Липопептид и липосомальная форма пептида с повышенной иммуногенностью на основе синтетического фрагмента антигена NS4A вируса гепатита С тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Белявцев Александр Николаевич

• Белявцев Александр Николаевич
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Белявцев Александр Николаевич

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярно-генетическая характеристика вируса гепатита С

1.2. Липопептиды для профилактики и терапии инфекционных заболеваний

1.3 Синтез иммуногенных липопептидов

1.4. Заключение литобзора

2. Результаты и обсуждение

2.1. Синтез и анализ свойств иммуногенного фрагмента полипептида №4А ВГС

2.2. Влияние липидных компонентов на иммуногенность синтетического фрагмента антигена NS4A вируса гепатита С

3. Экспериментальная часть

3.1. Химический синтез

3.1.1. Твердофазный синтез 24-пептида VIVGRIILS GRPAVIPDREVLYRK-NH2 (7)

3.1.2. Синтез 1,3-бис(пальмитоиламино)-2-(3-карбоксипропаноил)оксипропана (3)

3.1.3. Синтез липопептидного конъюгата 24-пептида с

1,3-бис(пальмитоиламино)-2-(3-карбоксипропаноил)оксипропаном (4)

3.1.4. Синтез монопальмитоильного липопептида (5)

3.1.5. Твердофазный синтез пептида VIVGRIILSGK (6)

3.2 Получение липосомальной формы 24-пептида

3.3. Определение размеров частиц

3.4. Твердофазный иммуноферментный анализ (метод ELISA)

3.5. Метод ELISpot

3.6. Иммунизация животных

3.7. Выделение лимфоцитов из селезенки мышей

Заключение

Выводы

Список литературы

Список публикаций автора по теме диссертации

Благодарности

Список сокращений

АРС - антиген-презентирующие клетки

CD - cluster of differentiation (кластер дифференцировки)

Соге-белок - ядерный (нуклеокапсидный) белок

DC - дендритные клетки

DIC - диизопропилкарбодиимид

DIPEA - диизопропилэтиламин

DMAP - 4-диметиламинопиридин

DMF - диметилформамид

EDC - 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид ELISpot - Enzyme-Linked ImmunoSpot HOBt - гидроксибензотриазол

HLA - система человеческих лейкоцитарных антигенов

HTL - хелперные T-лимфоциты

IFN-y - интерферон гамма

IgG - иммуноглобулины G

IL - интерлейкин

LHRH - релизинг-фактор лютеинизирующего гормона MALP - макрофаг-активирующий липопептид MAP-киназа - митоген-активируемая протеинкиназа МНС - главный комплекс гистосовместимости MPL - монофосфолипид А

MyD88 - myeloid differentiation factor (миелоидный фактор дифференцировки) 88 NF-kB - nuclear factor kappa В (ядерный фактор транскрипции каппа би) NS - неструктурный белок

Pam2APSuc - 1,3-бис(пальмитоиламино)-2-(3-карбоксипропаноилокси)пропан Pam2Cys - S-[2,3-бис(пальмитоилокси)-(2R)-пропил]цистеин

Pam2Suc - №[2,3-бис(пальмитоилокси)пропил]аминосукцинил

PAMP - ассоциированный с патогеном молекулярный паттерн

PRR - паттерн-распознающий рецептор

TCR - Т-клеточный рецептор

TEA - триэтиламин

TFA - трифторуксусная кислота

Th-клетки - Т-хелперные клетки

TIR - Toll / IL-1-рецептор

TIS - триизопропилсилан

TLR - Toll -подобный рецептор

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВГС (HCV) - вирус гепатита С (hepatitis C virus);

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВПЧ - вирусоподобные частицы

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДМСО - диметилсульфоксид

ДЦК - дициклогексилкарбодиимид

ИФА - иммуноферментный анализ

НАФ - неполный адъювант Фрейнда

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

ТСХ - тонкослойная хроматография

УВО - устойчивый вирусологический ответ

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЦТЛ (CTL) - цитотоксические T-лимфоциты

ЭПС - эндоплазматическая сеть

9-пептид - нонапептид

11-пептид - ундекапептид

lS-пептид - октадекапептид

24-пептид - тетракозапептид

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Липопептид и липосомальная форма пептида с повышенной иммуногенностью на основе синтетического фрагмента антигена NS4A вируса гепатита С»

Актуальность темы исследования

Вирус гепатита С (ВГС) из семейства Flaviviridae вызывает в организме человека инфекционное заболевание, которое может перейти в хроническую форму и в дальнейшем привести к летальному исходу вследствие возникновения цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы. В настоящее время имеется широкий спектр лекарственных препаратов для терапии гепатита С, но для элиминации гепатита С актуальна задача разработки вакцин. Традиционный подход к созданию вакцин на основе убитого или аттенуированного патогена в отношении ВГС не удалось реализовать, поэтому в настоящее время рассматриваются альтернативные варианты, среди которых одним из перспективных является получение синтетической пептидной вакцины. Преимущество этого варианта в том, что при помощи синтетических пептидов можно вызвать образование мощного В- и Т-клеточного ответа на такие эпитопы, которые обычно при иммунизации цельными вирионами или их нативными антигенами малоэффективны. Также пептидные вакцины имеют меньше побочных эффектов, чем другие типы вакцин. Поэтому синтез пептидных иммуногенов актуален ввиду возможности последующего создания на их основе противовирусных вакцин.

Антиген NS4A ВГС является кофактором сериновой протеазы NS3, который активирует её протеолитическую функцию. В NS4A экспериментально выявлены В-клеточные и Т-хелперные эпитопы. Блокирование протеазы NS3 может снизить продукцию ВГС, что является основой механизма для группы противовирусных препаратов прямого действия, ингибирующих активность NS3.

Одним из вариантов синтетического иммуногена может быть сочетание пептидных эпитопов антигена и липофильного адъюванта, обеспечивающее взаимодействие с клеточной мембраной и Toll-подобными рецепторами (TLR) антиген-презентирующих клеток (APC). Взаимодействие TLR с лигандами приводит к индукции сигнальных путей NF-kB и МАР-киназы, которые

5

индуцируют синтез и секрецию молекул, стимулирующих презентацию антигена и формирующих иммунный ответ. Иммунизация липопептидами может вызывать клеточно-опосредованные иммунные реакции, которые способны обеспечить иммунную защиту от различных целевых патогенов. Известно, что существуют липофильные соединения с адъювантными свойствами, которые являются компонентами природных лигандов ТЬЯ или их синтетическими аналогами, способные усиливать иммуногенность синтетических пептидов. Поэтому одним из перспективных направлений в разработке вакцин от гепатита С может стать синтез липопептидов на основе иммуногенных участков КБ4А в качестве кандидатных вакцинных препаратов. Усилить иммунный ответ может также включение синтетических пептидов в липосомы [1].

В связи с этим представляется актуальным синтез липопептидов с адъювантными свойствами на основе синтетического фрагмента антигена NS4A ВГС, а также получение липосомальной формы этого синтетического фрагмента, исследование их иммуногенности и оценка перспективы включения в состав кандидатной вакцины от гепатита С.

Степень разработанности научной тематики

Благодаря развитию методов анализа антигенных детерминант и большому

объему данных о пептидах ВГС, презентируемых иммунокомпетентными

клетками после связывания с белками главного комплекса гистосовместимости,

сформирована теоретическая основа получения синтетических иммуногенов для

разработки вакцин от гепатита С. Отечественной группой ученых проводились

исследования по созданию вакцины на основе синтетических пептидов,

содержащих антигенные детерминанты оболочечных белков ВГС [2].

Неструктурные белки ВГС, в том числе антиген NS4A, выполняющие важные

функции в жизненном цикле вируса, тоже рассматриваются в качестве объекта

для выработки подходов к созданию вакцины от гепатита С. Разработана

мультиэпитопная кандидатная пептидная вакцина, состоящая из консервативных

антигенных детерминант оболочечных (Е1, Е2) и неструктурных белков (К84Б,

6

№5Л, N853), которая при испытании на мышах инициировала у них выработку вирус-нейтрализующих антител и секрецию Т-лимфоцитами [3]. Методом

фагового дисплея доказано наличие консервативного В-эпитопа в области 24-36 №4Л [4], но иммунореактивность и иммуногенность этого участка в сочетании с Т-хелперным эпитопом достаточно подробно не исследована.

Известно, что липофильные адъюванты и липосомы могут усилить иммуногенность синтетических пептидов. КашшепБее И.О. и его коллеги показали, что липопептид на основе антигенного фрагмента нуклеопротеина (№) вируса гриппа (Л/РК/8/34), конъюгированного с трипальмитоил-Б-глицерилцистеином, без дополнительного адъюванта вызывал цитотоксический иммунный ответ CD8+ Т-лимфоцитов, тогда как не модифицированный пептид такой ответ не вызывал [5]. Также показано, что конъюгат липофильного адъюванта и пептида, воспроизводящего Т-хелперный эпитоп ВГС, стимулирует Т-клеточную активность [6]. Результаты этих и последующих исследований обосновывают перспективность дальнейших разработок в направлении создания синтетических липопептидных вакцин.

Цель

Цель исследования заключается в разработке липидмодифицированных пептидных иммуногенов на основе синтетического фрагмента антигена №4А вируса гепатита С, содержащего В- и Т-клеточные эпитопы, анализе их иммуногенности и оценке перспективы их включения в состав прототипа кандидатного вакцинного препарата против гепатита С.

Задачи

1. Синтез пептидов на основе аминокислотной последовательности антигена №4Л ВГС, содержащих В-клеточный и Т-хелперный эпитопы;

2. Синтез липопептида, состоящего из 24-пептида и липофильного адъюванта;

3. Получение липосомальной формы 24-пептида;

4. Исследование иммунореактивности пептидов;

5. Исследование иммуногенности 24-пептида, липопептида и липосомальной формы 24-пептида на биологической модели (лабораторные мыши).

7

Научная новизна работы

> Твердофазным синтезом по Fmoc-протоколу получен новый потенциальный пептидный иммуноген - амидированный по С-концевой карбоксильной группе тетракозапептид VIVGRIILSGRPAVIPDREVLYRK (24-пептид), соответствующий участку 24-47 полипептида №4А ВГС (субтип 1Ь), содержащему экспериментально подтвержденные В-клеточную антигенную детерминанту и Т-хелперный эпитопный мотив.

> Впервые получены липопептид, представляющий собой 24-пептид У1УаШ1Ь8аКРАУ1РВКЕУЬУКК-КН2, ацилированный 1,3-бис(пальмитоиламино)-2-(3-карбоксипропаноилокси)пропаном по N-концевой а-аминогруппе, и липосомальная форма этого 24-пептида.

> Показана высокая иммунореактивность 24-пептида методом ИФА на сыворотках крови инфицированных ВГС пациентов.

> Впервые исследована иммуногенность 24-пептида У1УаШ1Ь8аКРАУ1РВКЕУЬУКК-КН2 и адъювантная активность 1,3-бис(пальмитоиламино)-2-(3-карбоксипропаноилокси)пропана.

> В результате сравнительного анализа гуморального и Т-клеточного ответа у лабораторных мышей после иммунизации 24-пептидом, липопептидом, 24-пептидом с неполным адъювантом Фрейнда и 24-пептидом в липосомах установлено, что наиболее высокий титр антител и продукция Т-лимфоцитами получены у мышей, иммунизированных пептидом в фосфатидилхолиновых липосомах.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследования могут быть использованы при разработке компонентов вакцинных препаратов от гепатита С. Синтезированы новые соединения, структура которых содержит участок природного антигена КБ4А ВГС, разработаны методы их очистки с высокой степенью чистоты и определена их биологическая активность. На модели лабораторных мышей показано, что 24-

пептид обладает иммуногенностью. Получена наноразмерная липосомальная форма пептида с высокой степенью включения. Конъюгирование 24-пептида с 1,3-бис(пальмитоиламино)-2-(3-карбоксипропаноилокси)пропаном усиливало

гуморальный иммунный ответ, а включение 24-пептида в липосомы инициировало более высокий уровень гуморального и ТЫ-ответа. В результате эксперимента установлено, что 24-пептид VIVGRIILSGRPAVIPDREVLYRK-NИ2 может быть рекомендован в качестве иммуногена для использования с различными адъювантами в составе кандидатной вакцины против гепатита С.

Методология и методы диссертационного исследования

В работе применяли современную методологию твердофазного синтеза пептидов и классическую методологию органического синтеза. Чистоту полученных соединений определяли методами ТСХ и аналитической офВЭЖХ, а их структуру подтверждали методами 1Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения. Пептид в липосомах получали экструзией через поликарбонатный фильтр с нанопорами, а размер частиц измеряли на современном оборудовании методом динамического светорассеяния. Иммунизацию мышей и выделение лимфоцитов селезенки осуществляли стандартными биологическими методами. Наличие иммунного ответа на вводимые препараты фиксировали методами ИФА и ЕЫБро! с использованием оборудования для измерения оптической плотности и подсчета клеток, секретирующих цитокины.

Положения, выносимые на защиту

1. Синтез 24-пептида У1УОМ1Ь8ОКРАУ1РВКЕУЪУКК-ЫН2, содержащего В-клеточный и Т-хелперный эпитопы антигена NS4Л ВГС.

2. Синтез конъюгата 24-пептида и 1,3-бис(пальмитоиламино)-2-(3-карбоксипропаноил)оксипропана (липопептида).

3. Получение липосомальной формы пептида VIVGRIILSGRPAVIPDREVLYRK-NИ2 и определение её характеристик.

4. Исследование иммунореактивности 24-пептида на сыворотках крови инфицированных ВГС людей.

5. Исследование иммуногенности полученных препаратов по выработке антител и секреции цитокинов у лабораторных мышей, а также оценка адъювантной активности использованных липофильных соединений.

Степень достоверности результатов

Для синтеза соединений использовали фирменные реагенты и воспроизводимые методики, на каждой стадии проводили анализ прохождения реакции, чистоту и молекулярный вес подтверждали аналитическими методами хроматографии и масс-спектрометрии. Для исследования иммуногенности и иммунореактивности использовали сертифицированные тест-системы и оборудование, достоверность полученных результатов обусловлена наличием стандартизации методик эксперимента, воспроизводимости результатов в пределах выборки и статистической обработки данных.

Апробация работы и публикации

По результатам диссертационной работы опубликовано 3 статьи и 4 тезисов. Результаты диссертации были представлены на следующих конференциях:

• XXVI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2019», 2019 г.

• XXVII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2020», 2020 г.

• V научно-практическая конференция «Международная интеграция в сфере химической и фармацевтической промышленности», Москва, 2020 г.

• VI Международная конференция молодых ученых: биофизиков, биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов «ОрепВЮ-2021»

• II научная конференция молодых ученых с международным участием «Актуальные исследования в фармакологии», Москва, 2021 г.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярно-генетическая характеристика вируса гепатита С

Вирус гепатита С (ВГС) — это РНК-содержащий патоген из семейства Flaviviridae, геном которого впервые идентифицирован в 1989 году. Особенностью вируса является способность создавать новые генетические и антигенные варианты, задерживать формирование Т-хелперного и Т-киллерного ответа лимфоцитами при остром гепатите С, что способствует переходу в хроническую форму (ХГС). Длительный ХГС может приводить к летальным последствиям при развитии цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы [7,8]. ВГС инфицирует человека с помощью гемоконтактного механизма передачи возбудителя при непосредственном попадании в кровь, на поврежденные кожные или слизистые покровы. В мире около 70 миллионов людей живут с ХГС и ежегодно примерно 400 тысяч человек умирают от последствий заболевания [9]. Лечение больных с поздними стадиями заболевания печени затруднено и даже подавление репликации ВГС не приводит к снижению риска гибели пациентов.

Полная элиминация этой инфекции является пока ещё недостижимой задачей, так как не разработана вакцина. Большинство работ по разработке вакцин от гепатита С ориентированы на получение рекомбинантной субъединичной вакцины, вирусоподобных частиц (ВПЧ) или векторной вакцины. Вакцинные препараты на основе синтетических пептидов привлекают разработчиков тем, что имеют минимальное количество побочных эффектов [10]. Развитие методов анализа антигенных детерминант и конструирование синтетических пептидных антигенов делает возможным использование их в разработках вакцинных препаратов. Одним из перспективных направлений в разработке вакцин от гепатита С может стать синтез иммуногенных липопептидов, обладающих одновременно и адъювантными свойствами.

1.1.1. Строение вириона и жизненный цикл ВГС

Вирион ВГС имеет размер 45-75 нм и содержит липидно-белковую оболочку, которая сформирована липидами клетки-хозяина и поверхностными гликопротеинами вируса (Е1 и Е2) [11-13]. Под оболочкой ВГС располагается нуклеокапсид, который сформирован ядерным (core) белком и содержит вирусную РНК (рис. 1). Размеры нуклеокапсида по данным электронно-микроскопического анализа составляют 33-40 нм [14]. Строение ВГС доказано с помощью высокоразрешающего электронно-микроскопического анализа биоптатов печени больных гепатитом С и искусственных ВПЧ.

Рисунок 1. Схема строения вириона вируса гепатита С

Низкая плотность вирусных частиц объясняется ассоциацией ВГС с липопротеинами низкой плотности (ЛНП), содержащимися в сыворотке крови

[13]. Эти липопротеины представляют собой сферические частицы, сформированные монослоем фосфолипидов с включениями холестерина и аполипопротеинов В и Е, внутренняя полость частиц заполнена триглицеридами

[14]. Основная функция липопротеинов - доставка триглицеридов и холестерина различным клеткам. Синтез липопротеинов происходит в эндоплазматической сети (ЭПС) гепатоцитов, где они затем встраиваются в белково-липидную оболочку ВГС [15].

Итак, резюмируя вышеописанное строение вириона ВГС, выделим 3 его основные структурные единицы:

1) Одноцепочечная РНК вируса;

2) Нуклеокапсид (сформирован из соге-белка), внутри которого находится РНК;

3) Липидно-белковая оболочка, состоящая из гликозилированных оболочечных белков ВГС и липидов клетки, которая покрывает нуклеокапсид.

Жизненный цикл ВГС начинается с адсорбции на клеточной мембране и связывания вириона со специфическими рецепторами гепатоцита, что позволяет ему проникнуть внутрь клетки. В цитоплазме из нуклеокапсида высвобождается вирусная РНК и начинается трансляция [16]. Морфогенез ВГС осуществляется в мембранах ЭПС, вакуолях аппарата Гольджи и цитоплазме клетки (рис. 2). Синтезированный при трансляции белок ВГС расщепляется вирусными ферментами и клеточными сигнальными пептидазами на структурные и неструктурные белки. Структурные белки вируса отщепляются от полипротеина с помощью клеточных ферментов. Соге-белок остается на цитоплазматической поверхности ЭПС и в липидных вакуолях цитоплазмы, а оболочечные белки частично проникают во внутреннюю полость ЭПС. В эндоплазматической сети белки Е1 и Е2 формируют комплекс и подвергаются процессингу, который заканчивается в секреторных вакуолях аппарата Гольджи. Нуклеокапсид после упаковки РНК покрывается оболочкой и вирус выпочковывается в цистерны ЭПС.

13

1.1.2. Структура генома ВГС

ВГС является РНКовым вирусом рода ШраеМгш из семейства Flaviviridae. Выделяют 8 генотипов ВГС и множество субтипов, что обусловлено высокой частотой мутаций генома. Субтип 1Ь ВГС является наиболее распространенным на территории России. Геном ВГС представлен одноцепочечной РНК, имеющей положительную полярность, состоящей из 9400-9600 нуклеотидных остатков (н.о.). Для этого генома характерны: уникальная открытая рамка считывания, короткая (около 340 н.о.) 5'-концевая нетранслируемая область (НТО) и участки с высокой частотой мутаций [17]. Открытая рамка считывания кодирует единственный белок-предшественник, называемый полипротеином, который состоит из 3008-3037 аминокислотных остатков (а.о.) [18]. В результате ко- и посттрансляционного протеолитического расщепления полипротеина и процессинга продуктов образуются структурные и неструктурные белки (рис. 2).

Благодаря консервативному участку РНК ВГС в зоне 5'-концевой НТО возможно обнаружение вирусной РНК в разных изолятах методом ОТ-ПЦР (обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции). В зоне 3'-концевой НТО РНК тоже имеется высококонсервативный участок. Особенностью генома HCV является его генетическая неоднородность, обусловленная высокой частотой мутаций, поэтому вирус существует у инфицированных лиц как комплекс генетически близких, но иммунологически разграничиваемых вариантов, различия в нуклеотидной последовательности которых составляют несколько процентов (квазивиды) [19]. В течение инфекционного процесса вирус подвергается иммунному воздействию: одни варианты ВГС удаляются иммунной системой хозяина, а другие возникают [20].

Первым элементом генома ВГС является 5'-концевая НТО, выполняющая важные биологические функции. Этот участок генома обеспечивает взаимодействие вирусной РНК с рибосомой (40Б субъединицей), после которого происходит формирование трансляционного комплекса (инициация трансляции).

Участок связывания с 40S субъединицей рибосомы называется в английской аббревиатуре IRES (internal ribosome entry site) [21].

В процессе репликации генома ВГС образуется нестабильная РНК с отрицательной полярностью (минус-цепь РНК), которая расщепляется клеточными ферментами [22]. Для эффективной репликации вирусного генома необходим клеточный белок PTB (polypyrimidine tract-binding protein), связывающий полипиримидиновый тракт РНК [23].

1.1.3. Белки вируса гепатита С

Доминирующими протеинами ВГС являются оболочечные белки Е1 и Е2, нуклеокапсидный и неструктурные белки NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B. Кроме них с вирусного генома транслируются минорные полипептиды: пептид p7 (виропорин) и белок F [24]. Минорные полипептиды синтезируются в результате считывания генетической информации с дополнительных инициирующих кодонов, локализованных в области генома, кодирующей ядерный белок. Неструктурные белки обладают ферментативной активностью и выполняют важные функции в жизненном цикле ВГС [25].

Рисунок 2. Схема морфогенеза ВГС [25] 15

Виропорин ВГС состоит из 63 а.о. и имеет два трансмембранных домена (ТМ1 и ТМ2), которые образуют катион-специфический канал, необходимый для сборки вируса и оптимального выхода из инфицированных клеток путем изменения кислотно-щелочного равновесия внутриклеточных везикул [26].

Белок F синтезируется при сдвиге рамки считывания генетического кода на один нуклеотидный остаток и имеет консервативную аминокислотную последовательность [27].

Рисунок 3. Основные этапы жизненного цикла и расположение белков ВГС [16]: ББР - посттрансляционный процессинг сигнальной пептидазой (БР)

Оболочечные белки Е1 (35 кДа) и Е2 (72 кДа) являются основной мишенью иммунной атаки и их структуре свойственна максимальная изменчивость [28].

Изменение эпитопов на поверхности вириона не позволяет организму активировать возникший на предыдущее инфицирование этим вирусом иммунный ответ. Оба оболочечных белка относятся к трансмембранным протеинам и содержат углеводные остатки. Основные функции этих белков: взаимодействие с рецепторами и обеспечение проникновения вирусного генома в цитоплазму клетки. Пространственная укладка (фолдинг) белков Е1 и Е2 начинается одновременно с трансляцией и завершается после нее. Основные этапы фолдинга протеина Е1 осуществляются с помощью клеточного белка-шаперона калнексина, образующего с ним кратковременный комплекс [29]. Фолдинг белка Е2 более продолжительный, чем у протеина Е1. Это связано с наличием в молекуле Е2 большего количества дисульфидных связей и интенсивным гликозилированием белка [30]. Пространственная укладка протеина Е2 происходит при участии калнексина и других шаперонов, а также белка Е1. Под действием клеточных ферментов ЭПС белки Е1 и Е2 гликозилируются [31]. Процесс гликозилирования начинается одновременно с фолдингом белков и завершается в вакуолях аппарата Гольджи. Гликозилирование способствует осуществлению пространственной укладки и формированию определенной антигенной структуры у оболочечных гликопротеинов.

Нуклеокапсидный (core, ядерный) белок участвует в важных этапах морфогенеза вируса: формирует вирусный нуклеокапсид, инициирует упаковку РНК ВГС и сборку оболочки вируса [32]. Созревшая форма core-белка имеет различия в участках структуры: гидрофильную N-концевую область и гидрофобный С-концевой участок [33]. Функционально активная форма нуклеокапсидного протеина образована двумя полипептидными цепями, т.е. core-белок является димером, в котором преобладает альфа-спиральная структурная организация. Ядерный белок является одним из наиболее иммуногенных антигенов ВГС.

Белок NS2 относится к неструктурным протеинам ВГС, имеет молекулярную массу около 23 кДа, не содержит углеводных остатков и связан с

17

мембранами ЭПС [34]. Основные биологические функция белка N82 -расщепление пептидной связи между ним и сериновой протеазой N83 ВГС и регуляция сборки вирусных частиц.

Белок N83 обладает двумя важными ферментативными активностями: протеазной и хеликазной/нуклеотидтрифосфатазной [35]. Благодаря протеазной активности неструктурные белки N83, N84 и N85 отщепляются друг от друга. Высококонсервативные остатки His-1083, Лвр-1107 и Ser-П65 расположены в N концевой области №3 и формируют активный центр сериновой протеазы. Хеликазная/нуклеотидтрифосфатазная активность необходима для АТФ-зависимого раскручивания высокоупорядоченных участков и разъединения комплексов РНК. Кроме этих функций белок №3 вместе с полипептидом №4А участвует в блокировке клеточной антивирусной защиты [36].

Антиген №4А состоит из 54 аминокислот, его ^концевой участок гидрофобен и погружен в липидный бислой мембраны эндоплазматической сети, вследствие чего белок N83, содержащий протеазный и хеликазный домены, удерживается около мембраны. Антиген №4А выполняет роль кофактора сериновой протеазы №3 ВГС, активируя эту протеазу путем изменения её конформации в области каталитической триады His-1083, Лвр-1107 и Ser-1165 при формировании общего комплекса, и содержит в себе экспериментально подтвержденные В-клеточные и Т-хелперные (стимулирующие CD4+-Т-клетки) эпитопы. В результате, каталитическая триада активного центра взаимодействует с субстратом и тем самым ускоряет отщепление неструктурных белков N843, №5А и N853 [25]. №4А также участвует в блокировке внутриклеточного антивирусного сигналинга (расщепление клеточного сигнального белка ТИБ), регулировании репликации вируса и гиперфосфорилировании антигена №5А [37]. Протеазный домен №3-№4А в дальнейшей стадии жизненного цикла вируса принимает участие в сборке вириона и его мутации могут привести к дефектам при сборке.

В соответствии с гипотетической моделью молекулярных взаимодействий между N83, №4А и №5А особое значение в обеспечении этих взаимодействий имеет участок 1691-1704, сосредоточенный непосредственно вблизи ядра полипептидного клубка вируса [38]. Участок 1679-1691 №4А непосредственно взаимодействует с N83 в протеазном домене и содержит в себе консервативную область (рис. 4). Следовательно, блокирование соответствующих участков №4А может оказать ингибирующее воздействие на репликационную активность вируса. Один из способов такого блокирования - связывание с антителами, специфичными к участку взаимодействия N84А с протеазным доменом N83. Для продукции таких антител необходимо использовать пептидный иммуноген, содержащий как участок №4А, ответственный за взаимодействие с N83, так и В-и Т-хелперный эпитопы.

N83

щЫЬ о & У/

N5 5 А

Рисунок 4. Гипотетическая модель межмолекулярных взаимодействий между неструктурными антигенами ВГС [38]. Желтым цветом выделен участок NS4A, контактирующий с сериной протеазой NS3. Красным выделены аминокислоты, входящие в ядро сети взаимодействий между неструктурными антигенами ВГС.

Белок №4В (262 а.о.) - трансмембранный белок, имеющий 4 гидрофобных

домена. Этот белок участвует в формировании репликативного комплекса ВГС и

также вовлечен в блокировку антивирусных внутриклеточных механизмов через взаимодействие с клеточным адапторным белком STING.

Белок NS5A представляет собой Zn-содержащий фосфопротеин и является ключевым регулятором сборки репликативного комплекса, а также оказывает влияние на транскрипцию.

Белок NS5B (591 а.о.) относится к классу интегральных мембранных белков и является РНК-зависимой РНК-полимеразой, для которой характерно отсутствие механизма проверки правильности встраивания нуклеинового основания, вследствие чего возможны замены (мутации) в первичной структуре синтезируемой РНК.

1.1.4. Характеристика кандидатных вакцин и основных средств терапии, направленных против ВГС-инфекции

Вирусный гепатит С представляет серьезную проблему для здравоохранения России. В связи с этим важно создать вакцину против этой инфекции. Субъединичная кандидатная вакцина, состоящая из рекомбинантных оболочечных белков ВГС (гетеродимер Е1-Е2) и адъюванта MF59, вызывала гуморальный ответ у шимпанзе и в дальнейшем проходила клинические испытания I фазы. Также исследовали в качестве потенциальной вакцины вирусоподобные частицы, состоящие из нуклеокапсидного и оболочечных белков, продукция которых в организме происходила после внедрения через бакуловирусный вектор. Эти ВПЧ вызывали у мышей образование антител и Т-клеточный ответ (секреция IFN-y), а иммунизация ими шимпанзе привела к CD4+ и CD8+ T-клеточному ответу у всех животных. Ещё одним типом вакцины является векторная, одна из таких в качестве вектора имела аденовирус 6, содержала нуклеотидную последовательность, кодирующую неструктурные белки ВГС, и вызывала высокий уровень клеточного иммунного ответа. Проводились исследования по созданию вакцины на основе синтетических пептидов, содержащих антигенные детерминанты оболочечных белков ВГС [2], однако они были завершены на

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Белявцев Александр Николаевич, 2023 год

Список литературы

1. Schwendener, R.A. Liposome-based vaccines / R.A. Schwendener; B. Ludewig; A. Cerny; O. Engler. - In: Weissig V. Liposomes, Methods and Protocols, V. 1: Pharmaceutical Nanocarriers. - New York, NY, USA, 2010. - P. 163-175.

2. Колесанова Е.Ф. Путь к пептидной вакцине против гепатита C / Е.Ф. Колесанова, Б.Н. Соболев, А.А. Мойса, Е.А. Егорова, А.И. Арчаков // Биомед. химия. - 2015. - Т. 61. №2. - С. 254-264.

3. Dawood R.M. A multiepitope peptide vaccine against HCV stimulates neutralizing humoral and persistent cellular responses in mice / R.M. Dawood, R.I. Moustafa, T.H. Abdelhafez, R. El-Shenawy, Y. El-Abd, N.G. Bader El Din, J. Dubuisson, M.K. El Awady // BMC Infectious Diseases. - 2019. - V. 19. - Art. №932.

4. Pereboeva L.A. Identification of antigenic sites on three hepatitis C virus proteins using phage-displayed peptide libraries / L.A. Pereboeva, A.V. Pereboev, G.E. Morris // J. Med. Virol. - 1998. - V. 56, №2. - P. 105-111.

5. Schild H. Efficiency of peptides and lipopeptides for in vivo priming of virus-specific cytotoxic T cells / H. Schild, K. Deres, K.-H. Wiesmüller, G. Jung, H.-G. Rammensee // European journal of immunology. - 1991. - Т. 21, №11. - С. 26492654.

6. Langhans B. Lipidation of T-helper sequences from hepatitis C virus core significantly enhance T-cell activity in vitro / B. Langhans, I. Braunschweiger, S. Schweitzer, G. Jung, G. Inchauspe, T. Sauerbruch, U. Spengler // Immunology. -

2001. - V. 102, №4. - P. 460-5.

7. Николаева, Л.И. Вирус гепатита С: антигены вируса и реакция на них иммунной системы макроорганизма / Л.И. Николаева. - Новосибирск. «Вектор-Бест», 2009. - 78 с.

8. Gonzalez-Aldaco K. Immunometabolic Effect of Cholesterol in Hepatitis C Infection: Implications in Clinical Management and Antiviral Therapy / K. Gonzalez-Aldaco, L.A. Torres-Reyes, C. Ojeda-Granados, A. Jose-Abrego, N.A. Fierro, S. Roman // Annals of Hepatology. - 2018. - V. 17, №6. - P. 908-919.

9. Dore G.J. Hepatitis C virus elimination: laying the foundation for achieving 2030 targets / G.J. Dore, S. Bajis // Nat Rev Gastroenterol Hepatol. - 2021. - V. 18. - P. 91-92.

10. Мойса А.А. Синтетические пептидные вакцины / А.А. Мойса, Е.Ф. Колесанова // Биомед. химия. - 2011. - Т. 57., №1. - С. 14-30.

11. Andre P. Characterization of low- and very-low-density hepatitis C virus RNA-containing particles / P. Andre, F. Komurian-Pradel, S. Deforges, M. Perret, J. L. Berland, M. Sodoyer, S. Pol, C. Brechot, G. Paranhos-Baccala, V. Lotteau // J Virol. -

2002. - V. 76. - P. 6919-6928.

12. Bartenschlager R. Assembly of infectious hepatitis C virus particles / R. Bartenschlager, F. Penin, V. Lohmann, P. Andre // Trends in Microbiology. - 2011.

- V. 19, №2. - P. 95-103.

13. Zhao W. Expression and self-assembly of HCV structural proteins into virus-like particles and their immunogenicity / W. Zhao, G.Y Liao, Y.J. Jiang, S.D. Jiang // Clin. Med. J. - 2004. - V. 117. - P. 1217-1222.

14. Huang H. Hepatitis C virus production by human hepatocytesdependent on assembly and secretion of verylow-density lipoproteins / H. Huang, F. Sun, D.M. Owen, W. Li, Y. Chen, M. Gale, J. Ye // PNAS. - 2007. - V. 104. - P. 5848-5883.

15. Grassi G. Hepatitis C virus relies on lipoproteins for its life cycle / G. Grassi, G. Di Caprio, G.M. Fimia // World J Gastroenterol. - 2016. - V. 22, №6. - P. 1953-1965.

16. Suzuki T. Morphogenesis of Infectious Hepatitis C Virus Particles // Frontiers in Microbiology. - 2012. - V. 3. - Art. 38.

17. Иванов А.В. Молекулярная биология вируса гепатита С / А.В. Иванов, А. О. Кузякин, С.Н. Кочетков // Успехи биологической химии. - 2005. - Т. 45. - C. 37-86.

18. Chevaliez S. Virology of hepatitis C virus infection / S. Chevaliez, J.M. Pawlotsky // Best Pract Res Clin Gastroenterol. - 2012. - V. 26. - P. 381-389.

19. Li H.C. Hepatitis C virus: Virology, diagnosis and treatment / H.C. Li, S.Y. Lo // World J Hepatol. - 2015. - V. 7. - P. 1377-1389.

20. Tanaka Y A comparison of the molecular clock of hepatitis C virus in the United States and Japan predicts that hepatocellular carcinoma incidence in the United States will increase over the next two decades / Y. Tanaka, K. Hanada, M. Mizokami, A.E.T. Yeo, J. Wai-Kuo Shih, T. Gojobori, H.J. Alter // PNAS USA. -2002. - V. 99. - P. 15584-15589.

21. Dubuisson J. Virology and cell biology of the hepatitis C virus life cycle - An update / J. Dubuisson, F.-L. Cosset // J. of Hepatology. - 2014. - V. 61. - P. 3-13.

22. Madejon A. Effects of delayed freezing of liver biopsies on the detection of hepatitis C virus RNA strands / A. Madejon, M.L. Manzano, C. Arocena, I. Castillo, V. Carreno // J. Hepatol. - 2000. - V. 32. - P. 1019-1025.

23. Chang K.S. The polypyrimidine tract-binding protein (PTB) is required for efficient replication of hepatitis C virus (HCV) RNA / K.S. Chang, G. Luo // Virus Res. - 2006. - V. 115. - P. 1-8.

24. Vassilaki N. Two alternative mechanisms are responsible for the synthesis of the HCV ARFP/F/core+1 protein / N. Vassilaki, P. Mavromara // J. Biol. Chem. - 2003. - V. 278. - P. 40503-40513.

25. Suzuki T. Hepatitis C viral life cycle / T. Suzuki, K. Ishii, H. Aizaki, T. Wakita // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2007. - V. 59. - P. 1200-1212.

26. Lin C. Processing in the hepatitis C virus E2-NS2 region: identification of p7 and two distinct E2-specific products with different C termini / C. Lin, B.D.

Lindenbach, B.M. Pragai // J. Virol. - 1994. - V. 68. - P. 5063-5073.

27. van Eyll O. Non-AUG-Initiated Internal Translation of the L* Protein of Theiler's Virus and Importance of This Protein for Viral Persistence / O. van Eyll, T. Michiels // J. Virol. - 2002. - V. 76. - №21. - P. 10665-10673.

28. Earnest-Silveira L. Characterization of a hepatitis C virus-like particle vaccine produced in a human hepatocyte-derived cell line / L. Earnest-Silveira, B. Chua, R. Chin, D. Christiansen, D. Johnson, S. Herrmann, S.A. Ralph, K. Vercauteren, A. Mesalam, P. Meuleman, S. Das, I. Boo, H. Drummer, C.-T. Bock, E.J. Gowans, D.C. Jackson, J. Torresi // J. of General Virology. - 2016. - V. 97. - P. 1865-1876.

29. Niepmann M. Hepatitis C virus RNA translation // Curr Top Microbiol Immunol. -2013. - V. 369. - P. 143-66.

30. Vieyres G. Characterization of the envelope glycoproteins associated with infectious hepatitis C virus / G. Vieyres, X. Thomas, V. Descamps, G. Duverlie, A.H. Patel, J. Dubuisson // J. Virol. - 2010. - V. 84, №19. - P. 10159-10168.

31. Goffard A. Role of N-linked glycans in the functions of hepatitis C virus envelope glycoproteins / A. Goffard, N. Callens, B. Bartosch, C. Wychowski, F.L. Cosset, C. Montpellier, J. Dubuisson // J. Virol. - 2005. - V. 79. P. 8400-8409.

32. Boulant S. Hepatitis C Virus Core Protein Is a Dimeric Alpha-Helical Protein Exhibiting Membrane Protein Features / S. Boulant, C. Wanbelle, C. Ebel, F. Penin, J.-P. Lavergne // J. Virol. - 2005. - V. 79, №17. - P. 11353-11365.

33. Mousseau G. Dimerization-driven interaction of hepatitis C virus core protein with NS3 helicase / G. Mousseau, S. Kota, V. Takahashi, D.N. Frick, A.D. Strosberg // J. Gen. Virol. - 2011. - V. 92. - P. 101-111.

34. Yamaga A.K. Membrane topology of the hepatitis C virus NS2 protein / A.K. Yamaga, J.H. Ou // J. Biol. Chem. - 2002. - V. 277, №36. - P. 33228-33234.

35. Wölk B. Subcellular Localization, Stability, and trans-Cleavage Competence of the Hepatitis C Virus NS3-NS4A Complex Expressed in Tetracycline-Regulated Cell Lines / B. Wölk, D. Sansonno, H.G. Krausslich, F. Dammacco, C.M. Rice, H.E. Blum, D. Moradpour // J. Virol. - 2000. - V. 74, №5. - P. 2293-2304.

36. Johnson C.L. CARD games between virus and host get a new player / C.L. Johnson, M.Jr. Gale // Trends Immunol. - 2006. - V.27. - P. 1-4.

37. Gu M. Structures of hepatitis C virus nonstructural proteins required for replicase assembly and function / M. Gu, C.M. Rice // Curr. Opin. Virol. - 2013. - V. 3. - P. 129-136.

38. Campo D.S. Coordinated evolution of the hepatitis C virus / D.S. Campo, Z. Dimitrova, R.J. Mitchell, J. Lara, Y Khudyakov // PNAS. - 2008. - V. 105, №28. -P. 9685-9690.

39. Lucey M.R. Long-term management of the successful adult liver transplant: 2012 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases and the American Society of Transplantation / M.R. Lucey, N. Terrault, L. Ojo // Liver Transpl. - 2013. - V. 19, №1. - P. 3-26.

40. Crouchet E. Host-targeting therapies for hepatitis C virus infection: current developments and future applications / E. Crouchet, F. Wrensch, C. Schuster, M.B. Zeisel, T.F. Baumert // Ther. Adv. Gastroenterol. - 2018. - V. 11. - P. 1-15.

41. Wards S. Cellular immune responses against hepatitis C virus: the evidence base 2002 / S. Wards, G. Lauer, R. Isba, B. Walker, P. Klenerman // Clin. Exp. Immunol. - 2002. - V. 128. - P. 195-203.

42. Wedemeyer H. Impaired effector function of hepatitis C virus-specific CD8+ T cells in chronic hepatitis C virus infection / H. Wedemeyer, X.S. He, M. Nascimbeni, A.R. Davis, H.B. Greenberg, J.H. Hoofnagle, T.J. Liang, H. Alter, B. Rehermann // J. Immunol. - 2002. - V. 169. - P. 3447-58.

43. European Association for Study of L. EASL Clinical Practice Guidelines: management of hepatitis C virus infection // Hepatol. - 2014. - V. 60. - P. 392-420.

44. Chen J.Y. HCV and HIV co-infection: mechanisms and management / J.Y. Chen, E.Y. Feeney, R.T. Chung // Nat Rev Hastroenterol.&Hepatology. - 2014. - V. 11, №6. - P. 362-371.

45. Bo wen D. Adaptive immune responses in acute and chronic hepatitis C virus infection / D. Bowen, C. Walker // Nature. - 2005. - V. 436. - P. 946-952.

46. Suppiah V. IL28B is associated with response to chronic hepatitis C interferonalpha and ribavirin therapy / V. Suppiah, M. Moldovan, G. Ahlenstiel, T. Berg, M. Weltman, M.L. Abate, M. Bassendine, U. Spengler, G.J. Dore, E. Powell, S. Riordan, D. Sheridan, A. Smedile, V. Fragomeli, T. Müller, M. Bahlo, G.J. Stewart, D.R. Booth, J. George // Nat. Genet. - 2009. - V. 41. - P. 1100-4.

47. Langhans B. Hepatitis C virus-derived lipopeptide differentially induce epitope-specific immune responses in vitro / B. Langhans, S. Schweitzer, H.D. Nischalke, I. Braunschweiger, T. Sauerbruch, U. Spengler // J. Inf. Dis. - 2004. - V. 189, №2. - P. 248-53.

48. Куприянов В.В. Изучение перспектив использования антигена NS4A ВГС для разработки мозаичной рекомбинантной вакцины с самоадъювантными свойствами / В.В. Куприянов, Л.И. Николаева, А.А. Зыкова, П.И. Махновский // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2017. - Т. 92, №1. - С. 69-74.

49. Куприянов В.В. Иммуногенные свойства рекомбинантных мозаичных белков на основе антигенов NS4A и NS4B вируса гепатита С / В.В. Куприянов, Л.И. Николаева, А.А. Зыкова, П.И. Махновский, Р.Ю. Котляров, А.В. Васильев, Н.В. Равин // Вопросы вирусологии. - 2018. - Т. 63, №3. - С. 138-143.

50. Chen H.-W. A novel technology for the production of a heterologous lipoprotein immunogen in high yield has implications for the field of vaccine design / H.-W. Chen, S.-J. Liu, H.H. Liu, Y. Kwok, C.L. Lin, L.H. Lin, M.Y. Chen, J.P. Tsai, L.S. Chang, F.F. Chiu, W.-C. Lian, C.-Y. Yang, S.-Y Hsieh, P. Chong, C.H. Leng // Vaccine. - 2009. - V. 27. - P. 1400-09.

51. Масалова О.В. Исследование иммуногенности ковалентных конъюгатов неструктурных белков ВГС с иммуномаксом / О.В. Масалова, Е.И. Леонова, А.В. Пичугин, Т.М. Мельникова, М.Г. Беликова-Исагулянц, Т.И. Уланова, А.Н. Бурков, Р.И. Атауллаханов, А.А. Кущ // Иммунология. - 2008. - №6. - С. 338-345.

52. Zeng W. A modular approach to assembly of totally synthetic self-adjuvanting lipopeptide-based vaccines allows conformational epitope building / W. Zeng, K.J. Horrocks, G. Robevska, C.Y. Wong, K. Azzopardi, M. Tauschek, R.M. Robins-Browne, D.C. Jackson // J. Biol. Chem. - 2011. - V. 286. - P. 12944-12951.

53. Samayoa L. Characterization of a branched lipopeptide candidate vaccine agaist influenza A/Puerto Rico 8/34 which is recognized by human B and T-cell immune esponses / L. Samayoa, F.D. Diaz-Mitoma, A. Azizi // Virology J. - 2011. - V. 8. -309.

54. Chiang C.Y Immunogenicity of a novel tetravalent vaccine formulation with four recombinant lipidated dengue envelope protein domain IIIs in mice / C.Y. Chiang, C.H. Pan, M.Y Chen, C.-H. Hsieh, J.-P. Tsai, H.-H. Liu, S.-J. Liu, P. Chong, C.-H. Leng, H.-W. Chen // Sci.Rep. - 2016. - V. 6. - 30648.

55. BenMohamed L. Lipopeptide vaccines—yesterday, today, and tomorrow / L. BenMohamed, S.L. Wechsler, A.B. Nesburn // Infectious Diseases. - 2002. - V. 2. -P. 425-431.

56. Brown L.E. Lipid-based self-adjuvanting vaccines / L.E. Brown, D.C. Jackson // Cur. Drug Deliv. - 2005. - №2. - P. 383-93.

57. Иванов Б.Б. Использование синтетических носителей и адъювантов для повышения иммуногенности синтетического пептида из CS-белка Plasmodium Falciparum / Б.Б. Иванов, Е.А. Мещерякова, Т.М. Андронова, В.Т. Иванов // Биоорган. химия. - 1991. - Т. 17, №6. - С. 732-746.

58. Baz A. Branched and linear lipopeptide vaccines have different effects on primary CD4+ and CD8+ T-cell activation but induce similar tumor-protective memory CD8+ T-cell responses / A. Baz, K. Buttigieg, W. Zeng, M. Rizkalla, D.C. Jackson, P. Groves, A. Kelso // Vaccine. - 2008. - V. 26. - P. 2570-2579.

59. Brumeanu T.D. Immunogenicity of a contiguous T-B synthetic epitope of the A/PR/8/34 influenza virus / T.D. Brumeanu, S. Casares, A. Bot, S. Bot, C.A. Bona // J.Virol. - 1997. - V. 71, №7. - P. 5473-80.

60. Düesberg U. Cell activation by synthetic lipopeptides of the hepatitis C virus (HCV)-core protein is mediated by Toll like receptors (TLRs) 2 and 4 / U. Düesberg, A. von dem Bussche, C.J. Kirschning, K. Miyake, T. Sauerbruch, U. Spengler // Immunol. Lett. - 2002. - V. 84. - P. 89-95.

61. Rawadi G. Mycoplasma membrane lipoproteins induce proinflammatory cytokines by a mechanism distinct from that of lipopolysaccharide / G. Rawadi, S. RomanRoman // Infect. Immun. - 1996. - V. 64. - P. 637-643.

62. Mühlradt P. F. Purification and partial biochemical characterization of a Mycoplasma fermentans-derived substance that activates macrophages to release nitric oxide, tumor necrosis factor, and interleukin-6 / P.F. Mühlradt, M. Frisch // Infect. Immun. - 1994. - V. 62. - P. 3801-3807.

63. Frisch M. Mycoplasma fermentans-derived lipid inhibits class II major histocompatibility complex expression without mediation by interleukin-6, interleukin-10, tumor necrosis factor, transforming growth factor-b, type I interferon, prostaglandins or nitric oxide / M. Frisch, G. Gradehandt, P.F. Mühlradt // Eur. J. Immunol. -1996. - V. 26. - P. 1050-1057.

64. Zackay C. Macrophage-activating lipopeptide-2 exerts protective effects in a murine sepsis model / C. Zackay, T. Tschernig, F. Hildebrand, M. Frink, C.

Frömke, M. Dorsch, C. Krettek, T. Barkhausen // Shock. - 2010. - V. 33, №6. - P. 614-619.

65. Mühlradt P.F. Isolation, Structure Elucidation, and Synthesis of a Macrophage Stimulatory Lipopeptide from Mycoplasma fermentans Acting at Picomolar Concentration / P.F. Mühlradt, M. Kiess, H. Meyer, R. Süssmuth, G. Jung // J. Exp. Med. - 1997. - V. 185, №11. - P. 1951-1958.

66. Himmelreich R. Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumonia / R. Himmelreich, H. Hilbert, H. Plagens, E. Pirkl, B.-C. Li, R. Herrmann // Nucleic Acids Res. - 1996. - V. 24. - P. 4420-4449.

67. Into T. Synthesis and characterization of a dipalmitoylated lipopeptide derived from paralogous lipoproteins of Mycoplasma pneumonia / T. Into, J.-I. Dohkan, M. Inomata, M. Nakashima, K.-I. Shibata, K. Matsushita // Infection and Immunity. -2007. - V. 75. - P. 2253-2259.

68. Wiesmüller K.-H. Synthesis of the mitogenic S-[2,3-bis(palmitoyloxy)propyl]-N-palmitoylpentapeptide from E. coli lipoprotein / K.-H. Wiesmiiller, W. Bessler, G. Jung // Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. - 1983. - V. 364. - P. 593-596.

69. Tsuda Y Structure and synthesis of an immunoactive lipopeptide, WS 1279, of microbial origin / Y. Tsuda, Y. Okada, M. Tanaka, N. Shigematsu, Y. Hori, T. Goto, M. Hashimoto // Chem. Pharm. Bull. - 1991. - V. 39, №3. - P. 607-611.

70. Kurimura M. Synthesis and mitogenic activity of chiral lipopeptide WS1279 and its derivatives / M. Kurimura, A. Ochiai, K. Achiwa // Chem. Pharm. Bull. - 1993. - V. 41, №11. - P. 1965-1970.

71. Raetz C.R.H. Biochemistry of endotoxins // Annu. Rev. Biochem. - 1990. - V. 59. -P. 129-170.

72. Ющук, Н.Д. Антибиотики и противоинфекционный иммунитет / Н.Д. Ющук, И.Л. Балмасова. - М.: Практическая медицина, 2012. - 232 с.

73. Дехнич А.В. Даптомицин / А.В. Дехнич, А.И. Данилов // Клиническая микробиология, антимикробиология и химиотерапия. - 2010. - Т. 12, №4. - C. 295-313.

74. Nazari M. Classifying surfactants with respect to their effect on lipid membrane order / M. Nazari, M. Kurdi, H. Heerklotz // Biophysical J. - 2012. - V. 102. - P. 498-506.

75. Maget-Dana R. Iturins, a special class of pore-forming lipopeptides: biological and physicochemical properties / R. Maget-Dana, F. Peypoux // Toxicology. - 1994. -V. 87. - P. 151-174.

76. Синицина З.Т. Химия полимиксинов и родственных им антибиотиков / З.Т. Синицина, С.М. Мамиофе // Успехи химии. - 1962. - Т. XXXI, №2. - С. 211221.

77. Moyle P.M. Self-adjuvanting lipopeptide vaccines / P.M. Moyle, I. Toth // Curr.Med.Chem. - 2008. - V. 15, №5. - P. 506-16.

78. Буров С.В. Аналоги люлиберина, обладающие цитотоксическим действием на опухолевые клетки in vitro / С.В. Буров, Т.В. Яблокова, М.Ю. Дорош, З.П.

Шкарубская, М. Бланк, Н. Эпштейн, М. Фридкин // Биоорган. химия. - 2006. -Т. 32, №5. - С. 459-466.

79. Буров С.В. Аналоги люлиберина, содержащие последовательность ядерной локализации Т-антигена вируса SV-40 / С.В. Буров, Т.В. Яблокова, М.Ю. Дорош, Е.В. Кривизюк, А.М. Ефремов, С.В. Орлов // Биоорган. химия. - 2010. - Т. 36, №5. - С. 630-637.

80. Wu W. Structure-activity relationships in Toll-like receptor-2 agonistic diacylthioglycerol lipopeptides / W. Wu, R. Li, S.S. Malladi, H.J. Warshakoon, M.R. Kimbrell, M.W. Amolins, R. Ukani, A. Datta, S.A. David // J. Med. Chem. -2010. - V. 53. - P. 3198-3213.

81. Wedemeyer H. Oral immunization with HCV-NS3-transformed salmonella: induction of HCV-specific CTL in a transgenic mouse model / H. Wedemeyer, S. Gagneten, A. Davis, R. Bartenschlager, S. Feinstone, B. Rehermann // Gastroenterology. - 2001. - V. 121. - P. 1158-66.

82. Alexander J. Recognition of a novel naturally processed, A2 restricted, HCV-NS4 epitope triggers IFN-y release in absence of detectable cytopathicity / J. Alexander, M-F. Del Guercio, J.D. Fikes, R.W. Chesnut, F.V. Chisari, K.-M. Chang, E. Appella, A. Sette // Hum. Immunol. - 1998. - V. 59. - P. 776-782.

83. Lex A. A synthetic analogue of Escherichia coli lipoprotein, tripalmitoyl pentapeptide, constitutes a potent immune adjuvant / A. Lex, K.H. Wiesmüller, G. Jung, W.G. Bessler // J. Immunol. - 1986. - V. 137, №8. - P. 2676-2681.

84. Deres K. In vivo priming of virus-specific cytotoxic T-lymphocytes with synthetic lipopeptide vaccine / K. Deres, H. Schild, K.H. Wiesmuller, G. Jung, H.G. Rammensee // Nature. - 1989. - V. 342. - P. 561-564.

85. Nardin E.H. A totally synthetic polyoxime malaria vaccine containing Plasmodium falciparum B-cell and universal T-cell epitopes elicits immune responses in volunteers of diverse HLA types / E.H. Nardin, J.M. Calvo-Calle, G.A. Oliveira, R.S. Nussenzweig, M. Schneider, J.M. Tiercy, L. Loutan, D. Hochstrasser, K. Rose // J Immunol. - 2001. - V. 166, №1. - P. 481-489.

86. Metzger J. Lipopeptides containing 2-(palmitoylamino)-6,7-bis(palmitoyloxy) heptanoic acid: synthesis, stereospecific stimulation of B-lymphocytes and macrophages, and adjuvanticity in vivo and in vitro / J. Metzger, G. Jung, W.G. Bessler, P. Hoffmann, M. Strecker, A. Lieberknecht, U. Schmidt // J Med Chem. -1991. - V. 34. - P. 1969-1974.

87. Mergen F. Synthesis of 1,3-diacylaminopropan-2-ols and corresponding 2-acyl derivatives as amide isosteres of natural lipids / F. Mergen, D.M. Lambert, J.H. Poupaert, A. Bidaine, P. Dumont // Chem. Phys. of Lipids. - 1991. - V. 59. - P. 267272.

88. Zeng W. Structural requirement for the agonist activity of the TLR2 ligand Pam2Cys / W. Zeng, E. Eriksson, B. Chua, L. Grollo, D.C. Jackson // Amino Acids. - 2010. - V. 39. - P. 471-480.

89. Chua B.Y. Hepatitis C VLPs Delivered to Dendritic Cells by a TLR2 Targeting Lipopeptide Results in Enhanced Antibody and Cell-Mediated Responses / B.Y.

Chua, D. Johnson, A. Tan, L. Earnest-Silveira, T. Sekiya, R. Chin, J. Torresi, D.C. Jackson // PLoS ONE. - 2012. - V. 7, №10. - Art. e47492.

90. Chua B.Y Synthesis of Toll-Like Receptor-2 Targeting Lipopeptides as Self-Adjuvanting Vaccines / B.Y Chua, W. Zeng, D.C. Jackson // Methods Mol. Biol. -2008. - V. 494. - P. 247-261.

91. Zaman M. Immunostimulation by Synthetic Lipopeptide-Based Vaccine Candidates: Structure-Activity Relationships / M. Zaman, I. Toth // Front Immunol.

- 2013. - V. 4, №318. - P. 1-9.

92. Zeng W. Highly immunogenic and totally synthetic lipopeptides as self-adjuvanting immunocontraceptive vaccines / W. Zeng, S. Ghosh, Y.F. Lau, L.E. Brown, D.C. Jackson // J. Immunol.- 2002. - V. 169. - P. 4905-4912.

93. Tan A.C.L. Intranasal Administration of the TLR2 Agonist Pam2Cys Provides Rapid Protection against Influenza in Mice / A.C.L. Tan, E.J. Mifsud, W. Zeng, K. Edenborough, J. Mc Vernon, L.E. Brown, D.C. Jackson // Mol. Pharmaceutics. -2012. - V. 9. - P. 2710-2718.

94. Didierlaurent A.M. AS04, an aluminum saltand TLR4 agonist-based adjuvant system, induces a transient localized innate immune response leading to enhanced adaptive immunity / A.M. Didierlaurent, S. Morel, L. Lockman, S.L. Giannini, M. Bisteau, H. Carlsen, A. Kielland, O. Vosters, N. Vanderheyde, F. Schiavetti, D. Larocque, M. Van Mechelen, N. Garçon // J. Immunol. - 2009. - V. 183, №10. - P. 6186-6197.

95. Zeng W. Synthesis of a New Template with a Built-in Adjuvant and Its Use in Constructing Peptide Vaccine Candidates Through Polyoxime Chemistry / W. Zeng, D.C. Jackson, K. Rose // J. of Peptide Science. - 1996. - V. 2. - P. 66-72.

96. Hussein W.M. Double conjugation strategy to incorporate lipid adjuvants into multiantigenic vaccines / W.M. Hussein, T.-Y. Liu, P. Maruthayanar, S. Mukaida, P.M. Moyle, J.W. Wells, I. Toth, M. Skwarczynski // Chem. Sci. - 2016. - V. 7. - P. 2308-2321.

97. Bachmann M.F. Vaccine delivery: a matter of size, geometry, kinetics and molecular patterns / M.F. Bachmann, G. T. Jennings // Immunology. - 2010. - V. 10.

- P. 787-796.

98. Себякин Ю.Л. Синтез алифатических производных L-серина / Ю.Л. Себякин,

H.Л. Федякова, Т.Л. Рунова // Биоорган. химия. - 1994. - Т. 20, №10. - С. 11011106.

99. Себякин Ю.Л. Изучение взаимосвязи структура - свойства в ряду катионных липопептидов / Ю.Л. Себякин, УА. Буданова // Вестник МИТХТ. - 2006. - Т.

I. - с. 44-49.

100. Добрынина А.В. Дизаин и синтез гидрофобных производных RGD-пептидов / А.В. Добрынина, М.А. Цыкунова, Ю.Л. Себякин // Вестник МИТХТ. - 2010.

- Т. 5, №1. - C. 98-103.

101. Roth A. Induction of effective and antigen-specific antitumour immunity by a liposomal ErbB2/HER2 peptide-based vaccination construct / A. Roth, F.

Rohrbach, R. Weth, B. Frisch, F. Schuber, W.S. Wels // Brit. J. Cancer.- 2005. - V. 92. - P. 1421-1429.

102. Boeckler C. Design of highly immunogenic liposomal constructs combining structurally independent B cell and T helper cell peptide epitopes / C. Boeckler, D. Dautel, P. Schelte, B. Frisch, D. Wachsmann, J.-P. Klein, F. Schuber // Eur. J. Immunol. - 1999. - V. 29. - P. 2297-2308.

103. Heurtault B. Design of a Liposomal Candidate Vaccine Against Pseudomonas aeruginosa and its Evaluation in Triggering Systemic and Lung Mucosal Immunity / B. Heurtault, P. Gentine, J.-S. Thomann, C. Baehr, B. Frisch, F. Pons // Pharmaceutical Research. - 2009. - V. 26, №2. - P. 276-285.

104. Richards R.L. Liposomes Containing Lipid A Serve as an Adjuvant for Induction of Antibody and Cytotoxic T-Cell Responses against RTS,S Malaria Antigen / R.L. Richards, M. Rao, N.M. Wassef, G.M. Glenn, S.W. Rothwell, C.R. Alving // Infection and Immunity. - 1998. - V. 66, №6. - P. 2859-2865.

105. Kent S.B.H. Chemical synthesis of peptides and proteins // Ann. Rev. Biochem. -1988. - V. 57. - P. 957-89.

106. Бабаев Е.В. Базовые приемы работы на твердой фазе: от азбуки пептидного синтеза к библиотекам неприродных аминокислот / Е.В. Бабаев, Д.С. Ермолатьев // Рос. Хим. Ж. - 2009. - Т. LIII, №5. - С. 42-56.

107. Bodanszky, M. Peptide synthesis / M. Bodanszky, Y.S. Klausner, M.A. Ondetti. -New York. Wiley, 1976.

108. Hantke K. Diglyceride and amide-linked fatty acid at the N-terminal end of the murein-lipoprotein of the Escherichia coli outer membrane / K. Hantke, V. Braun // Eur. J. Biochem. - 1973. - V. 34. - P. 284-296.

109. Metzger J.W. Synthesis of N-Fmoc protected derivatives of S-(2,3-dihydroxypropyl)cysteine and their application in peptide synthesis / J.W. Metzger, K.-H. Wiesmüller, G. Jung // Int. J. Pep. Protein. Res. - 1991. - V. 38. - P. 545-554.

110. Wilkinson B.L. Synthesis of MUC1-Lipopeptide Chimeras / B.L. Wilkinson, L.R. Malins, C.K.Y Chun, R.J. Payne // Chem. Commun. - 2010. - V. 46. - P. 62496251.

111. Zhou Y. Development of N-Acetylated Dipalmitoyl-S-Glyceryl Cysteine Analogs as Efficient TLR2/TLR6 Agonists / Y Zhou, A.H. Banday, V.J. Hruby, M. Cai // Molecules. - 2019. - V. 24. - Art. 3512.

112. Barton G.M. Toll-like receptor signaling pathways / G.M. Barton, R. Medzhitov // Science. - 2003. - V. 300. - P. 1524-25.

113. Gerlach J.T. Minimal T-Cell-Stimulatory Sequences and Spectrum of HLA Restriction of Immunodominant CD4+ T-Cell Epitopes within HCV NS3 and NS4 Proteins / J.T. Gerlach, A. Ulsenheimer, N.H. Gruner, M.-C. Jung, W. Schraut, C.-A. Schirren, M. Heeg, S. Scholz, K. Witter, R. Zahn, A. Vogler, R. Zachoval, G.R.

Pape, H.M. Diepolder // J. Virol. - 2005. - V. 79, №19. - P. 12425-33.

114. Вольпина О.М. Предсказание структуры пептидов, способных индуцировать образование антител у мышей / О.М. Вольпина, М.А. Титова, М.Н. Жмак,

Д.О. Короев, М.Б. Обозная, Т.Д. Волкова, В.Т. Иванов // Биоорган. химия. -2002. - Т. 28, №5. - С. 387-395.

115. Sarwar M.T. NS4A protein as a marker of HCV history suggests that different HCV genotypes originally evolved from genotype 1b / M.T. Sarwar, H. Kausar, B. Ijaz, W. Ahmad, M. Ansar, A. Sumrin, U.A. Ashfaq, S. Asad, S. Gull, I. Shahid, S. Hassan // Virol. J. - 2011. - V. 8. - Art. 317.

116. Николаева Л.И. Анализ иммунореактивности отдельных В-клеточных эпитопов антигена NS4a вируса гепатита С / Л.И. Николаева, А.Н. Белявцев, Н.Г. Шевченко, М.Д. Стучинская, Е.И. Самохвалов, А.В. Дедова, Г.В. Сапронов, Н.С. Шастина, В.В. Куприянов // Вопросы вирусологии. - 2022. -№3. - С. 237-245.

117. Semmo N. CD4+ T cell responses in hepatitis C virus infection / N. Semmo, P. Klenerman // World J. Gastroenterol. - 2007. - V. 13(36). - P. 4831-4838.

Список публикаций автора по теме диссертации

Статьи:

1) Белявцев А.Н., Шастина Н.С., Куприянов В.В., Николаева Л.И., Мельникова М.В., Колесанова Е.Ф., Шимчишина М.Ю., Капустин И.В. Влияние липидных компонентов на иммуногенность синтетического фрагмента антигена NS4A вируса гепатита С // Биоорган. химия. - 2022. - Т. 48, №4. - С. 453-460. (Scopus)

2) Николаева Л.И., Белявцев А.Н., Шевченко Н.Г., Стучинская М.Д., Самохвалов Е.И., Дедова А.В., Сапронов Г.В., Шастина Н.С., Куприянов В.В. Анализ иммунореактивности отдельных В-клеточных эпитопов антигена NS4a вируса гепатита С // Вопросы вирусологии. - 2022. - №3. - С. 237-245. (Scopus)

3) Белявцев А.Н., Мельникова М.В., Шастина Н.С., Вахренев Р.Г., Шевченко Н.Г., Сапронов Г.В., Колесанова Е.Ф., Николаева Л.И. Синтез и анализ свойств иммуногенного фрагмента полипептида NS4A вируса гепатита С // Биоорган. химия. - 2021. - Т. 47, №3. - C. 341-347. (Scopus)

4) Белявцев А.Н., Николаева Л.И., Шастина Н.С., Куприянов В.В. Иммуногенные липопептиды // Биомедицина. - 2018. - № 4. - С. 88-95. (РИНЦ)

Благодарности

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-33-90037 "Синтез липидмодифицированных пептидных иммуногенов как компонентов вакцины против ВГС" (грант «Аспиранты»).

Автор выражает благодарность научному руководителю Шастиной Н.С. и д.б.н. Николаевой Л.И.,

а также коллегам:

д.б.н. Колесановой Е.Ф., к.б.н. Куприянову В.В., к.б.н. Гараеву Т.М., к.х.н. Журило Н.И., к.х.н. Панову А.В.

н.с. Щелконогову В.А., ст. спец-ту Мельниковой М.В., м.н.с. Вахреневу Р.Г., инж. Вострову И.А., зав. лаб. Табор Е.Я., м.н.с. Махновскому П.И., лаб. Николаеву Д.И., асс. Прохорову И.А., сотр. НИЧ Корбутовой Н.Е. асп. Юшиной А.А., Митиной Е., Соколову И.

студентам Иванову Д.Е., Шимчишиной М.Ю., Стучинской М.Д., Сурикову Н., Макарову Г., Ждановой М., Локтеву Г.

за разнообразное содействие в осуществлении диссертационного исследования.