Characterization of the genome and serine protease of a novel Bacillus subtilis isolate [Text] / Z. Khan, M. Shafique, F. Saleem et al. // Antonie Van Leeuwenhoek. - 2022. - V. 115 (2). - P. 281-295.

72) Kitadokoro, K. Purification, characterization and molecular cloning of an acidic amino-acid specific proteinase of Streptomyces fradiae ATCC 14544 [Text] / K. Kitadokoro, E. Nakamura, M. Tamaki, T. Horii, H. Okamoto, M. Shin, T. Sato, T. Fujiwara, H. Tsuzuki, N. Yoshida, H. Teraoka // Biochim. Biophys. Acta. -1993. - V. 1163. - P. 149 - 157.

73) Koga, Y. Proteolysis of abnormal prion protein with a thermostable protease from Thermococcus kodakarensis KOD1 [Text] / Y. Koga, S.-I. Tanaka, A. Sakudo et al. // Appl Microbiol Biotechnol. - 2014. - V. 98 (5). - P. 2113-2120.

74) Koontz, L. TCA precipitation [Text] / L. Coontz // Methods Enzymol. - 2014. -V. 541. - P. 3-10.

75) Kulyyassov, A. Targeted liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis of proteins: Basic principles, applications, and perspectives [Text] / A. Kulyyassov, M. Fresnais, R. Longuespee // Proteomics. - 2021. - V. 21 (23-24). - P. e2100153.

76) Kuppers, T. Developing a new production host from a blueprint: Bacillus pumilus as an industrial enzyme producer [Text] / T. Kuppers, V. Steffen, H. Hellmuth et al. // Microb Cell Fact. - 2014. - V. 13 (1). - P. 46.

77) Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 [Text] / U. K. Laemmli // Nature. - 1970. -V. 227. - P. 680-685.

78) Lee, G. Conserved nucleotide sequences in temporally controlled bacteriophage promoters [Text] / G. Lee, J. Pero // Mol Biol. - 1981. - V. 152 (2). - P. 247-265.

79) Lee, J. Effects of exogenous protease on performance, economic evaluation, nutrient digestibility, fecal score, intestinal morphology, blood profile, carcass trait, and meat quality in broilers fed normal diets and diets considered with matrix value [Text] / J. Lee, H. Oh. Y. Kim et al. // Poult Sci. - 2023. - V. 102 (5). - P. 102565.

80) Leite, A. H. P. Purification, biochemical characterization and fibrinolytic potential of proteases produced by bacteria of the genus Bacillus: a systematic literature review [Text] / A. H. P. Leite, I. H. A. da Silva, L. Pastrana, et al. // Arch Microbiol. -2022. - V. 204 (8). - P. 503.

81) Liu, C. Cutting in the middleman: hidden substrates at the interface between proteases and plant development [Text] / C. Liu, P. N. Moschou // New Phytol. - 2018. - V. 218 (3). - P. 916-922.

82) Liu, H. Saturation mutagenesis and self-inducible expression of trehalose synthase in Bacillus subtilis [Text] / H. Liu, X. Wang, S. Yang, R. Wang, T. Wang // Biotechnol Prog. - 2019. - V. 35 (4). - P. e2826.

83) Liu, Y. Advances in cold-adapted enzymes derived from microorganisms [Text] / Y. Liu, N. Zhang, J. Ma et al. // Front Microbiol. - 2023. - V. 14. - P. 1152847.

84) Liu, Z. High-level extracellular production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis WB800 by multiple tandem promoters [Text] / Z. Liu, W. Zheng, C. Ge et al. // BMC Microbiol. - 2019. -V. 19 (1). - P. 89.

85) Ma, R. J. Production enhancement of the extracellular lipase LipA in Bacillus subtilis: effects of expression system and Sec pathway components [Text] / R. J. Ma, Y. H. Wang, L. Liu et al. // Protein Expr Purif. - 2018. - V. 142. - P. 81-87.

86) Malten, M. Coexpression of the type I signal peptidase gene sipM increases recombinant protein production and export in Bacillus megaterium MS941 [Text] / M. Malten, H. Hahrstedt, F. Meinhardt, D. Jahn // Biotechnol Bioeng. - 2005. - V. 91 (5).

- P. 616-621.

87) Matkawala, F. Microbial alkaline serine proteases: production, properties and applications [Text] / F. Matkawala, S. Nighojkar, A. Kumar, A. Nighojkar // World J Microbiol Biotechnol. - 2021. - V. 37 (4). - P. 63.

88) McCafferty, K. W. Protease supplementation reduced the heat increment of feed and improved energy and nitrogen partitioning in broilers fed maize-based diets with supplemental phytase and xylanase [Text] / K. W. McCafferty, M. Choct, S. Musigwa, N. K. Morgan, A. J. Cowieson, A. F. Moss // Anim Nutr. - 2022. - V. 10. - P. 19-25.

89) Mechri, S. Preparation, characterization, immobilization, and molecular docking analysis of a novel detergent-stable subtilisin-like serine protease from Streptomyces mutabilis strain TN-X30 [Text] / S. Mechri, F. Allala, K. Bouacem et al. // Int. J. Biol. Macromol. - 2022. - V. 222. - P. 1326-1342.

90) Meshram, V. Production, purification and characterisation of a potential fibrinolytic protease from endophytic xylaria curta by solid substrate fermentation [Text] / V. Meshram, S. Saxena, K. Paul et al. // Appl Biochem Biotechnol. - 2017. -V. 181 (4). - P. 1496-1512.

91) Miao, C.-C. Construction of a high-expression system in Bacillus through transcriptomic profiling and promoter engineering [Text] / C.-C. Miao, L.-L. Han, Y.-B. Lu, H. Feng // Microorganisms. - 2020. -V. 8 (7). - P. 1030.

92) Msadek, T. DegS-DegU and ComP-ComA modulator-effector pairs control expression of the Bacillus subtilis pleiotropic regulatory gene degQ [Text] / T. Msadek, F. Kunst, A. Klier, G. Rapoport // J Bacteriol. - 1991. - V. 173 (7). - P. 2366-77.

93) Murugesan, G. R. Phytogenic feed additives as an alternative to antibiotic growth promoters in broiler chicken [Text] / G. R. Murugesan, B. Syed, S. Haldar, C. Pender // Front Vet Sci. - 2015. - V. 2. - P. 21.

94) Niidome, T. Purification and characterization of an acid amino acid-specific endopeptidase of Bacillus subtilis obtained from a commercial preparation (protease type XVI, Sigma) [Text] / T. Niidome, N. Yoshida, F. Ogata, A. Ito, K. Noda // J. Biochem. - 1990. - V. 108. - P. 965 - 970.

95) Noack, S. Anticoccidial drugs of the livestock industry [Text] / S. Noack, H. D. Chapman, P. M. Selzer // Parasitol Res. - 2019. - V. 118 (7). - P. 2009-2026.

96) Osejo, M. 16S rRNA amplicon sequencing characterization of caecal microbiome composition of broilers and free-range slow-growing chickens throughout their productive lifespan [Text] / M. Ocejo, B. Oporto, A. Hurtado // Sci Rep. - 2019. -V. 9 (1). - P. 2506.

97) Ozcan, T. The effects of using a starter culture, lipase, and protease enzymes on ripening of Mihalic cheese [Text] / T. Ozcan, E. Kurdal // Int J Dairy Technol. - 2012. -V. 65. - P. 585-593.

98) Park, S. Optimization of the secretion pathway for heterologous proteins in Bacillus subtilis [Text] / S. Park, W. Schumann // Biotechnol. Bioprocess Eng. - 2015.

- V. 20. - P. 623-633.

99) Parker, A. Gut microbes and metabolites as modulators of blood-brain barrier integrity and brain health [Text] / A. Parker, S. Fonseca, S. R. Carding // Gut Microbes.

- 2020. - V. 11 (2). - P. 135-157.

100) Pontarollo, G. Non-canonical proteolytic activation of human prothrombin by subtilisin from Bacillus subtilis may shift the procoagulant-anticoagulant equilibrium toward thrombosis [Text] / G. Pontarollo, L. Acquasaliente, D. Peterle et al. // J Biol Chem. - 2017. - V. 292 (37). - P. 15161-15179.

101) Prasad, L. The structure of a universally employed enzyme: V8 protease from Staphylococcus aureus [Text] / L. Prasad, Y. Leduc, K. Hayakawa, L. T. Delbaere // Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. - 2004. - V. 60 (2). - P. 256-259.

102) Pudova, S. D. Comparative genome analysis of two Bacillus pumilus strains producing high level of extracellular hydrolases [Text] / D. S. Pudova, A. A. Toymentseva, N. E. Gogoleva et al. // Genes (Basel). - 2022. - V. 13 (3). - P. 409.

103) Rahmer, R. Construction of a super-competent Bacillus subtilis 168 using the P mtlA -comKS inducible cassette [Text] / R. Rahmer, K. M. Heravi, J. Altenbuchner // Tront Microbiol. - 2015. - V. 6. - P. 1431.

104) Razzaq, A. Microbial proteases applications [Text] / A. Razzaq, S. Shamsi, A. Ali et al. // Front. Bioeng. Biotechnol. - 2019. - V. 7. - P. 110.

105) Rebello, S. Industrial Enzymes as Feed Supplements—Advantages to Nutrition and Global Environment [Text] / S. Rebello, D. Balakrishnan, A. N. Anoopkumar et al. // Green Bio-processes. - 2018. - P. 293-304.

106) Rekik, H. Production, purification and biochemical characterization of a novel detergent-stable serine alkaline protease from Bacillus safensis strain RH12 [Text] / H. Rekik, N. Z. Jaouadi, F. Gargouri et al. // Int J Biol Macromol. - 2019. - V. 121. - P. 1227-1239.

107) Sambrook, J. Molecular Cloning - a laboratory manual [Text] / J. Sambrook, D. W. Russell // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold. - 2001.

108) Serrano-Heras, G. A new plasmid vector for regulated gene expression in Bacillus subtilis [Text] / G. Serrano-Heras, M. Salas, A. Bravo // Plasmid. - 2005. - V. 54 (3). - P. 278-282.

109) Sharipova, M. R. The expression of Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase gene in Bacillus subtilis recombinant strains [Text] / M. R. Sharipova, E. I. Shagimardanova, I. B. Chastukhina et al. // Mol Biol Rep. - V. 34 (2). - P. 79-87.

110) Sharipova, M. The expression of the serine proteinase gene of Bacillus intermedius in Bacillus subtilis [Text] / M. Sharipova, N. Balaban, A. Kayumov et al. // Microbiol Res. - 2008. - V. 163 (1). - P. 39-50.

111) Shettar, S. S. Optimization of subtilisin production from Bacillus subtilis strain ZK3 and biological and molecular characterization of synthesized subtilisin capped nanoparticles [Text] / S. S. Shettar, Z. K. Bagewadi, H. N. Kolvekar, T. M. Khan Yunus, S. M. Shamsudeen // Saudi J Biol Sci. - 2023. - V. 30 (11). - P. 103807.

112) Singh, R. Fibrin and fibrinolytic enzyme cascade in thrombosis: unravelling the role [Text] / R. Singh, P. Gautam, C. Sharma, A. Osmolovskiy // Life (Basel). - 2023. -V. 13(11). - Номер статьи: 2196.

113) Solanki, P. Microbial proteases: ubiquitous enzymes with innumerable uses [Text] / P. Solanki, C. Putatunda, A. Kumar et al. // 3 Biotech. - 2021. - V. 11 (10). - P. 428.

114) Song, Y. High-efficiency secretion of beta-mannanase in Bacillus subtilis through protein synthesis and secretion optimization [Text] / Y. Song, G. Fu, H. Dong et al. // J Agric Food Chem. - 2017. - V. 65 (12). - P. 2540-2548.

115) Souza, C. C. The multifunctionality of expression systems in Bacillus subtilis: Emerging devices for the production of recombinant proteins [Text] / C. C. de Souza, J. M. Guimaräes, S. D. S. Pereira, L. A. M. Mariuba // Exp Biol Med (Maywood). - 2021. - V. 246 (23). - P. 2443-2453.

116) Stammen, S. High-yield intra- and extracellular protein production using Bacillus megaterium [Text] / S. Stammen, B. K. Müller, C. Korneli, R. Biedendieck, M. Gamer, E. Franco-Lara, D. Jahn // Appl. Environ. Microbiol. - 2010. - V. 76. - P. 4037-4046.

117) Sun, L. Insights into the role of gut microbiota in obesity: pathogenesis, mechanisms, and therapeutic perspectives [Text] / L. Sun, L. Ma, Y. Ma et al. // Protein Cell. - 2018. - V. 9 (5). - P. 397-403.

118) Svendsen, I. The primery structure of the glutamic acid-specific protease of Streptomyces griseus [Text] / I. Svendsen, M. R. Jensen, K. Breddam // FEBS Letters. -1991. - V. 292 (1, 2). - P. 165 - 167.

119) Tanvir, H. E. Kinetics, detergent compatibility and feather-degrading capability of alkaline protease from Bacillus subtilis AKAL7 and Exiguobacterium indicum AKAL11 produced with fermentation of organic municipal solid wastes [Text] / H. E. Tanvir, A. Hakim, D. Chakraborthy et al. // J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng. - 2020. - V. 55 (11). - P. 1339-1348.

120) Tjalsma, H. Signal peptide-dependent protein transport in Bacillus subtilis: a genome-based survey of the secretome [Text] / H. Tjalsma, A. Bolhuis, J. D. H. Jongbloed, S. Bron, J. M. van Dijl // Microbiol Mol Biol Rev. - 2000. - V.64 (3). - P. 515-547.

121) Toghyani, M. Performance, nutrient utilization, and energy partitioning in broiler chickens offered high canola meal diets supplemented with multicomponent carbohydrase and mono-component protease [Text] / M. Toghyani, S. B. Wu, R. A. Perez-Maldonado, P. A. Iji, R. A. Swick // Poult Sci. - 2017. - V. 96 (11). - P. 39603972.

122) Tolibia, S. E. M. Engineering of global transcription factors in Bacillus, a genetic tool for increasing product yields: a bioprocess overview [Text] / S. E. M. Tolibia, A. D. Pacheco, C. Y. G. Balbuena et al. // World J Microbiol Biotechnol. - V. 39 (1). - P. 12.

123) Toymentseva, A. A. Label-free multiple reaction monitoring, a promising method for quantification analyses of specific proteins in bacteria [Text] / A. A. Toymentseva, A. O. Koryagina, A. V. Laikov, M. R. Sharipova // Int J Mol Sci. - 2020.

- V. 21 (14). - P. 4924.

124) Toymentseva, A. A. New CRISPR-Cas9 vectors for genetic modifications of Bacillus species [Text] / A. A. Toymentseva, J. Altenbuchner // FEMS Microbiol. Lett.

- 2019. - V. 366 (1). - P. fny284.

125) Toymentseva, A. A. Regulatory characteristics of Bacillus pumilus protease promoters [Text] / A. A Toymentseva, T. Mascher, M. R. Sharipova // Curr Microbiol.

- 2017. - V. 74 (5). - P. 550-559.

126) Toymentseva, A. A. The LIKE system, a novel protein expression toolbox for Bacillus subtilis based on the lial promoter [Text] / A. A. Toymentseva, K. Schrecke, M. R. Sharipova, T. Mascher // Microb Cell Fact. - 2012. -V. 11. - P. 143.

127) Tran, D. T. M. Development of inducer-free expression plasmids based on IPTG-inducible promoters for Bacillus subtilis [Text] / D. T. M. Tran, D. T. P. Phan, T. K. Huynh et al. // Microb Cell Fact. - 2017. -V. 16 (1). - P. 130.

128) Tripathi, P. T. Genome-wide survey of prokaryotic serine proteases: analysis of distribution and domain architectures of five serine protease families in prokaryotes [Text] / P. T. Tripathi, R. Sowdhamini // BMC Genomics. - 2008. - V. 9. - P. 549.

129) Trung, N. T. An auto-inducible phosphate-controlled expression system of Bacillus licheniformis [Text] / N. T. Trung, N. M. Hung, N. H. Thuan et al. // BMC Biotechnol. - 2019. - V. 19 (1). - P. 3.

130) Valbuzzi, A. A novel member of the subtilisin-like protease family from Bacillus subtilis [Text] / A. Valbuzzi, E. Farrari, A. M. Albertini // Microbiology. - 1999. - V. 145. - P. 3121-3127.

131) Videnska, P. Characterization of egg laying hen and broiler fecal microbiota in poultry farms in croatia, czech republic, hungary and slovenia [Text] / P. Videnska, Md. M. Rahman, M. Faldynova et al. // PLoS One. - 2014. - V. 9 (10). - P. e110076.

132) Walk, C. L. Evaluation of novel protease enzymes on growth performance and nutrient digestibility of poultry: enzyme dose response [Text] / C. L. Walk, K. Juntunen, M. Paloheimo, D. R. Ledoux // Poult Sci. - 2019. - V. 98 (11). - P. 5525-5532.

133) Wang, H. Engineering of a Bacillus amyloliquefaciens strain with high neutral protease producing capacity and optimization of its fermentation conditions [Text] / H. Wang, L. Yang, Y. Ping et al. // PLoS One. - 2016. - V. 11 (1). - P. e0146373.

134) Wang, W. Characterization and function study of a glutamyl endopeptidase homolog from Nocardia seriolae [Text] / W. Wang, S. Hou, G. Chen et al. // J Fish Dis. - 2021. - V. 44 (6). - P. 813-821.

135) Wang, X. C. Improving production of extracellular proteases by random mutagenesis and biochemical characterization of a serine protease in Bacillus subtilis S1-4 [Text] / X. C. Wang, H. Y. Zhao, G. Liu, X. J. Cheng, H. Feng // Genet Mol Res. -2016. - V. 15 (2). - P. gmr.15027831.

136) Wang, Z. R. Effects of enzyme supplementation on performance, nutrient digestibility, gastrointestinal morphology and volatile fatty acid profiles in the hindgut of broilers fed wheat-based diets [Text] / Z. R. Wang, S. Y. Oiao, W. Q. Lu, D. F. Li // Poult. Sci. - 2005. - V.84 (6). - P. 875-881.

137) Yang, H. An overview and future prospects of recombinant protein production in Bacillus subtilis [Text] / H. Yang, J. Qu, W. Zou, W. Shen, X. Chen //Appl Microbiol Biotechnol. - 2021. V. 105(18). - P. 6607-6626.

138) Yang, H. Characterization of an intracellular alkaline serine protease from Bacillus velezensis SW5 with fibrinolytic activity [Text] / H. Yang, Y. Liu, Y. Ning et al. // Curr Microbiol. - 2020. - V. 77 (8). - P. 1610-1621.

139) Yansura, D. G. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis [Text] / D. G. Yansura, D. J. Henner // Proc Natl Acad Sci USA. - 1984. - V. 81 (2). - P. 439-443.

140) Yao, D. Enhanced extracellular expression of Bacillus stearothermophilus a-amylase in Bacillus subtilis through signal peptide optimization, chaperone overexpression and a-amylase mutant selection [Text] / D. Yao, L. Su, N. Li, J. Wu // Microb Cell Fact. - 2019.- V. 18 (1). - P. 69.

141) Zephyr, J. Viral proteases: Structure, mechanism and inhibition [Text] / J. Zephyr, N. K. Yilmaz, C. A Schiffer // Enzymes. - 2021. - V. 50. - P. 301-333.

142) Zhang, K. High-level extracellular protein production in Bacillus subtilis using an optimized dual-promoter expression system [Text] / K. Zhang, L. Su, X. Duan et al. // Microb Cell Fact. - 2017. -V. 16 (1). - P. 32.

143) Zhang, K. Recent advances in recombinant protein production by Bacillus subtilis [Text] / K. Zhang, L. Su, J. Wu // Annu Rev Food Sci Technol. - 2020. - V. 11. - P. 295-318.

144) Zhang, X. Production of d-tagatose by whole-cell conversion of recombinant Bacillus subtilis in the absence of antibiotics [Text] / X. Zhang, R. Lu, Q. Wang, M. Hu et al. // Biology (Basel). - 2021. - V. 10(12). - P. 1343.

145) Zheng, J. A sensitive, high-throughput LC-MS/MS method for measuring catecholamines in low volume serum [Text] / J. Zheng, R. Mandal, D. S. Wishart // Anal Chim Acta. - 2018. - V. 1037. - P. 159-167.

146) Zhou, J. Deep profiling of protease substrate specificity enabled by dual random and scanned human proteome substrate phage libraries [Text] / J. Zhou, S. Li, K. K. Leung et al. // Proc Natl Acad Sci USA. - 2020. - V. 117 (41). - P. 25464-25475.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Выписка из протокола № 22 П1

Cimuk.ui мкртм,1м

(К ялучяому иескломияю ЛЬгвеяяе пшиши кормом?« л/чвки на асшове Пробволгао* и бапершлышя фермой п-н. фнтнгы и протсимш «и продуитвииостк уешмявосл 1ШТ«ТС.1Ы<ЫХ всикхт» ктеркинрнгхшпиарнун» оценку иясл и биохими-кск»* пошпатели крови аыазлт бройяф» и кур-яесушекм, «плш1мром*1Ж1Ы) лл« ироиелеиил ил бме НИЛ Микробное Бшнсхжмошп м нммрм» фср*ерс*пга хсплДстш КФК А.шмчусвов 3 И <Рпссяк, Рес1г><\.ти«1 Мярнй Эл. Медисаевскяй р-н, л. Среди« АэтмоХ.

• протокол кекзомнм

ш» • 9 ч«ло»е». «гтротн»» - 0 человек . имядержалось» - О человек, Пктпаш

ОдсЛрат. проведение ипуниою нсслслюмляв «Иэучяаи вляини* корыово« добаита ив ос ко ПС пробиотнков и бактериальны* фермевпов, фиты и проиннвш я« продутимосп., усвояемость шттелыпл шмвешл. ■стсринаршьсвштариу*' оценку мяса и бапхямнчесхне вокнмте.лл ером пшют броАлсро» и кур-ПКушаг*. »планированное для проведении яа базе НИЛ МПфвАше Нмотехнолсчин ■ ни мри я фермерского хеткЛстш» КФК Алимчуевой 1 И (Рпссик. Республики Марий Эл, МслвелевасиА р-н. л. Среднее Аадково».