Математическое моделирование процессов дерегуляции Ca2+-гомеостаза в нейронах головного мозга крысы при гиперстимуляции глутаматных рецепторов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Бородин, Александр Владимирович

• Бородин, Александр Владимирович
• кандидат физико-математических наук
• 0

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Бородин, Александр Владимирович

4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Роль глутамата в инициации процессов, приводящих к гибели клеток

Глу-иидуцироваиные изменения Са2+ гомеостаза нейрона

Изменения входящего потока Са2+ во время действия Глу и в поспилутаматный период

Изменения выходящего потока Са2+ во время действия Глу и в постглутоматный период

Роль внутриклеточных органелл в процессах нарушения [Ca2+li гомеостаза

Математическое моделирование Са2+ гомеостаза в нейронах

Модел ь Friel 'a- Tsien 'а

Модель David'а

Модель Colegrove'a - Friel'a

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Модель нормально функционирующего нейрона 40 Моделирование потоков Са2+ через плазматическую мембрану

Моделирование митохондриального транспорта Са2+

Митохондриальный буфер

Система уравнений 46 Чувствительность модели к параметрам

Са2+-транспортных систем 48 Применение модели для анализа особенностей динамики fCa2+Ji в различных нейронах 51 Применение модели нормально функционирующего нейрона для исследования роли МД в процессах [Ca2+]i гомеостаза

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Математическое моделирование процессов дерегуляции Ca2+-гомеостаза в нейронах головного мозга крысы при гиперстимуляции глутаматных рецепторов»

Актуальность проблемы. Мозговая гипоксия/ишемия лежит в основе многих острых и хронических заболеваний центральной нервной системы, причем инсульт занимает одно из первых мест среди причин смерти людей в развитых странах. В течение последнего десятилетия достигнут значительный прогресс в изучении механизмов повреждения клеток мозга, вызванных ишемией/гипоксией. Установлено, что причина исключительно высокой (по сравнению с другими тканями) чувствительности клеток мозга к недостатку кислорода обусловлена нейротоксическим действием эндогенного возбуждающего нейромедиатора глутамата (Глу), высвобождающегося и накапливающегося в синаптических щелях при гипоксии.

Исследования, основанные на экзогенном воздействии Глу на культивируемые нейроны, позволили более детально изучать процессы, происходящие в нервных клетках при гиперстимуляции их высокими концентрациями Глу во время ишемии/гипоксии (Lipton, Р., 1999; Nicholls, D & Budd, S., 2000 ). Механизмы, посредством которых воздействие Глу может вызывать повреждение нейронов, пока до конца не ясны, однако установлено, что основным определяющим фактором является стойкое повышение

2 о. 2— цитозольной концентрации Са ([Са '],), сохраняющиеся даже после устранения токсического воздействия Глу на нейрон. В настоящее время считается доказанным (Khodorov, В., et al., 1996 a, b; Khodorov, В., et al., 1999; Vergun, О., 1999; Ходоров, Б., и др. 2001 а, б), что такое нарушение нейронального Са2+ гомеостаза обусловлено, главным образом, нарушением функционирования Са2+-выводящих систем плазматической мембраны нервных клеток. Однако механизмы этого нарушения в настоящее время до конца не изучены.

Современный прогресс в изучении механизмов дерегуляции [Са2 ]i гомеостаза в большой мере связан с открытием роли митохондриальной дисфункции в этом процессе

Nicholls, D & Budd, S. 2000). В частности, была выявлена высокая степень корреляции между Глу-индуцированным коллапсом потенциала на внутренней мембране митохондрий (А^м) и потерей клетками способности восстанавливать базальный уровень [Ca2"]i после Глу-воздействия (Khodorov, В., et al., 1996 a; Vergun, О., et al., 1999).

Настоящая работа посвящена изучению природы корреляции между митохондриальной деполяризацией (МД) и нарушением способности нейронов восстанавливать Са2^-гомеостаз после гиперстимуляции глутаматных рецепторов. С этой целью создана математическая модель, способная симулировать экспериментально 2 наблюдаемую динамику [Са ']; при воздействии на нейрон различных агентов. Модель оказала большую помощь в разработке экспериментальных подходов и интерпретации данных, полученных при изучении роли дисфункции митохондрий в механизмах нарушения [Са ], гомеостаза нейрона при токсическом воздействии Глу.

Цель работы. Целью данной работы было создание математической модели, позволяющей симулировать и проводить количественный анализ экспериментально наблюдаемых нарушений регуляции [Са2 ]i гомеостаза и ДЧ^ при гиперстимуляции Глу рецепторов нейронов головного мозга.

Основные задачи исследования. 1) На основе ранее опубликованных данных о системах регуляции Са2+-гомеостаза нейрона создать математическую модель динамики [Са2 ]i в нормально функционирующем нейроне, устойчивом к токсическому воздействию Глу. 2) Исследовать с помощью этой модели различия в динамике восстановления [Са2"]; в различных нейронах после их кратковременного возбуждения. 3) Провести моделирование дерегуляции [Са2^], гомеостаза в молодых нейронах при воздействии на них Глу в сочетании с искусственно вызванной (с помощью митохондриальных ядов) деполяризацией митохондрий. 4) С помощью разработанной модели исследовать: а) механизм возникновения постглутаматного [Са2*]; плато; б) природу дополнительного подъема [Ca2*]j при искусственно вызванной МД во время действия Глу на нейрон; б) Глу-индуцированные изменения [Са2*]; ответа при

2 + десинхронизированной инактивации входящего и выходящего Са потока через нейрональную мембрану; в) правомерность гипотезы о вкладе митохондриального захвата Са2* и систем выведения Са2" из нейрона в восстановлении базальной [Са2 ]{ в постглутаматный период. 5) Опираясь на результаты перечисленных выше исследований, построить модель нарушения [Са2"]; гомеостаза в зрелых нейронах, у которых Глу приводит к возникновению постглутаматного [Са ]i плато и сильной МД без применения митохондриальных ядов. С этой целью разработать феноменологическую модель деполяризации митохондрий и исследовать роль этой деполяризации в процессе дерегуляции [Са2 ]i гомеостаза во время и после воздействия Глу.

Научная новизна. На базе современных представлений о кинетике транспорта Са2* через плазматическую мембрану нейрона и процессов захвата и выведения Са2^ митохондриями в работе впервые создана математическая модель нарушений нейронального Са2 гомеостаза при длительном воздействии возбуждающего нейромедиатора Глу. С помощью этой модели проведена симуляция процессов деполяризации митохондрии при длительном воздействии Глу. Впервые для симуляции нарушении нейронального Са2" гомеостаза при токсическом воздействии Глу в модель введена система инактивации механизмов нейронального входа и выведения Са , зависящая от концентрации цитозольного Са2* и МД. На основе теоретического анализа, проведенного с помощью модели, показано, что МД является необходимым условием возникновения нарушений Са2" гомеостаза при гиперстимуляции Глу рецепторов нейрональной мембраны.

Научно-практическая ценность. Работа имеет выраженную фундаментальную направленность. Проведенные исследования позволяют углубить существующие представления о механизмах регуляции [Са2 ], как в физиологических условиях, так и патологических состояниях. Результаты исследований могут найти применение в теоретической и экспериментальной патофизиологии, исследованиях по моделированию различных патологических состояний нейронов мозга, связанных с нарушением ионного гомеостаза. Возможно использование модели как в учебном процессе, так и при повышении квалификации научных сотрудников для более наглядной иллюстрации л основных механизмов [Са ],-гомеостаза нейронов в нормальных условиях и его нарушении при патогенном воздействии на мозг.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на: Межлабораторном семинаре лабораторий мембранологии НЦЗД РАМН и лаборатории общей патофизиологии нервной системы НИИ ОП и ПФ., заседании кафедры физики живых систем Московского Физико-технического института (июнь 2000), научной конференции МФТИ (Долгопрудный, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 134 страницах и включает 42 рисунка. Список цитирования включает 92 источника.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Бородин, Александр Владимирович

выводы

1) Разработана математическая модель (М-1), которая показывает, что для симуляции изменении [Ca2+]j во время и после Глу воздействия в молодом нормально функционирующем нейроне достаточно построить систему дифференциальных уравнений, описывающих Са2"-потоки между наружной средой, цитозолем, митохондриальным матриксом и митохондриальным Са2~буфером.

2) С помощью модели М-1 показано, что: а) различия в динамике восстановления [Са2 ]i после короткого возбуждающего стимула в нейронах периферической и центральной нервных систем можно объяснить, если принять, что нейроны ЦНС способны сохранять в течение длительного промежутка времени, накопленный при стимуляции Са2+, за счет более медленного высвобождения его из митохондрий; б) дополнительный подъем Са2+ в ответ на искусственную деполяризацию митохондрий метаболическими ингибиторами во время действия Глу может быть симулирован только в том случае, если принять, что он обусловлен торможением митохондриального захвата Са2*.

3) Построена модель М-2, которая показывает, что для симуляции Глу индуцированных нарушений [Ca2+]j гомеостаза в молодых нейронах, при искусственной деполяризации митохондриальной мембраны, необходимо предположить, что МД в сочетании с высокой [Ca2"]j индуцирует развитие инактивационного процесса, который синхронно подавляет входящий и выходящий Са2+ -потоки через плазматическую мембрану нейрона. Этот инактивационный процесс, в сочетании с блокадой митохондриального захвата Са2+, приводит к возникновению постглутаматного [Ca2+]j плато.

4) Исследования проведенные с помощью модели М-2 позволили, во-первых, предсказать изменения [Ca2*]i при несинхронной инактивации входящих и

117 выходящих Са2" потоков через плазматическую мембрану (например, при аппликации Глу и метаболических ингибиторов на фоне воздействия олигомицина), во-вторых подтвердить предположение, что система захвата Са2" митохондриями способна обеспечивать освобождение цитозоля от избытка Са2+ при блокаде системы выведения Са2+ из клетки.

5) Построена модель М-3, которая показывает, что для симуляции Глу индуцированных изменений[Са2"]; в зрелых нейронах, у которых Глу приводит к возникновению постглутаматного [Са2 ]i плато и сильной МД без применения митохондриальных ядов, необходимо ввести в модель систему митохондриальной деполяризации и принять, что эта деполяризация обусловлена повышением [Ca2+]i и накоплением внутри митохондрий фактора X, потенцирующего деполяризующие действие [Ca2+]i.

6) С помощью модели (М-3) показано, что вторая фаза МД является следствием регенеративного процесса, обусловленного наличием положительной обратной связи между изменениями [Са2 ]i и ДТМ: повышение [Ca2+]i усиливает МД, 1 которая, блокируя митохондриальный захват Са вызывает подъем [Са ];. Этот регенеративный процесс завершается коллапсом ДЧ'м и установлением [Ca2"]i на уровне высокого плато.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе сделана, насколько нам известно, первая попытка математического моделирования нарушения внутриклеточного Са2+ гомеостаза нейрона при токсическом воздействии возбуждающего нейромедиатора Глу на нервные клетки.

С этой целью первоначально была разработана математическая модель, позволяющая симулировать изменения [Са2*], в молодых, нормально функционирующих нейронах, устойчивых к нейротоксическому воздействию Глу. Для этого мы воспользовались опубликованными ранее данными о нейрональном транспорте Са2", а именно: о Са2" - потоках через плазматическую и митохондриальные мембраны нейрона и о связывании свободного митохондриального Са2" с буфером. Для этого мы записали систему дифференциальных уравнений для изменения концентраций [Ca2+]j в цитоплазме, митохондриях и митохондриальном буфере (ур. 1-16). Оказалось, что с помощью этой системы уравнений, можно не только симулировать экспериментально наблюдаемые изменения [Ca2"]i в нормально функционирующем нейроне (Рис.9) на и проводить анализ причинно-следственных отношений лежащих в их основе.

Такой анализ позволил заключить, что различия в динамике восстановления уровня [Ca2"]i в различных (периферических и центральных) нейронах после возбуждающего воздействия можно объяснить различиями в функционировании их внутриклеточных оргенелл (Рис.12). Нейроны центральной нервной системы (гиппокампальных, кортикальных и церебеллярных) способны в течение длительного промежутка времени сохранять Са2+аккумулированный за время Глу воздействия в митохондриях благодаря медленному его выведению, тогда как более мощные системы выведения Са2" митохондрий периферических нейронов (симпатических и нейронах дорзальных корешков) быстро освобождают их от избытка Са .

С помощью этой модели был симулирован наблюдаемый в эксперименте дополнительный подъем [Са2 ];, вызываемый применением митохондриальных деполяризаторов (DNP, CN") во время воздействия Глу (13), и показано, что этот подъем обусловлен блокадой митохондриального захвата Са2+ на фоне его продолжающегося входа по Глу зависимым каналам, а не следствием частичного торможения систем выведения Са2+ из нейрона, как это предполагали некоторые авторы (рис. 25). Был также проведен анализ изменения [Ca2+]j ответа на воздействие Глу в зависимости от изменения различных параметров модели (рис. 10, 11, 13, 15), который показал, что данная модель ни при каких изменениях ее параметров не может симулировать стойкую

2+ задержку восстановления [Са ]; в постглутаматный период при продолжающемся воздействии на нейрон митохондриальных деполяризаторов.

Для симуляции нарушения [Са2+]; -гомеостаза при сочетанном воздействии Глу и митохондриальных ядов нам пришлось ввести в модель систему инактивации транспорта Са2+ через нейрональную мембрану. При этом, мы приняли, что эта инактивация: а) зависит от [Са2"], и ЛЧ^М; б) синхронно тормозит как входящий, так и выходящий из нейрона Са2+ потоки (ур. 17-32).

В таком виде модель позволила не только симулировать высокое постглутаматное [Ca2+]i плато, но и показать правомерность гипотезы о взаимозаменяемости систем транспорта Са2" через плазматическую и митохондриальную мембраны в процессе 2 освобождения цитозоля от избытка Са (рис. 14, 17). Моделирование также показало, что сложная динамика изменения [Са2"], при совместном действии на нейрон Глу, митохондриальных деполяризаторов и блокатора митохондриальной АТР-азы олигомицина и может быть объяснена десинхронизацией процессов торможения входящего и выходящего потоков Са2" через плазматическую мембрану.

С помощью этой модели был проведен анализ динамики постглутаматного восстановления [Ca2*]i, и динамики изменений [Ca2+]i при удалении наружного Са2+ во время действия Глу в зависимости от параметров системы инактивации Са2* транспорта нейрональной мембраны (рис. 29, 31)

Проведенные с помощью математического моделирования исследования, в сочетании с накопленным экспериментальным материалом, позволили показать, что эти нарушения, могут быть количественно описаны, если принять что: МД во время Глувоздействия является не только непосредственной причиной блокады

2+ 2+ митохондриального Са -захвата, но в сочетании с высоким [Са ],, играет ведущую роль в механизмах инактивации Са -транспортных систем нейрональной мембраны.

Следующим этапом наших исследований было моделирование изменения [Са2 ]; в зрелых нейронах, у которых Глу приводит к возникновению постглутаматного [Са2*]; плато и сильной МД без применения митохондриальных ядов. С этой целью мы симулировали экспериментально наблюдаемую динамику МД, для чего ввели в модель систему уравнений описывающих зависимость МД от [Са ]; и изменили имеющиеся уравнения так, чтобы симулировать влияние МД на [Са ]j. Полученная таким образом модель способна симулировать изменения [Ca2+]i и ДЧ^ в зрелых нейронах при длительном воздействии Глу (ур. 33-37). Длительное воздействие Глу вызывает в нейронах двухфазную МД в сочетании с двухфазным подъемом [Ca2+]i. Удаление Са2" или блокада Глу-зависимых каналов в одних нейронах приводит к восстановлению Са2* а в других не влияет на [Са2"]; уровень. Мы считали это различие можно объяснить тем, что в последних инактивационные процессы развиваются быстрее, чем в первых. Моделирование показало, что экспериментально наблюдаемую динамику деполяризации внутренней мембраны митохондрий, можно симулировать, если принять, что существует некий деполяризующий фактор X, накопление которого приводит к усилению зависимости МД от [Ca2+]i и , как следствие, возникновению второй сильной фазы МД, и что обе эти фазы МД сильно зависят от [Ca2"]i (рис. 35-36).

Было также обнаружено, что блокада митохондриального захвата Са2*, вызванная МД, и развитие инактивации являются необходимыми и достаточными условиями для симуляции: 1) [Са2+], ответа и МД у зрелых нейронов при длительном воздействие Глу и 2) изменения [Ca2"]i и МД в ответ на удаление наружного Са2+ или фармакологическую блокаду Са2т каналов в начале второй фазы [Са2+]; подъема; 3) нечувствительность постглутаматного [Ca2+]i плато к этим воздействиям.

Таким образом, предложенная модель способна симулировать экспериментально наблюдаемые нарушения [Са2 ]i гомеостаза и коллапс ДТМ при гиперстимуляции Глу рецепторов нейронов головного мозга.

Исследования, проведенные с помощью этой модели, показали, что вторая фаза МД является следствием регенеративного процесса, обусловленного наличием положительной обратной связи между изменениями [Ca2*]i и Д¥м. Это может быть

1 го 2+ 1 наглядно продемонстрировано, если зафиксировать уровень [Са ]i -lj- = 0 ) или dt dMP зафиксировать ДЧ^м (-= 0) во время развития второй фазы МД. Такое dt клампирование» приводит либо к резкому торможению падения ДЧ'м либо к резкому прекращению роста [Са2+], (рис. 39).

По нашей гипотезе - повышение [Ca2~]j вызывает деполяризацию митохондриальной мембраны, при этом происходит снижение скорости потенциалзависимого захвата Са2+ митохондриями, что, в свою очередь, приводит к повышению [Ca2+]j (рис. 40). Кульминацией этого патологического регенеративного процесса является постглутаматное [Са2*]; плато, обусловленное полным прекращение

2+ 2-митохондриального захвата Са и инактивацией систем транспорта Са через нейрональную мембрану.

115

Таким образом, дерегуляция [Са ], гомеостаза нейронов при гиперстимуляции Глу рецепторов является следствием порочного круга между изменениями [Са2^], и ДТМ, а причиной возникновения этого порочного круга является накопление фактора X, потенцирующего деполяризующие действие [Ca2+]i.

Важным результатом исследований, проведенных с помощью предложенной нами модели, следует считать именно предсказание возникновения и накопления фактора X в митохондриях во время токсического воздействия Глу и коллапса ДЧ'м. При варьировании скорости накопления X установлено, что длительность первой фазы МД и [Са2 ]i сильно зависят от этой величины. Моделирование показало, что в случае медленного накопления фактора X во время Глу воздействия Глу-индуцированные изменения [Ca2+]i и ДЧ^ становятся сходными с теми, которые наблюдаются у молодых нейронов, устойчивых к токсическому действию Глу (рис. 41-42). Таким образом, проведенное математическое моделирование позволило поставить вопрос об идентификации фактора X, что, по всей видимости, даст ответ на вопрос о механизме Глу нейротоксичности. Исследования в этом направлении активно ведутся в нашей лаборатории.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Бородин, Александр Владимирович, 0 год

1. Adamec, Е., Didier, М. & Nixon, R. (1998). Developmental regulation of the recovery process following glutamate-induced calcium rise in rodent primary neuronal cultures. Brain Research, Developmental Brain Research 108, 101-110.

2. Andreeva, N., Khodorov, В., Stelmashook, E., Cragoe, Jr., Victorov, I. (1991) Inhibition of

3. Na7Ca2" exchange enhances delayed neuronal death elicited by glutamate in cerebellar granule cell cultures Brain Res. V. 548. -P. 322-325.

4. Asztely, F. and Gustafsson, B. (1996) lonotropic glutamate receptors: Their role in the expression of hippocampal synaptic plasticity. Mol. Neurobiol. 12:1-11.

5. Babcock, D., & Hille, B. (1998). Mitochondrial oversight of cellular Са2т signaling. Current Opinion in Neurobiology 8, 398-404.

6. Blaustein M P. (1988). Calcium transport and buffering in neurons. TINS. -. -V. 11. -P. 438-443.

7. Budd, S. L. & Nicolls, D. G. (1996). Mitochondria, calcium regulation, and acute glutamateexcitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neurochemistry 67, 22822291.

8. Budd, S. L., Castilho, R. F. & Nicholls, D. G. (1997) Mitochondrial membrane potential and hydroethidine-monitored superoxide generation in cultured cerebellar granule cells. FEBS Letters 415,21-24.

9. Carafoli E. (1987). Intracellular calcium homeostasis. Annu. Rev. Biochem. -V. 56. -P. 395-433.

10. Carafoli, E. (1991). Calcium pump of the plasma membrane. Physiological Review 71, 129-153.

11. Castilho, R. F., Ward, M. W. & Nicholls, D. G. (1999) Oxidative stress, mitochondrial function, and acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neurochemistry 72, 1394-1401.

12. Choi, D. W. & Rothman, S. M. (1990) The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review ofNeuroscience 13, 171-182.

13. Colegrove, S., Albrecht, M. and Friel, D.D. (2000). Quantitative analysis of mitochondrial Ca2~ uptake and release pathways in sympathetic neurons. Journal of General Physiology 115, 371-388.

14. Cotman C.W., Monaghan D.T., Ottersen O.P., Storm-Mathisen J. (1987). Anatomicalorganization of excitatory amino acid receptors and their pathways. Trends Neurosci. -V. 10.-P. 273-280.

15. Coyle, J.T. & Puttfarcken, P. (1993) Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science 262 689-695.

16. Danysz, W. and Parsons, C. G. (1998) Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors:

17. Physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacol. Rev. 50: 597-664.

18. David, G. (1999). Mitochondrial clearance of cytosolic Ca2^ in stimulated lizard motor nerve terminals proceeds without progressive elevation of mitochondrial matrix Ca2+., The Journal of neuroscience. 19 (17): 7495-7506.

19. Dawson, Т. M., Steiner, J. P., Dawson, V. L., Dinerman, J. L., Uhl, G. R. & Snyder, S. H. (1993). Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 90 (21), 9808-9812.

20. DiPolo, R. & Beauge, L. (1988). Ca2~ transport in nerve fibers. Biochimica et Biophysica Acta 947, 549-569.

21. Duchen, M.R. (1999) Topical Review: Contributions of mitochondria to animal physiology: from homeostatic sensor to calcium signaling and cell death, Journal of Physiology (London) V. 510. P. 1-17.

22. Duchen, M R. (2000) Topical Review: Contributions of mitochondria to animal physiology: from homeostatic sensor to calcium signaling and cell death, // Journal of Physiology (London). V. 529. P. 57-68.

23. Friel, D. D. and Tsien, R.W. (1994). An FCCP-sensitive Ca2' store in Bullfrog sympathetic and its participation in stimulus-evoked changes in Ca2+.i. Journal of Neuroscience. 14(7), 4007-4024.

24. Gatto С , Hale C., Xu W., Milanick M. (1995). Biochemistry. V. 34 P. 965-972.

25. Gunter, T. (1994). Cation Transport by Mitochondria. Journal of Bioenergetics and Biomembranes 26, 465-469.

26. Gunter, Т. E., Pfeiffer, D. R. (1990). Mechanisms by which mitochondria transport calcium. American Journal of Physiology. 258, C755-C786.

27. Hartley Z , Dubinsky J.M. (1993). Changes in intracellular pH associated with glutamate excitotoxicity. J. Neurosci. V. 13. P. 4690-4699.

28. Jacobson, D. & Duchen, M. (1998) Fluorescence imaging of the mitochondrial permeability transition in rat cortical astrocytes in culture. Journal of Physiology 506P, 75P-76P.

29. Kapus, A., Szaszi, K., Kaldi, K., Ligeti, E. & Fonyo, A. (1991). Is the mitochondrial Ca2* uniporter a voltage-modulated transport pathway? FEBS Letters 282, 61-64.

30. Keelan, J., Vergun, O. & Duchen, M. R. (1999) Excitotoxic mitochondrial depolarisation requires both calcium and nitric oxide in rat hippocampal neurons. Journal of Physiology 520 797813.

31. Kennedy, H., Pouli, A., Ainscow, E., Jouaville, L., Rizotto, R., Rutter, G. (1999). Glucosegenerates sub-plasma membrane ATP microdomains in single Islet b-cells. J. Biological Chemistry. 274, 19, 13281-13291.

32. Khodorov В., Pinelis V., Fayuk D., Storozhevikh Т., Vinskaya N., Koshelev S., Vergun O.,

33. Khaspekov L., Lyzhin A., Isaev, N., Victorov I. (1995a)Use of manganese to monitorchanges in calcium permeability of neuronal membrane caused by a toxic glutamate treatment of cultured nerve cells. Biophys. J. V. 68. 2, pt 2. -P. A212.

34. Khodorov В., Pinelis V., Vergun O., Storozhevykh Т., Fajuk D., Vinskaya N., Arsenjeva E.,

35. Khodorov, B. (2000). Mechanisms of destabilization of Ca2~-homeostasis of brain neurons caused by toxic glutamate challenge. Membrane Cell Biology 14, 149-162.

36. Khodorov, В., Pinelis, P., Storozhevykh, Т., Yuravichus, A., (1999). Blockade of mitochondrial Ca2" uptake by mitochondrial inhibitors amplifies the glutamate-induced calcium response in cultured cerebellar granule cells. FEBS Letters 458, 162-166.

37. Khodorov. В., Pinelis, V., Vergun, 0., Storozhevikh, T. & Vinskaya, N. (1996, c). Mitochondrial deenergization underlies neuronal calcium overload following a prolonged glutamate challenge. FEBS Letters 397, 230-234.

38. Kiedrowski, L. & Costa, E. (1995). Glutamate-induced destabilization of intracellular calcium concentration homeostasis in cultured cerebellar granule cells: role of mitochondria in calcium buffering. Molecular Pharmacology 47, 140-147.

39. MacDermott A.B., Mayer M L., Westbrook G.L., Smith S.J., Barker J.L. (1986). NMDA-receptor activation increases citoplasmic calcium concentration in spinal cord neurones. Nature. V. 321. -P. 519-522.

40. Magnus, G. and Keizer, J. (1997). Minimal model of P-cell mitochondrial Ca2~ handling.

41. Monaghan D.T, Holets V.R., Toy D.W, Cotman C.W. (1983). Anatomical distributions of four pharmacologically distinct 3H-L-glutamate binding sites. Nature. V. 306. -P. 176-179.

42. Nicholls, D & Budd, S. (2000). Mitochondria and neuronal survival. Physiological Reviews 80, 315-360.

43. Nicholls, D.G. (1986). Intracellular Ca2+ homeostasis. Brain Medicine Bull. 42, 353-358.

44. Ogura, A., Miyamoto, M. & Kudo, Y. (1988). Neuronal death in vitro: parallelism betweensurvivability of hippocampal neurones and sustained elevation of cytosolic Ca2+ after exposure to glutamate receptor agonist. Experimental Brain Research 73, 447-458.

45. Parsons C. G., Danysz W. and Quack G. (1999) Memantine is a clinically well tolerated N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist a review of preclinical data. Neuropharmacology 38: 735-767.

46. Richards D., Rega A., Garrahan P. (1978). Biochim. et Biophys. Acta. V. 511, P. 194-201.

47. Rosemund, C., Wesbrook, G. (1993). Calcium-induced actin depolymerization reduces NMDA channel activity. Neuron 10, 805-814.

48. Rosemund, C., Wesbrook, G. (1993). Calcium-induced actin depolymerization reduces NMDA channel activity. Neuron 10, 805-814.

49. Rosenmund C., Feltz A., Westbrook G.L. (1995). Calcium-dependent inactivation of synaptic NMDA receptors in hippocampal neurons. // J. Neurophysiol. V. 73. -P. 427-430.

50. Schinder, A. F., Olson, E. C., Spitzer, N. С & Montal, M. (1996). Mitochondrial dysfunction is a primary event in glutamate neurotoxicity. Journal of Neuroscience 16, 6125-6133.

51. Staubly U. and Lynch G. (1991) NMDA receptors and memory: evidence from pharmacological and correlation studies. In: Neurobiology of the NMDA receptor from chemistry to the clinic (Kozikowsky A.,Ed) pp. 149-172. VCH Publishers, Inc.

52. Storozhevikh ,T., Sorokina E.,Vinskaya N., Pinelis V., Khodorov B. // Intern.J.Neurosci (1996), 88, 199-214.

53. Swillens, S. and Mergan, D. (1990). Computer simulation of a cytosolic calcium oscillator. Biochemistry Journal. 271, 835-838.

54. Vergun, 0., Keelan, J., Khodorov, В. I. & Duchen, M. R. (1999) Glutamate-induced mitochondrial depolarisation and perturbation of calcium homeostasis in cultured rat hippocampal neurones. Journal of Physiology 519, 451-66.

55. Vergun, О, Sobolevsky, A., Yelshansky, M., Keelan, J., Khodorov, В., Duchen, M. (2001). Exploration of the role of reactive oxygen species in glutamate neurotoxicity in rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 531.1, 147-163.

56. Wang, G. J., Randall, R. D. & Thayer, S. A. (1994). Glutamate-induced intracellular acidification of cultured hippocampal neurons demonstrates altered energy metabolism resulting from Ca2+ loads. Journal of Neurophysiology 72, 2563-2569.

57. Wassle H., Yamashita M., Greferath U., Grunert U., Muller F. (1991). The rod bipolar cell of the mammalian retina. // Vis. Neurosci. V. 7. -P. 99-112.

58. Watkins J.C., Krogsgaard-Larsen P., Honore T. (1990). Structure-activity relationships in the development of excitatory amino acid receptor agonosts and competitive antagonists. Trends Pharmacol. Sci. V. 11. -P. 25-33.

59. Watkins J.C., Olverman H.J. (1987). Agonists and antagonists for excitatory amino acid receptors. //Trends Neurosci. V. 10. -P. 265-272.

60. White, R. J. & Reynolds, I. J.(1996). Mitochondrial depolarization in glutamate-stimulatedneurones: an early signal specific to excitotoxic exposure. Journal of Neuroscience 16, 5688-5697.

61. Wigrove, D.E. and Gunter, Т.Е. (1986). Kinetics of mitochondrial calcium transport. J. Biological Chemistry. 261. 15166-15171.

62. Zoratti, M. & Szabo, I. (1995). The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta 1241 (2), 139-569.

63. Богачев, А. В., Быкова JI. П., Ходоров Б. И., Андреева Н. А., Хаспеков JI. Г., Пинелис В. Г., и Викторов И. В. (1992). Биологические мембраны, 9, 1057.

64. Пинелис, В. Г., Быкова Л. П., Богачев А. П., Исаев Н. К. Викторов И. В., Ходоров Б. И. (1992). Бюлл.эксп. биол.мед., 123, №2, 162-164.

65. Ходоров, Б. И. (1975) Общая патология возбудимых мембран. Наука.

66. Ходоров, Б. И., Пинелис В. Г., Головина В. А., Фаюк Д. А., Уварова Т. М., Андреева Н. А., Хаспеков, Л. Г. , Викторов И. В. (1992). Биологические мембраны 9 (10-11), 10451049.135

67. От всей души благодарю профессора Бориса Израилевича Ходорова, идеи знания и опыт, которого лежат в основе этого исследования, и чьи энергия и оптимизм были необходимым условием создания этой работы.

68. Огромную благодарность выражаю Александру Михайловичу Сурину за неоценимый опыт, полученный в ходе совместной работы.

69. Искренне благодарю Сергея Владимировича Ревенко за живое участие и огромную помощь в создании этой работы.

70. Сердечно благодарю всех сотрудников лаборатории общей патологии нервной системы Института общей патологии и патофизиологии РАМН и лаборатории мембранологии Научного Центра здоровья Детей РАМН за неоценимую поддержку и помощь.