Лабораторная оценка минимальной остаточной болезни как критерий эффективности терапии хронического лимфолейкоза с использованием стандартного иммунохимиотерапевтического режима тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.10, кандидат наук Миролюбова Юлия Владимировна

• Миролюбова Юлия Владимировна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Миролюбова Юлия Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Актуальность определения МОБ при ХЛЛ

1.2 Развитие лабораторных методов определения МОБ при ХЛЛ

1.2.1. Проточная цитометрия

1.2.2. СD160 и ROR1-новые маркеры для детекции МОБ при ХЛЛ

1.2.3. Молекулярные методы выявления МОБ на основе ПЦР-реакции

1.2.4. Материал для определения МОБ при ХЛЛ

1.3. Значение МОБ при ХЛЛ, как прогностического фактора

1.3.1 МОБ как прогностический фактор для стандартных схем иммунохимиотерапии

1.3.2 Прогностическая значимость МОБ-статуса по сравнению с клиническим ответом

1.3.3. МОБ-статус как конечная точка в клинических исследованиях

1.3.4. Влияние прогностических факторов, определяемых до начала терапии на беспрогрессивную и общую выживаемость у МОБ-положительных и МОБ-отрицательных пациентов

1.3.5. Влияние прогностических факторов, определяемых до начала терапии на достижение МОБ-негативности

1.4. Определение МОБ при хроническом лимфолейкозе в клинической практике

1.4.1 Достижение МОБ-негативности как точка окончания терапии

1.4.2. Значение определения МОБ в новых схемах терапии

1.4.3. Значение достижения элиминации МОБ при аллогенной трансплантации стволовых клеток

1.4.4 Определение МОБ как средство индивидуализации терапии при хроническом лимфолейкозе

ГЛАВА2 ОБЪЕКТ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Общая характеристика больных

2.2 Критерии диагностики и оценка ответа на терапию

2.3 Схема терапии

2.4 Лабораторные методы

2.5 Статистическая обработка

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Результаты определения МОБ в анализируемой группе

3.1.1 Результаты по определению МОБ после 3 курса терапии (МОБ3)

3.1.2 Влияние демографических, цитогенетических и молекулярно-биологических факторов на достижение МОБ негативности после 3 курса терапии

3.1.3 Результаты по определению влияния МОБ после 3 курса терапии на беспрогрессивную и общую выживаемость

3.1.4 Результаты по определению МОБ после 6 курса терапии

3.1.5 Влияние демографических, цитогенетических и молекулярно-

биологических факторов на достижение МОБ-негативности после 6 курса терапии

3.1.6. Результаты по определению влияния МОБ после 6 курса терапии на

беспрогрессивную и общую выживаемость

3.2 Результаты анализа влияния главных прогностических факторов на

выживаемость МОБ-отрицательных и МОБ-положительных больных

3.2.1 МОБ и мутационный статус ЮУН-генов

3.2.2. МОБ и цитогенетические данные

3.2.3 МОБ и другие факторы

3.2.4 Результаты оценки значимости МОБ в мультифакторном анализе

беспрогрессивной и общей выживаемости

3.3 Результаты оценки применения сочетания маркеров СD160 и R0R1 для

выявления МОБ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Лабораторная оценка минимальной остаточной болезни как критерий эффективности терапии хронического лимфолейкоза с использованием стандартного иммунохимиотерапевтического режима»

Актуальность темы исследования

Минимальная остаточная болезнь (МОБ) является объективной мерой статуса заболевания, определяемой как количество лейкозных клеток, сохраняющихся в костном мозге и периферической крови после проведенного лечения [32,42]. В клинической лабораторной диагностике детекция МОБ при онкогематологических заболеваниях развивалась в связи с потребностями в объективном контроле терапии и течения заболевания.

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) является наиболее распространенным лейкозом, особенно часто встречающимся у пожилых людей. Среди больных отмечается значительная разнородность по общей выживаемости, сохранению трудоспособности и качеству жизни. Общая выживаемость пациентов колеблется от 2 до 20 лет [6, 89]. За последние 20 лет были предложены новые подходы к терапии заболевания, в том числе, таргетная и химио-иммунотерапия, приводящие к исчезновению клинических симптомов у значительной части больных, в том числе и развитию долгосрочных ремиссий [11, 21, 30, 31, 41, 47]. Наиболее значимые успехи в терапии ХЛЛ были связаны с применением схемы FCR (флударабин, циклофосфан, ритуксимаб) [31, 41, 47, 48, 82], где флударабин и циклофосфан являются химиотерапевтическими препаратами, а ритуксимаб -моноклональным антителом. Но не все больные по своему общетерапевтическому статусу, особенно учитывая, что ХЛЛ является болезнью преимущественно пожилого возраста, могут перенести эту, достаточно интенсивную, химиотерапию. Поэтому разрабатывались и другие подходы, в частности, режим бендамустин+ритуксимаб (BR), которая характеризуется меньшей токсичностью [13,30,38]. В последние годы предложен ряд других эффективных подходов -ингибиторы В-клеточного рецептора, анти-Ьс1-2 препараты в виде монотерапии и комбинаций, в том числе с моноклональными антителами [21-23, 42, 43, 45, 58-61, 75, 77, 78, 89]. В условиях, когда с появлением новых лекарственных средств появляется возможность терапевтического выбора, особенно важна адекватная, и

возможно более ранняя оценка ответа на терапию, в первую очередь для этой цели используются клинические лабораторные методы. Морфологическая оценка ответа является недостаточно чувствительной и часто невозможной, поскольку абсолютный лимфоцитоз, как правило, исчезает к моменту окончания курса терапии, кроме того, лимфоциты при ХЛЛ не имеют заметных морфологических особенностей. Значительно возрастает роль лабораторного определения минимальной остаточной болезни. МОБ-негативность при ХЛЛ определяется как состояние при количественном обнаружении менее 1 лейкозной клетки на 10 тыс. лейкоцитов (0,01%) [32,42]. Как продемонстрировано рядом исследований, достижение МОБ-негативного статуса по окончании терапии, ассоциируется с продолжительной выживаемостью [4, 7, 8, 48-51, 56, 71, 73, 79, 81, 86].

За последние годы предложено несколько лабораторных методов оценки МОБ при ХЛЛ. Наиболее чувствительными являются молекулярные методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использование набора аллель-специфических ПЦР-праймеров, а также методы высокопроизводительного секвенирования нового поколения. Однако эти методы отличается значительной трудоемкостью и высокой стоимостью [14, 16, 17, 34, 55, 64, 70, 72, 81, 88]. Сравнимым по чувствительности является более доступный метод многоцветной проточной цитофлюориметрии, активно используемый в лабораторной практике [4, 8, 9, 20, 26, 66-72, 76, 87]. Проведено несколько мультицентровых исследований с целью стандартизации как первичной диагностики, так и последующего мониторинга МОБ методом проточной цитофлюориметрии. На их основе был принят стандарт диагностики, с использованием маркеров CD45, CD19, CD5, CD20, CD23, CD79b, CD22, CD200, CD43 и мониторинга МОБ, с использованием маркеров CD19, CD5, CD45, CD3, CD14, CD20, CD38, CD79b, CD22, CD43, CD81 в панели для четырехцветных проточных цитофлюориметров [68]. Вместе с тем проводятся исследования, с целью как повышения чувствительности и специфичности метода, так и к упрощению и удешевлению лабораторной процедуры, путем использования минимального набора наиболее специфичных антител. В частности, была предложена комбинация CD160 и ROR1

для выявления МОБ [24, 35, 36, 62, 70, 72, 76]. Таким образом, с развитием технологий, в том числе внедрения 6-10 цветных проточных цитометров, метод продолжает совершенствоваться.

С точки зрения клинического подхода важно понять имеет ли количественный уровень МОБ прогностическое значение и использоваться для модификации тактики терапии. В настоящее время не выработаны критерии и алгоритмы терапевтического решения в зависимости от количественных данных измерения МОБ при ХЛЛ. Несмотря на то, что доказана связь МОБ-негативности и продолжительности ремиссии ХЛЛ, нет однозначного понимания является ли элиминация МОБ целью проводимой терапии. Таким образом, современные исследования нацелены на определение значения лабораторной оценки МОБ при хроническом лимфолейкозе для клинической практики и выработки рекомендаций по ее использованию.

Степень разработанности темы

В настоящее время ряд международных и российских исследований доказал значимость достижения недетектируемой МОБ для беспрогрессивной выживаемости (БПВ) и общей выживаемости (ОВ) больных ХЛЛ [4, 7, 8, 48-51, 56, 72, 73, 79, 80, 86]. В большинстве работ анализировались данные пациентов, получивших иммуннохимиотерапию по схеме FCR в рамках клинических испытаний, так и в проспективных и ретроспективных наблюдениях. Данных о достижении МОБ-негативности и на схеме BR и ее прогностической значимости существенно меньше. [23, 30, 38]. Отсутствуют данные о количественных характеристиках МОБ в определенные точки терапии BR, и их прогностическом значении.

В литературе встречаются противоречивые данные о том, какие пациенты чаще достигают МОБ-негативности при ХЛЛ. В различных исследованиях были идентифицированы различные возможные положительные прогностические факторы, включая отсутствие del(17p), мутированный статус генов вариабельного

участка иммуноглобулинов (ЮНУ), трисомию 12, женский пол, отсутствие мутации NOTCH1, возраст <70 лет и отсутствие del(11q) [18, 73, 74, 82].

Несмотря на то, что достижение недетектируемой МОБ является положительным фактором прогноза, показано что показатели выживаемости МОБ-негативных пациентов могут существенно варьировать, таким образом эта группа является разнородной. Идет постоянный сбор информации о влиянии факторов биологии ХЛЛ, в том числе цитогенетических особенностей, мутационного статуса ЮУН-генов на БПВ и ОВ больных, достигших недетектируемой МОБ на различных схемах терапии.

Лабораторное определение МОБ при ХЛЛ, в настоящее время рекомендовано для клинических исследований в качестве суррогатной конечной точки для сравнения и оценки результатов применения различных терапевтических схем, ставящих перед собой задачу увеличить БПВ и ОВ. [32, 34, 42, 50, 57]. Показания для определения уровня МОБ при ХЛЛ в клинической практике является предметом для дискуссий. Имеются отдельные данные и предположения о том, что достижение или недостижение МОБ-негативности могло бы послужить критерием для модификации терапии. Ряд современных клинических исследований используют МОБ как критерий для назначения поддерживающей терапии или ее отмены.

Что касается технических вопросов определения МОБ, в настоящее время существует консенсус применять для определения МОБ при ХЛЛ два равноправных метода - многоцветной проточной цитофлюорометрии и пациент-специфической количественной ПЦР [32, 33, 42, 57]. С развитием технических возможностей проточной цитометрии, метод совершенствуется за счет перехода от 4-х цветных панелей к 8-10-цветные панелям, что дает возможность оценить все необходимые маркеры в одной пробирке [70]. Это повышает чувствительность и экономичность метода. Однако, в настоящее время не выработан единый стандартизованный протокол детекции МОБ при ХЛЛ для 8-10-цветных проточных цитометров. Выбор оптимальных маркеров для протокола определения МОБ при ХЛЛ остается предметом современных исследований.

Цель исследования

Определить роль лабораторной оценки минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии как критерия эффективности иммунохимиотерапевтического лечения хронического лимфолейкоза с использованием режима бендамустин+ритуксимаб в первой линии терапии в группе пациентов без жестких критериев отбора.

Задачи исследования

1. Оценить частоту достижения МОБ-негативности после завершения терапии по схеме бендамустин+ритуксимаб, и ее влияние на показатели беспрогрессивной и общей выживаемости больных хроническим лимфолейкозом.

2. Оценить значение количественной и качественной оценки минимальной остаточной болезни, определенного методом проточной цитометрии после третьего (промежуточного) курса терапии по схеме бендамустин+ритуксимаб как критерия прогноза беспрогрессивной и общей выживаемости больных хроническим лимфолейкозом, а также достижения МОБ-негативности по окончании терапии.

3. Оценить зависимость беспрогрессивной и общей выживаемости МОБ-отрицательных больных хроническим лимфолейкозом, получивших терапию по схеме бендамустин+ритуксимаб, от мутационного статуса ЮНУ-генов.

4. Определить диагностическое значение ROR1 и СD160 как маркеров для выявления минимальной остаточной болезни при хроническом лимфолейкозе методом проточной цитометрии в сравнении со стандартизованной диагностической панелью.

Научная новизна

Проведена оценка частоты достижения МОБ-негативности методом проточной цитометрии, и ее влияние на беспрогрессивную и общую выживаемость у больных хроническим лимфолейкозом, получивших терапию по

схеме бендамустин+ритуксимаб в первой линии у пациентов без жестких критериев отбора.

Впервые доказана значимость клинической лабораторной оценки количественного уровня МОБ после третьего (промежуточного) курса терапии методом проточной цитометрии, как раннего критерия прогноза ответа на терапию по схеме бендамустин+ритуксимаб.

Показано сочетанное влияние МОБ-статуса и мутационного статуса ЮНУ-генов на прогноз терапии хронического лимфолейкоза по схеме бендамустин+ритуксимаб.

Впервые проведена оценка эффективности использования панели с применением моноклональных антител к СD160 и ROR1 для детекции МОБ при хроническом лимфолейкозе, в сравнении со стандартизованной панелью.

Теоретическая и практическая значимость исследования

В результате исследования раскрыто влияние количественного уровня минимальной остаточной болезни, как после окончания терапии, так и на промежуточном этапе лечения, на прогноз хронического лимфолейкоза. Доказана важность скорости элиминации минимальной остаточной болезни, что отражает глубину и, следовательно, долгосрочность ответа. Показано как определение минимальной остаточной болезни используется в качестве лабораторного контроля течения хронического лимфолейкоза. Показано, что мутационный статус ЮНУ- генов, как один из главных прогностических факторов течения хронического лимфолейкоза, сохраняет свое влияние на выживаемость МОБ-отрицательных больных и, таким образом доказана важность определения обоих параметров для определения прогноза и тактики ведения. Определены количественные параметры уровня МОБ, которые могут использоваться в качестве критерия оценки эффективности, и модификации терапии. Доказаны высокие дискриминантные свойства рецептора ROR1 для использования его при детекции МОБ при ХЛЛ методом проточной цитометрии.

Методология и методы исследования

Методология работы включает в себя теоретические, лабораторные и статистические методы. К теоретическим методам относится анализ и синтез, Лабораторные методы: многоцветная проточная цитометрия, гематологические, молекулярно-биологические и цитогенетические методы исследования. Статистический анализ проводился с помощью компьютерной программы STATISTICA 10 (анализ кривых выживаемости, построение ROC-кривых, сравнение групп по параметрическим и непараметрическим критериям, многофакторный анализ, дискриминантный анализ).

Положения, выносимые на защиту

1. Количественная оценка минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии при хроническом лимфолейкозе после третьего курса стандартной иммунохимиотерапии по схеме бендамустин+ритуксимаб является критерием ее эффективности, как предиктор достижения МОБ-негативности по окончании полного курса терапии и продолжительности ремиссии заболевания.

2. Беспрогрессивная выживаемость МОБ-отрицательных больных хроническим лимфолейкозом по окончании иммунохимиотерапии по схеме бендамустин+ритуксимаб зависит от мутационного статуса ЮНУ-генов. Пациенты с мутированным статусом ЮНУ-генов и неопределяемой МОБ представляют собой группу наиболее благоприятного прогноза.

3. Включение маркера RОR1 в диагностическую панель проточной цитометрии для определения минимальной остаточной болезни при хроническом лимфолейкозе повышает свойства дискриминации ХЛЛ-клеток от нормальных лимфоцитов.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность работы подтверждена числом обследованных пациентов с ХЛЛ, у которых данные по МОБ получены у 149 человек, а также использованием современных методов статистической обработки данных. Материалы, основные

положения и выводы диссертации были представлены в виде постерных докладов. «Минимальная остаточная болезнь и мутационный статус как основные предикторы ответа на ХЛЛ» - на XIV Российской конференции с международным участием «Злокачественные лимфомы» (2017 г.). На IV конгрессе гематологов России (2018 г.) был представлен постерный доклад «Минимальная остаточная болезнь при ХЛЛ - ранний ответ как предиктор хорошего прогноза в первой линии терапии». На XV Российской конференции с международным участием «Злокачественные лимфомы» (2018 г.) был представлен постер «ROR1 для детекции МОБ-ХЛЛ методом проточной цитометрии». Результаты работы были доложены на Российском Рабочем Совещании гематологов «Значение Минимальной Остаточной болезни (МОБ) в оптимизации терапии при рефрактерном, рецидивном ХЛЛ: от исследований к рутинной практике» в 2018 г., а также на 10 Евроазиатском гематолого-онкологическом конгрессе в Стамбуле в 2019 г.

Внедрение результатов исследования

Практические рекомендации на основе выводов диссертации используются в клинической практике отделения химиотерапии онкогематологических заболеваний и трансплантации костного мозга. Главные положения диссертации используются в учебном процессе на кафедре факультетской терапии с курсом эндокринологии, кардиологии и функциональной диагностики имени Г.Ф. Ланга с клиникой ФГБОУ «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 6 в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертации.

Личное участие автора

Автор непосредственно принимал участие в выполнении лабораторных исследований по диагностике ХЛЛ и выявлении МОБ ХЛЛ методом проточной цитометрии, а также в обработке клинических данных и интерпретации результатов исследования.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 114 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, характеристику материалов и методов проведенных исследований, собственные результаты исследования, заключение, выводы, практические рекомендации и библиографический список из 91 отечественных и зарубежных источников. Диссертация содержит 45 рисунков и 20 таблиц.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Актуальность определения МОБ при ХЛЛ.

ХЛЛ, согласно критериям ВОЗ, определяется как неоплазия из зрелых мономорфных В-лимфоцитов, с характерной коэкспрессией СD19, CD5 и СD23, при которой количество клональных В-лимфоцитов в периферической крови составляет более 5*109 /л [90]. Это самый распространенный у взрослых, особенно у пациентов старшего возраста, лейкоз, отличающийся неоднородным течением от индолентного до прогрессирующего [6, 42, 57].

Морфология и иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга являются главными критериями диагностики заболевания [6, 42, 57, 90].

Подходы к терапии ХЛЛ претерпели за последние годы существенную эволюцию. Изначально терапия (хлорбутин, преднизолон, циклофосфан) не ставила задачи излечения заболевания, а была направлена на купирование симптомов, преимущественно сдерживая рост лейкоцитоза и лимфоузлов. Общая продолжительность жизни при этом не увеличивалась [68]. Появление новых химиопрепаратов (флударабин, бендамустин) расширило терапевтические возможности, особенно с внедрением в практику комбинации химиотерапевтических препаратов с терапевтическими моноклональными антителами. Это позволило достигать полных клинико-гематологических ремиссий, что привело к увеличению продолжительности жизни [41, 47, 67]. Успехи терапии привели к тому, что с помощью микроскопических методов исследования крови и костного мозга нельзя было адекватно оценить глубину ремиссии, и потребовались более чувствительные лабораторные тесты для оценки минимальной остаточной болезни (МОБ) [20, 34, 64, 66, 87]. Появились данные, что достижение эрадикации МОБ коррелирует с увеличением общей и беспрогрессивной выживаемости пациентов [51, 55, 56, 67].

Эти факты обусловили интенсивное развитие лабораторных методик определения МОБ при ХЛЛ.

1.2. Развитие лабораторных методов определения МОБ при ХЛЛ

1.2.1. Проточная цитометрия

Поскольку типичным иммунофенотипом при ХЛЛ является аберрантная коэкспрессия СD19/CD5, не характерная для большинства нормальных В-лимфоцитов, определение МОБ при ХЛЛ началось с выявления клеток с экспрессией СD19/CD5 и моноклональности по легким цепям иммуноглобулинов каппа/лямбда [20, 66, 87]. Этот способ прост и позволяет проводить количественную оценку опухолевой популяции. Однако, по мере развития успехов терапии, выяснилось, что при углублении ответа метод показывает низкую специфичность, ввиду наличия в норме немногочисленной субпопуляции В-лимфоцитов с коэкспрессией CD19/CD5 (около 1% в периферической крови), что приводило к ложноположительным результатам [29, 52, 63, 91]. На практике определение моноклональности по легким цепям иммуноглобулинов на очень малых популяциях клеток, часто вызывает затруднения, учитывая слабую экспрессию иммуноглобулина на ХЛЛ -клетках [20, 51, 68]. Лимит детекции (то есть способность к выявлению остаточной опухолевой популяции) по протоколу Каппа/Лямбда/CD19/CD5 составила около 1% (1 клетка ХЛЛ среди 100 нормальных). Несмотря на недостаточную специфичность, метод может использоваться для скрининговой оценки опухолевой популяции, но не для детекции минимальной остаточной болезни [69].

В 2007 году появились предложенные A.Rawstron et а1. [68] разработки стандартизации определения МОБ для 4-х цветного проточного цитометра. Для надежного разделения опухолевых клеток ХЛЛ и нормальных В-лимфоцитов в крови и костном мозге было исследовано 50 возможных комбинаций моноклональных антител для детекции МОБ при ХЛЛ. В исследование были включены антитела к маркерам, которые потенциально экспрессируются по-разному на клетках ХЛЛ и нормальных лимфоцитах, как показывал накопленный опыт иммунофенотипирования ХЛЛ. В целях контроля качества ХЛЛ клетки

разводили в суспензии нормальных лимфоцитов, и использовали полученный материал как положительный контроль с известным количественным значением для установления порога чувствительности. Также было предпринято слепое исследование по предложенному протоколу независимыми лабораториями образцов, содержащих как ХЛЛ-клетки, так и кровь здоровых доноров в качестве негативного контроля. Было выделено несколько комбинаций, обладавших наибольшей специфичностью и чувствительностью (CD5/CD19/CD20/CD38, CD5/CD19/ CD81/CD22 и CD5/CD19/CD79b/CD43). Учитывая тот факт, что иммунофенотип клеток ХЛЛ имеет некоторую вариабельность, все 3 комбинации были включены в диагностическую панель. Это позволило повысить чувствительность метода, за счет охвата возможных вариантов иммунофенотипа, в том числе, когда первичный иммунофенотип не был известен. Итогом являлась следующая панель для 4-х цветного цитометра:

1. CD45/CD14/CD19/CD3

2. CD20/CD38/CD19/CD5

3. CD81/CD22/ CD19/CD5

4. CD79b/CD43/CD19/CD5

5. sIgк/sIgУCD19/CD5

Специфичность и чувствительность метода оказались очень высоки (специфичность 98.8%, чувствительность 91.1%), в особенности вследствие стандартизации протокола исследования, в том числе пробоподготовки и стратегии гейтирования [68]. Применимость метода возросла, поскольку в большинстве случаев исследователю не требовалось знать первичный иммунофенотип.

Для определения чувствительности метода был введен термин «лимит детекции». Он рассчитывался от количества собранных для анализа клеток и достигал 0.01% (1 клетка ХЛЛ на 10 000 нормальных лейкоцитов или 10-4). Для количественного определения опухолевой популяции считалось необходимым наличие не менее минимум 50 клеток с аберрантным фенотипом, поэтому

требовалось проанализировать как минимум 500 000 лейкоцитов для достижения чувствительности 0.01% (1 на 10 000).

Детекция МОБ методом проточной цитометрии развивалась в связи с совершенствованием приборов и увеличением количества доступных флюорохромов, что уменьшает общее количество используемых пробирок. Это снижает стоимость и трудоемкость и повышает чувствительность. В 2012 г. A. Rawstron предложил панель из 2 пробирок для 6-цветного цитометра: CD 19/CD5/CD20/CD3/CD3 8/CD79b( 1) и CD19/CD5/CD20/CD81/CD22/CD43(2) [69].

В настоящее время, с появлением возможности проведения 8-10-цветной проточной цитометрии разрабатывается панель для единственной пробирки. В частности, главными считаются маркеры CD19, CD20, CD5, CD43, CD79b и CD81[70]. Эти 6 маркеров, представляющие собой базовую панель можно дополнить дополнительными антителами, для более точного подсчета ХЛЛ-клеток в том числе CD45, CD3, или потенциально более специфичными CD160 и ROR1 [35,36,66]. В одной пробирке значительно проще собрать большее количество событий, и таким образом увеличить чувствительность метода до 0,001% (10-5). При этом по современным критериям для детекции МОБ в единственной пробирке принято считать достаточным наличие хотя бы 20 аберрантных событий, а для количественного определения - 50 аберрантных событий [68-70].

1.2.2. СБ160 и ROR1-новые маркеры для детекции МОБ при ХЛЛ

Использование ROR1 и CD160 в качестве потенциальных маркеров для выявления минимальной остаточной болезни было предложено на основании специфичной экспрессии этих маркеров на клетках ХЛЛ, в отличие от нормальных В-лимфоцитов [35, 36, 62, 72].

ROR1 (receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1) является белком семейства тирозин-киназ, кодируемым геном ROR1. Он состоит из трех

внеклеточных доменов, один из которых является иммуноглобулиноподобным, и одного внутриклеточного домена (тирозинкиназного). Этот белок активно синтезируется в эмбриональном периоде, особенно в нервной ткани, принимая, по-видимому, активное участие в органогенезе [15, 24, 35]. У взрослых этот белок практически не обнаруживается в нормальных тканях, в том числе на клетках крови, тем не менее экспрессия ROR1 обнаружена на мезенхимальных клетках и на В-клеточных предшественниках в костном мозге, а также клетках жировой ткани, поджелудочной железы, легких [15, 24, 35]. Отмечается экспрессия ROR1 на опухолевых клетках, особенно на В-клеточных гемопоэтических опухолях.

Клетки ХЛЛ обнаруживают яркую, однородную экспрессию ROR1 независимо от цитогенетических, молекулярных вариантов заболевания, что предложено использовать как критерий дифференциальной диагностики [72], в частности с лимфомой маргинальной зоны. Также этот белок рассматривают как потенциальную мишень для таргетной терапии моноклональными антителами и маркер для выявления МОБ [15, 24, 35].

CD160 является гликозилфосфатидилинозитол-связанным мембранным белком, который в норме экспрессирован на субпопуляции естественных киллеров (МК-лимфоциты) а также на небольшой субпопуляции цитотоксических СD8+ Т-лимфоцитов. Не отмечается экспрессии этого белка на нормальных В-клетках, в том числе на костномозговых предшественниках, и плазматических клетках. Напротив, при В-клеточных неоплазиях (ХЛЛ, волосатоклеточный лейкоз) обнаружена экспрессия этого белка [10, 36]. Белок, в норме не выявляющийся на В-клетках может быть удачным маркером для мониторинга МОБ [35, 36]. Однако, лимитирующим фактором в использовании этого маркера может быть его слабая и гетерогенная экспрессия на клетках ХЛЛ [10].

1.2.3. Молекулярные методы выявления МОБ на основе ПЦР-реакции

Для детекции МОБ при ХЛЛ обычно используется ПЦР с применением праймеров к генам вариабельной области тяжелых цепей иммуноглобулинов

(IGHV). Метод с использованием стандартных праймеров [88] имеет достаточно низкую чувствительность (около 1%), хотя это наиболее быстрая методика из молекулярных. Чувствительность лимитирована амплификацией нормальных поликлональных генов IGHV на фоне регенерирующего костного мозга. Метод не является количественным. Кроме того, некоторые ХЛЛ клоны не амплифицируются, так как стандартные праймеры не всегда способны связаться, таким образом этот метод не применим для всех пациентов [81].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Миролюбова Юлия Владимировна, 2021 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Глянц, С. Медико-биологическая статистика / С. Глянц. - Москва: Практика, 1999. - 459 с.

2. Григорьев С.Г. Роль и место логистической регрессии и ROC-анализа в решении медицинских диагностических задач. / С.Г. Григорьев, .В.Лобзин, Н.В. Скрипченко // Журнал инфектологии. - 2016. - Том8. - №4. - С.36-45.

3. Зурочка А.В. Проточная цитометрия в биомедицинских исследованиях. /

A.В.Зурочка, С.В.Хайдуков, С.В.Кудрявцев. В.А.Черешнев. - Екатеринбург: РИО УрО РАН, 2018. - 720 с.

4. Кисиличина, Д.Г. Оценка прогноза и минимальной резидуальной болезни при В-клеточном хроническом лимфолейкозе с использованием метода многоцветной проточной цитофлуориметрии: диссертация ... кандидата медицинских наук: 14.03.10 / Кисиличина Дарья Григорьевна. - Москва, 2013. -82 с.

5. Клиническая лабораторная диагностика. Национальное руководство. /гл. ред. В.В.Долгов. - Москва: ГЭОТАР-медиа. -2012. -Т.1. - 928 с.

6. Клинические рекомендации по обследованию и лечению больных хроническим лимфолейкозом. / коллектив авторов под руководством

B.Г.Савченко, И.В.Поддубной. Рекомендации утверждены на II Конгрессе гематологов России. Национальное гематологическое общество. Российское профессиональное общество гематологов. 2014.

7. Кувшинов, А.Ю. Роль минимальной остаточной болезни в течении хронического лимфолейкоза и возможности современных методов ее коррекции: автореферат дис. ... кандидата медицинских наук: 14.01.21 / Кувшинов Алексей Юрьевич. - Санкт-Петербург, 2017. - 23 с.

8. Н.А. Купрышина. Проточная цитометрия в онкогематологии. Часть II. Основы и нововведения в диагностике хронического лимфолейкоза. / Н.А.Купрышина, Н.Н. Тупицын. // Клиническая онкогематология. - 2012. - Т.5, №14. - С.349-354.

9. Луговская С.А. Диагностика минимальной остаточной болезни при В-клеточном хроническом лимфолейкозе методом многопараметрической лазерной проточной цитофлюориметрии. / Луговская С.А., Почтарь М.Е., Наумова Е. В. //Клиническая лабораторная диагностика. -2010. - №9. - С.20-20а.

10. Луговская С.А. Новые маркеры (CD160, CD200, LAIR-1) в диагностике В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний. / С.А.Луговская, Г.Кисиличина, М.Е.Почтарь и др.// Клиническая онкогематология. - 2013. - Т.6, №1. - С.45-52.

11. Никитин, Е.А. Дифференцированная терапия хронического лимфолейкоза //Дис. ... д-ра мед. наук: 14.01.21 / Никитин Евгений Александрович. - М., 2014. - 221 с.

12. Никитин Е.А. Прогностическое значение мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов у больных хроническим лимфолейкозом, получавших комбинированную терапию флударабином и циклофосфаном. / Никитин Е.А., Стадник Е.А., Лорие Ю.Ю. и др. // Терапевтический архив. - 2007. -Т.79, №7. -С. 66-70.

13. Стругов В.В. Механизм действия и клиническая эффективность нового алкилирующего препарата бендамустин при хроническом лимфолейкозе. / Стругов В.В., Стадник Е.А., Зарицкий А.Ю. // Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. - 2011. - Т.4, №3. -С.217-227.

14. Сидорова Ю.В. Определение минимальной остаточной болезни у больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом методом пациентспецифичной ПЦР./ Сидорова Ю.В., Сорокина Т.В., Бидерман Б.В.// Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. - №12. - С.22-35.

15. Baskar S. Unique cell surface expression of receptor tyrosine kinase ROR1 in human B-cell chronic lymphocytic leukemia. /Baskar S, Kwong KY, Hofer T et al.// Clin Cancer Res. 2008. - Vol.14, № 2. - P. 396-404.

16. Böttcher, S. Comparative analysis of minimal residual disease detection using four color flow cytometry, consensus IgH-PCR, and quantitative IgH PCR in CLL after allogeneic and autologous stem cell transplantation / S. Böttcher, M. Ritgen, C. Pott, et al. // Leukemia. - 2004. - Vol. 18, №10. - P 1637-1645.

17. Böttcher, S. Standardized MRD flow and ASO IGH RQ-PCR for MRD quantification in CLL patients after rituximab-containing immunochemotherapy: A comparative analysis / S. Böttcher, S. Stilgenbauer, R. Busch, et al. // Leukemia. -2009. - Vol. 23, №11. - P. 2007-2017.

18. Bottcher, S. Minimal residual disease quantification is an independent predictor of progression-free and overall survival in chronic lymphocytic leukemia: a multivariate analysis from the randomized GCLLSG CLL8 trial. / S. Bottcher, M. Ritgen, K. Fischer, et al. // J Clin Oncol. - 2012. - Vol. 30, №9. - P. 980-988.

19. Bulian P IGHV gene mutational status and 17p deletion are independent molecular predictors in a comprehensive clinical-biological prognostic model for overall survival prediction in chronic lymphocytic leukemia./ Bulian P, Rossi

D, Forconi F. et al//J Transl Med. - 2012. - Vol.10, №18 - P. 1-11.

20. Cabezudo E. Analysis of residual disease in chronic lymphocytic leukemia by flow cytometry. / Cabezudo E, Matutes E, Catovsky D et al. // Leukemia. - 1997.-Vol.11, №11 - P.1909-1914.

21. Chanan-Khan A. Ibrutinib combined with bendamustine and rituximab compared with placebo, bendamustine, and rituximab for previously treated chronic lymphocytic leukaemia or small lymphocytic lymphoma (HELIOS): a randomised, double-blind, phase 3 study. / Chanan-Khan A, Cramer P, Demirkan F, et al. // Lancet Oncol. 2016. - Vol.17, №2 - P.200-211.

22. Collett L. Assessment of ibrutinib plus rituximab in front-line CLL (FLAIR trial): study protocol for a phase III randomised controlled trial. / Collett L, Howard DR, Munir T, McParland L, Rawstron A.C et al.// Trials. - 2017. - №18 - P.387.

23. Cuneo.A. Efficacy of bendamustine and rituximab as first salvage treatment in chronic lymphocytic leukemia and indirect comparison with ibrutinib: a GIMEMA,

ERIC and A 20. UK CLL FORUM study. / Antonio Cuneo, George Follows, Gian Matteo Rigolin et al.// Haematoljgica. - 2018.- Vol.103, № 7. - P. 1209-1217.

24. Daneshmanesh AH. Orphan receptor tyrosine kinases ROR1 and ROR2 in hematological malignancies./ Daneshmanesh AH, Porwit A, Hojjat-Farsangi M. et al. //Leuk Lymphoma. 2013. - Vol.54, №4. - P.843-850.

25. Davis BH. 2006 Bethesda International Consensus recommendations on the flow cytometric immunophenotypic analysis of hematolymphoid neoplasia: Medical indications. /16. Davis BH, Holden JT, Bene MC et al. // Cytometry Part B. - 2007. -Vol.72B (Suppl 1). - P.5-13.

26. Dowling, A. K. Optimization and Validation of an 8-Color Single-Tube Assay for the Sensitive Detection of Minimal Residual Disease in B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia Detected via Flow Cytometry. / Dowling, A. K., Liptrot, S. D., O'Brien et al.// Laboratory Medicine. - 2016 - Vol. 47, №2, P. 103-111.

27. Dreger P. Managing high-risk CLL during transition to a new treatment era: stem cell transplantation or novel agents? / Dreger P, Schetelig J, Andersen N, et al. //Blood. -2014. - Vol. 124, №26. - P.3841-3849.

28. Dreger P. German CLL Study Group. Allogeneic stem cell transplantation provides durable disease control in poor-risk chronic lymphocytic leukemia: long-term clinical and MRD results of the German CLL Study Group CLL3X trial. /Dreger P, D'ohner H, Ritgen M, et al.// Blood. - 2010 - Vol. 116, №14. - P.2438-2447.

29. Durrieu F. Normal Levels of Peripheral CD19+CD5+ CLL-Like Cells: Toward a Defined Threshold for CLL Follow-Up—A GEIL-GOELAMS Study. / Durrieu F, Genevieve F, Arnoulet C et al.// Cytometry Part B (Clinical Cytometry). -2011. - Vol. 80, №6. - P. 346-353.

30. Eichhorst B. First-line chemoimmunotherapy with bendamustine and rituximab versus fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab in patients with advanced chronic lymphocytic leukaemia (CLL10): an international, open-label, randomised, phase 3, non-inferiority trial. /Eichhorst B, A.M Fink, J. Bahlo et al. // Lancet Oncol. - 2016. - Vol.17, №7. - P. 928-942.

31. Eichhorst, B. Frontline chemoimmunotherapy with fludarabine (F),

cyclophosphamide (C), and rituximab (R) (FCR) shows superior efficacy in comparison to bendamustine (B) and rituximab (BR) in previously untreated and physically fit patients (pts) with advanced chronic lymphocytic leukemia (CLL): Final analysis of an international, randomized study of the German CLL Study Group (GCLLSG) (CLL10 study) / B. Eichhorst, A.M. Fink, R. Busch, et al. // Blood. - 2014. - Vol. 124, №21. -P. 19.

32. European Medicines Agency. Guideline on the use of minimal residue disease as an endpoint in chronic lymphocytic leukemia studies EMA/629967/2014 , код доступа,10 сентября 2020г.:

http://www.ema.europa.eu/docs/en GB/document library/Scientific guideline/2014/12/ WC500179047.pdf

33. European Medicines Agency. Appendix 4 to the guideline on the evaluation of anticancer medicinal products in man - condition specific guidance. 17 December 2015 EMA/CHMP/703715/2012 Rev. 2 Committee for Medicinal Products for Human Use код доступа,10 сентября 2020г.:

https://www.ema.europa.eu/documents/scientific-guideline/evaluation-anticancer-medicinal-products-man-appendix-4-condition-specific-guidance-rev2 en.pdf

34. Farina L. Qualitative and quantitative polymerase chain reaction monitoring of minimal residual disease in relapsed chronic lymphocytic leukemia: early assessment can predict long-term outcome after reduced intensity allogeneic transplantation. / Farina L, Carniti C, Dodero A, et al.// Haematologica. - 2009. - Vol.94. №5. - P.654-662.

35. Farren T.W. Combined ROR1 and CD160 Detection for Improved Minimal Residual Disease in Patients with Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). / Farren TW, Liu F, Macey MG, et al.// Blood. - 2013. - Vol. 22, №21. - P.2572.

36. Farren T.W. Minimal residual disease detection with tumor-specific CD160 correlates with event-free survival in chronic lymphocytic leukemia. / Farren TW, Giustiniani J, Fanous M, et al.// Blood Cancer J. 2015. - Vol. 5, №1. - P.273.

37. Fink AM. Lenalidomide maintenance after first-line therapy for high-risk chronic lymphocytic leukaemia (CLLM1): final results from a randomised double-

blind, phase 3 study. / Fink AM, Bahlo J, Robrecht S, et al. // Lancet Haematol. 2017. -Vol. 4,№10. - P.475-486.

38. Fischer, K. Bendamustine in combination with rituximab for previously untreated patients with chronic lymphocytic leukemia: a multicenter phase II trial of the German Chronic Lymphocytic Leukemia Study Group / K. Fisher, P. Cramer, R. Busch, et al. // J. Clin. Oncol. - 2012. - Vol. 30, № 26. - P. 3209-3216.

39. Ghia, P. A look into the future: can minimal residual disease guide therapy and predict prognosis in chronic lymphocytic leukemia? / P. Ghia // Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. - 2012. - Vol. 2012, № 1. - P. 97-104.

40. Ghia P Minimal residual disease analysis in chronic lymphocytic leukemia: a way for achieving more personalized treatments. /Ghia P, Rawstron A. //Leukemia. 2018 -Vol. 32, №6. - P.1307 - 1316.

41. Hallek, M. Immunochemotherapy with fludarabine (F), cyclophosphamide (C), and rituximab (R) (FCR) versus fludarabine and cyclophosphamide (FC) improves response rates and progression free survival (PFS) of previously untreated patients (pts) with advanced chronic lymphocytic leukemia (CLL) / M. Hallek, G. Fingerle-Rowson, A. Fink, et al. // Blood. - 2008. - Vol. 112, №11. - P. 325.

42. Hallek M. IwCLL guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment, and supportive management of CLL. /Hallek M, Cheson BD, Catovsky D, et al.// Blood. - 2018. - Vol. 131, № 25. - P. 2745-2760.

43. Hallek, M. The HELIOS trial protocol: a phase III study of ibrutinib in combination with bendamustine and rituximab in relapsed/refractory chronic lymphocytic leukemia / M. Hallek, N.E. Kay, A. Osterborg, et al. // Future Oncol. -2015. - Vol. 11, № 1. - P.51-59.

44. Hallek M. Chronic lymphocytic leukemia: 2017 update on diagnosis, risk stratification, and treatment. Am J Hematol. - 2017.- Vol92. - P.946-965

45. Herman SE. Ibrutinib-induced lymphocytosis in patients with chronic lymphocytic leukemia: correlative analyses from a phase II study/ Herman SE, Niemann CU, Farooqui M, et al.// Leukemia.2014. - Vol. 28, № 11. - P.2188-2196.

46. Hillmen P et al. The initial report of the Bloodwise TAP CLARITY study containing ibrutinib and venetoclax in relapsed, refractory CLL shows acceptable safety and promising early indications of efficacy. /EHA. - 2017. - Abstract S770.

47. Keating, M.J. Early results of a chemoimmunotherapy regimen of fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab as initial therapy for chronic lymphocytic leukemia. / M.J. Keating, S. O'Brien, M. Albitar, et al. // J. Clin. Oncol. -2005. - Vol. 23, №18. -P.4079-4088.

48. Kovacs, G. Minimal Residual Disease Assessment Improves Prediction of Outcome in Patients with Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) Who Achieve Partial Response: Comprehensive Analysis of Two Phase III Studies of the German CLL Study Group / G. Kovacs, S. Robrecht, A.M. Fink, et al. // J. Clin. Oncol. - 2016. - Vol. 34, № 31. - P. 3758-3765

49. Kwok M. Minimal residual disease is an independent predictor for 10-year survival in CLL. /Kwok M, Rawstron A, Varghese A, et al.// Blood. - 2016. - Vol.128, №24. -P.2770-2773.

50. Ladetto M. et al. ESMO consensus conference on malignant lymphoma: general perspectives and recommendations for prognostic tools in mature B-cell lymphomas and chronic lymphocytic leukaemia //Annals of Oncology. - 2016. - Vol. 27. - №. 12. - P. 2149-2160.

51. Lenormand B. Residual disease in B-cell chronic lymphocytic leukemia patients and prognostic value. / Lenormand B, Bizet M, Fruchart C, et al. // Leukemia.1994. - Vol. 8, №6. - P.1019-1026.

52. Lee J. Identification and characterization of a human CD5 pre-naive B cell population. / Lee J, Kuchen S, Fischer R et al. // JImmunol. 2009. - Vol.182, №7. - P. 4116-4126.

53. Little RF. Measure for measure: minimal residual disease in CLL. / Little RF, McShane LM . // Blood. 2016. - Vol.128, № 24. - P. 2747-2748.

54. Logan AC. Minimal residual disease quantification using consensus primers and high-throughput IGH sequencing predicts post-transplant relapse in chronic

lymphocytic leukemia. / Logan AC, Zhang B, Narasimhan B, et al. // Leukemia.2013 -Vol. 27, №8. - P.1659-1665.

55. Moreno C. Clinical significance of minimal residual disease, as assessed by different techniques, after stem cell transplantation for chronic lymphocytic leukemia / C. Moreno, N. Villamor, D. Colomer, et al. // Blood. - 2006. - Vol. 107, №11. - P. 4563-4569.

56. Moreton, P. Eradication of minimal residual disease in B-cell chronic lymphocytic leukemia after alemtuzumab therapy is associated with prolonged survival / P. Moreton, B. Kennedy, G. Lucas, et al. // J Clin Oncol. - 2005. - Vol. 23, №13. - P. 2971-2979.

57. NCCN - Clinical Practice Guidelines in Oncology, Non-Hodgkin's lymphomas 2014, https://www.nccn.org/about/nhl.pdf // (accessed 29 Nov 2017).

58. O'Brien, S. A phase 2 study of idelalisib plus rituximab in treatment -naive older patients with chronic lymphocytic leukemia / S. O'Brien, N. Lamanna, T.J. Kipps, et al. // Blood. - 2015. - Vol. 126, №25. - P. 2686-2694.

59. O'Brien, S. Ibrutinib as initial therapy for elderly patients with chronic lymphocytic leukaemia or small lymphocytic lymphoma: an open-label, multicentre, phase 1b/2 trial / S. O'Brien, R.R. Furman, S.E. Coutre, et al. // Lancet Oncol. - 2014.

- Vol. 15, №1. - P. 48-58.

60. O'Brien, S. Efficacy and safety of ibrutinib in patients with relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia or small lymphocytic leukemia with 17p deletion: results from the phase II RESONATE™-17 trial. (ASH Annual Meeting Abstracts) / S.O'Brien, J.A. Jones, S. Couture, et al. // Blood. - 2014. - Vol. 124, №21.

- P. 327.

61. Oughton J.B. GA101 (obinutuzumab) monoclonal Antibody as Consolidation Therapy in CLL (GALACTIC) trial: study protocol for a phase II/III randomised controlled trial. / Oughton J.B., Collett L., Howard D.R, et al.// Trials. - 2017. - №18. -P.353.

62. Patz M. ROR-1 Is a Highly Discriminative Marker in Flow Cytometric Minimal Residual Disease (MRD) Detection in Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). / Patz M, Pentok B, Cremer K, et al. // Blood. - 2016. - Vol.128, №22. - P. 3197.

63. Perez-Andres M. Primary Health Care Group of Salamanca for the Study of MBL. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. / Perez-Andres M, Paiva B, Nieto WG et al. // Cytometry Part B. - 2010. - Vol.78B (Suppl 1). - P.47-60.

64. Pfitzner T. A real-time PCR assay for the quantification of residual malignant cells in B cell chronic lymphatic leukemia. /Pfitzner T, Engert A, Wittor H, et al. // Leukemia. - 2000. - Vol. 14, № 4 - P.754-766.

65. Pflug N. Development of a comprehensive prognostic index for patients with chronic lymphocytic leukemia. / Pflug N, Bahlo J, Shanafelt T.D. et al.//Blood. - 2014. - Vol. 124, №1. - P.49-62.

66. Rawstron A.C. Quantitation of minimal disease levels in chronic lymphocytic leukemia using a sensitive flow cytometric assay improves the prediction of outcome and can be used to optimize therapy / A.C. Rawstron, B. Kennedy, P.A. Evans, et al.// Blood. - 2001. - Vol. 98, №1. - P. 29-35.

67. Rawstron, A.C. Early prediction of outcome and response to alemtuzumab therapy in chronic lymphocytic leukemia / A.C. Rawstron, B. Kennedy, P. Moreton, et al. //Therapy. - 2004. - Vol. 103, № 6. - P. 2027-2031.

68. Rawstron, A.C. International standardized approach for flow cytometric residual disease monitoring in chronic lymphocytic leukaemia / A.C. Rawstron, N. Villamor, M. Ritgen, et al. // Leukemia. - 2007. - Vol. 21, №5. - P. 956-964.

69. Rawstron AC. Improving efficiency and sensitivity: European Research Initiative in CLL (ERIC) update on the international harmonised approach for flow cytometric residual disease monitoring in CLL. / Rawstron AC, Böttcher S, Letestu R, et al. on behalf of the European Research Initiative in CLL (ERIC). // Leukemia. -2013. - Vol 27, №1. - P.142-149.

70. Rawstron AC. A complementary role of multiparameter flow cytometry and high-throughput sequencing for minimal residual disease detection in chronic

lymphocytic leukemia:an European Research Initiative on CLL study. / Rawstron AC, Fazi C, Agathangelidis A, et al.// Leukemia. - 2016. - Vol.30, №4. - P.929-936.

71. Rawstron AC, Cohen D, De Tute RM, McParland L, Collett L, Phillips D et al. The Level of Residual CLL Objectively Predicts the Outcome of Patients Following FCR-Based Therapy with Sequential Benefits per Log Depletion and Improved Post-Treatment Monitoring. Blood. - 2015. - Vol.126. - P.1717

72. Rawstron A C. Reproducible diagnosis of chronic lymphocytic leukemia by flow cytometry: An European Research Initiative on CLL (ERIC) & European Society for Clinical Cell Analysis (ESCCA) Harmonization project. / Rawstron AC, Kreuzer KA, Soosapilla A. et al. //Cytometry B Clin Cytom. - 2018. - Vol.94, №1. - P. 121-128

73. Santacruz R. The prognostic impact of minimal residual disease in patients with chronic lymphocytic leukemia requiring first-line therapy. / Santacruz R, Villamor N, Aymerich M, et al.// Haematologica. - 2014. - №99 - 873-880.

74. Seymour JJF, Ma S, Brander DM, et al. Venetoclax plus rituximab in relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia: a phase 1b study. / Seymour JJF, Ma S, Brander DM, et al. // Lancet Oncol. - 2017. -Vol.18, № 2. - P.230-240.

75. Sharman JP. Ublituximab (TG-1101), a novel glycoengineered anti-CD20 antibody, in combination with ibrutinib is safe and highly active in patients with relapsed and/or refractory chronic lymphocytic leukaemia: results of a phase 2 trial. / Sharman JP, Farber CM, Mahadevan D, et al. //Br J Haematol. - 2017.- Vol.176. -P.412-420.

76. Stehlikova O. Detecting minimal residual disease in patients with chronic lymphocytic leukemia using 8-color flow cytometry protocol in routine hematological practice. / Stehlikova O, Chovancova J, Tichy B, et al. // Int J Lab Hematol. - 2014. -Vol. 36, № 2. - P.165-71.

77. Stilgenbauer S. Venetoclax in relapsed/refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL) with 17p deletion: outcome and minimal residual disease from the full population of the pivotal M13-982 trial. / Stilgenbauer S, Chyla B, Eichhorst B, et al. // European Hematology Association. - 2017. - Abstract S771.

78. Stilgenbauer S. Phase Ib study (G028440) of venetoclax with bendamustine/rituximab or bendamustine/obinutuzumab in patients with relapsed/refractory or previously untreated chronic lymphocytic leukemia. / Stilgenbauer S, Morschhauser F, Wendtner C-M, et al.// Blood. - 2016. - Vol.128. -Abstract 4393.

79. Strati P. Eradication of bone marrow minimal residual disease may prompt early treatment discontinuation in CLL. / Strati P., Keating MJ, O'Brien SM, et al. // Blood. - 2014. - Vol.123, №24. - P.3727-3732.

80. The International CLL-IPI working group. An international prognostic index for patients with chronic lymphocytic leukaemia (CLL-IPI): a meta-analysis of individual patient data. / Lancet Oncol. - 2016. Vol.17, №6. - P.779-790.

81. Thompson P.A. Eliminating minimal residual disease as a therapeutic endpoint:working toward cure for patients with CLL / P.A. Thompson, W.G. Wierda // Blood.2016. - Vol. 127, № 3. - P. 2791-286.

82. Thompson P.A. Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia. /Thompson P.A. Constantine S.T, O'Brien S.M. et al.// Blood. - 2016. - Vol. 127. - № 3. - P. 303-309.

83. Thompson P.A. Serial minimal residual disease (MRD) monitoring during first-line FCR treatment for CLL may direct individualized therapeutic strategies. / Philip A. Thompson, Christine B. Peterson, Paolo Strati et al//Leukemia. - 2018. Vol. 32, №11. - P. 2388-2398.

84. Turtle CJ. Durable Molecular Remissions in Chronic Lymphocytic Leukemia Treated with CD19-Specific Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells After Failure of Ibrutinib./ Turtle CJ, Hay KA, Hanafi LA et al. // J. Clin Oncol. - 2017. - Vol. 35, №26 -P.3010-3020.

85. Uhrmacher S. Use of the receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ROR1) as a diagnostic tool in chronic lymphocytic leukemia (CLL). /Uhrmacher S, Schmidt C, Erdfelder F et al.// Leuk Res.- 2011. - Vol.35, №10. - P.1360-1366.

86. Varghese AM. Eradication of minimal residual disease improves overall and progression-free survival in patients with chronic lymphocytic leukaemia, evidence from NCRN CLL207: a phase II trial assessing alemtuzumab consolidation. / Varghese AM, Howard DR, Pocock Ch, Rawstron AC et al. //Br J Haematol. - 2017. - Vol.176. -P.573-582

87. Vuillier F. Evaluation of residual disease in B-cell chronic lymphocytic leukemia patients in clinical and bone-marrow remission using CD5-CD19 markers and PCR study of gene rearrangements/ Vuillier F, Claisse JF, Vandenvelde C, et al.//Leuk Lymphoma.1992. - Vol 7. - № 3. - P.195-204.

88. Voena C. A novel nested-PCR strategy for the detection of rearranged immunoglobulin heavy-chain genes in B cell tumors. / Voena C, Ladetto M, Astolfi M, et al.// Leukemia. - 1997. - Vol.11, №10. - P.1793-1798.

89. Winqvist M. Dual targeting of Bruton tyrosine kinase and CD52 induces minimal residual disease-negativity in the bone marrow of poor-prognosis chronic lymphocytic leukaemia patients but is associated with opportunistic infections - Results from a phase I study. / Winqvist M, Palma M, Heimersson K, et al.//Br J Haematol. -2017. - Vol.182, №4. - P.590-594.

90. WHO classification of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues. / Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al.// IARC. Lyon.- 2017. - Revised 4th Ed. - P. 588

91. Youinou P. CD5 expression in human B-cell populations. / Youinou P, Jamin C, Lydyard.P.// Immunology Today. - 1999. -Vol. 20, №7. -P.312-316.