Расшифровка механизмов регуляции генов сериновых протеиназ бацилл тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Тойменцева, Анна Александровна

• Тойменцева, Анна Александровна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Тойменцева, Анна Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Протеолитические ферменты бацилл

1.1. Субтилазы

1.2. Глутамилэндопептидазы бактерий

1.3. Сериновые протеазы В. pumilus 3

2. Адаптационные процессы в бациллах

2.1. Регуляторная сеть бацилл

3. «Нокаутирование» генетического материала

4. Генно-инженерная биотехнология бактерий

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Расшифровка механизмов регуляции генов сериновых протеиназ бацилл»

Актуальность проблемы. Секретируемые белки составляют до 50% от общего количества белковых компонентов клеток бацилл. Многие из них участвуют в гидролизе природных полипептидов и синтезируются в ответ на изменения в окружающей среде. Среди них особое внимание привлекают протеиназы. Эти ферменты вовлечены в важнейшие физиологические процессы клетки, например, участвуют в катаболизме субстратов, споруляции, расщеплении и круговороте белков. Бактериальные протеиназы широко используются в пищевой промышленности, для производства моющих средств и имеют большой потенциал применения в качестве фармакологических препаратов, например, для лечения расстройств пищеварения или болезней сердечнососудистой системы [Gupta et al., 2002]. Как правило, в качестве продуцентов протеиназ используются различные штаммы бацилл. Однако, наличие комплекса внеклеточных протеиназ у бацилл создает большую проблему в генной инженерии и биотехнологии, поскольку снижает накопление гетерологичных белков в культуральной жидкости продуцентов [Westers et al., 2004]. Решение этой проблемы требует создания новых штаммов-продуцентов и экспрессионных систем, основанных на индуцибельных бациллярных промоторах.

Одной из наиболее интересных групп протеолитических ферментов является класс сериновых протеиназ. Они обнаружены у прионов, бактерий, вирусов, простейших и высших эуе67кариот [Rawlings et al., 2012]. Сериновые протеиназы эукариот участвуют во многих процессах, в том числе, в эмбриогенезе и развитии патологических состояний. В связи с этим, исследование прокариотических аналогов этих ферментов является удобной моделью при разработке новых лекарственных средств для борьбы с заболеваниями человека. Расшифровка механизмов регуляции генов прокариотических сериновых протеиназ может стать основой для новой стратегии получения гетерологичных белков и создания высокоэффективных систем их экспрессии, что является актуальным направлением современной молекулярной биотехнологии.

Несмотря на объём знаний, накопленных о сериновых протеиназах бацилл, функция этих ферментов в клетке и механизмы их регуляции изучены недостаточно. Для выяснения физиологической функции белка часто используют метод направленной инактивации гена. Штаммы с инактивированными генами протеиназ служат для получения гетерологичных белков, поскольку инактивация внеклеточных ферментов позволяет достичь выхода продукта в количествах, необходимых для применения в биотехнологии. Для разработки эффективных рекомбинантных штаммов и новых систем экспрессии необходимы знания о механизмах регуляции генов. Анализ регуляторных областей, выяснение промоторной специфичности и расшифровка механизмов экспрессии генов является основой клонирования генов в составе экспрессионных систем.

Целью работы являлись расшифровка механизмов регуляции генов сериновых протеиназ бацилл, выяснение роли этих белков в физиологии микробной клетки и разработка системы экспрессии для клонирования их генов.

Основные задачи исследования:

1. Определить длину регуляторной области генов субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы Bacillus pumilus;

2. Определить влияние транскрипционных факторов (SpoOA, DegU, SigD, плейотропных репрессоров) на функционирование промоторов;

3. Установить роль протеиназ в физиологии бацилл путём инактивации генов сериновых протеиназ;

4. Разработать систему экспрессии для получения гетерологичных белков на основе антибиотико-индуцибельного промотора двухкомпонентной системы LiaRS Bacillus subtilis;

5. Оценить эффективность экспрессии репортёрного гена gfp и генов сериновых протеиназ в составе новой экспрессионной системы.

Научная новизна. Все результаты, изложенные в диссертационной работе, получены впервые.

1. Впервые изучена зависимость экспрессии генов сериновых протеиназ от длины промоторного региона генов на основе репортёрных fusion-конструкций (Раргвр-gfp, РgseBp-gfp)• Установлены области регуляции генов протеиназ В. pumilus, свидетельствующие, что длина промотора обусловлена вкладом фермента в физиологию бацилл.

2. Разработаны новые беспротеазные штаммы В. pumilus с инактивированными генами субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы. Получены приоритетные данные, свидетельствующие, что инактивация генов протеиназ привела к изменениям в клеточной морфологии, ускорению лизиса клеток, частичному изменению в способности разлагать углеводы и изменению уровня секреции других гидролаз.

3. Разработана новая эффективная система экспрессии генов на основе lial промотора В. subtilis, который регулируется двухкомпонентной антибиотико-индуцибельной системой LiaRS (LIKE система - от нем. Lla-Kontrollierte Expression). При клонировании рекомбинантных генов в состав LIKE-системы показано, что в течение 30-60 мин после индукции экспрессия рекомбинантных внутриклеточных генов возрастает в 100-1000 раз. Делеция на хромосоме отдельных элементов lialH- оперона приводит к дополнительному увеличению экспрессии генов. Показано, что эффективная продукция внеклеточных ферментов в составе LIKE системы происходит в течение 4-5 часов после добавления индуктора.

Практическая значимость результатов. Данные о структуре промоторов и контроле экспрессии генов сериновых протеиназ (аргВр, gseBp) В. pumilus 3-19 необходимы при клонировании генов под собственными промоторами, а также могут быть использованы при конструировании новых систем экспрессии на основе модификации промоторов.

Беспротеазные штаммы В. pumilus, полученные в работе, могут служить в качестве реципиентов для получения гетерологичных белков, повышения уровня их продукции и качества целевого белка за счет снижения протеолитической деградации. Эти штаммы могут применяться в биотехнологии, генной инженерии и, в частности, быть использованы для получения минорных компонентов спектра внеклеточных протеаз В. pumilus.

Впервые разработанная новая LIKE экспрессионная система позволяет получить высокий выход гетерологичных белков в клетках бацилл и может быть использована при получении промышленно важных микробных препаратов.

Положения, выносимые на защиту: 1. Гены гидролаз бацилл имеют различную длину промоторов, которая определяется их функцией в физиологии бактерий.

2. Формирование пула внеклеточных гидролитических ферментов В. pumilus зависит от функциональной активности субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы.

3. Новая антибиотико-индуцибельная система экспрессии на основе промотора Рuai В. subtilis эффективна для продукции гетерологичных белков, включая протеиназы бацилл.

Связь работы с научными программами. Работа выполнена в соответствии с планом НИР Казанского (Приволжского) федерального университета (№ гос. регистрации 01:02.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования выполнены при поддержке грантов РФФИ № 09-04-99044-рофи, Германской службы академических обменов DAAD 2009-2011 гг.: № А/08/75088, № А/09/84065, Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» 2009-2013 гг.: ГК № П344, ГК № П406, ГК № П323, ГК № 815, ГК № 1053, ГК № 16.740.11.0741.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на IV Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Казань, РФ, 2009), XIV Международной конференции "Ферменты микроорганизмов в биологии и медицине" посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха (Казань, РФ, 2009), Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии», (Казань, РФ, 2009), 3-й совместной конференции Немецкого общества гигиены и микробиологии (DGHM) и Ассоциации по общей и прикладной микробиологии (VAAM) (Ганновер, Германия, 2009), X Научной конференции молодых учёных, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского (Приволжского) федерального университета (Казань, РФ, 2011), III Ежегодной Международной научно-практической конференции по биологии студентов, магистрантов и аспирантов Тбилисского государственного университета им. Иванэ Джавахишвили (Тбилиси, Грузия, 2011), Итоговой научно-образовательной конференции студентов Казанского (Приволжского) федерального университета (Казань, РФ, 2011), XIX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «ЛОМОНОСОВ-2012», МГУ,

Москва, РФ, 2012), XI Научная конференция молодых учёных, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского (Приволжского) федерального университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, РФ, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 работ, из них 5 статей в центральных отечественных и зарубежных рецензируемых журналах.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 2 таблицы, 28 рисунков. Библиография содержит 184 наименований российских и зарубежных авторов.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Тойменцева, Анна Александровна

выводы

1. Установлена регуляторная область генов протеиназ Bacillus pumilus, необходимая для полноценной экспрессии: для гена субтилизиноподобной

•u.U. протеиназы (аргВр) оптимальный промотор составляет1445 п.о.; для гена глутамилэндопептидазы (gseBp) - 150 п.о.

2. С помощью fusion-конструкций с репортёрным геном gfp показано, что факторы транскрипции DegU и SpoOA оказывают позитивное влияние на экспрессию генов протеиназ. Мутация по гену sigD повышает активность промотора гена gseBp в 1,5-2,5 раза и незначительно влияет на активность промотора аргВр протеиназы.

3. Инактивация генов протеолитических ферментов бацилл приводит к плейотропному эффекту: изменяется спектр внеклеточных гидролаз, частично морфология и биохимические характеристики.

4. Сконструирована новая LIKE-система экспрессии на основе антибиотико-индуцибельного промотора LiaRS двухкомпонентной системы Bacillus subtilis.

5. Новая LIKE экспрессионная система эффективна в отношении экспрессии генов внутриклеточного белка GFP и внеклеточных сериновых протеиназ.

5. Заключение

Уникальные свойства бациллярных сериновых протеаз позволяют их использование в различных областях, включая медицину и фармокологию. Для эффективного внедрения этих ферментов в практику требуются знания о структуре, свойствах, функциях ферментов и регуляции экспрессии их генов. Так, продуцируемые бактериями В. pumilus 3-19 сериновые протеазы -субтилизиноподобная и глутамилэндопептидаза, перспективны для медицины вследствие их высокой активности по гидролизу тромбообразований (фибринолитическая, антикоагулянтная активности). Несмотря на продолжительные исследования этих белков до сих пор остаётся открытым вопрос о конкретной физиологической роли данных ферментов в клетках бацилл. Кроме того, хотя выявлены основные регуляторные механизмы, участвующие в активации протеаз в клетке (транскрипционные о Г . ■у ? ■ факторы - DegU, 8роОА, АЬгВ, ЭсоС, БпЛ и др.), не доказано их прямое взаимодействие с промоторами генов аргВр и gseBp. Анализ работ с описанием получения аналогичных продуцентов позволяет сделать несколько обобщающих выводов: знания о механизмах регуляции позволяют исключить нежелательную репрессию интересуемых генов; информация о физиологической функции ферментов в клетке необходима при создании штаммов-суперпродуцентов, поскольку высокая концентрация фермента может быть токсичной для клетки; эффективной стратегией для получения рекомбинантных белков является применение индивидуальных экспрессионных систем, имеющих специальные элементы - сильные промоторы, активаторы, полилинкеры и т.п. В связи с этим, в настоящей работе были сформулированы следующие задачи: расшифровать регуляторные механизмы генов сериновых протеиназ на основе изучения протяженности промоторов и создания йшоп-конструкций. А также получить новую эффективную систему экспрессии генов на основе знаний о механизмах регуляции и апробировать её на моделях протеаз бацилл.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Штаммы бактерий, плазмидные вектора и условия культивирования г

В работе использовали штаммы и плазмиды из > музея лаборатории Биосинтеза и Биоинженерии Ферментов КФУ: стрептомицинустойчивый штамм В. pumilus 3-19, протеазо-дефицитный штамм В. subtilis BG2036 (предоставлен проф. Eugenio Ferrarri, Genencor Int. Inc., USA), штамм В. subtilis W168 (trpC2), вектора pSC9 и pCB22 (для синтеза гена erm), p58.21, pUC19, pGEM-T Easy (для создания нокаутированных по генам сериновых протеиназ штаммов). Использовали штаммы и плазмиды, любезно предоставленные научной группы Dr. Prof. Т. Mascher (Мюнхенский университет Людвига-Максимилиана, г. Мюнхен, Германия): В. subtilis W168 sinRv.spec (ТМВ079), В. subtilis W168 scoCv.tet (ТМВ081), В. subtilis W168 abrBv.kan (TMB082), В. subtilis W168 degUv.kan (TMB124), В. subtilis W168 spoOA:\tet (TMB205), B. subtilis W168 sigDwspec (TMB225), B. subtilis W168 amyEv. pSJ5101 (Phargfp) (TMB408), B. subtilis WT168 APharliaIH clean deletion (TMB604), E. coli DH5a (recA 1 endAX gyrA96 thi hsdRllfamK+) relA 1 supE44 c|>80A/acZAM15 A(lacZYA-argF)U169), вектора - pDG1662, pGP380, pSG1151 (для синтеза гена gfpmutl), pMAD (для создания штаммов не содержащих гены На оперона - clean delition), pGFPатуЕ (для изучения регуляторных участков генов сериновых протеаз). Полученные рекомбинантные штаммы и плазмиды перечислены в таблице 1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Тойменцева, Анна Александровна, 2012 год

1. Большой практикум по микробиологии / Под ред. проф. Г.Л. Селибера. М.: Высшая школа, 1962.

2. AI 587156 SU С12К1/00, C12D13/10. Штамм бактерий продуцент щелочной внеклеточной рибонуклеазы / И.Б. Лещинская, P.A. Сайманова, Р.Ш. Булгакова, М.Н. Карпанова, H.A. Голубенко // Опубликовано: 05.01.1978. Заявка: 2389167 от 01.08.1976.

3. Ицкович ЕЛ. Биосинтез щелочной внеклеточной протеиназы В.intermedius 3-19 Текст. / Е.Л. Ицкович, Л.В. Знаменская, Н.П. Балабан, Т. А. Ершова, И. Б. Лещинская // Микробиология. 1995. - Т. 64. - №5. - С. 623-629.

4. Ицкович Е.Л. Тромболитические и антикоагулянтные свойства тиолзависимой сериновой протеиназы Bacillus intermedius 3-19 Текст. / Е.Л.

5. Люблинская Л.А. Р-нитроанилиды пироглутамилпептидов -хромогенных субстратов сериновых протеаз Text. / Л. А. Люблинская, Т.Л. Воюшина, В.М. Степанов // Биоорганическая химия. 1987. - Т. 13. - №. 6. -С. 748-753.

6. Мильготина Е.И. Глутамилэндопептидазы. Страктура, функции, практическое использование Текст. / Е.И. Мильготина, Т.Л. Воюшина, Г.Г. Честухина // Биоорганическая химия. 2003. - Т. 29. - №. 6. - С. 563-576.

7. Михайлова Е.О. Выделение и характеристика субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом

8. Bacillus subtilis AJ 73 на разных фазах роста бацилл Текст. / Е.О. Михайлова, А.М. Марданова, Н.П. Балабан, Г.Н. Руденская, М.Р. Шарипова // -Биохимия. -2007. -Т. 72. -№.2. -С. 228-236.

9. Мосолова О.В. Glu, Asp-специфичная протеиназа актиномицетов Текст. / О. В. Мосолова, Г. Н. Руденская, В. М. Степанов, О. М. Ходова, И. А. Цаплина // Биохимия. 1987. - Т.52. - №3. - С. 414 - 422.

10. Руденская Г.Н. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов новое подсемейство химотрипсиновых протеиназ Текст. / Г.Н. Руденская // Биоорганическая химия. - 1998. - Т. 24. - №. 4. - С. 256-261.

11. Шарипова М.Р. Влияние источников углерода и мононуклеотидов на продукцию внеклеточной щелочной фосфатазы Bacillus intermedius Текст. / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, Н.В. Нехотяева, И.Б. Лещинская // Микробиология. 2000. - Т. 69. -№. 10. - С. 191-.196.

12. Шарипова М.Р. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedius Текст. / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, J1.A. Габдрахманова, М.А. Шилова, Ю.М. Кадырова, Т.Н. Руденская, И.Б. Лещинская //Микробиология. 2002. - Т. 71. - №. 4. - С. 494-499.

13. Шарипова М.Р. Продукция внеклеточной щелочной фосфатазы антибиотикоустойчивыми штаммами Bacillus intermedius Текст. / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, И.Б. Лещинская // Микробиология. 1994. -Т. 63. -Вып. 1. - С. 52-58.

14. Abe S. Regulation of Bacillus subtilis aprE expression by glnA through inhibition of scoC and sigma(D)-dependent degR expression Text. / S. Abe. A Yasumura, T. Tanaka // J. Bacteriol. 2009. - V. 191. - No. 9. - P. 3050-3058.

15. Anagnostopolous C. Requirements for transformation in Bacillus subtilis Text. / C. Anagnostopolous, J. Spizizen [Text] // Journal of Bacteriology. 1961. -V. 81.-P. 741-746.

16. Aoyama M. Soybean-milk-coagulating activity of Bacillus pumilus derives from a serine proteinase Text. / M. Aoyama, M. Yasuda, K. Nakaci, N. Kobamoto, H. Oku, F. Kato // Applied Microbial. Biotechnology. 2000. - V. 53. -No. 4.-P. 390-395.

17. Arnaud M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, gram-positive bacteria Text. / M. Arnaud, A. Chastanet, M. Débarbouillé // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. - No. 11. -P. 6887-6891.

18. Barrett A.J. Handbook of Proteolytic Enzymes. New York: Academic Press, 1998.

19. Belitsky B.R. Contributions of multiple binding sites and effector-independent binding to CodY-mediated regulation in Bacillus subtilis Text. J. B.R. Belitsky, A.L. Sonenshein // J. Bacterid. 2011. - V. 193. - No. 2. - P. 473-484.

20. Bierbaum G. Analysis of nucleotide pools during protease production with Bacillus licheniformis Text. / G. Bierbaum, U.E. Giesecke, C. Wandrey // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991. - V.35. -P. 725-730.

21. Bisicchia P. Suite of novel vectors for ectopic insertion of GFP, CFP and IYFP transcriptional fusions in single copy at the amyE and bglS loci in Bacillus subtilis Text. / P. Bisicchia, E. Botella, K.M. Devine // Plasmid. 2010. - V. 64. -P. 143-149.

22. Biswas I. High-efficiency gene inactivation and replacement system for grampositive bacteria Text. / I. Biswas, A. Gruss, S.D. Ehrlich, E. Maguin // J. Bacteriol. 1993. - V. 175.-No. 11.-P. 3628-3635.

23. Bongers R.S Development and characterization of a subtilin-regulated expression system in B. subtilis: strict control of gene expression by addition of subtilin Text. / R.S. Bongers, J.W. Veening, M. Van Wieringen, O.P. Kuipers, M.

24. Kleerebezem // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71. - No. 12. - P. 88188824.

25. Borgmeier C. Genetic analysis of the Bacillus licheniformis degSU operon and the impact of regulatory mutations on protease production Text. / C. Borgmeier, J. Bongaerts, F. Meinhardt // J. Biotechnol. -2012. -V.159. -P. 12-20.

26. Botella E. pBaSysBioII: an integrative plasmid generating gfp transcriptional fusions for high-throughput analysis of gene expression in Bacillus subtilis Text. /

27. E. Botella, M. Fogg, M. Jules, S. Piersma, G. Doherty, A. Hansen, E.L. Denham, L. Le Chat, P. Veiga, K. Bailey, P.J. Lewis, J.M. van Dijl, S. Aymerich, A.J. Wilkinson, K.M. Devine // Microbiology. 2010. -V. 156. - No. Pt 6. - P. 16001608.

28. Chai Y. Bistability and biofilm formation in Bacillus subtilis Text. / Y. Chai,

29. F. Chu, R. Kolter, R. Losick // Mol. Microbiol. 2008. - V. 67. - No. 2. - P. 254263.

30. Charney J. A colorimetric method for the determination of the proteolytic activity of duodenal juice Текст. / J. Charney, R.M. Tomarelli // J. Biochem. -1947.-V. 177.-P. 501-505.

31. Chastanet A. Just-in-time control of SpoOA synthesis in Bacillus subtilis by multiple regulatory mechanisms Text. / A. Chastanet, R. Losick // J. Bacterid.2011. V. 193. - No. 22. - P. 6366-6374.

32. Connelly M.B. Extracellular proteolytic activity plays a central role in swarming motility in Bacillus subtilis Text. / M.B. Connelly, G.M. Young, A. Stoma//J. Bacterid. 2004. - V. 186.-No. 13. - P. 4159-4167.

33. Cormack B.P. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP) Text. / B.P. Cormack, R.H. Valdivia, S. Falkow // Gene. 1996. - V. 173. -P. 33-38.

34. Dahech I. Partial purification of a Bacillus licheniformis levansucrase producing levan with antitumor activity Text. / I. Dahech, K.S. Belghith, H. Belghith, H. Mejdoub // Int. J. Biol. Macromol. -2012. -V.51. -No.3. -P.329-335.

35. Dixit M. Epr is transcribed from a final sigma(D) promoter and is involved in swarming of Bacillus subtilis Text. / M. Dixit, C.S. Murudkar, K.K. Rao // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - No. 2. -P. 596-599.

36. Drapeau G.R. Cleavage at glutamic acid with staphylococcal protease Text. / G.R. Drapeau // Methods Enzymol. 1977. - V.47. - P. 189-191.

37. Errington J. Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expression and control of morphogenesis Text. / J. Errington // Microbiol. Rev. 1993. - V. 57. -No. l.-P. 1-33.

38. Ferrari E. Trascription of Bacillus subtilis subtilisin and expression of subtilisin in sporulation mutants Text. / E. Ferrari, D.J. Henner, M. Perego, J.A. Hoch // J. Bacteriolog. 1988. - V. 170. - P. 289-295.

39. Fleming A.B. Extracellular enzyme synthesis in a sporulation-deficient strain of Bacillus licheniformis Text. / A.B. Fleming, M. Tangney, P.L. Jorgensen, B. Diderichsen, F.G. Priest // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - No. 11.-P. 3775-3780.,

40. Fujita M. Evidence that entry into sporulation in Bacillus subtilis is governed by a gradual increase in the level and activity of the master regulator SpoOA Text. / M. Fujita, R. Losick // Genes Dev. 2005. - V. 19. - No. 18. - P. 2236-2244.

41. Fujita M. The master regulator for entry into sporulation in Bacillus subtilis becomes a cell-specific transcription factor after asymmetric division Text. / M. Fujita, R. Losick // Genes Dev. 2003. - V. 17. - No. 9. - P. 1166-1174.

42. Geissendorfer M. Regulated expression of heterologous genes in B. subtilis using the TnlO encoded tet regulatory elements Text. / M.Geissendórfer, W. Hillen / Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. - V. 33. - No. 6. - P. 657-663.

43. González-Pastor J.E. Cannibalism by sporulating bacteria Text. / J.E. González-Pastor, E.C. Hobbs, R. Losick [Text] / // Science. 2003. - V. 301. -No. 5632.-P. 510-513.

44. Guberman J.M. PSICIC: noise and asymmetry in bacterial division revealed by computational image analysis at sub-pixel resolution Text. / J.M. Guberman, A. Fay, J. Dworkin, N.S. Wingreen, Z. Gitai // PLoS Comput. Biol. 2008. - V. 4. -No. 11. ЄІ000233.

45. Gupta R. An overview on fermentation, downstream processing and properties of microbial alkaline proteases Text. / R. Gupta, Q.K. Beg, S. Khan, B. Chauhan // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 60. - No. 4. - P. 381-395.

46. Hambraeus G. A 5' stem-loop and ribosome binding but not translation are important for the stability of Bacillus subtilis aprE leader mRNA Text. / G. Hambraeus, K. Karhumaa, B. Rutberg // Microbiology. 2002. - V. 148. - Pt. 6. -P. 1795-1803.

47. Handke L.D. Interaction of Bacillus subtilis CodY with GTP Text. / L.D. Handke, R.P. Shivers, A.L. Sonenshein // J. Bacteriol. 2008. - V. 190. - No. 3. -P. 798-806.

48. Harwood C.R. Molecular Biological Methods for Bacillus / C.R. Harwood, S.M. Cutting // John Wiley & Sons, Chichester, 1990.

49. Heermann R. Stimulus perception and signaling in histidine kinases // Bacterial Signaling Text. / R. Heermann, K. Jung // Eds. Krämer R., Jung K. Wiley-VCH. 2009. - Chap. 8. - P. 135-161.

50. Ho K.M. Co-expression of a prophage system and a plasmid system in B. subtilis Text. / K.M. Ho, B.L. Lim // Protein Expr. Purif. 2003. -V. 32. - No. 2. -P. 293-301.

51. Houmard J,,// Eur. J. Biochem. 1967. - V. 68. - P. 621-628.=,,

52. Jan J. Characterization of the 5' subtilisin (aprE) regulatory region from Bacillus subtilis Text. / J. Jan, F. Valle, F. Bolivar, E. Merino // FEMS Microbiol. Lett.-2000.-V. 183.-No. l.-P. 9-14.

53. Johnson B.T. Extracellular proteolytic activities expressed by Bacillus pumilus isolated from endodontic and periodontal lesions Text. / B.T. Johnson, L.N. Shaw, D.C. Nelson, J.A. Mayo // J. Med. Microbiol. 2008. -V. 57. - Pt. 5. -P. 643-651.

54. Jung K. Heermann R. Histidine kinases and response regulators in networks Text. / K. Jung, L. Fried, S. Behr // Curr. Opin. Microbiol. 2012. - V. 15. - No. 2.-P. 118-124.

55. Kallio P.T. The transition state regulator Hpr of Bacillus subtilis is a DNA-binding protein. Text. / P.T. Kallio, J.E. Fagelson, J.A. Hoch, M.A. Strauch // J. Biol. Chem. 1991; -V. 266.-P. 13411-13417.

56. Kawamura F, Doi RH. Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient in extracellular alkaline and neutral proteases Text. / F. Kawamura, R.H. Doi//J. Bacteriol.- 1984,-V. 160.-No. 1. P.442-444.

57. Kayumov A. Inactivation of the general transcription factor TnrA in Bacillus subtilis by proteolysis Text. / A. Kayumov, A. Heinrich, M. Sharipova, O. Iljinskaya, K. Forchhammer // Microbiology. 2008. - V.154. - No. Pt 8. - P. 2348-2355.

58. Kobayashi K. Gradual activation of the response regulator DegU controls serial expression of genes for flagellum formation and biofilm formation in Bacillus subtilis Text. / K. Kobayashi // Mol. Microbiol. 2007. - V. 66. - No. 2. - P. 395-409.

59. Kodgire P. A dual mode of regulation of flgM by ScoC in Bacillus subtilis Text. / P. Kodgire, K.K. Rao // Can J. Microbiol. 2009. - V. 55. - No. 8. - P. 983-989.

60. Kodgire P. ScoC and SinR negatively regulate epr by corepression in Bacillus subtilis Text. / P. Kodgire, M. Dixit, K.K. Rao // J. Bacterid. 2006. - V. 188. -No. 17.-P. 6425-6428.

61. Kumar C.G. Purification and characterization of a thermostable alkaline protease from alkalophilic Bacillus pumilus Text. / C.G. Kumar // Lett. Appl. Microbiol. 2002. - V. 34. -No. 1. - P. 13-17.

62. Kunst F. Salt stress is an enviromental signal affecting degradative enzyme synthesis in Bacillus subtilis Text. / F. Kunst, G. Rapoport. // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - No. 9. - P. 2403-2407.

63. Lee S.J. Development of a stationary phase-specific autoinducible expression system in B. subtilis Text. / S.J. Lee, J.G. Pan, S.H. Park, S.K Choi // J. Biotechnol. 2010. - V. 149. - No. 1-2. - P. 16-20.

64. Leighton T.J. The relationship of serine protease activity to RNA polymerase modification and sporulation in Bacillus subtilis Text. / T.J. Leighton, R.H. Doi, R.A.J. Warren, R.A. Kelln // J. Mol. Biol. 1973. - V. 76. - P. 103-122.

65. Levine J.H. Pulsed feedback defers cellular differentiation Text. / J.H. Levine, M.E. Fontes, J. Dworkin, M.B. Elowitz // PLoS Biol. 2012. - V. 10. -No. I.el001252.

66. Lopez D. Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis Text. / Lopez D., Fischbach M.A., Chu F., Losick R., Kolter R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2009. V. 106. - No. 1. P. 280-285.

67. Lopez D., Kolter R. Extracellular signals that define distinct and coexisting cell fates in Bacillus subtilis Text. / D. Lopez, R. Kolter // FEMS Microbiol. Rev. 2010. - V. 34. - No. 2. - P. 134-149.

68. Lu X. Limited proteolysis induces woodchuck hepatitis virus infectivity for human HepG2 cells Text. / X. Lu, T. Hazboun, T. Block // Virus Res. 2001. -V. 73.-No. l.-P. 27-40.

69. Lutz R. Independent and tight regulation of transcriptional units in E. coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/Il-I2 regulatory elements Text. / R. Lutz, H. Bujard // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - No. 6. - P. 1203-1210.

70. Ma J. Correlations between Shine-Dalgarno sequences and gene features such as predicted expression levels and operon structures Text. / J. Ma, A. Campbell, S.J. Karlin // Bacterid. 2002. - V. 184. - №. 20. - P. 5733-5745.

71. Maamar H. Noise in gene expression determines cell fate in Bacillus subtilis Text. / H. Maamar, A. Raj, D. Dubnau // Science. 2007. - V. 317. - No. 5837. -P. 526-529.

72. Mascher T. Cell wall stress responses in Bacillus subtilis: the regulatory network of the bacitracin stimulon Text. / T. Mascher, N.G. Margulis, T. Wang, R.W. Ye, J.D. Helmann // Mol. Microbiol. 2003. -V. 50. - P. 1591-1604.

73. Ming L.J. Structure and function of "metalloantibiotics" Text. / L.J. Ming // Med. Res. Rev. 2003. - V. 23. - No. 6. - P. 697-762.

74. Ming Y.M. Development of a B. subtilis expression system using the improved Pg/V promoter Text. / Y.M. Ming, Z.W. Wei, C.Y. Lin, G.Y. Sheng // Microb. Cell Fact. 2010. - V. 9. - No. 55. - P. 1-8.

75. Mirouze N. Spo0A~P imposes a temporal gate for the bimodal expression of competence in Bacillus subtilis Text. / N. Mirouze, Y. Desai, A. Raj, D. Dubnau // PLoS Genet. 2012. -V. 8. - No. 3. el002586.

76. Molle V. The SpoOA regulon of Bacillus subtilis Text. / V. Molle, M. Fujita, S.T. Jensen, P. Eichenberger, J.E. Gonzalez-Pastor, J.S. Liu, R. Losick // Mol. Microbiol. 2003a. - V. 50. - P. 1683-1701.

77. Molle V. The SpoOA regulon of Bacillus subtilis Text. / V. Molle, M. Fujita, S.T. Jensen, P. Eichenberger, J.E. González-Pastor, J.S. Liu, R. Losick // Mol. Microbiol. 2003. - V. 50. - No. 5. - P. 1683-1701.

78. Msadek T. When the going gets tough: survival strategies and environmental signaling networks in Bacillus subtilis Text. / T. Msadek // Trends Microbiol.1999. V. 7. - No. 5. - P. 201-207.

79. Pan S.H. Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3) Text. / S.H. Pan, Malcolm B.A. // Biotechniques.2000. V. 29. - No.6. - P. 1234-1238.

80. Pan X. The genetical effects of degUS gene in Bacillus subtilis Ki-2-132 Text. / X. Pan, Y. Zhang, M. Tang // Yi Chuan Xue Bao. 1997. - V. 24. - No. 3. -P. 282-288.

81. Rawlings N. D. Evolutionary families of peptidases Text. / N.D. Rawlings, A. J. Barrett // J. Biochem. 1993. - V. 290. - P. 205-218.

82. Rawlings N.D. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors Text. / N.D. Rawlings, A.J. Barrett, A. Bateman // Nucleic. Acids Res. 2012. -V. 40. - P. 343-350.

83. Reder A., Gerth U., Hecker M. Integration of gB activity into the decisionmaking process of sporulation initiation in Bacillus subtilis Text. / A. Reder, U. Gerth, M. Hecker // J. Bacteriol. 2012. - V.194. - No. 5. - P. 1065-1074.

84. Resnekov O. Changes in the stability of specific mRNA species in response to growth stage in Bacillus subtilis Text. / O. Resnekov, L. Rutberg, A. von Gabain //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990. - V. 87. - No. 21. - P. 8355-8359.

85. Rietkötter E. Bacitracin sensing in Bacillus subtilis Text. / E. Rietkötter, D. Hoyer, T. Mascher // Mol. Microbiol. 2008. - V. 68. - No. 3. - P. 768-785.

86. Sambrook J. Molecular Cloning a laboratory manual Text. / J. Sambrook, D.W. Russell // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold. - 2001.

87. Sánchez A. Bacillus subtilis transcriptional regulators interaction Text. / A. Sánchez, J. Olmos // Biotechnol. Lett. 2004. - V. 26. - No. 5. - P. 403-407.

88. Shoer R. Analysis of a Bacillus subtilis proteinase mutant Text. / Shoer R., H.P. Rappaport. // J. Bacteriol. 1972. - V. 109. - P. 575-583.

89. Siezen R.J. Evolution of prokaryotic subtilases: genome-wide analysis reveals novel subfamilies with different catalytic residues Text. / R.J. Siezen, B. Renckens, J. Boekhorst // Proteins. 2007. - V. 67. -No.3. - P.681-694.

90. Siezen R.J. Homology modeling and protein engeneering strategy of subtilases, the family of subtilisin-like serine proteinases Text. / R.J. Siezen, W.M. de Vos, J.A.M. Leunissen, B.W Dijkstra // Protein engineering. 1991. - V. 4.-P.719-737.

91. Siezen R.J. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like serine proteinases Text. / R.J. Siezen, A.M. Leunissen // Protein science. 1997. - V. 6. - P. 501523.

92. Sloma A. Gene encoding a minor extracellular protease in Bacillus subtilis Text. / A. Sloma, A. Ally, D. Ally, J. Pero // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - No. 12.-P. 5557-5563.

93. Smits W. K. Stripping Bacillus: ComK auto-stimulation is responsible for the bistable response in competence development Text. / W.K. Smits, C.C. Eschevins, K.A. Susanna, S. Bron, O.P. Kuipers, L.W. Hamoen // Mol. Microbiol. 2005. -V. 56.-P. 604-614.

94. Smits W.K. The transcriptional regulator Rok binds A+Trich DNA and is involved in repression of a mobile genetic element in Bacillus subtilis Text. / W.K. Smits, A.D. Grossman // PLoS Genet. 2010. - V.6. el001207.

95. Stahl M.L. Replacement of the Bacillus subtilis subtilisin structural gene with an In vitro-derived deletion mutation Text. / M.L. Stahl, E. Ferrari // J. Bacteriol. -1984.-V. 158.-No. 2. P. 411-418.

96. Steinmetz M. Induction of saccharolytic enzymes by sucrose in Bacillus subtilis: evidence for two partially interchangeable regulatory pathways Text. / M. Steinmetz, D. Le Coq, S. Aymerich // J. Bacteriol. -1989. -V.171. -N.3. -P. 15191523.

97. Stephenson K. Cellular lysis in Bacillus subtilis; the effect of multiple exrtacellular protease deficiencies Text. / K. Stephenson, S. Bron, C.R. Harwood // Lett. Appl. Microbiol. 1999. - V. 29. - P. 141-145.

98. Stewart B. The lonS gene regulates swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus Text. / B. Stewart, J.L. Enos-Berlage, L.L. McCharter // J. Bacteriol. 1997. - V. 179. -P. 107-114.

99. Stock A.M. Two-component signal transduction Text. / A.M. Stock, V.L. Robinson, P.N. Goudreau // Annu. Rev. Biochem. 2000. - V. 69. - P. 183-215.

100. Storm D.R. Complex formation between bacitracin peptides and isoprenyl pyrophosphates. The specificity of lipid-peptide interactions Text. / D.R. Storm, J.L. Strominger // J. Biol. Chem. V. 248. - No. 11. - P. 3940-3945.

101. Strauch M.A. Transition-state regulators and sentinels of -Bacillus subtilis post-exponential gene expression Text. / M.A. Strauch, J.A. Hoch. // 1993. Mol. Microbiol. -V.l.- P. 337-342.

102. Studier F.W. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes Text. / F.W. Studier, B.A. Moffatt // J. MoL Biol. 1986. -V.189. - No. l.-P. 113-130.

103. Subbian E. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone: intrinsically unstructured propeptide modulates stochastic activation of subtilisin Text. / E. Subbian, Y. Yabuta, U.P. Shinde // J. Mol. Biol. 2005. - V.347. - No. 2.-P. 367-383.

104. Suntharalingam P. The LiaFSR system regulates the cell envelope stress response in Streptococcus mutans Text. / P. Suntharalingam, M.D. Senadheera, R.W. Mair, C.M. Levesque, D.G. Cvitkovitch // J. Bacteriol. 2009. - V.191. -No. 9. - P. 2973-2984.

105. Svendsen I. Isolation and amino acid sequence of a glutamic acid specific endopeptidase from Bacillus licheniformis Text. /1. Svendsen, K. Breddam // Eur. J. Biochem. 1992.- V.204. - No. l.-P. 165-171.

106. Terpe K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems Text. / K. Terpe, // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. - V.72. - No. 2. - P. 211222.

107. Tsukahara K. Characterization of DegU-dependent expression of bpr in Bacillus subtilis Text. / K. Tsukahara, M. Ogura // FEMS Microbiol. Lett. -2008b.-V. 280.-No. l.-P. 8-13.

108. Tsukahara K. Promoter selectivity of the Bacillus subtilis response regulator DegU, a positive regulator of the flalche operon and sacB Text. / K. Tsukahara, M. Ogura // BMC Microbiol. 2008a. - V. 15. 8:8.

109. Uehara H. Thermosensitive, extracellular neutral proteases in Bacillus subtilis: isolation, characterization, and genetics. Text. / H. Uehara, K. Yamane, B. Maruo // J. Bacterid. 1979. -V. 139. -P. 583-590.

110. Urtz B.E. Purification and characterization of a novel extracellular protease from Beauveria bassiana Text. / B.E. Urtz, W.C. Rice // Mycol. Res. 2000. - V 104.-P. 180-186.

111. Utsumi R. Two-component Signal Transduction as Attractive Drug Targets in Pathogenic Bacteria Text. / Utsumi R., Igarashi M. // Yakugaku Zasshi. 2012. -V. 132.-No. l.-P. 51-58.

112. Valbuzzi A. A novel member of the subtilisin-like protease family from Bacillus subtilis Text. / A. Valbuzzi, E. Ferrari, A. M. Albertini // Microbiology. -1999.-V. 145.-P. 3121-3127.

113. Vavrova L. Comparison of different Bacillus subtilis expression systems Text. / L. Vavrova, K. Muchova, I. Barak // Res. Microbiol. 2010. - V. 161. -No. 9.-P. 791-797.

114. Veening J.W. Phosphatases modulate the bistable sporulation gene expression pattern in Bacillus subtilis Text. / J.W.Veening, L.W. Hamoen, O.P. Kuipers // Mol. Microbiol. 2005. - V. 56. - P. 1481-1494.

115. Vellanoweth R.L. The influence of ribosome-binding-site elements on translational efficiency in Bacillus subtilis and Escherichia coli in vivo Text. / R.L. Vellanoweth, J.C. Rabinowitz // Mol. Microbiol. 1992. -V. 6. - No. 9. -P. 1105-1114.

116. West J.T. Relative roles of the fla/che P(A), P(D-3), and P(sigD) promoters in regulating motility and sigD expression in Bacillus subtilis Text. / J.T. West, W. Estacio, L. Márquez-Magaña // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - No. 17. - P. 48414848.

117. Westers H. The CssRS two-component regulatory system controls a general secretion stress response in Bacillus subtilis Text. / H. Westers, L. Westers, E. Darmon, J.M. van Dijl, W.J. Quax, G. Zanen // FEBS J. 2006. - V. 273. - No. 16.-P. 3816-3827.

118. Westers L. Bacillus subtilis as cell factory for pharmaceutical proteins: a biotechnological approach to optimize the host organism Text. / L. Westers, H. Westers, W.J. Quax // Biochim. Biophys. Acta. 2004. -V. 1694. - No. 1-3. - P. 299-310.

119. Wiegert T. Alkaline shock induces the Bacillus subtilis ow regulon Text. / T. Wiegert, G. Homuth, S. Versteeg, W. Schumann // Mol. Microbiol. 2001. - V. 41.-P. 59-71.

120. Wolz C. The synthesis and function of the alarmone (p)ppGpp in firmicutes Text. / C. Wolz, T. Geiger, C. Goerke // Int. J. Med. Microbiol. 2010. -V. 300. No. 2-3.-P. 142-147.

121. Wray L.V.Jr. Bacillus subtilis glutamine synthetase controls gene expression through a protein-protein interaction with transcription factor TnrA Text. / L.V.Jr. Wray, J.M. Zalieckas, S.H. Fisher // Cell. 2001. - V. 107. - No. 4. - P. 427-435.

122. Wu C.M. Construction and characterization of nisin-controlled expression vectors for use in Lactobacillus reuteri Text. / C.M .Wu, C.F. Lin, Y.C. Chang, T.C. Chung // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006. - V. 70. - No. 4. - P. 757-767.

123. Yabuta Y. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone. A functional peptide chaperone designed using sequence databases Text. / Y. Yabuta, E. Subbian, C. Oiry, U. Shinde // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 15246-15251.

124. Yang M.Y. Cloning of the neutral protease gene of Bacillus subtilis and the use of the cloned gene to create an in vitro-derived deletion mutation Text. / M.Y. Yang, E. Ferrari, D.J. Henner//J. Bacterid.- 1984.-V. 160.-No. 1.- P. 15-21.

125. Штаммы Время, мин Max, ед. GFP

126. М/168 (без конструкции) 0

127. ТМВ408 168: не опт. 5Ь) индукция 0

128. ТМВ408 (IV 168; не опт. 50) + индукция 264

129. ТМВ1172 М/ 168 индукция 0

130. ТМВ1172. И/ 168 + индукция ■ ■■ ■ ■ «я 1440

131. ТМВ1174 ТМВ604 (ДР//а11а1Н) индукция 0

132. ТМВ11741 ТМВ604 (ДР//а11а1Н) + индукция ■ щр ■ 958

133. ТМВ1153 ТМВ1151 (Д11а1Н) индукция 0

134. ТМВ1153 ТМВ1151 (Д|1а1Н) ♦ индукция 1080

135. ТМВ1318. ТМВ1152 (ДИаШТегт) индукция 0

136. ТМВ13181 ТМВ1152 (Д||а1НТегт) + индукция 14161. Colour legend025 0.0375 0 05 0109375 016875 0 228125 0 2875 0 346875 0 40625 0 465625 0 525 0 534375064375 0.703125 0

137. Анализ активности Р/ю^бо) промотора на основе экспрессии гена £//? в составе рЫКЕ-Ш вектора в различных рекомбинантных штаммах В. яиЫШБ.юрЫКЕ-гер+^лш!/s