Механизмы атерогенной модификации липопротеидов низкой плотности карбонильными соединениями тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Кумскова, Елена Михайловна

• Кумскова, Елена Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кумскова, Елена Михайловна

Содержание

Содержание

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы. Окислительная модификация ЛНП при атеросклерозе и сахарном диабете

2. Экспериментальная часть

Материалы и методы исследования

Материалы

Биохимические методы

Биофизические методы

Иммунологические методы

Методы клеточной биологии

Компьютерная обработка данных

3. Результаты и их обсуждение

3.1.Поглощение макрофагами ЛНП, модифицированных первичными и вторичными продуктами свободнорадикального окисления полиеновых липидов

3.2 Характеристика препаратов нативныхЛНП и ЛНП, модифицированных МДА и метилглиоксалем

3.3. Генерирование супероксидного анион-радикала при взаимодействии карбонильных соединений с лизином

3.4. Использование иммуноферментного анализа для определения антигенной специфичности антител к модифицированным ЛНП и уровня окисленных ЛНП в популяции

Выводы

Заключение

Список литературы

Список сокращений

АА - акриламид

АР - альдозоредуктаза

АТФ - аденозинтрифосфат

АФК - активные формы кислорода

апоВ - апопротеин В

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГАФД - глицеральдегид-з-фосфатдегидрогеназа

ДАГ - диацилглицерол

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИФА - иммуноферментный анализ

КПНГ - конечные продукты неферментативного гликозилирования ЛВП - липопротеиды высокой плотности ЛНП - липопротеиды низкой плотности Лп(а) - липопротеид (а)

ЛП-ФЛА2 - липопротеид ассоциированная фосфолипаза А2 МДА - малоновый диальдегид

модЛНП - модифицированные липопротеиды низкой плотности

МПО-миелопероксидаза

НСТ - нитросиний тетразолий

ПААГ - полиакриламидный гель ПАРП - поли-АДФ-рибозополимераза ПКС - протеинкиназа С

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПЭГ - полиэтиленгликоль

СОД - супероксиддисмутаза

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ФЛА2 - фосфолипаза А2

ХС - холестерин

ALDH - алдегиддегидрогеназа

ELISA - иммуноферментный анализ (enzyme-linked immunosorbent assay)

МТР - микросомный триглицерид-переносящий белок (microsomal triglyceride-transfer protein)

NAD+ - никотинамиддинуклеотид

NADPH - никотинамиддинуклеотидфосфат

NFkB - ядерный фактор кВ (nuclear factor кВ)

PAF - фактор, активирующий тромбоциты

PBS - изотонический фосфатный буфер (potassium buffer solution) SDS - додецилсульфат натрия (Sodium dodecylsulfate)

SREBP - sterol regulatory element-binding protein (белок, связывающийся со стерол-регулируемым элементом)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы атерогенной модификации липопротеидов низкой плотности карбонильными соединениями»

Введение

Актуальность проблемы

Атеросклероз и ишемическая болезнь сердца - одни из наиболее частых причин смертности в развитых странах, причём основные осложнения этих заболеваний вызваны повреждением стенки сосудов. Несмотря на определённый прогресс в изучении механизмов атерогенеза, ключевые вопросы первичного поражения сосудистой стенки по-прежнему остаются далёкими от окончательного разрешения. В настоящий момент не вызывает сомнений тот факт, что липопротеиды низкой плотности (ЛНП) играют важную роль в атерогенном повреждении сосудов, являясь источником липидов, накапливающихся в стенке сосуда при атеросклерозе. На сегодняшний день одна из основных гипотез, объясняющих развитие атеросклероза, связывает начало атеросклеротического процесса с появлением в кровотоке модифицированных ЛНП, значительно отличающихся от нативных частиц по физико-химическим свойствам, причём модификация может затрагивать как белковую часть ЛНП (апопротеин В-юо), так и фосфолипидный монослой. Известно, что модифицированные ЛНП активно захватываются с помощью скэвенджер-рецепторов макрофами стенки сосуда, которые трансформируются в пенистые клетки, образуя зоны липоидоза - первичного предатерогенного повреждения сосудистой стенки [Климов, Никульчева, 1999]. Несмотря на то, что агенты, способные принимать участие в модификации апобелка ЛНП, достаточно разнообразны, наибольшую роль в этом процессе, как полагают, играют карбонильные соединения, преимущественно, низкомолекулярные альдегиды различного происхождения [Меньщикова и соавт., 2008].

В процессе окислительного стресса низкомолекулярные альдегиды могут накапливаться в качестве вторичных продуктов свободнорадикального окисления липидов. При этом образуются малоновый диальдегид (МДА), 4-гидроксиноненаль и другие алкенали [Ланкин и соавт., 2000-2004]. В

последние годы в качестве возможных модификаторов ЛНП рассматриваются также альдегиды, образующиеся при карбонильном стрессе в реакциях автоокисления глюкозы, сопровождающих развитие сахарного диабета. Основными карбонильными продуктами автоокисления глюкозы и триозофосфатов являются глиоксаль, метилглиоксаль, з-дезоксиглюкозон и др. [Меныцикова и соавт., 2008]. Структуры альдегидов, генерируемых в процессе свободнорадикального окисления липидов и в процессе автоокисления глюкозы и триозофосфатов, весьма схожи, такие дикарбонилы, как глиоксаль и МДА, являются гомологами, а метилглиоксаль и МДА - изомерами. Тем не менее, сравнительного исследования влияния назкомолекулярных природных дикарбонилов на свойства ЛНП, связанные с их атерогенностью, до сих пор не проводилось.

Известно, что больные сахарным диабетом имеют повышенную склонность к развитию атеросклероза, причём при этом заболевании выявлена прямая корреляция между уровнем гипергликемии и выраженностью сосудистых поражений [Bucala, 1997]. При этом соединения, способные связывать накапливающиеся в кровотоке дикарбонилы, могут рассматриваться как наиболее перспективные на данный момент лекарственные препараты для лечения сахарного диабета [Gallagher, LeRoith, 2011], что свидетельствует в пользу важной роли низкомолекулярных карбонильных соединений в прогрессировании сахарного диабета и связанных с ним осложнений. Таким образом, исследование, посвященное изучению молекулярных механизмов атерогенной модификации ЛНП под действием различных природных дикарбонилов, представляется весьма актуальным. Настоящее исследование посвящено изучению сравнительного биологического действия природных альдегидов различного происхождения и его возможных патогенетических последствий.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является выяснение особенностей механизмов атерогенной модификации ЛНП под действием низкомолекулярных природных альдегидов, образующихся при свободнорадикальном окислении липидов (на примере МДА) и автоокислении глюкозы и триозофосфатов (на примере метилглиоксаля), а также определение патогенетического значения карбонильной модификации ЛНП.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительное исследование роли первичных (липогидропероксиды) и вторичных (низкомолекулярные дикарбонилы) продуктов свободнорадикального окисления липидов в увеличении атерогенности ЛНП (усилении захвата частиц ЛНП моноцитами-макрофагами стенки сосуда).

2. Сравнить изменение физико-химических свойств ЛНП (по изменению суммарного поверхностного заряда частиц, образованию внутри- и межмолекулярных сшивок, накоплению флуоресцирующих шиффовых оснований, а также их окисляемости) при модификации ЛНП под действием МДА и метилглиоксаля.

3. Изучить особенности агрегации ЛНП после их модификации природными низкомолекулярными альдегидами различного происхождения.

4. С использованием различных методов (спектрофотометрия, хемилюминесценция, ЭПР-спектроскопия) исследовать возможность образования активных форм кислорода и органических свободнорадикальных интермедиатов в ходе реакции Мэйларда (при реакциях аминогруппы апобелка с альдегидной группой).

5. С помощью иммуноферментного анализа (моноклональные антитела к МДА-модифицированным и метилглиоксаль-модифицированным ЛНП) исследовать антигенные свойства эпитопов, образующихся в апопротеине В-юо при его взаимодействии с природными низкомолекулярными альдегидами различного происхождения.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Впервые показано, что усиленный захват ЛНП культивируемыми макрофагами человека происходит при альдегид-зависимой модификации апопротеина В-юо, но не при ферментативном окислении (накоплении ацилгидропероксидов) наружного фосфолипидного слоя частиц. При сравнительном исследовании физико-химических свойств ЛНП (изменение суммарного поверхностного заряда частиц, образование поперечных сшивок, накопление флуоресцирующих шиффовых оснований, окисляемость частиц ЛНП) установлено, что МДА в большей степени влияет на изменение структуры апопротеина В-юо и поверхностного заряда частицы, тогда как модификация метилглиоксалем провоцирует интенсификацию свободнорадикального окисления липидной компоненты ЛНП. Впервые с помощью различных методов (спектрофотометрия, хемилюминесценция, ЭПР-спектроскопия) обнаружено генерирование активных форм кислорода в ходе реакции Мэйларда (при реакциях аминогруппы апобелка с альдегидной

группой), а также на основании качественного анализа образующихся свободнорадикальных интермедиатов предложен механизм автокаталитического усиления окислительного стресса в процессе метилглиоксаль-зависимой модификации ЛНП. С использованием иммуноферментного анализа (моноклональные антитела к МДА-модифицированным и метилглиоксаль-модифицированным ЛНП) выявлены принципиальные различия в антигенной структуре образующихся эпитопов в апопротеине В-юо при модификации ЛНП в присутствии МДА и метилглиоксаля. Установлено, что атерогенные (обогащённые холестерином) ЛНП являются одновременно и наиболее окисленными.

Практическая значимость исследования

Полученные результаты уточняют молекулярные механизмы взаимодействия лизиновых остатков белков с МДА и метилглиоксалем и позволяют связать выявленные различия в молекулярных механизмах со степенью атерогенности ЛНП, образующихся при реакциях с альдегидами, накапливающимися при свободнорадикальном окислении липидов в процессе развития атеросклероза (МДА) и при автоокислении глюкозы и триозофосфатов в процессе развития сахарного диабета (метилглиоксаль). Кроме того, полученные результаты свидетельствуют о важной роли карбонильной модификации ЛНП в атерогенезе, и позволяют рассматривать уровень карбонил-модифицированных ЛНП в качестве независимого фактора риска развития атеросклероза, возможно, более перспективного, чем традиционно измеряемые биохимические показатели (содержание общего холестерина и холестерина ЛНП в сыворотке крови). Выявленные в работе различия в антигенной специфичности различных моноклональных антител к модифицированным ЛНП могут служить основой для разработки подходов к селективной экспресс-диагностике атеросклероза и сахарного диабета.

1. Обзор литературы. Окислительная модификация ЛНП при атеросклерозе и сахарном диабете.

Атеросклероз и связанные с ним болезни сердечно-сосудистой системы являются одной из основных причин смертности населения в развитых странах, опережая рак и другие неинфекционные заболевания (Stocker, Keaney, 2004). Причиной развития атеросклеротических повреждений сосудов является нарушение липидного обмена, при котором происходит внутриклеточное и внеклеточное отложение липидов в интиме сосудов. Развитие атеросклероза связывают с увеличением общего количества липидов, циркулирующих в кровотоке: избыток липидов (преимущественно холестерина (ХС), входящего в состав липопротеидов низкой плотности (ЛНП)), откладывается в атеросклеротических бляшках, способствуя, таким образом, прогрессированию атеросклеротических повреждений сосудов [Климов, Никульчева, 1999]-

В развитии атеросклероза важную роль играют 2 класса липопротеидов плазмы крови, выполняющие различные функции - ЛНП и липопротеиды высокой плотности (ЛВП). ЛНП представляют собой сферические частицы диаметром 180-250 Â, плотностью 1,019-1,06 г/мл и относительной молекулярной массой 1800-2800 кДа (рис.1.1) [Климов, Никульчева, 1999> Меныцикова и соавт., 2001, Segrest et al., 2001]. В среднем на 1 частицу ЛНП приходится 1600 молекул эфиров ХС, 700 молекул фосфолипидов, 600 молекул свободного ХС, 170 молекул триглицеридов и единственная копия основного белка ЛНП - апопротеина В-юо (апоВ-юо) [Ôôrni et al., 2000]. Гидрофобное ядро ЛНП, состоящее из нейтральных липидов (преимущественно эфиров ХС и триглицеридов), окружено монослоем из фосфолипидов и свободного ХС.

монослой фосфолипидов

эфиры холестерина

смектическая фаза под (В-складкой апоВ-100

свободный холестерин

триглицериды

апоВ-100

неполярное липидное ядро

амфип аттические р-складки

. > Ч'. <Г ^ 4 "

амфипатические а-спирали

Рис. 1.1. Схема строения частицы ЛНП. Верхняя часть рисунка иллюстрирует организацию лииидной компоненты частиц, нижняя часть - предполагаемую организацию белковой цепи апоВ-юо на поверхности частицы (а-спирали и Р-складки, находящиеся с тыльной стороны частицы, изображены более светлыми)

Аполипопротеин В-юо - один из самых крупных мономерных белков, он состоит из 453б аминокислот и подвергается О-гликозилированию в 15 положениях [Segrest et al., 2001]. АпоВ-юо относится к необмениваемым аполипопротеинам, он практически не растворим в водной фазе и сохраняется в составе частицы в течение всей её жизни. Апо В-юо покрывает около половины поверхности частицы ЛНП и, в отличие от обмениваемых аполипопротеинов, имеет в своём составе (3-складчатые структуры, которые отличаются высокой гидрофобностью и составляют 40-50% от всей аминокислотной последовательности (рис. 1.1) [Segrest et al., 2001]. АпоВ-юо стабилизирует частицу, обеспечивает её рецепторное связывание с клетками и, возможно, участвует в регуляции размеров частиц ЛНП [Климов, Никульчева, 1999, Segrest et al., 2001]. Специфическое распределение молекул поверхностного слоя обеспечивает формирование отдельных кластеров (доменов) на поверхности частицы: апоВ-юо прочно связан с фракцией поверхностных фосфолипидов, и, по всей вероятности, контактирует с эфирами ХС в гидрофобном ядре через (3-складчатые структуры [Segrest et al., 2001], тогда как свободный ХС взаимодействует преимущественно со сфингомиелином [Oorni et al., 2000].

ЛНП образуются в кровотоке из секретируемых печенью липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП) путём гидролиза триацилглицеридов гидрофобного ядра липопротеидлипазой, удаления апобелков С и Е и части лецитина поверхностного слоя [Климов, Никульчева, 19991- Важно отметить, что одним из источников окисленных липидов в ЛНП могут быть окисленные липиды экзогенного происхождения (образующиеся в пищевых продуктах животного происхождения при кулинарной обработке), которые после всасывания в желудочно-кишечном тракте включаются в хиломикроны и транспортируются в печень, где, также как эндогенно генерируемые продукты ПОЛ, могут встраиваться в секретируемые в кровоток ЛОНП [Ланкин и соавт., 2001]. Формирование апоВ-содержащих частиц ЛОНП происходит в печени при участии микросомного триглицерид-переносящего белка (microsomal triglyceride-transfer protein, МТР) [Segrest et al., 2001]. В процессе синтеза апоВ-юо его N-концевой участок, имеющий гомологичные МТР

последовательности, формирует «липидный карман», который взаимодействует с МТР, в результате чего образуется «липидное гнездо», в котором аккумулируются липиды в процессе роста частицы [Segrest et al., 2001]. Ингибирование МТР приводит к подавлению секреции апоВ-содержащих частиц [Segrest et al., 2001].

ЛНП осуществляют транспорт эндогенных липидов, в частности холестерина, через кровяное русло в периферические ткани. В кровотоке, в присутствии кислорода и гемового железа, окисленные липиды, входящие в состав ЛОНП, могут подвергаться окислительной деструкции с образованием вторичных продуктов ПОЛ, в т.ч. МДА [Ланкин и соавт., 2001]. Это, в свою очередь, должно приводить к накоплению продуктов окисления в циркулирующих в кровяном русле ЛНП и вызывать их окислительную модификацию [Ланкин и соавт., 2001]. Удаление ЛНП осуществляется преимущественно через захват высокоаффинными апобелок-В,Е-рецепторами, причём время полувыведения ЛНП составляет около 2 суток [Меныцикова и соавт, 2008].

В то время как ЛНП осуществляют транспорт липидов к периферическим тканям, где происходит их рецептор-опосредованный захват, ЛВП, в свою очередь, обеспечивают обратный процесс: при контакте с рецепторами на клеточных мембранах они абсорбируют избыточный ХС через ПКС-зависимый механизм. Затем частицы ЛВП переносят этот ХС в печень, где происходит катаболизм ХС с образованием желчных кислот [Климов, Никульчева, 1999]- Уровень ХС ЛВП является хорошим индикатором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний: у людей в возрасте старше 50 лет увеличение уровня ХС ЛВП на 1мг/дл связано с уменьшением риска развития сердечно-сосудистых заболеваний на 2% у мужчин и 3% у женщин [Mertens, Holvoet, 2001].

В отличие от ЛНП, ЛВП практически не подвержены окислительным модификациям, более того, ЛВП способны защищать ЛНП от окисления и удалять продукты окисления из ЛНП [Mertens, Holvoet, 2001, Podrez, 2010 ]. Метиониновые остатки 112 и 148 в аполипопротеине A-I, ассоциированном с

ЛВП, способны непосредственно восстанавливать гидропероксиды в фосфатидилхолине и эфирах ХС [Podrez, 2010]. PAF ацетилгидролаза, а также параоксоназы l и 3, ассоциированные с ЛВП, гидролизуют образующиеся гидроперекиси липидов, предотвращая окисление частиц ЛНП [Hajjar, Haberland, 1997]. Кроме того, параоксоназа l усиливает отток ХС из макрофагов, облегчая связывание ЛВП через ABCAi-рецепторы [Podrez, 2010]. Имеются данные, что и другие белки, ассоциированные с ЛВП, способны защищать ЛНП от окислительных модификаций и подавлять воспалительные реакции [Mertens, Holvoet, 2001, Podrez, 2010].

Показано, что уровень ХС в ЛНП коррелирует с наличием атеросклероза и риском развития ишемической болезни сердца (ИБС), тогда как уровень ХС в ЛВП и вероятность развития сердечно-сосудистых заболеваний находятся в обратной зависимости [Illingworth, Durrington, 1999, Mertens, Holvoet, 2001]. Тем не менее, уровень ХС в ЛНП и ЛВП не всегда можно использовать как надёжный критерий наличия атеросклероза: почти в 30% случаев ИБС развивается при близком к норме содержании ХС в плазме крови [Homma, 2004, Johnston et al., 2006]. Таким образом, гиперхолестеринемия не является решающим фактором риска развития атеросклероза. Более того, данные последних лет указывают на то, что не уровень общего ХС и ХС ЛНП, а уровень окисленных ЛНП является важным диагностическим фактором ИБС и атеросклероза [Johnston et al., 2006].

В настоящее время существует несколько гипотез о механизмах атерогенеза. В частности, апоВ-юо частиц ЛНП, циркулирующих в кровяном русле, может взаимодействовать с протеогликанами внеклеточного матрикса, приводя к накоплению ЛНП в сосудистой стенке [Williams, Tabas, 2005]. «Удержание» ЛНП в стенке сосуда при взаимодействии с протеогликанами делает частицы ЛНП мишенью для других компонентов внеклеточного матрикса, в том числе протеолитических и липолитических ферментов, а также окислителей различной природы [Öörni et al., 2000], приводя к дальнейшим изменениям в структуре частиц. Изменение структуры ЛНП под действием разнообразных модифицирующих агентов может приводить к их слиянию и образованию

относительно крупных липидных включений в сосудистой стенке [Ôorni et al., 2000]. С другой стороны, атеросклероз может развиваться вследствие механического или воспалительного повреждения стенки сосуда [Ross, 1999, Trepels et al., 2006]. Воспаление увеличивает проницаемость сосуда для частиц ЛНП, приводя к отложению липидов в стенке сосуда, а также вызывает адгезию лейкоцитов и тромбоцитов, способных выделять вазоактивные вещества, цитокины и факторы роста, и макрофагов, которые могут поглощать липиды ЛНП, трансформируясь в перегруженные липидами «пенистые клетки» [Stocker, Keaney, 2004]. В любом случае, важным звеном в развитии атеросклероза является изменение функциональной целостности частиц ЛНП в результате биохимических модификаций [Bucala, 1997]-

В начале 1980-х гг. было показано, что в присутствии эндотелиоцитов может происходить окислительная модификация ЛНП, которая приводит к их усиленному поглощению макрофагами [Меныцикова и соавт, 2008]. Эти исследования послужили обоснованием свободнорадикальной теории атерогенеза, исходящей из важной роли перекисного окисления липидов (ПОЛ) в этиологии и патогенезе атеросклероза. Данные различных исследований указывают на то, что стационарная концентрация продуктов свободнорадикального ПОЛ существенно увеличена в крови больных атеросклерозом [Нежданова, 2004, Lankin, 2003 и др.] и при клинически связанных с ним заболеваниях, в частности, при сахарном диабете[МоЬатес1 et al., 1999, Niedowicz, Daleke, 2005].

Основным субстратом ПОЛ служат полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), прежде всего, наиболее распространённая линолевая кислота (18:2), имеющая двойные связи при 9-м и 12-м атомах углерода [Меныцикова и соавт., 2008]. ПНЖК входят в состав фосфолипидов мембран клеток и субклеточных органелл, а также липопротеидов плазмы крови; в присутствии кислорода они легко окисляются до соответствующих гидропероксидов [Ланкин и соавт., 2000]. В качестве индуктора процессов ПОЛ в биомембранах может выступать гидроксил-радикал (НО'), образующийся при

дисмутации супероксидного анион-радикала (02'~) в пероксид водорода (Н202), который, так же как гипохлорная кислота (НОС1), генерирует НО' при распаде [Ланкин и соавт., 2000, Lankin, 2003]. Липогидропероксиды, образующиеся при свободнорадикальном перекисном окислении ненасыщенных липидов (ПОЛ), весьма лабильны и могут подвергаться дальнейшей окислительной деструкции, в связи с чем в процессе ПОЛ кроме первичных продуктов окисления обычно накапливается большое количество вторичных продуктов [Jomova, Valko, 2011] (рисл.2). Наиболее важными из них являются а,Р-ненасыщенные альдегиды (такие как 4-гидроксиноненаль, 4,5-дигидроксидеценаль, 4-гидроксигексеналь) и малоновый диальдегид (МДА) и др. [Witz, 1989, Jomova, Valko, 2011].

Поскольку липогидропероксиды, ненасыщенные альдегиды и МДА являются мутагенами и обладают выраженной цитотоксичностью [Ланкин и соавт., 2000, Lankin, 2003,, Jomova, Valko, 2011], в организме существуют регуляторные механизмы, контролирующие избыточное накопление этих высокотоксичных продуктов ПОЛ. Свободнорадикальное окисление ПНЖК в биомембранах могут подавлять природные антиоксиданты, важнейшими из которых являются а-токоферол (витамин Е), который может содержаться во всех частицах ЛНП, а также ß-каротин (провитамин А), восстановленная (фенольная) форма коэнзима Qx0 и аскорбиновая кислота (витамин С) [Tsuchihashi et al., 1995, Бурлакова и соавт., 1998, Ланкин и соавт., 2000, Lankin, 2003]. Ведущую роль в регуляции процессов ПОЛ в организме играют « антиоксид антные» ферменты, способные утилизировать 02'~ (супероксиддисмутаза, СОД), Н202 (каталаза) и липогидропероксиды (глутатионпероксидаза, GSH-пероксидаза; глутатион-Б-трансфераза; GSH-трансфераза) [Зенков и соавт.. 2001, Lankin, 2003, Jomova, Valko, 2011]. Ослабление механизмов антиоксидантной защиты является важным звеном в развитии свободнорадикальных патологий, при этом происходит уменьшение уровня восстановленного глутатиона и NAD(P)H, что приводит к снижению активности антиоксидантных ферментов [Stocker, Keaney, 2004, Меныцикова и соавт., 2008].

н»

А-

л к н

ПНЖК

r*

н

алкилыный тпкдный радикал

Н, ООН

./ \ + R< литидная гидроперекись

апкильный липадный радикал

ROO* Нч ,0-0*

гвдроперекисный тпмдный радикал Ш 1

/ V V \

эидолорсчси.

о о

АЛ

Н Н

Рис.1.2. Схема образования МДА в процессе свободнорадикального окисления липидов

Многочисленные данные указывают на то, что атерогенные ЛНП являются классом липопротеидов плазмы крови, наиболее чувствительным к индукции процессов свободнорадикального окисления [Климов, Никульчева, 1999, Steinberg, 1995]. Установлено, что при окислении ЛНП происходит изменение конформации апопротеина В-юо, сопровождающиеся его смещением из гидрофобной зоны частицы в водную фазу, что, в свою очередь, приводит к увеличению нерецепторного захвата окисленных атерогенных ЛНП клетками стенки сосуда [Krisko et al., 2007, Jayaraman et al., 2007]. Кроме того, карбонильные соединения, образующиеся в процессе окислительной деструкции липопероксидов в окисленных ЛНП, могут реагировать с £-аминогруппами лизиновых остатков апоВ-юо, приводя к образованию амино,имино-пропеновых связей типа флуоресцирующих «шиффовых

оснований» [Witz, 1989], приводящих к образованию внутри- и межмолекулярных поперечных сшивок [Requena et al., 1997] и, в конечном счёте, к изменению структуры частиц ЛНП (рис.1.3) [Esterbauer et al., 1992, Steinberg, 1995]. Кроме того, при прогрессировании полимеризации окисленных липидов и белков могут образовываться сложные соединения -цероидные или возрастные пигменты и липофусцин [Negre-Salvayre et al., 2008, Zhang et al. 2009].

Такой же окислительный процесс может приводить к модификации липопротеина(а) (Лп(а)), который имеет сходный с ЛНП липидный состав и, также как ЛНП, содержит апоВ-юо [Mackness, Durrington, 1995]. Лп(а)отличается от ЛНП дополнительным белком - апопротеином(а), который связан с апоВ-юо дисульфидной связью. Апо(а) имеет высокую степень гомологии с плазминогеном; в его составе выделяют и 3-хпетельных участков, каждый из которых стабилизируется тремя дисульфидными связями и обозначается как крингл. Апо(а) может содержать до 54 крингл-повторов; каждый из типов кринглов (IV-i - VI-10 и V) представлен единственной копией, за исключением крингла IV-2 [Scanu, Edelstein, 1997]. Кринглы в апо(а) могут связывать низкомолекулярные лиганды: лизин и его аналоги и фибрин(оген). Хотя структура Лп(а) неплохо изучена, его функции в организме до сих пор остаются загадкой. Предполагается, что в очаге воспаления Лп(а) может подвергаться расщеплению под действием эластазы и металлопротеиназ, принимая участие в провоспалительных процессах [Scanu, Edelstein, 1997]. Высокий уровень Лп(а) является независимым фактором риска развития атеросклероза и ИБС [Schaefler at al., 2002]. Использование антител к нативному и окисленному Лп(а) позволило выявить взаимосвязь между уровнем окисленного Лп(а) в плазме крови и тяжестью атеросклеротических повреждений сосудов; кроме того, среди людей, страдающих заболеваниями сосудов, чаще встречается фенотип Лп(а) с небольшим (27 и менее) количеством крингл-повторов К-IV, более подверженный окислению [Morishita et al., 2009]. Предполагается также, что более мелкие изоформы Лп(а) легче проникают сквозь сосудистую стенку в очаг воспаления [Scanu, Edelstein, 1997].

lys

LYS

LYS

%

■nh2 + /

h

u

- CH2"

МДА

4

о

H

У

\

H

шиффово основание

¿И , 2e

-NH—CH2—CH2—CH2OH

производное Lys-МДА

(3-( №»пи зн и о)п рола нИ -ол)

LYS — N = CH—СН«С.

енопат

/ ч

О"

н

LVS — N=CH—СН2 — СН=«— LYS * 1

LYS —N=CH=€H=€H2—NH—L|S ^ шиффово основание

Ш, 2e-

LYS — МН—€Н2

•СН2—NH—LYS

производное Lys-MflA-Lys

(1,3-ди(М'--лизино)пропан)

Рис.1.3 Схема взаимодействия МДА с лизииовыми остатками белковых молекул, ведущая к обращоваиию шиффовых оснований и поперечных сшивок в белковых молекулах

В результате модификации липопротеиды с дефектной конформацией апоВ-100 перестают опознаваться ЛНП-рецепторами моноцитов-макрофагов, проникающих в межэндотелиальное пространство стенки сосудов [Mackness, Durrington, 1995, Steinberg, Lewis, 1997]. Экспрессия ЛНП-рецепторов, через которые происходит поглощение нативных частиц ЛНП, регулируется по принципу отрицательной обратной связи: ХС, поступающий внутрь клетки, активирует SREBP-путь (Sterol Regulatory Element-Binding Protein), в результате чего происходит подавление транскрипции гена ЛНП-рецептора [Goldstein, Brown, 2009]. Таким образом, в норме внутриклеточная концентрация ХС поддерживается на определенном уровне, необходимом для нужд клеток. Гольдштейн и Браун первыми доказали, что при атеросклерозе

макрофаги в основном поглощают модифицированные ЛНП: ацетилирование ЛНП провоцирует быстрый захват частиц ЛНП макрофагами [Goldstein, Brown, 2009I, после чего они трансформируются в перегруженные липидными включениями «пенистые клетки» [Steinberg,1995, Turk, 2010]. Гольдштейн и Браун также обнаружили особый рецептор, ответственный за опознавание модифицированных ЛНП, названный ими «рецептором для ацетилированных ЛНП» или «скэвенджер-рецептором» [Goldstein, Brown, 2009]. В отличие от ЛНП-рецепторов, экспрессия и активность скэвенджер-рецепторов не регулируются по принципу отрицательной обратной связи, что ведёт к неконтролируемому поглощению модифицированных ЛНП и их усиленному накоплению в клетках [Goldstein, Brown, 2009]. Затем было показано, что ЛНП, модифицированные in vitro в присутствии МДА или при свободнорадикальном окислении, также опознаются «скэвенджер-рецептором» макрофагов человека [Haberland et al., 1982, Steinbrecher et al, 1989]. Было показано, что модификация под действием МДА всего лишь 2-3 лизиновых остатков апоВ-юо ведёт к уменьшению деградации частиц ЛНП через ЛНП рецепторы, а модификации 30 аминокислотных остатков под действием МДА достаточно для утилизации частиц ЛНП через скэвенджер-рецепторы [Haberland et al., 1982, Parthasarathy et al., 2008]

Позднее выяснилось, что существуют и другие рецепторы макрофагов, способные связывать окисленные ЛНП, которые не конкурируют со «скэвенджер-рецептором» и могут быть названы «рецепторами окси-ЛНП» [Stanton et al., 1992, Endeman et al., 1993, Mackness, Durrington, 1995]. На сегодняшний день известно, по меньшей мере, и различных рецепторов к модифицированным ЛНП, обозначаемых как семейство скэвенджер-рецепторов (scavenger receptor family); многие из них также способны связывать конечные продукты неферментативного гликозилирования (КПНГ) белков [Horiuchi et al, 2003].

Помимо захвата модифицированных ЛНП через скэвенджер-рецепторы существуют и другие механизмы поглощения ЛНП моноцитами-макрофагами. Модификация поверхностной структуры ЛНП может привести

к потере стабильности частицы, что, в свою очередь, отразится на взаимодействиях между частицами и может способствовать их слипанию и слиянию [Oorni et al., 2000]. Это приводит к тому, что глубокая модификация любого типа молекул поверхностного слоя ЛНП может оказаться достаточной, чтобы инициировать их агрегацию. Среди агентов, способных индуцировать агрегацию ЛНП, можно назвать протеолитические ферменты (химаза, триптаза, матричные металлопротеиназы, плазмин, калликреин, тромбин, лизосомальные протеазы), липолитические агенты (секреторные сфингомиелиназа и фосфолипаза А2, липаза эфиров холестерина и лизосомальная липаза), а также оксиданты (индуцибельная NO-синтаза, NADPH-оксидаза, липоксигеназы, миелопероксидаза и ионы металлов переменной валентности). Все вышеперечисленные агенты были обнаружены в интиме сосудов больных атеросклерозом [Oorni et al., 2000]. Судя по всему, не только модификации, вызываемые свободнорадикальным окислением, но и любые химические модификации апоВ-юо должны увеличивать их атерогенность; в частности, это справедливо для неферментативного гликозилирования ЛНП при сахарном диабете [Turk, 2010]. При этом стоит принять во внимание данные, что свободнорадикальное окисление ЛНП сопровождается процессом их агрегации [Тёртов, 2000, Steinberg et al., 1989], которая также усиливает захват частиц ЛНП макрофагами через фагоцитоз [Llorente-Cortes et al., 2000]. Показано, что агрегаты частиц ЛНП накапливаются в культуре макрофагов гораздо активнее, чем неагрегированные ЛНП, в то время как деградация апоВ-юо в агрегатах частиц идёт значительно медленнее [Hoff et al., 1993].

При усиленном поглощении окисленных ЛНП макрофаги превращаются в нагруженные липидами «пенистые клетки» и секретируют моноцитарный хемотаксический белок-i, а также факторы, стимулирующие их колониеобразование, и другие тканевые факторы, способные увеличивать экспрессию скэвенджер-рецепторов на поверхности макрофагов и других типов клеток сосудистой стенки [Hajjar, Haberland, 1997]. Это приводит к кластеризации нагруженных липидами клеток, в результате чего в стенке сосуда начинают формироваться липидные пятна [Mackness, Durrington,

19951- Кроме того, при связывании окисленных ЛНП с одним из классов скэвенджер-рецепторов макрофагов, CD36, происходит активация транскрипционного фактора NFkB, что приводит к экспрессии молекул клеточной адгезии, ингибированию обратной миграции макрофагов и их накоплению в поврежденных участках стенки сосуда [Silverstein, 2010]. Окисленные ЛНП способны активировать эндотелиальные клетки и индуцировать их переход к воспалительному фенотипу, изменяя пути передачи сигналов внутри клетки и модулируя экпрессию и синтез белков антиоксидантной 3anprrbi[Hajjar, Haberland, 1997].

В конечном счёте, пенистые клетки, перегруженные продуктами перекисного окисления липидов, погибают путём апоптоза, выделяя в окружающую среду лизофосфатидилхолин, интерлейкин-i и другие биоактивные соединения, индуцирующие хемотаксис моноцитов и усиленную пролиферацию макрофагов, а также способствующие миграции гладкомышечных клеток из интимы в медию и их пролиферации [Hajjar, Haberland, 1997]- Из изложенного выше становится понятной важная роль окисленных ЛНП в формировании предатеросклеротических липоидозных повреждений стенки сосуда.

Все основные типы клеток, присутствующие в стенке сосуда, включая эндотелиоциты, макрофаги моноцитарного происхождения и гладкомышечные клетки, способны индуцировать свободнорадикальное окисление ЛНП в субинтимальном пространстве [Steinberg et al., 1989, Yla-Herttuala, 19926, Negre-Salvayre et al., 2008] вследствие генерирования этими клетками 02", NO* и других активных форм кислорода (АФК) [Steinberg et al., 1989, Madamanchi et al., 2005, Negre-Salvayre et al., 2008]. Показано, что гладкомышечные клетки аорты кролика в культуре поглощают и утилизируют ЛНП значительно быстрее в присутствии гидропероксидов линолеата или после предварительной инкубации с липогидропероксидами [Arima et al., 1998], макрофаги также активнее поглощают ЛНП, содержащие продукты ПОЛ [Arima et al., 1998]. Атерогенная окислительная трансформация ЛНП может происходить не только в процессе их циркуляции

в кровяном русле, но и непосредственно в стенке сосуда in situ с участием прооксидантных ферментов С-15 липоксигеназы и фосфолипазы А2) миелопероксидазы и других агентов [Ôorni et al., 2000].

Продукты, накапливающиеся при свободнорадикальном окислении ЛНП, являются цитотоксичными для макрофагов, эндотелиальных и гладкомышечных клеток [Chisholm, 1991, Hardwick et al., 1996, Negre-Salvayre et al., 2008], хотя сами эти типы клеток способны индуцировать окислительные реакции в ЛНП [Marchant et al., 1996, Negre-Salvayre et al., 2008]. Культивируемые макрофаги и эндотелиоциты окисляют ЛНП со значительно большей эффективностью при ишемии и последующей реперфузии [Биленко и соавт., 2003], т.е. в условиях, близких к тем, которые могут существовать в кровотоке больных ИБС со стенокардией. За высокую токсичность окисленных ЛНП ответственны, по всей видимости, содержащиеся в них оксистерины [Freeman et al., 2005] и/или ацил-пероксиды ненасыщенных глицеридов, и, прежде всего, эфиров ХС [Hardwick et al., 1997]- Показано, что оксистерины, выделенные из атеросклеротических бляшек человека (7(3-гидропероксихолестерин, 7(3-гидрохолестерин, 7-кетохолестерин и др.), способны вызывать апоптоз в различных типах K7ieTOK[Hajjar, Haberland, 1997]. Весьма показательно, что макрофаги человека, культивируемые in vitro, не только индуцируют окисление ЛНП при совместной инкубации, но и сами гибнут при этом от спровоцированной ими токсичности окисленных ЛНП [Marchant et al., 1996]. Окси-ЛНП индуцируют гибель макрофагов путём апоптоза [Hegyi et al., 1996], при этом в результате гибели «пенистых клеток» макрофагального происхождения во внутренних слоях их скоплений образуется липидное ядро, что приводит к формированию и расширению «некротической основы» или «атеромы» развивающейся липофиброзной бляшки [Hegyi et al., 1996, Mitchinson M.J., 199В].

В атерогенезе важную роль играют ферменты, обладающие провоспалительным действием, такие как фосфолипаза А2 (ФЛА2) [Adibhatla, Hatcher, 2008], миелопероксидаза (МПО) [Parthasarathy et al., 2008 ] и др.

МПО, экспрессирующаяся в азурофильных гранулах лейкоцитов, может высвобождаться ими при воспалительных состояниях. Ферментная активность МПО приводит к образованию активных форм кислорода, азота и галогенов, которые могут не только провоцировать окислительную модификацию белковой компоненты ЛНП [ЗсЫпсШеЬп е1 а1., 2009], но и интенсифицировать процессы ПОЛ в наружном фосфолипидном слое частиц [ШсЬюИэ, Нагеп, 2004], приводя к увеличению атерогенности частиц ЛНП. Показано, что высокий уровень МПО может рассматриваться как независимый фактор риска атеросклероза, причём уровень 3-хлоротирозина в ЛНП (маркер повреждения частиц в результате ативности МПО), выделенных из интимы с атеросклеротическими поражениями, выше в 6 раз по сравнению с показателями для неповреждённой интимы сосудов и выше в 20 раз по сравнению с ЛНП, циркулирующими в кровотоке [8сЫпс111е1т е1 а1., 2009].

Клетки в атеросклеротических бляшках выделяют ряд провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-1(3, фактор некроза опухолей-а и интерферон-у, которые могут индуцировать экспрессию секреторной ФЛА2 [Б1усЬеу, Schieffer, 2008]. ФЛА2 гидролизует ацилы фосфолипидов в зп-2 положении с образованием лизофосфолипида и свободной жирной кислоты, что изменяет размер и пространственную структуру частиц ЛНП. Это усиливает афинность ЛНП к протеогликанам, приводя к удержанию модифицированных частиц в стенке сосуда, их агрегации и усиленному поглощению макрофагами [\Уоо1:оп-Кее а1., 2004]. Показано, что секреторная ФЛА2 взаимодействует с окисленными ЛНП более эффективно [Бп^сЬеу, 8сЫеГ£ег, 2008]. Уровень ФЛА2, ассоциированной с ЛНП, повышен у больных ИБС [У/оо1:оп-Кее гЛ а1., 2004] и может использоваться как прогностический фактор развития атеросклероза у здоровых людей, а также при оценке вероятности инфаркта миокарда у ишемических больных [Б1усЬеу, 8с1т^£ег, 2008]. Существует изоформа ФЛА2, ассоциированая непосредственно с липопротеидами плазмы крови - ЛП-ФЛА2. У здоровых людей большая часть фермента ассоциирована с частицами ЛНП, однако эта изоформа может связываться также с Лп(а). Показано, что Лп(а) по

сравнению с ЛНП обогащён ЛП-ФЛА2, причём активность фермента, ассоциированного с Лп(а), также повышена [Tsimikas at al., 2007]. Авторы указанной работы предполагают, что Лп(а) аккумулирует окисленные фосфолипиды - субстрат для ЛП-ФЛА2. Важно отметить, что одним из продуктов, образующихся в результате активности ФЛА2, является арахидоновая кислота - предшественник таких эйкозаноидов, как тромбоксан, простациклин и лейкотриены.

Установлено, что гидропероксиды ПНЖК являются наиболее эффективными природными ингибиторами биосинтеза естественного антитромбогенного фактора - простациклина [Ланкин и соавт., 2000, Szczeklik, Gryglewski, 1980, Moneada, 1982]. Высокое содержание липогидропероксидов в ЛНП больных атеросклерозом обуславливает их способность ингибировать биосинтез простациклина в эндотелиальных клетках аорты [Szczeklik, Gryglewski, 1980]. Интересно отметить, что тромбоксансинтаза (ферментная система синтеза тромбоксана А2 - фактора адгезии и агрегации тромбоцитов), в отличие от простациклинсинтазы, менее чувствительна к ингибирующему действию липопероксидов [Granstrom et al., 1983]- При этом показано, что глутатионпероксидаза, утилизирующая липогидропероксиды, контролирует скорость биосинтеза тромбоксана А2 в тромбоцитах [Guidi et al., 1984], причём снижение её активности в клетках при атерогенезе [Real et al., 2010] должно способствовать увеличению содержания тромбоксана А2 в крови. Таким образом, накопление липопероксидов в плазме крови больных атеросклерозом ингибирует синтез простациклина в стенке сосуда, но не нарушает, а возможно даже увеличивает, синтез тромбоксана А2 в тромбоцитах, что может приводить к увеличению тромбоксан-простациклинового соотношения в крови больных ИБС [Moneada, 1982, Lankin V., 2003].

Есть основания полагать, что многообразные атерогенные эффекты окси-ЛНП, выявленные различными исследователями in vitro, могут быть отнесены и к процессу атерогенеза in vivo [Steinberg, Lewis, 1997]. Исходя из этого, липопероксидемию (повышенный уровень липопероксидов, вернее,

окси-ЛНП в крови) вполне можно рассматривать в качестве дополнительного фактора риска атеросклероза [Steinberg, Lewis, 1997, Parthasarathy et al., 2008], и исследование связи между этим патогенным нарушением метаболизма и другими факторами риска, включая гиперхолестеринемию и сахарный диабет, представляется весьма актуальным.

Известно, что больные сахарным диабетом имеют повышенную (в 3-4 раза) склонность к развитию атеросклероза, причём заболевания сердечнососудистой системы являются основной причиной смерти пациентов с диабетом [Giugliano et al, 1996, Bucala, 1997]. Так, для больных сахарным диабетом типа 2 обнаружено четырехкратное повышение риска летальности от острой сердечно-сосудистой недостаточности (инфаркты, инсульты) по сравнению с общей популяцией. Это обусловлено ускоренным прогрессированием атеросклероза у этих больных, причём между уровнем гипергликемии и выраженностью сосудистых поражений при сахарном диабете выявлена прямая корреляция [Bucala, 1997]-

В основе такой тесной взаимосвязи между сахарным диабетом и атеросклерозом лежит многоступенчатый механизм, связанный с нарушениями метаболизма глюкозы и развитием окислительного стресса при хронической гипергликемии. Прежде всего, накопление глюкозы в крови приводит к усилению её утилизации в клетках и тканях. При этом в результате интенсификации аэробного гликолиза растёт концентрация конечного продукта гликолиза - ацетил-КоА, в результате чего возрастает скорость обменных процессов в митохондриях и увеличивается образование АФК в цикле трикарбоновых кислот, что, в конечном счёте, может способствовать развитию окислительного стресса [Nishikawa et al., 2000]. Показано, что окислительный стресс вызывает повреждения в ДНК: при сахарном диабете типа 2 отмечено увеличение уровня 8-оксигуанина, при этом длина теломеров у диабетических больных снижается на 30% по сравнению с контролем [Sampson et al., 2006]. Накопление АФК сопровождается фрагментацией ДНК под действием свободных радикалов и активацией поли-АДФ-рибозо-полимеразы (poly(ADP-ribose)polymerase-i,

PARP)[Kiss, Szabo, 2005]. ПАРП, выполняя множество функций в клетке, является одним из ключевых звеньев в развитии эндотелиальной дисфункции. ПАРП играет роль сенсора повреждений ДНК, при связывании с двух- и одноцепочечными разрывами фермент активируется, в результате чего происходит поли-АДФ-рибозилирование различных белковых субстратов (гистонов, факторов транскрипции и репликации, сигнальных молекул). В качестве субстрата ПАРП использует никотинамиддинуклеотид (NAD+), перенося отрицательно заряженный АДФ-рибозильный остаток на акцепторную молекулу. Аутополи-АДФ-рибозилирование ПАРП, приводящее к снижению ферментативной активности, является основным механизмом регуляции действия ПАРП [Kiss, Szabo, 2005]. При незначительных повреждениях ДНК активация ПАРП способствует выживанию клеток, однако при значительном количестве разрывов ДНК усиленная активация ПАРП приводит к истощению клеточных запасов NAD+ и АТФ, замедлению процессов гликолиза и митохондриального дыхания и, в конечном счёте, к некрозу. Активация ПАРП увеличивает продукцию медиаторов воспаления через активацию NFkB-зависимой транскрипции [Oliver et al, 1999].

Субстратом ПАРП является также один из ключевых ферментов гликолиза -глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД), поли-АДФ-рибозилирование ГАФД приводит к ингибированию этого фермента [Du et al, 2003, Reusch, 2003]. Таким образом, процессы гликолиза, проходящие в цитоплазме, блокируются на стадии триозофосфатов, при этом нормальная утилизация глюкозы становится невозможной, а её избыток направляется по другим метаболическим путям - полиоловому [Chung et al, 2003, Gleissner et al., 2008] и гексозаминовому [Buse, 2006].

В превращениях глюкозы по полиоловому пути участвует два фермента [Chung et al, 2003, Gleissner et al., 2008]. На первой стадии альдозоредуктаза (АР) восстанавливает глюкозу до сорбитола, используя в качестве кофактора никотинамиддинуклеотидфосфат (NADPH). Увеличение соотношения NADP+/NADPH ведет к снижению активности глютатионредуктазы и подавлению восстановления глютатиона [Lee, Chung, 1999]- На второй стадии

сорбитол окисляется до фруктозы при катализе сорбитолдегидрогеназой с восстановлением NAD+. Показано, что активация ферментов полиолового пути окисления глюкозы в условиях гипергликемии приводит к развитию окислительного стресса, что сопровождается падением уровня восстановленного глютатиона и увеличением уровня малонового диальдегида [Chung et al, 2003]. Предполагается, что по крайней мере в развитии ретинопатии важную роль играет осмотический стресс, связанный с накоплением сорбитола в сетчатке [Lee, Chung, 1999]. По всей видимости, АР играет провоспалительную роль, её активация усиливает развитие окислительного стресса при ишемии мозга у мышей, в то время как мыши с нокаутом АР демонстрируют снижение уровня окислительного стресса [Gleissner et al., 2008]. Использование ингибиторов АР позволяет предотвратить развитие диабетических осложнений у животных [Oates, Mylari, 1999]- У трансгенных мышей, в сетчатке которых экспрессируется человеческая АР, после инъекции стрептозотоцина развивается катаракта, причём степень повреждения сетчатки пропорциональна уровню экспрессии АР [Chung et al, 2003]. Показано, что захват окисленных ЛНП моноцитами-макрофагами стенки сосуда через СБзб-рецепторы сопровождается активацией АР, которая способствует развитию окислительного стресса внутри клеток [Gleissner et al., 2008].

Гексозаминовый путь утилизации глюкозы характеризуется превращением фруктозо-6-фосфата в глюкозамин-6-фосфат при участии глутамин-фруктозо-6-фосфат-амидотрансферазы, после чего происходит конверсия глюкозамин-6-фосфата в конечный продукт гексозаминового пути -уридинфосфат-И-ацетилглюкозамин [Buse, 2006]. Уридинфосфат-N-ацетилглюкозамин является субстратом О-глюкозо-М-ацетилтрансферазы и может участвовать в О-гликировании белков по остаткам серина и треонина [Buse, 2006]. Показано, что утилизация глюкозы по гексозаминовому пути коррелирует с инсулинорезистентностью, возможно, за счет О-гликирования и частичного ингибирования инсулинового рецептора или связанных с ним транскрипционных факторов [Buse, 2006].

Триозофосфаты, накапливающиеся в клетке после подавления гликолиза, в свою очередь, в результате конформационных перестроек могут превращаться в а-глицерофосфат - предшественник диацилглицерола (ДАГ) (Xia et al., 1994)- ДАГ является вторичным мессенджером и может активировать изоформы протеинкиназы С (ПКС) - фермента, запускающего различные сигнальные пути в клетке [Rask-Madsen, King, 2005]. Накопление триозофосфатов приводит к образованию карбонильных соединений -метилглиоксаля, глиоксаля и 3-дезоксиглюкозона, которые участвуют в процессе окислительной модификации белков, липидов и ДНК [Vasdev, Stuckless, 2010, Turk, 2010]. Эти высокореактивные продукты, образующиеся в результате анаэробных процессов автоокисления глюкозы, весьма токсичны для клетки и наряду с МДА вызывают повреждение тканей [Beisswenger et al.,2003, Quisser et al., 2010].

Увеличение содержания глюкозы и её производных может также приводить к усилению процессов неферментативного гликозилирования белков [Shinohara et al., 1998, Nobecourt et al., 2010], в результате чего также могут образовываться низкомолекулярные дикарбонилы [Turk, 2010]. Ациклическая форма глюкозы может обратимо взаимодействовать со свободными аминогруппами лизиновых остатков белков, приводя к образованию первичного шиффова основания, концентрация которого в состоянии равновесия составляет приблизительно 0,3% от концентрации глюкозы [Thornalley et al., 19991- Ациклическая форма первичного основания Шиффа может подвергаться перестройкам с образованием фруктозаминового производного аминокислотного остатка белка (продукта Амадори) (рис. 1.4) [Thornalley et al., 1999]. Продукты Амадори, в свою очередь, могут подвергаться дальнейшим окислительным и неокислительным превращениям с образованием низкомолекулярных дикарбонильных соединений [Zhang et al., 2009] и стабильных конечных продуктов неферментативного гликозилирования - КПНГ [Thornalley et al., 1999].

А

но

Ф а !ь_сл н 1 к н » 1 ич

О Н

V

Н— ¿—он

¿—н

1

В—С—он

Н—С— он

СНгОН глюкоза

К он

V

НО—^—н автоокисление НО-с-н

И — С. — ОН

й-

С»!-ОН

ггажольальдегид

автоокисление/ рв«роа»1«дольн»

Ч^О н

глиоксаль

-С—он

СН2ОН

1,2-ен-дяол

о. н

V

+ О; (. Н2О2)

О, и

' '¡-У рИ|К1с).'[ЬЛигЬЧ<г,Ч Г |Г>|,ДВ'<СЛ,(ИЯ

с-он «-

—он

¿- н

I

Н— С—он и—С—он

СН2ОН

2.3-емол

V

¿о

1

-9-

н-г-он

н-^-он

I

СИ, он

Оч н

V

г°

г

н—с—он

Н—С—он

!

СНгОН

3-д вюти гл кжозйи

Р-ЫН2+Глюкоза

он

шиффово основание

N11— Белок

СНзОН

перегруппировка Амадори

он

мт

фру ктозам и и

Г(-М1

"сн^ ¿«=0 НО—¿--И.

к-\н н

V

¿-он но-(!:-н

-он -он СнгОН

й-н-

-он -он аьон

о

у*о и

глиоксаль

н

1

С—о

сн5

н-н-

-он

-он

СН2ОН

¡-дезохсиглкжозон

Рис. 1.4. Схема реакций автоокисления глюкозы (А) и гликирования белковых молекул по свободным аминогруппам (Б), в результате которых может происходить образование низкомолекулярных дикарбонильных соединений (глиоксаль, метилглиоксаль, 3-дезоксиглюкозон) и образование фруктозаминовых производных белков

- -'Ж ■ СИ ■ - СО-.-.-.,.- ..-.-/. N1- ! СН ^/-Г^Н- ^ н > -^--мн СН го

|СНЫ4 . ^ (СНа) а 1СНА

NN NN 8 ОН Г; Ы >1;0Н

С Ищ СН СНЭ с»

еоон ООО н С( ЗОН

каобсксигч'е1 ишмзш гсрС | ^.иэмл! 1» 5 карбзчсим е-лплигеин ПМрраЛЙН:

.'НН си со ын с и со СН - СО

(СН2)3

ш 411 КГЦ ОН

N N N \н м он - ( 3-6

N. (СНОН)гС1 ЧгОН § V 1 Ч;

<01 'СН.м (СНак

°0 НС чн СО ЬС N4 •'"-•СО НС мн

И'ИИД^О (сНгЫ СШИ™|' э прс И "НГ'Д Г>0 -Д 'П 1И'"у1ГПЮ1' ¿ЗОЬ ш "бНГЭЗЙДЯН Гл-о-;азеиан

чН он : 0 снкои СН;-ОН ¡СНОНЬ

|Сг он С

Г' ...он NN

' N С? 1 {'Г (С V.) м N фн <сн со П N

1 ЪЧ-¡СИ..),. / ['С.! 1 . ;• ; :Г11 м

" '-"СО- но \Н :о н< -мн Си > Н'" N'1

"ОГД (л^зиюаыи д/^юр гписжсаля) лот 5речные сшивки флуо-рояинк

Рис. 1.5 Химические структуры некоторых конечных продуктов карбонильной модификации белков, образующихся при реакции аминокислотных остатков с глиоксалем, метилглиоксалем и з-дезоксиглюкозоном.

В крови больных сахарным диабетом типа 2 неферментативное гликозилирование белков плазмы крови резко возрастает [Lyons, 1993, Mohamed et al., 1999, Nobecourt et al., 2010], причём аполипопротеин В, входящий в состав циркулирующих в кровотоке ЛНП, подвергается гликированию в первую очередь [Lyons, 19931- Гликированные ЛНП, подобно окисленным ЛНП и другим типам химически модифицированных ЛНП, метаболизируются не при помощи классических ЛНП-рецепторов, а при участии скэвенджер-рецепторов макрофагов [Lyons, 1993, Horiuchi at al., 2003], стимулируя образование «пенистых клеток» и липоидозные повреждения стенки сосудов. Как было сказано выше, гликированные белки также могут быть источником низкомолекулярных дикарбонилов, причём скорость образования глиоксаля и метилклиосаля в этом случае значительно выше, чем при спонтанном окислении свободной глюкозы (в 5 и 32 раза, соответственно) [Thornalley et al., 1999] (рис.1.4). Продукты, образующиеся в ходе модификации белков и нуклеотидов метилглиоксалем и другими низкомолекулярными карбонильными соединениями, также относят к КПНГ, т.к. они образуются в ходе автоокисления глюкозы и её производных, и так же, как и гликированные ЛНП, могут связываться со скэвенджер-рецепторами [Horiuchi at al., 2003]. Важно отметить, что метилглиоксаль считается одним из наиболее реакционноспособных дикарбонильных соединений, образующихся при сахарном диабете [Tessier et al., 2003] и может приводить к образованию различных производных, в т.ч. флуорофоров, при реакции с лизиновыми и аргининовыми остатками белковых молекул (рис.1.5) [Zhang et al., 2009].

Интенсификация свободнорадикального окисления ненасыщенных ацилглицеридов ЛНП при атеросклерозе (окислительный стресс) сопровождается образованием большого количества карбонильных соединений (подобных 4-гидроксиноненалю и МДА) и модификацией структуры частиц ЛНП [Климов, Никульчева. 1999, Ланкин и соавт., 2000, Зенков и соавт., 2001, Steinberg, Lewis, 1997> Madamanchi et. al., 2005]. Другие низкомолекулярные альдегиды, прежде всего глиоксаль, метилглиоксаль и 3-дезоксиглюкозон, которые образуются при автоокислении глюкозы у больных

сахарным диабетом с гипергликемией, также способны вызывать атерогенную модификацию ЛНП [Kannel, McGee, 1979, Zhang et al., 2009] (рис.1.5.). В соответствии с вышеизложенным, можно предположить, что быстрое прогрессирование атеросклероза при наличии декомпенсированного сахарного диабета связано с накоплением соединений карбонильной природы, способных модифицировать ЛНП и приводить к их активному захвату клетками стенки сосуда, т.е. с развитием карбонильного стресса [Giugliano et al., 1995].

Известно, что присутствие глюкозы усиливает свободнорадикальное окисление ЛНП in vitro [Beaudeux et al., 1995], однако увеличение чувствительности ЛНП из плазмы крови пациентов с сахарным диабетом к свободнорадикальному окислению in vitro наблюдается не всегда [Inouye et al., 2000]. Тем не менее, результаты многочисленных клинических исследований [Nishigaki et al., 1991, Chittar et al., 1994, Jain, Palmer, 1997, Nourooz-Zadeh et al., 1997, Inouye et al., 2000] свидетельствуют об интенсификации ПОЛ при сахарном диабете: отмечено накопление МДА и других продуктов свободнорадикального окисления липидов в плазме крови больных, причём уровень липогидропероксидов наиболее сильно повышен у больных сахарным диабетом типа 2 с сосудистыми осложнениями и наличием ИБС [Maxwell et al., 1997]- Антиоксидантная активность плазмы крови, зависящая от содержания в ней а-токоферола, аскорбата и мочевой кислоты, была значительно ниже у больных сахарным диабетом типа 2 по сравнению с контрольными группами [Inouye et al., 1999]. Интенсификация свободнорадикальных процессов при сахарном диабете типа 2 подтверждается также увеличением мембранных уровней гидропероксиацилов фосфолипидов [Inouye et al., 1999] одновременно с увеличением содержания гликированного гемоглобина [Oberley, 1988]. Было показано, что у пациентов с сахарным диабетом типа 2 уровень МДА повышен также в ЛВП плазмы крови: предполагается, что продукты ПОЛ поступают в ЛВП из клеток периферических тканей, что служит косвенным

подтверждением усиленного свободнорадикального повреждения биомембран при диабете [Nourooz-Zadeh et al., 1997].

Гипергликемия в конечном итоге усиливает генерирование кислородных радикалов [Jain, Palmer, 1997, Mohamed et al., 1999], a АФК индуцируют экспрессию антиоксидантных ферментов в тканях [Lankin et al., 2006]. Исходя из этого, существование окислительного стресса в эндотелиальных клетках при сахарном диабете подтверждается результатами экспериментов, в которых высокие уровни глюкозы приводили к увеличению экспрессии mRNA Си^п-СОД, Mn-СОД, каталазы и глутатионпероксидазы в культивируемых эндотелиоцитах человека [Sechi et al., 1997]. Тем не менее, кислородные радикалы и продукты неферментативного гликозилирования белков, помимо негативной роли в развитии сахарного диабета, участвуют также в процессах адаптации миокарда к диабету, подобных механизму развития кальциевой резистентности сердца [Kar, Chakraboti, 1999]-

Таким образом, активные формы кислорода могут вызывать первичное повреждение инсулин-синтезирующей функции панкреатических ß-клеток [Jörns et al., 1999]> а возникновение гипергликемии способно индуцировать окислительный стресс, сопровождающийся падением активности защитных антиоксидантных ферментов вследствие гликирования их молекул и накопления токсичных продуктов nOJl[Niedowicz, Daleke, 2005]. Это приводит к атерогенной модификации ЛИП, дисфункции эндотелия и другим сосудистым нарушениям, способствующим прогрессированию атеросклероза у диабетиков. В то же время, экстремально высокий уровень окисленных ЛИП у больных сахарным диабетом типа 2 в стадии декомпенсации углеводного обмена существенно снижается при проведении сахароснижающей терапии даже без дотации антиоксидантов [Недосугова и соавт., 2003]. Это даёт основания полагать, что введение антиоксидантов в комплексную терапию больных сахарным диабетом типа 2 может значительно повысить эффективность стандартной сахароснижающей терапии.

Важно отметить, что химическая структура низкомолекулярных дикарбонильных соединений, образующихся при перекисном окислении липидов в процессе атерогенезе (МДА) и при диабетической гипергликемии (глиоксаля и метилглиоксаля) весьма схожа: глиоксаль и МДА являются гомологами, а метилглиоксаль и МДА - структурными изомерами. Благодаря наличию высокореакционноспособных карбонильных групп, эти соединения легко вступают в реакции с нуклеофильными группами биополимеров, приводя к модификации белков и нуклеотидов. В организме существуют механизмы защиты, позволяющие утилизировать небольшие количества низкомолекулярных дикарбонилов. Ферменты семейства альдегиддегидрогеназ (прежде всего, ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH2, ALDH3A1, ALDH3B1, ALDH8A1) окисляют низкомолекулярные альдегиды до соответствующих карбоксильных кислот с одновременным восстановлением NAD(P)+, а глиоксалазы I и II, входящие в состав глиоксалазной системы, осуществляют глутатион-зивисимое окисление глиоксаля и метилглиоксаля до гликолата и лактата, соответственно (рис.1.6) [Thornalley et al. 2008, Marchitti et al., 2008]. Развитие окислительного стресса и/или гипергликемии приводит к усиленному образованию низкомолекулярных дикарбонильных соединений, которое не может быть компенсировано защитными системами организма. Ситуация усугубляется тем, что при развитии окислительного стресса происходит истощение восстановленого глутатиона, который необходим для работы глиоксалазной системы, а при накоплении дикарбонилов в результате их взаимодействия с белками может происходить усиленное образование АФК [Thornalley et al. 2008, Turk, 2010]. При истощении механизмов защиты происходит накопление низкомолекулярных дикарбонилов, которые вызывают повреждение ДНК и инактивацию ферментов: развивается так называемый карбонильный стресс.

В настоящее время важным вопросом является разработка диагностических методов, позволяющих выявлять группы риска развития атеросклероза и сахарного диабета, а также оценивать тяжесть протекания этих заболеваний и эффективность проводимой медикаментозной терапии. Исходя из вышесказанного, становится ясно, что оценка содержания окисленных ЛНП и

ЛНП, модифицированных различными карбонильными соединениями, может быть весьма перспективным направлением в биохимической экспресс-диагностике ИБС и атеросклероза.

В современной практике для исследований процессов повреждения ЛНП при окислении, гликировании и других патологических процессах широко используются иммунологические методы. На сегодняшний день существует широкий спектр тестов, использующих моноклональные антитела к антигенам, имеющим отношение к развитию окислительного стресса при атеросклерозе. Среди них - тесты, определяющие содержание окисленных ЛНП по уровню окисленных фосфатидилхолинов [Itabe, 2003] или модифицированного апоВюо [Holvoet,i999], содержание нативного и окисленного Лп(а) [Morishita et al,2009], различных изоформ фосфолипазы А2 [Wooton-Kee et al., 2004, Divchev, Schieffer, 2008], простациклина [Kuklinska et al., 2009], 8-оксигуанина [Sampson et al., 2006] и т.д.. Моноклональные антитела, полученные к окисленным и МДА-модифицированным ЛНП, применяются не только в научных исследованиях; существуют тест-наборы, позволяющие определять содержание модифицированных ЛНП в сыворотке крови, в качестве независимого фактора риска развития и прогрессирования атеросклероза [Holvoet, 1999, Johnston et al., 2006, Gomez et al, 2009]. Показано, что уровень окисленных ЛНП существенно повышается при патологии сердечно-сосудистой системы [Holvoet, 1999, Johnston et al., 2006, Itabe, 2003, Gomez et al, 2009]. Однако в силу существенных различий в деталях процедуры измерения и антигенной специфичности используемых антител результаты различных исследований не всегда сопоставимы, более того, зачастую результаты различных исследовательских групп противоречат друг другу: в частности, это касается эффективности использования статинов для снижения уровня окисленных ЛНП [Itabe, Ueda, 2007]. Тем не менее, определение окисленных ЛНП является весьма перспективным не только для диагностики уже существующих заболеваний сердечно-сосудистой системы, но и для прогноза их прогрессирования [Itabe, Ueda, 2007]. Использование иммуноферментного анализа в диагностике атеросклероза началось сравнительно недавно, однако уже опубликованы работы, свидетельствующие

о высокой диагностической эффективности этих тестов, в частности, определения окисленного (альдегид-модифицированного) апоВюо при сердечно-сосудистых заболеваниях. Специфичность и чувствительность этого теста значительно превосходит аналогичные величины для традиционно измеряемых показателей - уровней общего ХС и ХС ЛНП, а также уровня триглицеридов [Johnston et al, 2006]. Использование антител, специфичных к различным типам модификации апоВюо ЛНП карбонильными соединениями, открывает перспективы для селективной диагностики различных состояний и осложнений, возникающих при развитии сердечнососудистых заболеваний и сахарного диабета [Holvoet, 1999].

«L:'I 1 А О О

О"-"' "-'О — - - - - о''*" "" он .. - -„ ►

МДА w Л,н <™лилп,догил V,, ,f"r/d..UHr.^l"H

.v-tUM мз.чсчоыой кии.Ю!ы д, гп-тгг;

г j

ь

* I Д| " I Is о !

iau™ *

О 11'

ацетальдегяд qq

"

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Кумскова, Елена Михайловна

Выводы

1. Установлено, что усиление захвата частиц культивируемыми моноцитами макрофагами происходит в результате накопления вторичных продуктов свободнорадикального окисления липидов (карбонил-зависимая модификация апоВ-юо ЛНП), в то время как увеличение содержания первичных продуктов свободнорадикального окисления липидов (липогидропероксидов ацилов фосфолипидов) в ходе ферментативного окисления ЛНП не влияет на увеличение атерогенности частиц.

2. При сравнительном исследовании влияния низкомолекулярных дикарбонилов на физико-химические свойства ЛНП выявлено, что модификация под действием МДА в большей степени, чем метилглиоксаль-зависимая модификация, изменяет суммарный поверхностный заряд частиц, вызывает образование внутри- и межмолекулярных сшивок и накопление флуоресцирующих шиффовых оснований, в то время как модификация под действием метилглиоксаля усиливает дальнейшую окисляемость частиц ЛНП и значительно увеличивает скорость их агрегации.

3. С использованием различных методов (спектрофотометрия, хемилюминесценция, ЭПР-спектроскопия) обнаружено неферментативное генерирование супероксидного анион-радикала и органических свободнорадикальных интермедиатов в ходе реакции Мэйларда при взаимодействии аминогруппы лизина с метилглиоксалем, но не с МДА.

4. Показано, что добавление в среду инкубации СОД, дисмутирующей супероксидный анион-радикал, значительно снижает скорость метилглиоксаль-зависимой агрегации частиц ЛНП, но не оказывает влияния на скорость агрегации ЛНП под действием МДА.

5. С помощью иммуноферментного анализа показано, что моноклональные антитела, специфичные к МДА-модифицированным ЛНП, не взаимодействуют с метилглиоксаль-модифицированными частицами, а моноклональные антитела, специфичные к метилглиоксаль-модифицированным ЛНП не взаимодействуют с частицами, модифицированными МДА что свидетельствует о различной антигенной структуре эпитопов, образующихся при реакции апоВ-юо сданными дикарбонилами.

6. Установлено, что атерогенные (обогащённые холестерином) частицы ЛНП являются одновременно и наиболее окисленными, причём отношение уровня окисленных ЛНП к содержанию ЛВП повышено в группах с высоким риском развития атеросклероза и с клиническими проявлениями ИБС.

Заключение

Атеросклероз и сахарный диабет в настоящее время занимают первое место в промышленно-развитых странах среди неинфекционных заболеваний, причём около 8о% больных сахарным диабетом погибают от сердечнососудистых осложнений. Важную роль в атерогенезе, как установлено, играет окислительный стресс и сопряжённые с ним процессы окислительной модификации ЛНП. В связи с этим, чрезвычайно важными являются исследования, направленные на понимание молекулярных механизмов первичного поражения стенки сосуда и на разработку методов ранней диагностики этих заболеваний. Исходя из этого, в настоящей работе было проведено сравнительное исследование физико-химических особенностей окислительной модификации ЛНП, что может быть важным для понимания молекулярных механизмов первичного повреждения стенки сосуда.

Нами показано, что усиленный захват ЛНП культивируемыми макрофагами человека происходит при альдегид-зависимой модификации апопротеина В-юо, но не при ферментативном окислении (накоплении ацилгидропероксидов) наружного фосфолипидного слоя частиц. Сравнительное исследование физико-химических свойств ЛНП (изменение суммарного поверхностного заряда частиц, образование внутри- и межмолекулярных сшивок, накопление флуоресцирующих шиффовых оснований, окисляемость частиц ЛНП) выявило, что МДА в большей степени влияет на изменение структуры апопротеина В-юо и поверхностного заряда частицы, тогда как модификация метилглиоксалем провоцирует интенсификацию свободнорадикального окисления липидной компоненты ЛНП. С помощью различных физико-химических методов (спектрофотометрия, хемилюминесценция, ЭПР-спектроскопия) мы впервые обнаружили возможность генерирования активных форм кислорода в ходе реакции Мэйларда (при реакциях аминогруппы апобелка с альдегидной группой). На основании качественного анализа образующихся свободнорадикальных интермедиатов нами был предложен механизм автокаталитического усиления окислительного стресса в процессе метилглиоксаль-зависимой модификации ЛНП. С использованием иммуноферментного анализа (моноклональные антитела к МДА-модифицированным и метилглиоксаль-модифицированным ЛНП) нами были выявлены принципиальные различия в антигенной структуре образующихся эпитопов в апопротеине В-юо при модификации ЛНП в присутствии МДА и метилглиоксаля.

При анализе образцов сыворотки крови, полученных при проведении эпидемиологических обследований населения г. Таллинна (Эстония) и г.Москвы (Россия) мы установили, что атерогенные (обогащённые холестерином) ЛНП являются одновременно и наиболее окисленными. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли карбонильной модификации ЛНП в атерогенезе, и позволяют рассматривать уровень карбонил-модифицированных ЛНП в качестве независимого фактора риска развития атеросклероза, вероятно, более перспективного, чем традиционно измеряемые биохимические показатели (содержание общего холестерина и холестерина ЛНП в сыворотке крови). Выявленные в работе различия в антигенной специфичности различных моноклональных антител к модифицированным ЛНП могут служить основой для разработки подходов к селективной экспресс-диагностике атеросклероза и сахарного диабета.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кумскова, Елена Михайловна, 2012 год

Список литературы

1. Берберова Н.Т. Роль неорганических ион-радикалов в органических и неорганических реакциях. Соросовский образовательный журнал, 1999, 5:48-53

2. Биленко М.В., Хильченко А.В., Коновалова Г.Г., Ланкин В.З. Влияние антиосиданта пробукола на клеточноопосредованное окисление ЛПНП in vitro и in vivo. Бюлл.экспер.биол.мед. 2003, 13ó(8):145-147

3. Бурлакова Е.Б., Крашаков С.А., Храпова Н.Г. Роль токоферолов в пероксидном окислении липидов биомембраню Биол. мембраны, 1998, 15(2): 137-167

4. Зенков Н.К. Ланкин В.З., Меныцикова Е.Б. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологические аспекты. М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001,343 с.

5. Калмыкова В. И. Содержание липидов и перекисей жирных кислот в крови интиме аорты в норме и при атеросклерозе. Тер.архив, 1970, 62(11): 43-48

6. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. С.-Петербург: «Питер», 1999, 291-360

7. Ланкин В.З., Гордеева Н.Т., Осис Ю.Г., Вихерт А.М., Шеве Т., Рапопорт С. Липоксигеназы животных: изменение активности липоксигеназы ретикулоцитов при взаимодействии с липопротеидами плазмы крови. Биохимия, 1983,48(6): 914-921

8. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Свободнорадикальные процессы при патологии сердечно-сосудистой системы. Кардиология, 2000,40(7): 48-61

д. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Капелько В.И., Шепелькова Г.С., Шумаев К.Б., Панасенко О.М., Коновалова Г.Г.,Беленков Ю.Н. Биохимия, 2007,72, 1330-1341

10. Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З., Бондарь И.А., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Патологические состояния и заболевания. Новосибирск: «АРТА», 2008, 284 с.

11. Недосугова Л.В., Ланкин В.З., Балаболкин М.И., Коновалова Г.Г.,Беленков Ю.Н., Тихазе А.К., Антонова К.В., Лисина М.О. Взаимосвязь между компенсацией углеводного обмена и выраженностью проявлений окислительного стресса при сахарном диабете II типа. Бюлл.экспер.биол.мед., 2003,136(8): 152-155

12. Нежданова И.Б. Особенности свободнорадикальных процессов при различных формах первичной гиперхолестеринемии у больных ишемической болезнью сердца: Автореф.дис.... канд.мед.наук, М., 2004

13. Тёртов В.В. Множественно-модифицированные липопротеиды низкой плотности, циркулирующие в крови человека: Дис...докт.биол.наук., М., 2000

14. Янушевская Е.В., Валентинова Н.В., Медведева Н.В., Морозкин А.Д., Власик Т.Н. Иммунохимическая гетерогенность липопротеинов низкой плотности человека. Ангиология и сосудистая хирургия, 1999,5: 241-255

15. Adibhatla R.M., Hatcher Е. J.F. Phospholipase А2, reacrive oxygen species, and lipid peroxidation in CNS pathologies. BMB reports, 2008,41(8): 560-567

16. Arai K, Iizuka S., Tada Y., Oikawa K, Taniguchi N. Icrease in the glycosylated form of erythrocyte Cu,Zn-superoxidedismutase in diabetes and close association of the nonenzymatic glycosylation with the enzyme activity. Biochim.Biophys.Acta, 1987, 924: 292-296

17. Arima N., Sasaguri Y., Yagi K. Effects of short- and long-term exposure to linoleic acid hydroperoxide on cytosolic calcium ion level of human aortic intimal smooth muscle cells in vitro. Biochem.Mol.Biol.Int., 1998,44(6): 11871192.

18. Atchley D.H., Lopes-Virella M.F., Zheng D., Virella G. Oxidized LDL-anti-oxidized LDL immune complexes and diabetic nephropathy. Diabetologia, 2002,45:1562-1571

19. Avogaro P., Bon G.B., Cazzolato G. Presence of a modified low density lipoprotein in humans. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol., 1988, 8: 79-87

20. Beaudeux J.L., Guillausseau P.J., Peynet J., Flourie F., Assayag M., Tielmans D., Warnet A., Rousselet F. Enhanced susceptibility of low-density lipoprotein to in vitro oxidation in type I and type II diabetic patients. Clin.Chim.Acta, 1995, 239:131-141

21. Belkner J., Wiesner R., Kuhn H., Lankin V.Z. The oxygenation of cholesterol esters by the reticulocyte lipoxygenase. FEBS Lett., 1991, 279,110-114

22. Beisswenger PJ, Howell SK, Nelson RG, Mauer M, Szwergold BS. Alpha-oxoaldehyde metabolism and diabetic complications. Biochem Soc Trans. 2003, 6:1358-1363

23. Binder C.J. Natural IgM antibodies against oxidation-specific epitopes. J.Clin.Immunol., 2010, 30 (suppl.i): S56-S60

24. Bucala R. Lipid and lipoprotein modification by advanced glycosylation end-products: role in atherosclerosis. Exp. Physiol., 1997,82: 327-337

25. Bucala R., Makita Z., Koschinsky T., Cerami A., Vlassara H. Lipid advanced glycosilation: pathway for lipid oxidation in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1993,90: 9441-9445

26. Buse MG. Hexosamines, insulin resistance, and the complications of diabetes: current status. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2006, 290(1):Ei-E8

27. Chisholm G.M. Cytotoxity of oxidized lipoproteins. Curr.Opin.Lipidology, 1991,2:311-316

28. Chittar H.S., Nihalani K.D., Varthakavi P.K., Udipi S.A. Lipid peroxide levels in diabetics with micro- and macro-angiopathies. J.Nutr.Biochem., 1994,5: 442445

29. Chung S., Ho E., Lam K,Chung S. Contribution of Polyol Pathway to Diabetes-Induced Oxidative Stress J Am Soc Nephrol 2003,14: 233-236

30. D'Alessandro N., Bianchi G., Fang X.J.F., Schuchmann H.-P., Von Sontag C. J. Chem. Perkin Trans., 2000,2:1862-1867

31. Divchev D., Schieffer B. The secretoryvphospholipase A2 group IIA: a missing link between inflammation, activated renin-angiotensin system, and atherogenesis? Vascular Health and Risk Management, 2008,4(3): 597-604

32. Du X., Matsumura T., Edelstein D., Rossetti L., Zsengeller Z., Szabo C., Brownlee M. Inhibition of GAPDH activity by poly(ADP-ribose) polymerase activates three major pathways of hyperglycemic damage in endothelial cells. J Clin Invest 2003,112:1049-1057

33. Endemann G., Stanton L.W., Madden K.S., Bryant C.M.,White R.T., Protter A.A. CD36 is a receptor for oxidized low density lipoprotein. J.Biol. Chem., 1993, 268:11811-11816

34. Esterbauer H., Gebicki J., Puhl H., Jürgens G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radic. Biol.Med., 1992,13: 341-390

35. Festa A., Kopp H.P., Schernthaner G., Menzel E.J. Autoantibodies to oxidized low density lipoproteins in IDDM are inversely related to metabolic control and microvascular complications. Diabetologia, 1998,41: 350-356

36. Fredrikson G.N., Hedblad B., Berglund G., Alm R., Ares M., Cercek B., Chyu K.Y., Shah P.K., Nilsson J. Identification of immune responses against aldehyde-modified peptide sequences in apoB associated with cardiovascular disease. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol., 2003, 23: 872-878

37. Freeman NE, Rusinol AE, Linton M, Hachey DL, Fazio S, Sinensky MS, Thewke D. Acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase promotes oxidized LDL/oxysterol-induced apoptosis in macrophages. J Lipid Res. 2005,46(9): 1933-1943

38. Gallagher E.J., LeRoith D. Diabetes, cancer and metformin: connections of metabolism and cell proliferation. Ann.N.Y.Acad.Sci., 2011,1243: 54-68

39. Giugliano D., Ceriello a., Paolisso G. Diabetes mellitus, hypertension, and cardiovascular disease: which role for oxidative stress? Metabolism, 1995, 44: 363-368

40. Giugliano D., Ceriello a., Paolisso G. Oxidative stress and diabetic vascular complications. Diabetes Care, 1996,19: 257-267

41. Gleissner C.A., Sanders J.M., Nadler J., Ley K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol., 2008, 28:1137-1143

42. Goldstein J.L., Brown M.S. History of discovery: the LDL receptor. Aiterioscler.Thromb.Vasc.Biol., 2009, 29(4): 431-438.

43. Granstrom E., Diczfalusy U., Hamberg M. The thromboxanes. In: Prostaglandines and related substances, Amsterdam-N.Y.-Oxford: Elsevier, 1983: 45-94

44. Griffith R.L., Virella G.T., Lopes-Virella M.F. Low density lipoprotein metabolism by human macrophages activated with low density lipoprotein immune complexes. A possible mechanism of foam cell formation. J.Exp.Med, 1988,168:1041-1059

45. Guidi G., Schiavon R., Biasloli A., Perona G. The enzyme glutathione peroxidase in arachidonic metabolism of human plateltets. J.Lab.Clin.Med., 1984,104:574-582

46. Haberland M.E., Fogelman A.M., Edwards P.A. Specificity of receptor-mediated recognition of malondialdehyde-modified low density lipoproteins. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1982, 79:1712-1716

47. Hajjar D.P., Haberland M.E. Lipoprotein trafficking in Vascular cells. Molecular Trojan horses and cellular saboteurs. J.Biol.Chem., 1997, 272 (37): 22975-22978

48. Hara A., Radin N.S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Anal.Biochem., 1978, 90: 420-426

49. Hardwick S.J.., Carpenter K.L., Law N.S., Van Der Veen C., Marchant C.E., Hird R., Mitchinson M.J. Toxicity of polyunsaturated fatty acids esters: the anomalous behaviour of cholesteryl linolenate. Free Radic.Res., 1997, 26: 351362

50. Hardwick S.J., Hegyi L., Clare K, Law N.S., Carpenter K.L., Mitchinson M.J., Skepper J.N. Apoptosis in human monocyte-macrophages exposed to oxidized low-density lipoprotein. J.Pathol., 1996,179: 294-302

51. Hegyi L., Skepper J.N., Cary N.R.B., Mitchinson M.J. Foam cell apoptosis and the development of the lipid core of human atherosclerosis. J.Pathol., 1996, 180: 423-429

52. Hoff HF, Whitaker TE, O'Neil J. Oxidation of low density lipoprotein leads to particle aggregation and altered macrophage recognition. J.Biol.Chem. 1992; 267: 602-609.

53. Hoff HF, Zyromsky N., Armstrong D, O'Neil J. Aggregation as well as chemical modification of LDL during oxidation is responsible for poor precessing in macrophages. J.Lipid Res. 1993; 34:1919-1929.

54. Holvoet P. Endothelial dysfunction, oxidation of low-density lipoprotein, and cardiovascular disease. Ther.Apher., 1999,3(4), 287-293

55. Horiuchi S., Sakamoto Y., Sakai M. Scavenger receptors for oxidized and glycated proteins. Amino Acids, 2003, 25: 283-292

56. Hunt J.V., Bottoms M.A., Clare K., Skamarausras J.T., Mitchinson M.J., Glucose oxidation and low-density lipoprotein-induced macrophage ceroid accumulation: possible applications for diabetic atherosclerosis. Biochem. J., 1994,300: 243-249

57. Illingworth D.R., Durrington P.N., Dyslipidemia and atherosclerosis: how much more evidence do we need? Curr.Opin.Lipidology, 1999,10:383-386

58. Inouye M., Mio T., Sumino K. Link between glycation and lipoperoxidation in red blood cells in diabetes. Clin.Chim.Acta, 1999, 285: 35-44

59. Inouye M., Mio T., Sumino K. Dicarboxilic acids as markers of fatty acid peroxidation in diabetes. Atherosclerosis, 2000,148:197-202

60. Itabe H., Ueda M. Measurement of plasma oxidized low-density lipoprotein and its clinical implications. J.Atheroscler.Thromb., 2007,14:1-11

61. Jain S.K, Palmer M. The effect of oxygen radicals metabolites and vitamin E on glycosylation of proteins. Free Radic.Biol.Med., 1997,22:593-596

62. Jayaraman S., Gantz D.L., Gursky 0. Effects of oxidation on the structure and stability of human low-density lipoprotein. Biochemistry, 2007,46(19): 57905797

63. Johnston N., Jerngberg T., Lagerqvist B., Siegbahn A., Wallentin L. Improved identification of patients with coronary artery disease by the use of new lipid and lipoprotein biomarkers. Am.J.Cardiol., 2006, 97(5): 640-645

64. Jomova K., Valko M. Advances in metal-induced oxidative stress and human disease. Toxicology, 2011, 283(2-3):6s-87

65. Jörns A., Tiedge M., Lenzen S., Munday R. Effect of superoxide dismutase, catalase, chelating agents, and free radical scavengers on the toxicity of alloxan to isolated pancreatic islets in vitro. Free.Radic.Biol.Med., 1999, 26:1300-1304

66. Kannel W.B., McGee D.L. Diabetes and cardiovascular disease. The Framingham study. JAMA, 1979, 241:2035-2038

67. Kar M., Chakraborti A.S. Release of iron from haemoglobin - a possible sourse of free radicals in diabetes mellitus. Indian J.Exp.Biol., 1999,37:190-192

68. Kiss L., Szabo C. The pathogenesis of diabetic complications: the role of DNA injury and poly(ADP-ribose) polymerase activation in peroxynitrite-mediated cytotoxicity Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2005,100, suppl.i

69. Krisko A., Stjepanovic G., Pifat G., Ruysschaert J.M., Goormaghtigh E. Detection of apolipoprotein B100 early conformational changes during oxidation. Biochim.Biophys.Acta, 2007,1768(11): 2923-2930

70. Kroh L.W., Fiedler T., Wagner J. Alpha-dicarbonyl compounds - key intermediates for the formation of carbohydrate-based melanoidins. Ann.N.Y.Acad.Sci., 2008,1126: 210-215

71. Kuhn H., Wiesner R., Stender H., Schewe T., Lankin V.Z., Nekrasov A.S., Rapoport S.M. Requirement of monohydroperoxy fatty acids for the oxygenation of 15LS-HETE by reticulocyte lipoxygenase. FEBS Lett., 1986, 203: 247-252

72. Lankin V. The enzymatic systems in the regulation of free radical lipid peroxidation. In: Free Radical, Nitric Oxide and Inflammation: Molecular, Biochemical, and Clinical Aspects. NATO Science Series, Amsterdam etc.: IOS Press, 2003,344: 8-23

73. Lankin V., Arzamastseva N., Tikhaze A. LDL modification during atherosclerosis and diabetes. Atherosclerosis, 2006, 6 (suppl.i): 69-70

74. Lankin V., Tikhaze A. Free radical lipoperoxidation during atherosclerosis and antioxidative therapy of this disease. In: Tomasi A, Ozben T, Skulachev V (eds) Free Radicals, Nitric Oxide, and Inflammation: Molecular, Biochemical, and

Clinical Aspects, IOS Press, Amsterdam etc., NATO Science Series, 2003, vol.344, pp.218-231

75. Lee A., Chung S. Contributions of polyol pathway to oxidative stress in diabetic cataract. The FASEB Journal, 1999,13: 23-30

76. Lo T.W., Westwood M.E., McLellan A.C., Selwood T., Thornalley P.J. Binding and modification of proteins by methylglyoxal under physiological conditions. Akinetic and mechanistic study with N alpha-acetylarginine, N alpha-acetylcysteine, and N alpha-acetyllysine, and bovine serum albumin. J.Biol.Chem., 1994,269 (51): 32299-32305

77. Lopes-Virella M.F., Virella G., Orchard T.J., Koskinen S., Evans R.W., Becker D. J., Forrest K.Y. Antibodies to oxidized LDL and LDL-containing immune complexes as risk factors for coronary artery disease in diabetes mellitus. Clin. Immunol., 1999,90:165-172

78. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J.Biol.Chem., 1951,193: 265-275

79. Lyons T.J. Glycation and oxidation: a role in pathogenesis of atherosclerosis. Am.J.Cardiol., 1993,71: 26B-31B

80. Mackness M.I., Durrington P.N. HDL, its enzymes and its potential to influence lipid peroxidation. Atherosclerosis, 1995,115: 243-253

81. Madamanchi N.R., Vendrov A., Runge M.S. Oxidative stress and vascular disease. Arterioscler.Thromb,Vase,Biol., 2005, 25:29-38

82. Marchant C.E., van der Veen C., Law N.S., Hardwick S.J., Carpenter K.L.H., Mitchinson M.J. Oxidation of low-density lipoprotein by human monocyte-macrophages results in toxicity to the oxidizing culture. Free Radic.Res., 1996, 24: 333-342

83. Marchitti S.A., Brocker C., Stagos D., Vasiliou V. Non-P450 aldehyde oxidizing enzymes: the aldehydedehydrogenase superfamily.

Expert.Opin.Drug.Metabol.Toxicol., 2008,4(6): 697-720

84. Matkovics B., Varga S.I., Szabo L., Witas H. The effect of diabetes on the activities of the peroxide metabolizing enzymes. Horm.Met.Res., 1982,14: 7779

85. Maxwell S.R.J., Thomason H., Sandler D., Leguen C., Baxter M.A., Thorpe G.H.G., Jones A.F., Barnett A.H. Antioxidant status in patients with uncomplicated insulin-dependent and non-insulin-dependent diabetes mellitus. Eur.J.Clin.Invest., 1997, 27: 484-490

86. Mertens A., Holvoet P. Oxidized LDL and HDL: antagonists in atherothrombosis. FASEB J., 2001,15: 2073-2084

87. Mitchinson M.J. Are free radicals a major factor in atheroma? Dialogues in Cardiovasc.Med., 1998,3: 32-37

88. Mohamed A.K., Bierhaus A., Schiekofer S., Tritschler H., Ziegler R.,Nawroth P.P. The role of oxidative stress and NF-kappaB activation in late diabetic complications. Biofactors, 1999,10:157-167

89. Moncada S. Prostacyclin and arterial wall biology. Arteriosclerosis, 1982, 2:

193-207

90. Morishita R., Ishii J., Kusumi Y., Yamado Sh., Komai N., Ohishi M., Nomura M., Hishida H., Niihashi M., Mitsumata M. Association of serum oxidized lipoprotein (a) concentration with coronary artery disease: potential role of oxidized lioprotein(a) in the vascular wall. J.Atheroscler.Thromb., 2009,16: 410-418

91. Murata-Kamiya N., Kamiya H. Methylglyoxal, an endogenous aldehyde, crosslinks DNA polymerase and the substrate DNA Nucleic Acids Res., 2001, 29(16): 3433-3438

92. Negre-Salvayre A., Coatrieux C., Ingueneau C., Salvayre R. Advanced lipid peroxidation end products in oxidative damage to proteins. Potential role in diseases and therapeutic prospects for inhibitors. British Journal of Pharmacology, 2008,153: 6-20

93. Nicholls S.J., Hazen S.L. The role of myeloperoxidase in the pathogenesis of coronary artery disease. Jpn. J.Infect.Dis., 2004, 57: S21-S22

94. Niedowicz D.M., Daleke D.L. The role of oxidative stress in diabetic complications. Cell Biochemistry and Biophysics, 2005,43: 289-330.

95- Nishigaki I., Hagihara M., Tsunekawa H., Maseki M., Yagi K. Lipid peroxide levels of serum lipoprotein fractions of diabetic patients. Biochem.Med., 1991, 25: 373-378

96. Nishikawa et al. Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage. Nature, 2000,404: 787-790

97. Nobecourt E., Tabet F., Lambert G., Puranik R., Bao S., Yan L., Davies M.J., Brown B.E., Jenkins A. J., Dusting G.J., Bonnet D.J., Curtiss L.K., Barter P. J., Rye K.-A. Nonenzymatic glycation impairs the antiinflammatory properties of apolipoprotein A-I. Arterioscler.Thromb. Vasc.Biol., 2010,30: 766-772

98. Nourooz-Zadeh J., Rahimi A., Tajaddini-Sarmadi J., Tritschler H., Rosen P., Halliwell B., Betteridge D.J. Relationships between plasma measures of oxidative stress and metabolic control in NIDDM. Diabetologia, 1997,40: 647653

99. Oates P. J., Mylari B.L. Aldose reductase inhibitors: Therapeutic implications for diabetic complications. Expert Opin Investig Drugs 1999, 8: 2095-2119

100. Oberley L.W. Free radicals and diabetes. Free Radic.Biol.Med., 1988,5:113124

101. Oliver FJ, Menissier-de Murcia J, Nacci C, Decker P, Andriantsitohaina R, Muller S et al. Resistance to endotoxic shock as a consequence of defective NF-kappaB activation in poly (ADP-ribose) polymerase-i deficient mice. EMBO J

1999,18: 4446-4454

102. Oorni K, Pentikainen MO, Ala-Korpela M, Kovanen PT. Aggregation, fusion and vesicle formation of modified low density lipoprotein particles: molecular mechanisms and effects on matrix interactions. J.Lipid Res., 2000,41:17031714

103. Orchard T.J., Virella G., Forrest K.Y., Evans R.W., Becker D.J., Lopes-Virella M.F. Antibodies to oxidized LDL predict coronary artery disease in type 1 diabetes: a nested case-control study from the Pittsburgh Epidemiology of Diabetes Complications Study. Diabetes, 1999,48:1454-1458

104. Orekhov A.N., Tertov V.V., Mukhin D.N., Koteliansky V.E., Glukhova M.A., Frid M.G., Sukhova G.K., Khashimov K.A., Smirnov V.N. Insolubilization of

low density lipoprotein induces cholesterol accumulatopn in cultured subendothelial cells of human aorta. Atherosclerosis, 1989,79(1): 59-70

105. Parthasarathy S., litvinov D., Selvarajan K., Garelnabi M. Lipid peroxidation and decomposition: conflictiong roles in plaque vulnerability and stability. Biochim.Biophys.Acta, 2008,1781(5): 221-231

106. Podrez E. A. Antioxidant properties of high-density lipoprotein and atherosclerosis. Clin.Exp.Pharmacol.Physiol., 2010,37(7): 719-725

107. Quisser M.A., Yao D. Geisler S., Hammes H.-P., Lochnit G., Schleicher E.D., Brownlee M., Preissner K.T. Hyperglycemia impairs proteasome function by methylglyoxal. Diabetes, 2010,59: 670-678.

108. Rabinovitch A., Suarez-Pinzon W.L., Strynadka K., Lakey J.R., Rajotte R.V. Human pancreatic islet beta-cell destruction by cytokines involves oxygen free radicals and aldehyde production. J.Clin.Endocrinol.Metab., 1996, 81: 31973202

109. Rask-Madsen C, King GL. Proatherosclerotic mechanisms involving protein kinase C in diabetes and insulin resistance. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2005, 25(3): 487-496

110. Real J.T., Martinez-Hervas S., Tormos M.C., Domenech E., Pallardo F.V., Saez-Tormo G., Redon J., Carmena R., Chaves F.J., Ascaso J.F., Garcia-Garcia A.B. Increased oxidative stress levels and normal antioxidant enzyme activity in circulating mononuclear cells from patients of familial hypercholesterolemia. Metabolism. 2010,59(2):293-298.

111. Requena J.R., Fu M.X., Ahmed M.U., Jenkins A. J., Lyons T.J., Baynes J.W., Thorpe S.R. Quantification of malondialdehyde and 4-hydroxynonenal adducts to lysine residues in native and oxidized human low-density lipoprotein. Biochem. J., 1997,322: 317-325.

112. Reusch J.E. Diabetes, microvascular complications, and cardiovascular complications: what is it about glucose? J Clin Invest 2003,112: 986-988

113. Ross R. Atherosclerosis - an inflammatory disease. N.Engl.J.Med., 1999,340: 115-126

114- Salonen J.T., Yla-Hertualla S., Yamamoto R., Butler S., Korpela M., Salonen R. et al. Autoantibody against oxidized LDL and progression of carotid atherosclerosis. Lancet, 1992,339: 883-888

115. Sampson M.J., Dozio N., Winterbone M.S., Hughes D.A., Hughes J.C. Monocyte telomere shortening and oxidative DNA damage in type 2 diabetes. Diabetes Care, 2006, 29(2): 283-289

116. Saxena A.K., Saxena P., Wu X., Obrenovich M., Weiss M.F., Monnier V.M. Protein aging by carboxymethylation of lysines generates sites for divalent metal and redox active copper binding: relevance to diseases of glycoxidative stress. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1999, 260: 332-338

117. Scanu A.M., Edelstein C. Learning about the structure and biology of human lipoprotein [a] through dissection by enzymes of the elastase family: facts and speculations. J.Lipid Res., 1997,38: 2193-2206

118. Schaefler E.J. Lipoproteins, nutrition, and heart disease. Am.J.Clin.Nutr., 2002,75:191-212

119. Schalkwijk C.G., Vermeer M.A., Stehouwer C.D., te Koppele J., Princen H.M., van Hinsbergh V.W. Effect of methylglyoxal on the physico-chemical and biological properties of low-density lipoprotein. Biochim.Biophys.Acta, 1998, 1394:187-198

120. Schindhelm R.K., van der Zwan L.P., Teerlink T., Scheffer P.G. Myeloperoxidase: a useful biomarker for cardiovascular disease risk stratification? Clinical Chemistry, 2009,55(8): 1462-1470

121. Sechi L.A., Ceriello A., Griffin C.A., Catena C., Amstad P., Schambelan M., Bartoli E. Renal antioxidant enzyme mRNA levels are increased in rats with experimental diabetes mellitus. Diabetologia. 1997,4o(i):23-29.

122. Segrest J.P., Jones M.K., De Loof H., Dashti N. Structure of apolipoprotein B-100 in low density lipoproteins. J.Lipid Res. 2001,42:1346-1367

123. Sentman M.L., Jonsson L.M., Marklund S.L. Enhanced alloxan-induced beta-cell damage and delayed recovery from hyperglycemia in mice lacking extracellular superoxide dismutase. Free Radic.Biol.&Med., 1999, 27: 790-796

124. Shinohara M., Thornalley P.J., Giardino I., Beisswenger P., Thorpe S.R., Onorato J., Brownlee M. Overexpression of glyoxalase-I in bovine endothelial cells inhibits intracellular advanced glycation endproduct formation and prevents hyperglycemia-induced increases in macromolecular endocytosis. J Clin Invest. 1998,101(5): 1142-1147

125. Silverstein R.L., Li W., Park Y.N., Rahaman S.O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans.Am.Clin.Clim.Association, 2010,121: 206-220

126. Slatter D.A., Avery N.C., Bailey A. J., Identification of a new cross-link and unique histidine adduct from bovine serum albumin incubated with malondialdehyde. J.Biol.Chem., 2004, 279 (1): 61-69

127. Stanton L.W., White R.T., Bryant C.M., Protter A.A., Endemann G. The macrophage Fc receptor for IgG is also a receptor for oxidized low density lipoprotein. J.Biol.Chem., 1992, 267: 22446-22451

128. Steinberg D. Role of oxidized LDL and antioxidants in atherosclerosis. In: Nutrition and Biotechnologu in Heart Disease and Cancer, N.Y.: Plenum Press, 1995,39-48

129. Steinberg D., Lewis A. Oxidative modification of LDL and atherogenesis. Circulation, 1997, 95:1062-1071

130. Steinbrecher U.P., Lougheed M., Kwan W.C., Dirks M. Recognition of oxidized low density Apoprotein by the scavenger receptor of macrophages results from derivatization of apoprotein B by products of fatty acids peroxidation. J.Biol.Chem., 1989, 264:15216-15223

131. Stocker R., Keaney J.F. Role of Oxidative Modification in Atherosclerosis. Phisiol.Rev, 2004, 84:1381-1478

132. Suji G., Sivakami S. DNA damage during glycation of lysine by methylglyoxal: assessment of vitamins in preventing damage. Amino Acids, 2007,33 (4): 615621

133. Szczeklik A., Gryglewski R. J. Low density lipoproteins are carriers for lipid peroxides and inhibit prostacyclin biosynthesis in arteries. Artery, 1980,7: 488-495

134- Tarpey M.M., Wink D.A., Grisham M.B. Methods for detection of reactive metabolites of oxygen and nitrogen: in vitro and in vivo considerations. Am.J.Physiol. Regul.Integr.Comp.Physiol., 2004, 286: R431-R444

135. Tertov V.V., Sobenin I.A., Gabbazov Z.A., Popov E.G., Jakkola 0., Solakivi T., Nikkari T., Smirnov V.N., OrekhovA.N. Multiple-modified desialyted low-density lipoproteins thet cause intracellular lipid accumulation. Isolation, fractionation and characterization. Laboratory Investigations, 1992, 67: 665675

136. Tessier F.J., Monnier V.M., Sayre L.M., Kornfield J.A. Triosidines: movel Maillard reaction products and cross-links from the reaction of triose sugars with lysine and arginine residues. Biochem.J., 2003,369: 705-719

137. Thornalley P.J. Monosaccharide autoxidation in health and disease. Environmental health perspectives, 1985, 64: 297-307

138. Thornalley P.J. Protein and nucleotide damage by glyoxal and methylglyoxal in physiological systems - role in ageing and disease. Drug metabol.Drug.Interact, 2008, 23(1-2): 125-150

139. Thornalley P. J., Langborg A., Minhas H.S. Formation of glyoxal., methylglypxal and 3-deoxyglucosone in the glycation of proteins by glucose. Biochem.J., 1999,344:109-116

140. Thorpe S.R., Baynes J.W. Maillard reaction products in tissue proteins: new products and new perspectives. Amino Acids, 2003, 25: 275-281

141. Trepels T, Zeiher AM, Fichtlscherer S. The endothelium and inflammation. Endothelium. 2006, i3(6):423-9.

142. Tsimikas S., Tsironis L.D., Tselepis A.D. New insights into the role of lipoprotein (a)-associated lipoprotein associated phospholipase A2 in atherosclerosis and cardiovascular disease. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 2007, 27: 2094-2099

143. Tsuchihashi H., Kigoshi M., Iwatsuki M., Niki E. Action of (3-carotene as an antioxidant against lipid peroxidation. Arch.Biochem.Biophys., 1995,323:137147

144- Turk Z. Glycotoxines, carbonyl stress and relevance to diabetes and its complications. Physiol.Res., 2010, 59:147-156

145. Uusitupe M.I.J., Niskanen L., Luoma J., Vilja P., Rauramaa R., Ylä-Herttula S. Autoantibodies against oxidized LDL do not predict atherosclerosis vascular disease in non-insulin-dependent diabetes mellitus. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol., 1996,16:1236-1242

146. Vasdev S., Stuckless J. Role of methylglyoxal in essential hypertension. Int.JAngiol., 2010,19(2): e58-e65.

147. Virella G.S., Koskinen S., Krings G., Onorato J.M., Thorpe S.R., Lopes-Virella M. Immunochemical characterization of purified human oxidized low-density lipoprotein antibodies. Clin.Immunol., 2000,95:135-144

148. Virella G., Lopes-Virella M.F. Lipoprotein autoantibodies: measurement and significance. Clin.Diagn.Lab.Immunol., 2003,10(4): 499-505

149. Virella G., Thorpe S.R., Alderson N.L., Stephan E.M., Atchley D.H., Wagner F., Lopes-Virella M.F. Autoimmune response to advanced glycosilation end products of human low density lipoprotein. J.Lipid Res., 2003,44: 487-493

150. Williams K.J., Tabas I. Lipoprotein retention - and clues for atheroma regression. Arterioscl.Thromb.Vasc.Biol., 2005, 25:1536-1540

151. Witz G. Biological interactions of a,ß-unsaturated aldehydes. Free Rad.Biol.Med., 1989,7: 333-349

152. Witztum J.L. The oxidation hypothesis of atherosclerosis. Lancet, 1994,344: 793-795

153. Xia P, Inoguchi T, Kern TS, Engerman RL, Oates PJ, King GL. Characterization of the mechanism for the chronic activation of diacylglycerol-protein kinase C pathway in diabetes and hypergalactosemia. Diabetes. 1994, 43(9): 1122-1129

154. Yagi K. Assay for blood plasma or serum. Methods Enzymol., 1984,105: 328333

155. Yim H.-S., Kang S.-O., Hah Y.-Ch., Chock P.B., Yim M.B. Free radicals generated during the glycation reaction of amino acids by methylglyoxal. A

model study of protein-cross-linked free radicals. J.Biol.Chem., 1995, 270: 28228-28233

156. Yla-Herttuala S. Gene expression in atherosclerotic lesion. Herz, 1992,17: 270276

157. Zhang Q., Ames J.M., Smith R.D., Baynes J.W., Metz T.O. A perspective on the Maillard reaction and the analysis of protein glycation by mass spectrometry: probing the pathogenesis of chronic disease. J.Proteome Res., 2009, 8(2): 754-769

158. Ziegelhoffer A., Styk J., Ravigerova T., Sebokova J., Volkovovova K, Wasculikova I., Carsky J., Dzurba A., Docolomansky P. Prevention of processes coupled with free adical formation prevents also the development of calcium-resistance in the diabetic heart. Life Sci., 1999, 65:1999-2001