Применение методов теоретической химии для изучения механизма действия D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi, апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека 1 и выбора среды проведения ферментативной реакции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Халиуллин, Ильяс Галиевич

• Халиуллин, Ильяс Галиевич
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Халиуллин, Ильяс Галиевич

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Пенициллин-связывающие белки. Б-аминопептидаза из ОсЬгоЬас^ит апШгор

1.1.1. Общие сведения.

1.1.2. Механизм действия ферментов семейства пенициллин-связывающих белков по данным литературных источников.

1.1.3. Мутагенетические исследования Э-аминопептидазы.

1.2. Апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 человека.

1.2.1. Общие сведения.

1.2.2. Механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека АРЕ1 по данным литературных источников.

1.3. Оптимизация условий проведения биокаталитических процессов в органических растворителях. Метод С08М0-118.

1.4. Методы теоритичсской химии, наиболее часто применяемые в энзимологии и биотехнологии.

1.4.1. Расстановка атомов водорода в кристаллографических структурах. Расчет состояний ионизации аминокислотных остатков.

1.4.2. Метод моделирования мутантных форм ферментов.

1.4.3. Метод молекулярной динамики.

1.4.4. Метод молекулярного докинга.

2. Постановка задачи.

3. Экспериментальная часть.

3.1. Методы моделирования.

3.1.1. Общее программное обеспечение и средства, использованные при моделировании.

3.1.2. Моделирование структур мутантных форм ферментов.

3.1.3. Моделирование субстратной специфичности и механизма действия Э-аминопептидазы из ОсЬгоЬайгат апШгор!.

3.1.4. Моделирование структуры фермент-субстратного комплекса апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека 1 (АРЕ1).

3.2. Материалы и методы экспериментального исследования.

3.2.1. Изучение рН-профиля активности О-аминопептидазы.

3.2.2. Изучение субстратной специфичности О-аминопептидазы и ее мутантов.

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека АРЕ

4.1.1. Молекулярное моделирование ионизационных состояний остатков активного центра

4.1.2. Связывание субстрата в активном центре фермента.

4.1.3. Каталитическое расщепление фосфодиэфирной связи: атака активированной молекулы воды.

4.1.4. Анализ связывания субстрата и поиск механизмозависимых ингибиторов

4.2. Механизм действия О-аминопептидазы из ОсЬгоЬас1гит ап^гор!.

4.2.1. Анализ структуры О-аминопептидазы. Молекулярное моделирование ионизационных состояний остатков активного центра.

4.2.2. Экспериментальное изучение рН-профиля активности ОАР.

4.2.3. Предлагаемый механизм действия О-аминопептидазы.

4.2.4. Механизмы действия ферментов семейства пенициллин-связывающих белков

4.3. Дизайн субстратной специфичности О-аминопептидазы.

4.3.1. Биоинформатический анализ семейства белков, гомологичных О-аминопептидазе, молекулярное моделирование мутантных форм.

4.3.2. Виртуальный скрининг и обоснование выбора позиций и замен для экспериментального получения.

4.3.3. Экспериментальное исследование субстратной специфичности полученных мутантных форм О-аминопептидазы.

4.4. Разработка метода виртуального скрининга наилучшего растворителя для проведения биокаталитических реакций.

4.4.1. Описание алгоритма.

4.4.2. Валидация разработанного метода виртуального скрининга растворителя

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Применение методов теоретической химии для изучения механизма действия D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi, апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека 1 и выбора среды проведения ферментативной реакции»

Рациональный дизайн ферментов с заданными свойствами, создание новых лекарственных препаратов, оптимизация биотехнологий представляют собой комплексное наукоемкое направление, чрезвычайно актуальное в настоящее время. Целенаправленное изменение каталитических свойств ферментов, дизайн новых ингибиторов ферментов и оптимизация условий проведения ферментативных реакций представляют собой важные и сложные задачи как с точки зрения фундаментальной, гак и прикладной науки. Сегодня очевидно, что решение проблем такого уровня сложности не может быть основано только лишь на чрезвычайно трудоемких эмпирических подходах и требует рационального использования достижений современной теоретической химии. Действительно, методы теоретической химии приобретают все большее значение при проведении исследовательских работ. Постоянно возрастающие производительность и доступность компьютерных систем и программных продуктов позволяют исследователям, прежде не имевшим отношения к моделированию, применять вычислительные методы для решения широкого круга своих задач. Не так давно применение расчетных методов в биохимии, молекулярной биологии и энзимологии было ограничено из-за чрезвычайной сложности и размера биологических систем. В настоящее время разработано множество методов для использования в биотехнологии. Это такие методы, как: классическая и гибридная молекулярная динамика, молекулярный докинг, предсказание трехмерной структуры биополимеров, расчет состояний ионизации аминокислотных остатков и другие.

В настоящей работе была поставлена задача исследовать возможности применения методов теоретической химии в сочетании с экспериментальными данными для решения задач биокатализа и биотехнологии. Необходимо было изучить механизм реакций, катализируемых D-аминопептидазой из Ochrobactrum anthropi (DAP) и апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазой человека 1 (АРЕ1) и использовать эти знания для получения ферментного препарата с измененной субстратной специфичностью, а также поиска новых ингибиторов. Наряду с использованием методов теоретической химии для дизайна каталитических свойств фермента и ингибиторов была предпринята попытка in silico подбора наилучшего растворителя для проведения биокаталитических реакций, протекающих в нетрадиционных (органических) средах.

1. Обзор литературы

1.1. Пенициллин-связывающие белки. D-аминопептидаза из Ochrobactrum anthropi

1.1.1. Общие сведения

Э-аминокислоты служат важным элементом при создании многих продуктов пищевой, агрохимической и фармацевтической промышленности (Рис. 1). Производными О-аминокислот являются, например, бета-лактамные антибиотики ампициллин и амоксициллин, заменитель сахара алитам.

СООН

Amoxicillin (Antibiotics) (D-/»-Hyd roxyph enylglycin e) cooh

Loxiglumide (Bowel disorder) (D-Glutamic acid)

0 COOH

GYKI-14766 (Thrombin inhibitor) (D-Phenyialanine)

C02H0

LK 423 (Anti inflammatory) (D-Glutamic acid)

Nateglinide (Antidiabetic) (D-Phenyialanine) Г f3c

Fluvalinate (Insecticide) (D-Valine) nh2 ,, о

НООС

Alitame(Synthetic sweetner) (D- Alanine)

Рис. 1. Примеры соединений различных отраслей химической промышленности, являющихся производными О-аминокислот.

При разделении рацемических смесей аминокислот и их производных в основном используются процессы специфичные к Ь-формам, как например, стереоселективное ацилирование/деацилирование по аминогруппе. Э-аминокислоты и их производные в таком случае обычно являются побочным продуктом процесса и не вступают в реакцию. В широко используемом процессе синтеза аминокислот по Штрекеру (Рис. 2) на первой стадии из альдегида и цианида получается рацемическая смесь аминонитрилов. На второй стадии смесь подвергается либо полному гидролизу с образованием рацематов аминокислот, либо частичному гидролизу с образованием рацематов амидов аминокислот. Последние представляют интерес в первую очередь как активированные доноры ацильной части в реакциях ферментативного ацильного переноса. Наличие биокатализатора, способного принимать в качестве субстрата стереоселективно Э-форму ацильного донора позволило бы существенно расширить возможности получения производных Э-аминокислот.

Э^ескег ЭуШЬваБ мн

РСНО-

Ас)20

СООН

1ЧН2 А

N4 Ас

Р^СООН

Асу1азе

1\1Н2 1

Р СООН

Н СЫ Н Х01МН2

Рис. 2. Способы получения О-аминокислот: традиционный (вверху) и с использованием

О-стереоспецифичных гидролаз.

В природе Б-аминокислоты содержатся в составе пептидогликановой оболочки, которая образует сетчатую структуру на поверхности плазматической мембраны бактерий. Поперечная сшивка пептидогликана производится ферментами транспептидазами, являющимися стереоспецифичными ЭО-карбоксипептидазами. На ингибировании этих ферментов основан механизм противобактериального действия бета-лактамных антибиотиков, образующих с транспептидазами ковалентные ацилферментные комплексы. Для защиты от бета-лактамных антибиотиков бактерии выработали ферменты бета-лактамазы, являющиеся по-видимому усовершенствованными в процессе эволюции транспептидазами [1]. В семейство так называемых пенициллин-связывающих белков (РВР) помимо Р-лактамаз классов А и С и транспептидаз, участвующих в построении бактериальной клеточной стенки, входит ряд других ферментов, проявляющих активность в отношении производных Б-аминокислот: О-аминопептидазы, щелочные Э-эндопептидазы, другие ОО-карбоксипептидазы.

О-аминопептидаза из ОсИгоЬас1гит аткгор1 является уникальным ферментом по своему строению и свойству катализировать расщепление широкого ряда производных О-аланина с высокой стереоселективностью [2]. Фермент представляет собой сериновую гидролазу и действует в виде гомодимера, отдельные субъединицы которого организованы в трехдоменную структуру [3] и имеют молекулярную массу 122 кДа.

Ы-концевой домен А (остатки 3-331) фермента состоит из двух участков - а/р и а. Участок а/р образован основным Р-листом из 5 антипараллельных тяжей и тремя фланкирующими его а-спиралями. Три дополнительных Р-тяжа лежат перпендикулярно плоскости основного Р-листа. Второй участок каталитического домена образован восемью а спиралями. Такая структура совпадает с классической укладкой сериновых бета-лактамаз [3]. Другие два домена - В (остатки 341-418) и С (остатки 422-510) - имеют структуру антипараллельных Р-бочек, образованных восемью тяжами. Домен В образует пять водородных связей с доменом А посредством петли между Р-тяжами (остатки 408411), а также три водородные связи, гидрофобный контакт и два солевых мостика с доменом С. В свою очередь, домен С образует близкий контакт с а участком каталитического домена. Петля 476-486 домена С (у петля) лежит между спиральным и а/р участками, участвуя в формировании полости связывания субстрата (Рис. 3).

Рис. 3. Структура мономера Э-аминопептидазы по данным работы [3] (РОВ 1е15). Домены А (каталитический), В и С показаны синим, зеленым и оранжевым соответственно. Красным и сиреневым показаны у и О петли доменов С и А.

Непосредственно в реакции в качестве атакующего нуклеофила выступает атом Оу остатка 8ег62 фермента. Аналогично традиционным сериновым протеазам ЫН группа остовной части каталитического 8ег62 образует оксианионный центр фермента (Рис. 4). Вторым остатком, составляющим оксианионный центр, является А1а290.

А1а290 \ г

Рис. 4. Каталитические остатки и связывание амида О-аланина в активном центре

Изначально, Э-аминопептидаза была ошибочно отнесена к цистеиновым гидролазам из-за своей подверженности ингибированию тяжелыми металлами [2], однако, в более поздней работе [4] авторами было отмечено сходство аминокислотных последовательностей Э-аминопептидазы с бактериальными ферментами бета-лактамазой и ОО-карбоксипептидазой. В частности найдены консервативные мотивы ЯХХК, УХЫ, и НХв (см. ниже) и изучено ингибирование фермента производными 6-аминопеницилановой кислоты. На основании полученных данных фермент был отнесен к семейству пенициллин-связьгвающих белков (РВР). Биологическая роль О-аминопептидазы не выяснена. Возможно, фермент принимает участие в метаболизме О-аланина - структурного составляющего пептидогликана.

Как уже было отмечено, О-аминопептидаза из ОсИгоЬаКит аШИгорг катализирует стереоселективное расщепление широкого ряда производных О-аланина [2]. Было также показано, что данный фермент также способен катализировать процесс ацильного переноса на 3-аминопентан с использованием амида или метилового эфира О-аланина в качестве донора ацильной части [5]. Процесс переноса протекает с высокой стереоселективностью, что позволяет использовать ацильный донор в виде рацемата. Тем

О-аминопептидазы. не менее, узкая субстратная специфичность, ограниченная производными небольших по размеру аминокислот (Таблица 1), не позволяет широко применять Э-аминопептидазу в качестве биокатализатора для получения производных Э-аминокислот. Кроме того, фермент, по-видимому, не обладает выраженной специфичностью по отношению к нуклеофилыюй (амидной) части субстрата.

Таблица 1. Субстратная специфичность О-аминопептидазы по отношению к ацилыюй и нуклеофилыюй части субстрата по данным работы [2].

Субстрат Относительная активность(%)

Б-аланин амид 100

Глицин амид 44

Б-серин амид 29

Б-треонин амид 9

О-метионин амид 2

Субстрат Относительная активность(%)

Б-аланин-п-нитроанилид 96 тетрапептид Б-аланина 89 трипептид Э-аланина 92

Б-аланин бензиламид 72

О-аланин н-бутиламид 66

В качестве другого примера возможного применения Б-аминопептидазы, при совместном ее использовании с а-амино-е-капролактам рацемазой, активной в отношении амидов аминокислот [6], была показана возможность получения оптически чистого Б-аланина из Ь-аланинамида [7].

Обобщая, можно сказать, что фермент Э-аминопептидаза из Ос1ггоЬас(гит аШкгорг является хорошей платформой для создания нового биокатализатора, который может быть использован для получения важных производных Б-амипокислот.

Заключение диссертации по теме «Катализ», Халиуллин, Ильяс Галиевич

Основные результаты и выводы

• Предложен согласованный механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека, показано, что общим основанием при катализе является остаток Азр210, а донором протона для уходящей группы - остаток Туг171.

• Установлены основные принципы механизма действия ферментов семейства пенициллин-связывающих белков и показано, что в случае Б-аминопептидазы и амидазы Э-аминокислот из ОскгоЬас1гит ап1кгор1 общим основанием при катализе является остаток Ьуэ65(63) с необычно низким значением рКа.

• При помощи методов теоретической химии предсказаны мутантные варианты 13-аминопептидазы из ОсЬгоЪаМгит ап1кгорг, обладающие расширенной субстратной специфичностью; изменение каталитических свойств мутантных ферментов подтверждено экспериментально.

• На основе метода СОБМО-ЯЗ разработан и реализован алгоритм виртуального скрининга растворителя, позволяющий провести выбор оптимальной среды для проведения биокаталитического превращения и достичь максимального выхода целевого продукта.

Благодарности

Работа была поддержана грантами Министерства образования и науки Российской федерации (в том числе совместный с ЕС проект "И^ЕЫЕ" по рациональному дизайну ферментов в рамках 7-ой Рамочной Программы), а также совместным грантом РФФИ и общества продвижения науки Японии 09-08-92104-ЯФа.

Автор выражает благодарность коллективу лаборатории прикладного вычислительного биокатализа факультета химии и фармации Университета Триеста (Италия) и лично проф. Л. Гардосси, коллективу центра биотехнологических исследований Университета префектуры Тояма (Япония) и лично проф. Я. Асано, а также всем сотрудникам отдела биокинетики Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ.

Заключение

В ходе выполнения данной работы:

1) Проведен расчет ионизационных состояний остатков активного центра апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека 1 и гибридное КМ/ММ моделирование фермент-субстратного комплекса АРЕ1-ДНК, содержащего молекулу воды, способную атаковать субстрат. В результате проведенного исследования показано, что функцию общего основания в каталитическом механизме, по всей видимости, выполняет остаток Азр210, а остаток ГПз309, находясь в протонированной (заряженной) форме, участвует в связывании фосфатной группы субстрата. Анализ молекулярно-динамической траектории фермент-субстратного комплекса показывает его высокую реакционноспособность и свидетельствует об адекватности проведенного молекулярного моделирования.

Выявлены наиболее важные взаимодействия в активном центре, определяющие эффективность связывания субстрата и потенциальных ингибиторов фермента, представляющих интерес в качестве перспективных сопровождающих препаратов в химио- и радиотерапии онкологических заболеваний. Выдвинуто предположение о роли Туг171 активного центра АРЕ1 как остатка, способного отдать протон уходящей группе субстрата. Таким образом, проведенное исследование позволило установить согласованный механизм действия фермента, обобщающий данные молекулярного моделирования, экспериментальные результаты кинетических исследований и другие сведения литературы, с описанием и распределением ролей аминокислотных остатков активного центра в каталитическом механизме. В дальнейшей работе планируется применить гибридные квантово-механические методы более высокого порядка для расчета энергетического барьера реакции, катализируемой эндонуклеазой АРЕ1 в соответствии с предложенным механизмом, и провести поиск эффективных ингибиторов с использованием построенной механистической полноатомной модели фермента.

2) Проведен биоинформатический анализ семейства пенициллин-связывающих белков и определены консервативные аминокислотные остатки. Установлен основной принцип механизма действия ферментов семейства пенициллин-связывающих белков, в том числе О-аминопептидазы из ОскгоЬас1гит апШгор1, который заключается в формировании необычной конфигурации каталитической триады. При помощи молекулярного моделирования показано, что консервативный остаток ЬуБб5 имеет необычно низкое значение рКа, которое подтверждено также экспериментальным исследованием рН-профиля каталитической активности О-аминопептидазы. Полученные данные позволили установить роль остатка Lys65 в механизме действия D-аминопептидазы и родственных ферментов как общего основания, ответственного за передачу протона от каталитического остатка Ser62 к остатку Туг153 и обратно на стадиях образования и расщепления промежуточного ацилфермента.

При помощи методов теоретической химии предсказаны мутантные варианты DAP с расширенной субстратной специфичностью. Мутантные формы фермента получены и протестированы, показана их каталитическая активность по отношению к производным D-лейцина и D-фенилаланина. Выявлен аминокислотный остаток, определяющий высокую стереоселективность действия D-аминопептидазы.

3) Разработан и протестирован основанный на COSMO-RS метод скрининга наилучшего растворителя для биокаталитичсских реакций, протекающих в неводных средах. Показано, что для удовлетворительного выбора наилучшего растворителя достаточно результатов экспериментального исследования равновесия в одних единственных условиях.

Выполнение диссертационной работы позволило получить важный опыт применения методов теоретической химии в сочетании с экспериментальными данными для решения задач биокатализа и биотехнологии. Изучение механизмов действия D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi (DAP) и апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека 1 (АРЕ1) дало возможность использовать эти знания для получения ферментного препарата с измененной субстратной специфичностью, а также поиска новых ингибиторов. Наряду с использованием методов теоретической химии для дизайна каталитических свойств фермента и его ингибиторов был получен ценный опыт in silico подбора наилучшего растворителя для проведения биокаталитических реакций, протекающих в органических средах. В целом выполненная работа показала плодотворность сочетания методов теоретической химии и экспериментального исследования при решении научных и прикладных задач.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Халиуллин, Ильяс Галиевич, 2012 год

1. Lee, W. et al. A 1.2-A snapshot of the final step of bacterial cell wall biosynthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 1427-31 (2001).

2. Asano, Y., Nakazavva, A., Kato, Y. & Kondo, K. Properties of a novel D-stereospecific aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi. The Journal of biological chemistry 264, 14233-9 (1989).

3. Bompard-Gilles, C. et al. Crystal structure of a D-aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi, a new member of the "penicillin-recognizing enzyme" family. Structure 8, 971-80 (2000).

4. Asano, Y., Kato, Y., Yamada, A. & Kondo, K. Structural similarity of D-aminopeptidase to carboxypeptidase DD and .beta.-lactamases. Biochemistry 31, 2316-2328 (1992).

5. Kato, Y., Asano, Y., Nakazawa, A. & Kondo, K. First stereoselective synthesis of D-amino acid N-alkyl amide catalyzed by D-aminopeptidase. Tetrahedron 45, 5743-5754 (1989).

6. Asano, Y. & Yamaguchi, S. Discovery of amino acid amides as new substrates for a-amino-e-caprolactam racemase from Achromobacter obae. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 36, 2229 (2005).

7. Asano, Y. & Yamaguchi, S. Dynamic kinetic resolution of amino acid amide catalyzed by D-aminopeptidase and alpha-amino-epsilon-caprolactam racemase. Journal of the American Chemical Society 127, 7696-7 (2005).

8. Okazaki, S. et al. Crystal structure and functional characterization of a D-stereospecific amino acid amidase from Ochrobactrum anthropi SV3, a new member of the penicillin-recognizing proteins. Journal of molecular biology 368, 79-91 (2007).

9. Okazaki, S., Suzuki, A., Komeda, H., Asano, Y. & Yamane, T. Deduced catalytic mechanism of D-amino acid amidase from Ochrobactrum anthropi SV3. Journal of synchrotron radiation 15, 250-3 (2008).

10. Massova, I. & Kollman, P. pKa, MM, and QM studies of mechanisms of beta-lactamases and penicillin-binding proteins: acylation step. Journal of computational chemistry 23, 1559-76 (2002).

11. Ke, Y.-Y. & Lin, T.-H. A theoretical study on the activation of Ser70 in the acylation mechanism of cephalosporin antibiotics. Biophysical chemistry 114, 103-13 (2005).

12. Chen, Y., McReynolds, A. & Shoichet, В. K. Re-examining the role of Lys67 in class С beta-lactamase catalysis. Protein science: a publication of the Protein Society 18, 662-9 (2009).

13. Komeda, H. & Asano, Y. Gene cloning, nucleotide sequencing, and purification and characterization of the D-stereospecific amino-acid amidase from Ochrobactrum anthropi SV3. European journal of biochemistry / FEBS 267, 2028-35 (2000).

14. Sharma, S. & Bandyopadhyay, P. Investigation of the acylation mechanism of class С beta-lactamase: pKa calculation, molecular dynamics simulation and quantum mechanical calculation. Journal of molecular modeling 18, 481-92 (2012).

15. Delmarcelle, M. et al. Specificity inversion of Ochrobactrum anthropi D-aminopeptidase to a D,D-carboxypeptidase with new penicillin binding activity by directed mutagenesis. Protein science: a publication of the Protein Society 14, 2296-303 (2005).

16. Asano, Y. & Yamaguchi, K. Mutants of d-aminopeptidase with increased thermal stability. Journal of Fermentation and Bioengineering 79, 614-616(1995).

17. Lindahl, Т., Wood, R.D. Quality Control by DNA Repair. Science 286, 1897-1905 (1999).

18. Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature 411, 366-74 (2001).

19. Речкунова Н.И., Красикова Ю.С., Лаврик О.И. // Биохимия. 201 1. Т. 76. С. 32-^15.

20. Abbotts, R. & Madhusudan, S. Human АР endonuclease 1 (APE1): from mechanistic insights to druggable target in cancer. Cancer treatment reviews 36, 425-35 (2010).

21. Liu, Y. & Wilson, S. H. DNA base excision repair: a mechanism of trinucleotide repeat expansion. Trends in biochemical sciences 37, 162-72 (2012).

22. Невинский Г.A. // Биохимия. 2011. Т. 76. С. 115-141.

23. Wilson, D.M. & Simeonov, A. Small molecule inhibitors of DNA repair nuclease activities of APE 1. Cellular and molecular life sciences : С MLS 67, 3621-31 (2010).

24. Дырхеева H.C., Ходырева C.H., Лаврик О.И. // Молекуляр. биология. 2007. Т. 41. С. 450466.

25. Fishel, М. L. & Kelley, М. R. The DNA base excision repair protein Apel/Ref-1 as a therapeutic and chemopreventive target. Molecular aspects of medicine 28, 375-95 (2007).

26. Gorman, M. A. et al. The crystal structure of the human DNA repair endonuclease HAP1 suggests the recognition of extra-helical deoxyribose at DNA abasic sites. The EMBO journal 16, 654858 (1997).

27. Mol, C.D., Izumi, Т., Mitra, S. & Tainer, J.A. DNA-bound structures and mutants reveal abasic DNA binding by APE1 and DNA repair coordination corrected. Nature 403, 451-6 (2000).

28. Mol, C.D., Hosfield, D.J. & Tainer, J.A. Abasic site recognition by two apurinic/apyrimidinic endonuclease families in DNA base excision repair: the 3' ends justify the means. Mutation research 460, 211-29 (2000).

29. Beernink, P.T. et al. Two divalent metal ions in the active site of a new ciystal form of human apurinic/apyrimidinic endonuclease, Apel: implications for the catalytic mechanism. Journal of molecular biology 307, 1023-34 (2001).

30. Lowry, D.F. et al. Investigation of the Role of the Histidine-Aspartate Pair in the Human Exonuclease Ill-like Abasic Endonuclease, APE1. Journal of Molecular Biology 329, 311-322 (2003).

31. Oezguen, N. et al. A "Moving Metal Mechanism" for Substrate Cleavage by the DNA Repair Endonuclease APE-1. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics 68, 313-323 (2007).

32. Lipton, A. et al. Characterization of Mg2+ Binding to the DNA Repair Protein Apurinic/Apyrimidic Endonuclease 1 via Solid-State 25Mg NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society 130, 9332-9341 (2008).

33. Mundle, S.T. et al. Novel role of tyrosine in catalysis by human AP endonuclease 1. DNA repair 3, 1447-55 (2004).

34. Mundle, S.T., Delaney, J.C., Essigmann, J.M., and Strauss, P.R. Enzymatic mechanism of human apurinic/apyrimidinic endonuclease against a THF AP site model substrate. Biochemistry 48, 19-26 (2009).

35. Borjigin, M., Arenaz, P. & Stec, B. Chinese hamster AP endonuclease operates by a two-metal ion assisted catalytic mechanism. FEBS letters 586, 242-7 (2012).

36. Claon, P. A. & Akoh, C. C. Enzymatic synthesis of geraniol and citronellol esters by direct esterification in n-hexane. Biotechnology Letters 15, 1211-1216 (1993).

37. Molinari, F., Villa, R. & Aragozzini, F. Production of geranyl acetate and other acetates by direct esterification catalyzed by mycelium of Rhizopus delemar in organic solvent. Biotechnology Letters 20, 41 —44 (1998).

38. Tewari, Y. B. Thermodynamics of the Lipase-Catalyzed Esterification of 1-Dodecanoic Acid and 1-Dodecanol in Organic Solvents. Journal of Chemical & Engineering Data 43, 750-755 (1998).

39. Hailing, P. J. Solvent selection for biocatalysis in mainly organic systems: predictions of effects on equilibrium position. Biotechnology and bioengineering35, 691-701 (1990).

40. Tewari, Y. B. & Bunk, D. M. Thermodynamics of the lipase-catalyzed esterification of glycerol and n-octanoic acid in organic solvents and in the neat reaction mixture. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 15, 135-145 (2001).

41. Tewari, Y. B., Schantz, m. M. & Vanderah, D. J. Thermodynamics of the Lipase-Catalyzed Esterification of 1-Dodecanoic Acid with (-)-Menthol in Organic Solvents. Journal of Chemical & Engineering Data 44, 641-647 (1999).

42. Tewari, Y. B. Thermodynamics of the lipase-catalyzed transesterification of (-)-menthol and dodecyl dodecanoate in organic solvents. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 9, 83-90 (2000).

43. Valivety, R. H., Johnston, G. A., Sucking, C. J. & Hailing, P. J. Solvent effects on biocatalysis in organic-systems equilibrium position and rates of lipase catalyzed esterification. Biotechnology and bioengineering 38, 1137-1143 (1991).

44. Castillo, E., Torres-gavilán, A., Sandoval, G. & Marty, A. Lipases and Phospholipases. 861, 383400 (Humana Press: Totowa, NJ, 2012).

45. Klamt, A., Jonas, V., Bürger, T. & Lohrenz, J. C. W. Refinement and Parametrization of COSMO-RS. The Journal of Physical Chemistry A 102, 5074-5085 (1998).

46. Klamt, A. Conductor-like Screening Model for Real Solvents: A New Approach to the Quantitative Calculation of Solvation Phenomena. The Journal of Physical Chemistry 99, 2224-2235 (1995).

47. Klamt. A. COSMO and COSMO-RS. In: Schleyer PvR and Allinger L, editors. Encyclopedia of Computational Chemistry. New York: John Wiley & Sons. 604-615 (1998).

48. Fermeglia, M., Braiuca, P., Gardossi, L., Priel, S. & Hailing, P. J. In silico prediction of medium effects on esterification equilibrium using the COSMO-RS method. Biotechnology progress 22, 1146-52 (1995).

49. Grob, S. & Hasse, H. Thermodynamics of Phase and Chemical Equilibrium in a Strongly Nonideal Esterification System. Journal of Chemical & Engineering Data 50, 92-101 (2005).

50. Chen, B., Guo, Z., Tan, T. & Xu, X. Structures of ionic liquids dictate the conversion and selectivity of enzymatic glycerolysis: theoretical characterization by COSMO-RS. Biotechnology and bioengineering 99, 18-29 (2008).

51. Guo, Z., Chen, B., Lopez Murillo, R., Tan, T. & Xu, X. Functional dependency of structures of ionic liquids: do substituents govern the selectivity of enzymatic glycerolysis? Organic & biomolecular chemistry 4, 2772-6 (2006).

52. Peters, M., Greiner, L. & Leonhard, K. Illustrating computational solvent screening: Prediction of standard Gibbs energies of reaction in solution. AIChE Journal 54, 2729-2734 (2008).

53. Peters, M. et al. Systematic Approach to Solvent Selection for Biphasic Systems with a Combination of COSMO-RS and a Dynamic Modeling Tool. Engineering in Life Sciences 8, 546-552 (2008).

54. Spieß, A. C. et al. Prediction of partition coefficients using COSMO-RS: Solvent screening for maximum conversion in biocatalytic two-phase reaction systems. Chemical Engineering and Processing: Process Intensification 47, 1034-1041 (2008).

55. Klamt, A. "COSMO-RS: From Quantum Chemistry to Fluid Phase Thermodynamics and Drug Design", Elsevier Science Ltd., Amsterdam, The Netherlands (2005).

56. Davies, M. N., Toseland, C. P., Moss, D. S. & Flower, D. R. Benchmarking pKa prediction. BMC biochemistry 7, 18 (2006).

57. Li, H., Robertson, A. D. & Jensen, J. H. Very fast empirical prediction and rationalization of protein pKa values. Proteins 61, 704-21 (2005).

58. Bas, D. C., Rogers, D. M. & Jensen, J. H. Very fast prediction and rationalization of pKa values for protein-ligand complexes. Proteins 73, 765-83 (2008).

59. Dunbrack, R. L. & Karplus, M. Backbone-dependent rotamer library for proteins. Application to side-chain prediction. Journal of molecular biology 230, 543-74 (1993).

60. URL: http://www.salilab.org/modeller/aboutmodeller.html

61. Hockney, R.W., Goel, S.P., and Eastwood, J. Quiet high resolution computer models of a plasma. J. Comp. Phys., 14, 148-158 (1974).

62. Izrailev, S., Stepaniants, S., Balsera, M., Oono, Y., and Schulten, K. Molecular dynamics study of unbinding of the Avidin-Biotin complex. Biophysical J., 72, 1568-1581 (1997).

63. Isralewitz, B., Gao, M., and Shulten, K. Steered molecular dynamics and mechanical functions of proteins. Curr. Opin. Struct. Biol., 11, 224-230 (2001).

64. Crespo, A., Marti, M.A., Estrin, D.A., and Roitberg, A.E. Multiple-steering QM-MM calculation of the free energy profde in chorismate mutase. J. Am. Chem. Soc., 127, 6940-6941 (2005).

65. Jensen, M.O., Park, S., Tajkhorshi, E., and Schulten, K. Energetics of glycerol conduction through aquaglyceroporin GlpF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 673 1-6736 (2002).

66. Jarzynsky, C. Non-equilibrium equality for free energy differences. Phys. Rev. Lett., 78, 26902693 (1997).

67. Berendsen, H.J.C., van der Spoel, D., and van Drunen, R. GROMACS: A message-passing parallel molecular dynamics implementation. Com. Phys. Comm., 91, 43-56 (1995).

68. Walker, R.C., Crowley, M.F., and Case, D.A. The implementation of a fast and efficient hybrid QM/MM potential method within the Amber 9.0 sander module. ./. Computat. Chem., 29, 1019-1031 (2008).

69. Solis, F.J. and Wets, R.J.-B. Minimization by random search techniques. Math. Operations Res., 6, 19-30 (1981).

70. Morris, G. M„ Goodsell, D. S., Halliday, R.S., Huey, R„ Hart, W. E„ Belew, R. K. and Olson, A. J. Automated docking using a lamarckian genetic algorithm and empirical binding free energy function. J. Comput. Chem., 19, 1639-1662 (1998).

71. URL: http://autodock.scripps.edu/

72. Ahlrichs, R., Baer, M., Haeser, M., Horn, H., and Koelmel, C. Electronic Structure Calculations on Workstation Computers: The Program System TURBOMOLE. Chem. Phys. Lett., 162(3), 165-169, (1989).

73. Klamt, A. & Schiiiirmann, G. COSMO: a new approach to dielectric screening in solvents with explicit expressions for the screening energy and its gradient. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2 230, 799-805 (1993).

74. Altschul, S. F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic acids research 25, 3389-402 (1997).

75. Notredame, C., Higgins, D. G. & Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of molecular biology 302, 205-17 (2000).

76. Katoh, K., Asimenos, G. & Toh, H. Multiple alignment of DNA sequences with MAFFT. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 537, 39-64 (2009).

77. Do, C. B., Mahabhashyam, M. S. P., Brudno, M. & Batzoglou, S. ProbCons: Probabilistic consistency-based multiple sequence alignment. Genome research 15. 330-40 (2005).

78. Krissinel, E. & Henrick, K. Secondary-structure matching (SSM), a new tool for fast protein structure alignment in three dimensions. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 60, 2256-68 (2004).

79. Konagurthu, A. S„ Whisstock, J. C„ Stuckey, P. J. & Lesk, A. M. MUSTANG: a multiple structural alignment algorithm. Proteins 64, 559-74 (2006).

80. Waterhouse, A. M., Procter, J. B., Martin, D. M. A., Clamp, M. & Barton, G. J. Jalview Version 2 -a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics 25, 1189-91 (2009).

81. The PyMOL Molecular Graphics System, Version l.Orl, Schrodinger, LLC. URL: http://www.pymol.org/

82. ACD/ChemSketch Freeware, version 8.17. Advanced Chemistry Development, Inc., Toronto, ON, Canada. URL: http://www.acdlabs.com

83. Case D.A. et al. AMBER 10. University of California. San Francisco (2008).

84. Walker, R. C., Crowley, M. F. & Case, D. A. The implementation of a fast and accurate QM/MM potential method in Amber. Journal of computational chemistry 29, 1019-31 (2008).

85. Humphrey, W., Dalke, A. & Schulten, K. VMD: visual molecular dynamics. Journal of molecular graphics 14, 33-8, 27-8 (1996).

86. Hornak, V. et al. Comparison of multiple Amber force fields and development of improved protein backbone parameters. Proteins 65, 712-25 (2006).

87. Chen, J., Dupradeau, F.-Y., Case, D. A., Turner, C. J. & Stubbe, J. Nuclear magnetic resonance structural studies and molecular modeling of duplex DNA containing normal and 4'-oxidized abasic sites. Biochemistry 46, 3096-107 (2007).

88. Rocha, G. B., Freire, R. O., Simas, A. M. & Stewart, J. J. P. RM1: a reparameterization of AMI for H, C, N, O, P, S, F, CI, Br, and I. Journal of computational chemistry 27, 1101-11 (2006).

89. SciDAVis: a free application for Scientific Data Analysis and Visualization. URL: http://scidavis.sourceforge.net/

90. Pace, C.N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G. & Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein science: a publication of the Protein Society 4, 2411-23 (1995).

91. Simeonov, A. et al. Identification and characterization of inhibitors of human apurinic/apyrimidinic endonuclease APE1. PloS one 4, e5740 (2009).