Кристаллизация мембранных белков методом in meso тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат физико-математических наук Моисеева, Екатерина Сергеевна

• Моисеева, Екатерина Сергеевна
• кандидат физико-математических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Моисеева, Екатерина Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Классический метод кристаллизации мембранных белков.

1.2 Кристаллизация in meso и фазовая диаграмма моноолеина.

1.3 Гипотетический молекулярный механизм кристаллизации мембранных белков в кубической фазе.

1.4 Теоретическое представление о кристаллизации in meso.

1.5 Классификация и свойства детергентов.

1.6 Влияние детергентов на липидную мембрану.

1.7 Влияние детергентов на фазовое поведение системы моноолеин/вода.

1.8 Структура и кристаллы, выращенные при кристаллизации in meso.

1.9 Zs-фаза.

1.10 Кристаллизация из бицелл.

1.11 Кристаллизация из везикул.

1.12 Бактериородопсин.

1.13 Двойникование кристаллов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кристаллизация мембранных белков методом in meso»

Мембранные белки являются основными функциональными компонентами клеточных мембран и составляют примерно одну треть от общего числа белков, закодированных в геноме. Исследование мембран на молекулярном уровне имеет огромное значение не только в расшифровке всех клеточных процессов, но и для понимания изменений, ведущих к аномальным трансформациям клеток, а также для создания лекарств. Более того, 70% существующих в настоящее время лекарственных средств направлены на мембранные белки. Однако, хотя количество мембранных белков с известной структурой за последние годы возросло, оно не сравнимо пока с тем же показателем по водорастворимым белкам.

Актуальность. Согласно базе данных мембранных белков с известной структурой (http://blanco.bioinol.uci.edu/Meinbranc Proteins xtal.html) и банку данных RCSB (http://\vww.rcsb.оrg/pdb) на сегодняшний день лишь 218 из более 50000 зарегистрированных белковых структур высокого разрешения относятся к числу уникальных мембранных белков. Данный факт объясняется, прежде всего, трудностью получения кристаллов белков этого класса вследствие их амфифильной природы и необходимостью использования детергентов на всех этапах работы, а также, как правило, их нестабильностью вне нативного мембранного окружения. Нестабильности можно избежать при возвращении белка обратно в липидный бислой при кристаллизации методом в кубической фазе [1]. Несмотря на то, что этот сравнительно новый метод кристаллизации позволил сделать ряд принципиальных прорывов в области кристаллизации мембранных белков [2-6], механизм кристаллизации в липидной мезофзе (in meso) остается до конца неизвестным. Кристаллизация каждого следующего мембранного белка, как правило, требует длительного и дорогостоящего перебора многочисленных параметров кристаллизационной системы, что неминуемо приводит к повышению временных и финансовых затрат. Развитие методов кристаллизации на базе мембранных систем для повышения эффективности производства высококачественных кристаллов мембранных белков для последующего структурного анализа является одной из самых приоритетных задач современной структурной биологии.

Цель работы заключалась в развитии метода кристаллизации in meso, основываясь на изучении механизма кристаллизации мембранных белков в липидной мезофазе на примере модельного белка бактериородопсина. Получение высококачественных кристаллов бактериородопсина для установления молекулярного механизма универсального и первого шага биоэнергетики векторного транспорта протона через мембрану клеток являлось комплементарной задачей работы.

Состояние исследуемых проблем. Новый подход в кристаллизации мембранных белков из липидной кубической фазы позволил преодолеть сложности и получить структуры около восьми различных типов мембранных белков. Так, только с помощью метода in meso впервые после почти 30 лет неудачных попыток, при которых использовались стандартные методы кристаллизации, удалось получить кристаллы бактериородопсина (БР) кристаллографического качества [7], также впервые был закристаллизован комплекс двух белков и решена его структура [3;4]; совсем недавнее достижение в сфуктурной биологии — структура человеческих {За-адренергического и Агл-аденозинового GPCR (рецепторов, сопряженных с G белком) [5;6]. Следует отметить, что на сегодняшний день именно на GPCR белки направлено действие около 25-50% лекарств на рынке, а ежегодный объем их продаж составляет свыше 40 миллиардов долларов. [8-10]. Решенные структуры самых разнообразных белков свидетельствуют о широком диапазоне применения и высоком потенциале данного метода. Однако повышение эффективности этого метода сдерживает отсутствие систематических исследований самой кристаллизации. В результате до сих пор остается неизвестной роль амфифильного окружения, а также механизм роста кристаллов в данной системе [11-13].

Кристаллизация в липидной кубической фазе позволила получить структуру основного состояния бактериородопсина с разрешением 1,55 А. Благодаря новому методу получены некоторые данные о структурах промежуточных состояний белка, внесшие вклад в понимание молекулярных основ функционирования бактериородопсина и других светочувствительных белков этого класса [14]. Вместе с тем надо отметить, что отдельные сведения о механизме переноса остаются противоречивыми. Данные трёх групп авторов, опубликовавших структуры ранних промежуточных состояний, разняться между собой из-за относительно невысокого качества кристаллов, в том числе зачастую обладающих понижающим информативность дефектом двойникования.

Научная новизна работы. Разработан новый эффективный метод кристаллизации мембранных белков в липидной фазе непосредственно из мембран, содержащих белок, с добавлением детергента в кристаллизационную систему. Данный подход к кристаллизации позволяет обойти ряд принципиальных трудностей, в том числе неизбежные потери мембранных белков и снижение их качества, связанные с солюбилизацией и/или обменом детергента, и, что не мало важно, позволяет существенно повысить эффективность работы.

Впервые проведены систематические исследования кристаллизации мембранного белка. Прежде всего, изучено влияние детергентов - влияние гидрофобных и гидрофильных взаимодействий на кристаллизационный процесс в мезофазе. Эксперименты с варьированием концентраций детергентов, относящихся к различным семействам и имеющих разное соотношение полярного и неполярного фрагментов, позволили выдвинуть предположение, что в успехе кристаллизации in meso значительную роль играет толщина липидного бислоя мезофазы, а не детали химического строения амфифильных молекул (линидов, детергентов). Данные исследования впервые показали возможность кристаллизации мембранного белка в подавляющем большинстве типов детергентов, как в коротко-, так и в длинноцепочечных, и позволили определить количественные характеристики, оптимальные для кристаллизации.

В процессе исследования механизма кристаллизации мембранных белков в липидной мезофазе отработан в деталях метод кристаллизации БР из пурпурных мембран (ПМ) с добавлением различных типов детергентов. Данный метод позволил найти новые условия образования больших высококачественных кристаллов бактериородопсина, дифрагирующих до 1,2 А, что дало возможность впервые установить ряд принципиальных элементов механизма транспорта протона.

Кроме того, в работе впервые был разработан метод повышения чистоты солюбилизированного бактериородопсина с помощью замораживания белкового препарата и последующего его ультрацентрифугирования. Данная процедура эффективно работает и позволяет значительно улучшить качество белка и в случае других мембранных белков таких, как галородопсин, сенсорный родопсин II и его комплекс с трансдьюсером.

Практическая ценность работы. Полученные в работе результаты представляют собой огромный интерес для структурной биологии, в частности, для процедур очистки и кристаллизации белков с целью последующего структурного анализа. Как показывает практика, результат кристаллизации и качество кристаллов зависят от чистоты исходного препарата белка. Разработанный новый метод дополнительной очистки ретинальных белков может быть использован для повышения качества и чистоты препарата как в случае других мембранных, так и в случае растворимых белков.

Результаты исследования механизма кристаллизации в липидпой мезофазе и разработанный новый подход к кристаллизации представляют интерес с точки зрения понимания механизма кристаллизации, что важно для дальнейшего развития экспериментальных методов кристаллизации мембранных белков. Приведенные в работе выводы и диаграммы кристаллизации БР в мезофазе с добавлением различных детергентов говорят о возможности получения кристаллов мембранных белков в любом детергенте, минуя стадию замены детергента на более подходящий для кристаллизации. Отраженные в диаграммах оптимальные условия роста кристаллов БР (в частности, диапазон концентраций детергента) могут быть использованы в качестве отправной точки при поиске условий кристаллизации других белков. Разработанный метод кристаллизации уже позволил получить кристаллы бактериородопсина высокого качества дифракции, что в свою очередь позволит улучшить структуру основного и промежуточных состояний БР и прояснить молекулярный механизм первого и универсального шага биоэнергетики клетки.

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав и заключения. Первая глава представляет литературный обзор современного состояния проблемы кристаллизации мембранных белков. Особое внимание уделено используемым в большинстве структурных исследований мембранных белков детергентам и их свойствам. Подробно описаны современные методы кристаллизации с акцентом на изложении различных аспектов кристаллизации мембранных белков новым методом -в липидной кубической фазе. Вторая глава включает в себя описание материалов, экспериментального оборудования, методов и процедур, использованных при выполнении диссертационной работы. Здесь подробно описан новый метод дополнительной очистки мембранных белков, а также новый подход по кристаллизации бактериородопсина из пурпурных мембран в липидной кубической фазе с добавлением детергента в кристаллизационную пробу. В третьей главе представлены экспериментальные результаты исследований влияния различных факторов на успех кристаллизации бактериородопсина в липидной кубической фазе. Данная глава начинается с описания результатов очистки новым методом солюбилизированного бактериородопсина и других ретинальсодержащих мембранных

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Моисеева, Екатерина Сергеевна

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ РАБОТЫ

1. Разработан принципиально новый эффективный метод кристаллизации мембранных белков непосредственно из природных или искусственных мембран без использования стадии полной очистки белков. Найдены условия, которые позволяют повысить вероятность получения белковых кристаллов.

2. Впервые продемонстрирована возможность кристаллизации мембранного белка в присутствии значительного количества детергента (до 50% от массы липида), что опровергает общепринятое мнение об ингибировании кристаллизации мембранных белков при больших, чем ККМ концентрациях солюбилизирующего агента.

3. Предложенный подход к кристаллизации мембранных белков позволил улучшить статистическую информацию о зависимости фактора двойникования от скорости роста кристаллов: замедление роста приводит к существенному увеличению количества кристаллов с низкой и нулевой долей двойникования.

4. Новым методом кристаллизации в различных детергентах получены уникальные по качеству кристаллы бактериородопсина из ПМ (большого размера, с разрешением до 1,2 А и низким или нулевым двойникованием). Рентгеноструктурный анализ этих кристаллов позволил уточнить структуры основного и промежуточных (К, L и М) состояний БР, дающие принципиально новую информацию о механизме транспорта протона.

5. В результате систематических исследований влияния различных детергентов на кристаллизацию БР in meso показано, что оптимум кристаллизации определяется не столько специфическими свойствами молекул детергента, сколько их влиянием на липидный бислой. Установлено, что ключевым параметром в кристаллизации in meso является толщина гидрофобной области липидного бислоя мезофазы.

6. Показано, что на образование высококачественных кристаллов оказывают влияние молекулы моноолеина, которые не только обладают характерными химическими свойствами, но и являются самоорганизующимися частицами, создающими необходимые условия для эффективной кристаллизации в виде бислойной мезофазы.

7. Предложен новый метод очистки мембранных белков с помощью глубокой заморозки и последующего ультрацентрифугирования. Метод позволяет значительно улучшить качество белка бактериородопсина с р. г. (А280/А553) = 1,7 до 1,5, галородопсина - с 2,53 до 1,56, сенсорного родопсина II - с 1,5-1,6 до 1,16 и его комплекса с трансдьюсером - до 1,28.

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключении хочу поблагодарить моего научного руководителя Горделия Валентина Ивановича за постановку научных задач, за продуктивное обсуждение результатов работы и новых идей, за постоянное внимание, личную поддержку и участие! Я глубоко признательна Георгу Бюлдту за предоставленную возможность выполнять часть данной работы в Институте Структурной Биологии Исследовательского Центра г. Юлиха, за доброе отношение и интересные научные беседы. Хочу выразить искренние слова благодарности Еве Пебай-Пероле за продуктивное сотрудничество с Институтом Структурной Биологии г Гренобля. За научные дисскуаш, критику и ценные замечания при написании работы я глубоко признательна Ягужинскоиу Льву Сергеевичу. Спасибо Валентину Борщевскому за постоянную помощь в проведении кристаллографических экспериментов и в обработке полученных данных, за консультации, обсуждение и участие в работе 1а техническую и дружескую поддержку я глубоко признательна Кристиану Бакену. Я искренне благодарю всех своих друзей и коллег из Центра Бионанофизики Московского Физико-Технического Института (ГУ) за помощь в работе: Абызова А., Андреева Г., Борщевскую Ю, Братанова Д., Волкова Д., Волкова О., Голощук В., Гущина И., Денисенко Е., Ерофеева И., Ерошенко Л., Иванову И., Ищенко А., Марышева П., Медведеву А., Моисееву В., Парилову Т., Полякова С., Проскурина М., Ремееву А., Решетняк А., Ромкину А., Силачеву М., Сиротинскую Е., Сквирского М., Соловьеву К., Червакова П., Чубукова П., Шаву А. Я очень признательна Эдельвейс Э. и Баландину Т. за неизменную поддержку, добрые советы и плодотворные научные беседы на протяжении всей моей научной деятельности. Я благодарю кафедру Молекулярной биологии и деканат ФМБФ за поддержку в течение обучения в МФТИ. Хочу выразить огромную благодарность кафедре Физики и технологии наноструктур и лично заведующему Лебедеву В. В., а также деканату ФОПФ, Центру Бионанофизики и его руководителю Трунину М. Р. за поддержку научных исследований.

Я сердечно благодарю моих родителей, родных и близкихI

1.14. Заключение

Известно, что одной из основных задач при кристаллизации мембранных белков является наработка необходимого количества чистого, гомогенного и стабильного препарата. Несмотря на все трудности работы с мембранными белками, за последнее время наблюдается значительный прогресс в расшифровке их структуры (рис. 1.17 А). Этот рост объясняется не только появлением новых и оригинальных способов кристаллизации мембранных белков, но и поиском новых условий и систем экспрессии генов этих белков в гетерогенных организмах, разработкой новых серий детергентов специально для эффективной солюбилизации и кристаллизации, улучшением методов очистки. Однако, тем не менее, почти половина из небольшого количества известных на сегодняшний день структур мембранных белков определена с относительно низким разрешением (более 3 А), и лишь небольшое их число с высоким [96].

Хотя большинство мембранных белков были закристаллизованы классическим способом in surfo (http://www.mpdb.ul.ie/), последние достижения в структурной биологии показали высокую эффективность работы новых подходов - методов кристаллизации мембранных белков «из мембран» (липидных бислоев). Диаграмма на рисунке 1.17 Б иллюстрирует рост количества решенных структур мембранных белков, закристаллизованных в липидной кубической фазе, в губчатой /.з-фазе и с помощью кристаллизации из бицелл. Основное достоинство этих методов заключается в том, что во время кристаллизации белок возвращается в нативное липидное окружение, что удерживает его в стабильном состоянии и предохраняет от агрегации. Образующиеся кристаллы типа I обладают плотной упаковкой. Характерная величина содержания растворителя в кристалле, выращенном в кубической фазе, составляет ~ 45-50%, в отличие от 60-70% для кристалла типа И, полученного стандартным методом кристаллизации [27]. При этом увеличивается дифрагирующая сила образца, что позволяет получать дифракционные картины хорошего качества, используя относительно небольшие по размерам кристаллы. В случае кристаллизации стандартным методом in surfo детергентная шуба, опоясывающая белок, достигает в ширину ~ 15-20 А и не позволяет образовывать прочные связи между белками внутри кристалла, что уменьшает плотность его упаковки и снижает дифракционное качество.

А.

Б.

6 8 10 12 14 16 года после первой структуры

20

18 '16 12 I 10

I • Бшдолы Ш 13~фааа Я Кубичвсх** фаза 11

II J f / # ^ ^ # /

Рис. 1.17. А. График, отражающий накопление всех новых структур белков с момента первой публикации кристаллографической структуры высокого разрешения [97]. Б. Диаграмма роста количества решенных структур мембранных белков, закристаллизованных в липидной кубической фазе, в губчатой Z-з-фазе и с помощью кристаллизации из бицелл [98].

С введением липидных мезофаз в кристаллизацию мембранных белков с целью последующего структурного анализа [43;99] совершен прорыв в области структурной биологии мембранных белков [2-6]. Несомненно, огромным успехом являются полученные недавно структуры высокого разрешения мембранных белков эукариотического происхождения [5;6;76;100]. Однако до сих пор данная система кристаллизации, состоящая в основном из белка и липида, остается плохо изученной. Не найдены ответы на вопросы о роли липидного окружения и механизм роста кристаллов в данной системе [11-13], а также является ли метод кристаллизации in meso достаточно общим эффективным методом для различных типов белков. В настоящее время огромные усилия направлены на исследование и развитие данной системы кристаллизации мембранных белков с целью последующего более рационального применения метода.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Выделение и очистка бактериородопсина

2.1.1. Материалы для культивирования бактерий и выделения бактериородопсина

В работе использовали штамм экстремальных галофильных бактерий Halobaclerium salinarum S9, любезно предоставленный профессором Г. Бюлдтом (Институт Структурной Биологии, г. Юлих, Германия).

Питательная среда для культивирования бактерий: 1% пептон (L37, Oxoid, Англия), 4,3 М NaCl, 80 мМ MgS04*7H20, 27 мМ КС1, 10 мМ дигидрат цитрата натрия, рН 6.5. Среду стерилизовали в течение 2 ч при 90°С.

Раствор базальтовой соли: 4.3 М NaCl, 80 мМ MgSOWH^O, 27 мМ КС1.

Буфер для солюбилизации БР: 3,75% (w/v) «-октил-)3-£>-глюкопиранозид, 20 мМ

NaHP04/KH2P04 (Na/K-Pi. рН 6,9).

Буфер для хранения БР: 368 мМ Na/K.-Pi рН 5,6 в тяжелой воде.

Буфер Лэмли: 25 мМ трис-HCl, рН 8.5, 192 мМ глицин, 0,1% ДДС-Na

4-кратпый буфер для нанесения проб: 0,25 М Трис-HCl, рН 6,8, 8% ДДС-Na, 40% глицерол, 20% |3-меркаптоэтанол, 0,016% бромфеноловый синий.

Разрешающий гель: 0,375 М трис-HCl, рН 8,8, 15% акриламид (акриламид : бис-акриламид - 29 : 1), 0,1% ДДС-Na, 0,06% персульфат аммония, 0,006% TEMED. Концентрирующий гель: 0,125 М трис-HCl, рН 6,8, 5% акриламид, 0,1% ДДС-Na, 0,08% персульфат аммония, 0,008% TEMED.

Окрашивающий раствор (Кумасси синий): 40% этанол, 5% уксусная кислота, 0,2% (w/v) Кумасси синий (G-250).

Раствор для отмывка гелей после окрашивания: 30% этанол, 7% уксусная кислота.

2.1.2. Культивирование бактерий. Для получения мембранного белка бактериородопсина 2-3 колонии Halobacterium salinarum штамма S9 засевали в 50 мл питательной среды (п. 2.1.1.) и инкубировали в течение 7-10 дней при 40°С, 130 об/мин и интенсивном освещении. Культуру переносили в 5 л питательной среды и выращивали в ферментере (INFOS, Швецария) при 40°С, 500 об/мин, интенсивном освещении и аэрации (5 л От в мин) до достижения оптической плотности культуры Абоо - 0,8 - 1,0. После этого поток кислорода и обороты перемешивания снижали (до

0,25 л От в мин и 200 об/мин соответственно) и продолжали ферментацию в течение 4 — 5 суток при температуре 40°С и интенсивном освещении. Клетки собирали центрифугированием при 9000 g и комнатной температуре, отмывали два раза от среды раствором базальтовой соли (п. 2.1.1.), пятикратно превышающем объем клеток. Средний выход клеточной массы составлял 7 г/л. Клеточный осадок хранили при -80°С.

2.1.3. Выделение пурпурных мембран. Halobacterium salinarum легко разрушаются под действием осмотического шока при переносе их в раствор с концентрацией соли меньше 1 М [101]. Для лизиса клеток на 1 г клеточного осадка добавляли 25 мл дистиллированной воды, содержащей ~1 мг ДНКазы (Sigma, Германия). Суспензию оставляли на ночь в темноте при непрерывном перемешивании при 4°С. Лизат осветляли центрифугированием 10 мин при 4300 g и охлаждении. Пурпурные мембраны выделяли и очищали серией последовательных центрифугирований при 4°С. Полученный супернатант откручивали дважды в течение 10 мин при 7600 g. Водную фракцию отделяли центрифугированием (55000 g, 1 ч), осадок обрабатывали дистиллированной водой с последующим ее отделением. Процедуру повторяли трижды до получения бесцветных промывных вод. Полученный осадок ПМ ресуспендировали в дистиллированной воде и центрифугировали в течение I ч при 60000 g. Полученный после двукратной промывки и центрифугирования осадок пурпурных мембран ресуспендировали в 0,02% NaN3 и хранили при -80°С. Содержание белка определяли спектрофотометрически (п. 2.2.5.). Выход фракции ПМ составлял ~8 мг/л.

2.1.4. Выделение и солюбилизация бактериородопсина. Бактериородопсин солюбилизировали добавлением по каплям при перемешивании буфера для солюбилизации (п. 2.1.1.) до конечной концентрации белка 2,5 мг/мл. Суспензию выдерживали в течение 2 суток при 4°С в темноте при непрерывном перемешивании. Солюбилизированную мембранную фракцию получали центрифугированием в течение 1 ч при 90000 g и 4°С. Надосадочную жидкость концентрировали в микроконцентраторах на 30 кДа (centricon YM-30, Millipore) в бакет-роторе при 5000 g 3 ч при 4°С, и затем сконцентрированный белок разбавляли 2,125 частями буфера для хранения белка (п. 2.1.1.) до конечной концентрации Na/K-Pi в растворе 250 мМ.

Солюбилизированный бактериородопсин в новом буфере концентрировали до нужной концентрации и хранили при -80°С. Выход фракции БР составлял ~8 мг/л.

2.1.5. Определение концентрации и качества бактериородоисина. Концентрацию и качество белкового препарата вычисляли из спектра поглощения, также степень чистоты мембранного белка определяли при помощи электрофоретического разделения образца в полиакриламидном геле. Спектр БР в УФ/видимом диапазоне (250 - 700 нм) имеет два максимума интенсивного поглощения: максимум на 280 нм, соответствующий поглощению ароматических аминокислот, и максимум в области —570 нм. соответствующий поглощению хромофора - ретиналя, и зависящий от окружения белка. Так, для свегоадаптированного БР в ПМ максимум поглощения находится на Ятах=568 нм с коэффициентом поглощения £568=62 700±700 !\Т'см"', тогда как для солюбилизированного в ОГ бактериородопсина - Дшах=553 нм и С55з=42000±700 M"'cm"' [102; 103]. Для вычисления концентрации белка использовали следующее соотношение: Сер = Лретиналь • MWbp / ( d • /:>.тах ), где СБр - концентрация бакгериродопсина (мг/мл), Аретш!ть - максимум поглощения линии ретиналя в белковом окружении, MWy,v - молярная масса бактериродопсина (26,8 кДа - в случае пурпурных мембран и 26,5 кДа - в случае солюбилизированного БР), d — длина оптического пути (см), exmax - коэффициент поглощения (М"'см''). Качество бактериородопсина (чистоту и долю нативного белка) определяли спектрофотометрически из отношения Агво/Аретиналь» величина которого для целей последующей кристаллизации не должна превышать 1,70. Если препарат не удовлетворял этому условию, белок подвергали процедуре дополнительной очистки (п. 2.1.8.).

2.1.6. Электрофоретическое разделение белков осуществляли в 15% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (15% ДЦС-Ыа-ПААГ) в вертикальной камере (Amersham, США) при силе тока 22 мА в течение часа (по Лэмли, 1970). Визуализацию белковых пятен в геле после завершения электрофореза осуществляли методом окрашивания Кумасси синий и нитратом серебра. В первом случае гель от додецилсульфата натрия отмывали водой и выдерживали в растворе Кумасси синий (окрашивающий раствор в п. 2.1.1.) в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Не связавшийся краситель отмывали в открашивающем растворе (п.

2.1.1.). В случае окрашивания нитратом серебра следовали инструкции производителя кита SilverSNAP Stain Kit II (PIERCE, США).

2.1.7. Определение концентрации детергента. Концентрацию детергента в растворе определяли методом взвешивания. После высушивания в течение не менее 2 ч под вакуумом каплю белкового раствора взвешивали, и из полученной массы вычитали массу соли и белка.

2.1.8. Дополнительная очистка солюбилизированного бактериородопсина. Метод повышения качества БР. Замороженный в жидком азоте или в морозильной камере при -80°С солюбилизированный бактериородопсин медленно опаивали на льду. Затем раствор белка дополнительно ультрацентрифугировали при 266000 g в течение I - 4 часов при 4°С (непрерывно или останавливая центрифугирование каждый час). За изменением качества белка следили спектрофотометрически, определяя величину

ОТНОШеНИЯ А28о/Аретиналь.

2.2. Кристаллизация бактериородопсина 2.2.1. Материалы для кристаллизации

Моноолеин (NU-Chek Prep, США) — моноглицерид с ненасыщенным углеводородным хвостом, водные суспензии которого формируют большое разнообразие мезофаз, при комнатной температуре образует биконтинуальные кубические фазы. Моноолеин гигроскопичен, хранили по 1 г в ампулах от производителя при -20°С. Детергенты: в работе использовали детергенты 10 семейств (Anatrace, США, за исключением и-октил-р-£>-глюкопиранозида (Sigma-AIdrich, Гермния)). Все детергенты высоко гигроскопичны и способны адсорбировать воду из атмосферы, а также светочувствительны, поэтому хранили их в темноте в закрытом виде под азотом при — 20°С. Свойства и используемые в работе при кристаллизации концентрации представлены в таблице 2.1.

Добавки: t-Бутанол (MERCK, Германия); 2-метил-2,4-пентадиол (MERCK, Германия); пентаэритритол пропоксилат (MERCK, Германия); Джеффамин М-600 (Sigma-AIdrich, Гермния); 1,4-бутандиол (MERCK, Германия); тиоцианат калия (MERCK, Германия).

Маточный раствор: 3 М Na/K-Pi, рН 5,6.

Кристаллизационный буфер (при кристаллизации in meso): 500 mM Na/K-Pi, рН 5,6. Буфер для растворения фазы моноолеина: 0,1% (w/v) и-октил-Р-Л-глюкопиранозид, 3 М Na/K-Pi, рН 5,6.

2.2.2. Кристаллизация в мостиках методом диффузии паров воды. Для кристаллизации стандартным методом использовали 24- и 96-луночные планшеты (Falcon, США). Необходимый объем маточного раствора разливали в резервуары планшетов и на полипропиленовые микромостики (Hampton Research, США) или в отведенную лунку (в случае 24- и 96-луночных плашек соответственно) раскапывали соответствующее количество предварительно приготовленной кристаллизационной смеси. Пробы герметизировали и оставляли в темноте при 22°С. Первые кристаллы наблюдали через 2-3 недели. Для эксперимента с добавлением липида в кристаллизационную смесь расплавленный при 42°С моноолеин смешивали с буфером в пропорции: 1 к 10, 16, 25 , 27, 32, 50, 64, 81, 100, 125, 250, 500, 103, 104, 105 и в получившуюся суспензию при 35°С добавляли белок. Объем маточного раствора в этом опыте составлял 400 и 600 мкл, объем капли - от 7 до 15 мкл. В случае кристаллизации из насыщенного раствора ю-октил-р-£)-глюкопиранозида детергент растворяли в буфере для кристаллизации и смешивали с белком. Соотношение объемов капле к маточному раствору изменяли от 0,0055 до 0,045. Исходные концентрации компонентов в кристаллизационной смеси варьировали в диапазоне: для белка 6-15 мг/мл, детергента 7,3 - 55,3%, Na/K-Pi в кристаллизационном буфере: 250, 600, 800 мМ.

2.2.3. Кристаллизация бактериородопсина из пурпурных мембран в мезофазе моноолеина. Кристаллизацию бактериородопсина в кубической фазе моноолеина проводили в ПЦР пробирках (Biozym, Германия). Для этого расплавленный при 42°С моноглицерид (п. 2.2.1.) раскапывали по 4 — 6 мг и осаждали центрифугированием на дно пробирки (10000 об/мин (13000 g) 10 мин). Пурпурные мембраны наилучшего качества (А280/А568 < 1,7), сконцентрированные до конечной концентрации 28 мг/мл осаждением при 20000 g (4°С), смешивали в соотношении 1:1 с удвоенной концентрацией детергента в буфере для кристаллизации (п. 2.2.1.). В итоге получали раствор пурпурных мембран (14 мг/мл) с требуемой концентрацией детергента (табл. 2.1) в 250 мМ Na/K-Pi буфере (рН 5,6), который немедленно раскапывали в предварительно приготовленные пробы с расплавленным моноолеином в соотношении 1 : 2 (МО : препарат белка). В некоторых экспериментах конечная концентрация пурпурных мембран, а также соли в пробе и соотношение моноолеин / белковый раствор варьировались, что указано непосредственно в тексте. Кристаллизационную смесь центрифугировали (1500 об/мин, 5 мин, Тком„) и выдерживали для уравновешивания системы в темноте 48 ч при 22°С. В качестве осадителя использовали сухую соль Na/K-Pi рН 5,6 (рН определяли для 100 мг/мл раствора соли) с конечной концентрацией в образце: 0,7; 0,9; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,9 М. Соль после добавления в пробу осаждали центрифугированием (1500 об/мин, 5 мин, TKOmii), и кристаллизационные пробы выдерживались сутки перед заключительным этапом гомогонезации. Для равномерного распределения белка внутри кристаллизационной пробы и быстрейшего формирования кубической фазы смесь гомогонезировали последовательным центрифугированием при 24°С, начиная с 5000 об/мин и постепенно увеличивая до 10000 об/мин (2700 - 10600 g) с шагом 1000 об/мин. Длительность каждого центрифугирования составляла 10 мин. Между центрифугированиями образцы поворачивали на 90°. Кристаллы выращивали в темноте при 22°С в течение 2-6 месяцев в зависимости от условий кристаллизации.

2.2.4. Отбор и подготовка кристаллов для кристаллографических экспериментов.

За ростом кристаллов следили при помощи стереомикроскопа (OLYMPUS, Япония). Кристаллизационные пробы с лучшими кристаллами (большого размера и правильной формой) отбирали с целью последующего использования в кристаллографических экспериментах. Для отделения кристаллов от кубической фазы содержимое кристаллизационной пробы с помощью микрошпателя переносили в 2,5 мл буфера для растворения фазы (п. 2.2.1) и выдерживали в темноте при 22°С в течение 1 - 2 недель. Из растворенных проб кристаллы помещали в криопетли (Hampton Research, США), замораживали до 100 К в криоструе (Cryostream 700 series, Oxford cryosystems, Англия) и тестировали на рентгеновской установке с вращающимся анодом (Brueker-Nonius FR571).

2.3. Кристаллографические измерения и обработка рентгеновских данных 2.3.1. Тестовые измерения и определение фактора двойникования кристаллов проводили на генераторе рентгеновского излучения с вращающимся анодом для оценки дифракционного качества белковых кристаллов перед основными измерениями. Используемый генератор оснащен двумерным Image Plate детектором (MAR Research, Гамбург, Германия) и одноосевым гониометром с горизонтальной осью вращения перпендикулярной рентгеновскому пучку. Измерения проводили при напряжение на аноде 50 кВ, силе тока 70 мА и с длиной волны рентгеновского излучения Х.= 1,5418 А (характеристическое излучение Ка линии меди). Во время дифракционных экспериментов диаметр рентгеновского пучка выставляли размером 300 мкм. Для каждого кристалла снимали 3-5 картин дифракции со временем экспозиции 300 -1800 с на одну дифракционную картину и с разрешением в диапазоне 2,0 - 30 А. Данные интегрировали в программе MOSFLM и масштабировали в программе SCALA [104]. Для каждого кристалла определяли долю двойникования. используя программу DETW1N [104], а также ресурс (www.doe-mbi.ucla.edu/Services/Tvvinning/. Yeates).

2.3.2. Установка для рентгеновской кристаллографии белков. Измерения картин рентгеновской дифракции проводили на установке ID14-EH1 ESRF (European Synchrotron Radiation Facility), которая предназначена для белковой кристаллографии. На данной установке используется монохроматичное синхротронное излучение с фиксированной длиной волны 0,934 А с размером сечения пучка 50 - 200 мкм (с расходимостью пучка 1/180°). Характерная интенсивность около 1012 фотон-мм"2^"1. Установка оборудована азотной криоструей (Cryostream 700 series, Oxford cryosystems, Англия). Для регистрации дифракционной картины на установке используется детектор рентгеновского излучения ADSC Q210 CCD (размер активной области 210 мм х 210 мм, 4096 х 4096 ячеек, время считывания 0,9 с) (Poway, США).

2.3.3. Выбор стратегии измерений. Для выбора стратегии измерений снимали две дифракционные картины, расположенные под углом 90°, по которым, используя программу MOSFLM [105], определяли разрешение (обычно 1,3 А - 1,5 А), симметрию (Р63), постоянные решетки (около 61 А х 61 Ах 110 А), мозаичность (0,2° - 0.6°), время экспозиции, угол осцилляции, начальный и конечный вращательный угол измерений. Затем снимали полный набор дифракционных данных, соответствующий для симметрии Р63 повороту кристалла на 90° с типичным углом осцилляции 0,4° и временем экспозиции 4 с на один дифракционный снимок. В случаях превышения интенсивности рефлексов в центральной части детектора его динамического диапазона снимали второй набор дифракционных данных с осцилляцией —1° и временем экспозиции 1 с на одну дифракционную картину с уменьшенной до 37,7% интенсивностью пучка и с разрешением ~2 А.

2.3.4. Обработка рентгеновских данных. [106] Данные интегрировали в программе MOSFLM [105] и масштабировали в программе SCALA [104]. Для построения моделей по данным с малой долей двойникования использовали пакет программ CCP4I [104]. Для решения фазовой проблемы использовали метод молекулярного замещения, реализованный в MOLREP [104]. В качестве начальной использовали полиаланиновую модель, построенную на основе опубликованной структуры основного состояния бактериородопсина с разрешением 1,55 А [2]. Для первичного построения модели использовали автоматизированную систему уточнения модели ARP/wARP [107]. Для дальнейшего уточнения модели использовали REFMAC5 [108]. Данные с совершенным двойникованием обрабатывали, используя специальные процедуры в CNS [109]. Карты 2Fo 1с, а также разностные карты Fo—Fc были построены как часть стандартных процедур в REFMAC5. Взвешенные экспериментальные разностные карты Fc-Fc были построены с использованием доработанных стандартных процедур в CNS. Карты электронной плотности изучались в программе Coot [110].

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Моисеева, Екатерина Сергеевна, 2010 год

1. Landau ЕМ & Rosenbusch JP (1996) Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 93, 14532-14535.

2. Moukhametzianov R, Klare JP, Efremov R, Baeken C, Goppner A, Labahn J, Engelhard M, Buldt G, & Gordeliy VI (2006) Development of the signal in sensory rhodopsin and its transfer to the cognate transducer. Nature, 440, 115-119.

3. Jaakola VP, Griffith MT, Hanson MA, Cherezov V, Chien EYT, Lane JR, IJzerman AP, & Stevens RC (2008) The 2.6 Angstrom Crystal Structure of a Human А2л Adenosine Receptor Bound to an Antagonist. Science, 322, 1211-1217.

4. Pebay-Peyroula E, Rummel G, Rosenbusch JP, & Landau EM (1997) X-ray structure of bacteriorhodopsin at 2.5 angstroms from microcrystals grown in lipidic cubic phases. Science, 277, 1676-1681.

5. Overington JP, Al-Lazikani B, & Hopkins AL (2006) Opinion How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery, 5, 993-996.

6. Parrill AL (2008) Crystal structures of a second G protein-coupled receptor: Triumphs and implications. Chemmedchem, 3, 1021-1023.

7. Caffrey M (2003) Membrane protein crystallization. Journal of Structural Biology, 142, 108-132.

8. Caffrey M (2009) Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination: Use of Lipidic Mesophases. Annual Review of Biophysics, 38, 29-51.

9. Lanyi JK & Schobert В (2004) Local-global conformational coupling in a heptahelical membrane protein: Transport mechanism from crystal structures of the nine states in the bacteriorhodopsin photocycle. Biochemistry, 43, 3-8.

10. Rivna AW, Sager G, Dahl SG, Sylte I (2009) Membrane Transporters: Structure, Function and Targets for Drug Design. Top Med Chem, 4, 15-51.

11. Michel H (2006) Crystallization of membrane proteins. International Tables for Crystallography F, 94-99.

12. Ostermeier C, Michel H (1997) Crystallization of membrane proteins. Current Opinion in Structural Biology, 7, 697-701.

13. Garavito RM, Ferguson-Miller S (2001) Detergents as tools in membrane biochemistry. J. Biol. Chem., 276, 32403-32406.

14. Anatrace (2006) Catalogue Anatrace. www.anatrace.com.

15. Reiss-Husson F, Ducruix A, Giege R (1999) Crystallization of membrane proteins. Picot, D. Crystallization of nucleic acids and proteins. A practical approach. Oxford University Press.

16. Deisenhofer J, Epp O, Miki K, Huber R, Michel I I (1985) Structure of the Protein Subunits in the Photosynthetic Reaction Center of Rhodopseudomonas-Viridis at ЗА Resolution. Nature, 318, 618-624.

17. Cowan SW, Schirmer T, Rummel G, Steiert M, Ghosh R, Pauptit RA, Jansonius JN, Rosenbusch JP (1992) Crystal-Structures Explain Functional-Properties of 2 Escherichia-Coli Porins. Nature, 358, 727-733.

18. Michel H. Crystallization of Membrane Proteins. CRC Press, Boca Raton . 1991.

19. Iwata S. Methods and Results in Crystallization of Membrane Proteins. 2003. International Unversity Line.

20. Prive GG (2007) Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods, 41, 388-397.

21. Cherezov V, Clogston J, Papiz MZ, Caffrey M (2006) Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J. Mol. Biol., 357, 1605-1618.

22. Zhou YF, Morais-Cabral JH, Kaufman A, MacKinnon R (2001) Chemistry of ion coordination and hydration revealed by a K+ channel-Fab complex at 2.0 angstrom resolution. Nature, 414,43-48.

23. Dutzler R, Campbell EB, MacKinnon R (2003) Gating the selectivity filter in C1C chloride channels. Science, 300, 108-112.

24. Dale GE, Oefner C, D'Arcy A (2003) The protein as a variable in protein crystallization. J. Struct. Biol. 142, 88-97.

25. Pebay-Peyroula E, Dahout-Gonzalez C, Kahn R, Trezeguet V, Lauquin GJM, Brandolin R (2003) Structure of mitochondrial ADP/ATP carrier in complex with carboxyatractyloside. Nature, 426, 39-44.

26. Abramson J, Smirnova I, Kasho V, Vemer G, Kaback HR, Iwata S (2003) Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Science, 301, 610-615.

27. Dahout-Gonzalez C, Brandolin G, Pebay-Peyroula E (2003) Crystallization of the bovine ADP/ATP carrier is critically dependent upon the detergent-to-protein ratio. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography, 59, 2353-2355.

28. Long SB, Tao X, Campbell EB, MacKinnon R (2007) Atomic structure of a voltage-dependent K+ channel in a lipid membrane-like environment. Nature, 450, 376-382.

29. Katona G, Andreasson U, Landau EM, Andreasson LE. Neutze R (2003) Lipidic cubic phase crystal structure of the photosynthetic reaction centre from Rhodobacter sphaeroides at 2.35A resolution. J. Mol. Biol., 331, 681-692.

30. Shearman GC, Ces O, Templer RH, Seddon JM (2006) Inverse lyotropic phases of lipids and membrane curvature. Journal of Physics-Condensed Matter, 18, SI 105-S1124.

31. Qiu H, Caffrey M (2000) The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects. Biomaterials, 21, 223-234.

32. Cherezov V, Fersi H, Caffrey M (2001) Ciystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins. Biophys. ./., 81, 225-242.

33. Chung H, Caffrey M (1994) The Curvature Elastic-Energy Function of the Lipid-Water Cubic Mesophase. Nature, 368, 224-226.

34. Chung Ii, Caffrey M (1994) The Neutral Area Surface of the Cubic Mesophase -Location and Properties. Biophysical Journal, 66, 377-381.

35. Nollert P, Qiu H, Caffrey M, Rosenbusch JP, Landau EM (2001) Molecular mechanism for the crystallization of bacteriorhodopsin in lipidic cubic phases. Febs Letters, 504, 179-186.

36. Grabe M, Neu J, Oster G, Nollert P (2003) Protein interactions and membrane geometry. Biophys. J., 84, 854-868.

37. Andersen OS, Koeppe RE (2007) Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, 36, 107-130.

38. Jensen MO, Mouritsen OG (2004) Lipids do influence protein function the hydrophobic matching hypothesis revisited. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes, 1666, 205-226.

39. Валиахметов АЯ (2008) Геометрия мембраны и функции белка. Биологические мембраны, 25, 83-96.

40. Tanford С (1978) The hydrophobic effect and the organization of living matter. Science, 200, 1012-1018.

41. Seddon AA, Curnow P, Booth PJ (2004) Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes, 1666, 105-117.

42. Prive GG (2009) Lipopeptide detergents for membrane protein studies. Curr. Opin. Struct. Biol., 19, 379-385.

43. Heerklotz H, Seelig J (2000) Correlation of membrane/water partition coefficients of detergents with the critical micelle concentration. Biophys. J., 78, 2435-2440.

44. Heerklotz H (2008) Interactions of surfactants with lipid membranes. Q. Rev. Biophys., 41, 205-264.

45. Lantzch G, Binder H, Heerklotz H, Wendling M, Klose G (1996) Surface areas and packing constraints in РОРС С (12)EO (n) membranes. A time-resolved fluorescence study. Biophys. Chem., 58, 289-302.

46. Angelov B, Ollivon M, Angelova A (1999) X-ray diffraction study of the effect of the detergent octyl glucoside on the structure of lamellar and nonlamellar lipid/water phases of use for membrane protein reconstitution. Langmuir, 15, 8225-8234.

47. Ai X, Caffrey M (2000) Membrane protein crystallization in lipidic mesophases: detergent effects. Biophys. J., 79, 394-405.

48. Misquitta Y, Caffrey M (2003) Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization. Biophys. J., 85, 3084-3096.

49. Anderson DM, Gruner SM, Leibler S (1988) Geometrical Aspects of the Frustration in the Cubic Phases of Lyotropic Liquid-Crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 85, 5364-5368.

50. Caffrey M, Lyons J, Smyth T, Hart DJ (2009) Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Membrane Protein Crystallization, 63, 83-108.

51. Raman P, Cherezov V, Caffrey M (2006) The Membrane Protein Data Bank. Cell Mol. Life Set, 63, 36-51.

52. Lanyi JK (2004) X-ray diffraction of bacteriorhodopsin photocycle intermediates. Mol. Membr. Biol., 21, 143-150.

53. Cherezov V, Yamashita E, Liu W, Zhalnina M, Cramer WA, Caffrey M (2006) In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution. J. Mol. Biol., 364,716-734.

54. Cherezov V, Liu W, Derrick JP, Luan B, Aksimentiev A, Katritch V, Caffrey M (2008) In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin. Proteins, 71, 24-34.

55. Hanson MA, Cherezov V, Griffith MT, Roth CB, Jaakola VP, Chien EY, Velasquez J, Kuhn P, Stevens RC (2008) A specific cholesterol binding site is established by the 2.8 A structure of the human ^-adrenergic receptor. Structure, 16, 897-905.

56. Ridell A, Ekelund K, Evertsson H, Engstrom S (2003) On the water content of the solvent/monoolein/water sponge (£3) phase. Colloids and Surfaces A-Physicochemical and Engineering Aspects, 228, 17-24.

57. Engstrom S, Alfons K, Rasmusson M, Ljusberg-Wahren H (1998) Solvent-induccd sponge (Li) phases in the solvent-monoolein-water system. Progress in Colloid and Polymer Science, 108. 93-98.

58. Faham S, Bowie JU (2002) Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J. Mol. Biol., 316, 1-6.

59. Faham S, Boulting GL, Massey EA, Yohannan S, Yang D, Bowie JU (2005) Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Sci., 14, 836-840.

60. Faham S, Uj'wal R, Abramson J, Bowie JU (2009) Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Current Topics in Membranes, 63, 109-125.

61. Sanders CR, Prestegard JH (1990) Magnetically orientable phospholipid bilayers containing small amounts of a bile salt analogue, CHAPSO. Biophys. J., 58, 447-460.

62. Sanders CR, Schwonek JP (1992) Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry, 31, 8898-8905.

63. Sanders CR, Landis GC (1995) Reconstitution of membrane proteins into lipid-rich bilayered mixed micelles for NMR studies. Biochemistry, 34, 4030-4040.

64. Sanders CR, Prosser RS (1998) Bicelles: a model membrane system for all seasons? Structure, 6, 1227-1234.

65. Ujwal R, Cascio D, Colletier JP, Faham S, Zhang J, Того L, Ping P, Abramson J (2008) The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 105, 17742-17747.

66. Kouyama T, Yamamoto M, Kamiya N, Iwasaki H, Ueki T, Sakurai I (1994) Polyhedral assembly of a membrane protein in its three-dimensional crystal. J. Mol. Biol., 236, 990-994.

67. Takeda K, Sato H, Hino T, Kono M, Fukuda K, Sakurai I, Okada T, Kouyama T (1998) A novel three-dimensional crystal of bacteriorhodopsin obtained by successive fusion of the vesicular assemblies. J. Mol. Biol., 283, 463-474.

68. Denkov ND, Yoshimura H, Kouyama T, Walz J, Nagayama К (1998) Electron cryomicroscopy of bacteriorhodopsin vesicles: mechanism of vesicle formation. Biophys. J., 74, 1409-1420.

69. Gordeliy VI, Moiseeva ES (2008) Crystallization of membrane proteins. In Soft matter: From Synthetic to Biological Materials 2008, ed.: Dhont JKG, Gompper G, Nagele G, Richter D, Winkler RG, FZ-Juelich.

70. Oesterhelt D, Stoeckenius W (1971) Rhodopsin-Like Protein from Purple Membrane of Halobacterium-Halobium. Nature-New Biology, 233, 149-152.

71. Henderson R (1975) The structure of the purple membrane from Halobacterium hallobium: analysis of the X-ray diffraction pattern. J. Mol. Biol., 93, 123-138.

72. Kates M (1992) Archaebacterial lipids: structure, biosynthesis and function. Biochem. Soc. Symp., 58, 51-72.

73. Kates M. Kushwaha SC, Sprott GD (1982) Lipids of purple membrane from extreme halophiles and of methanogenic bacteria. Methods Enzymol, 88, 98-111.

74. Sass HJ, Buldt G, Gessenich R, Hehn D, NeflTD, Schlesinger R, Berendzen J, Ormos P (2000) Structural alterations for proton translocation in the M state of wild-type bacteriorhodopsin. Nature, 406, 649-653.

75. Facciotti MT, Rouhani S, Burkard FT, Betancourt FM, Downing KH, Rose RB. McDennott G, Glaeser RM (2001) Structure of an early intermediate in the M-state phase of the bacteriorhodopsin photocyclc. Biophys. J., 81, 3442-3455.

76. Luecke H, Richter HT, Lanyi JK (1998) Proton transfer pathways in bacteriorhodopsin at 2.3 angstrom resolution. Science, 280, 1934-1937.

77. Parsons S (2003) Introduction to twinning. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 59, 1995-2003.

78. Dauter Z (2003) Twinned crystals and anomalous phasing. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 59, 2004-2016.

79. Efremov R, Moukhametzianov R, Buldt G, Gordeliy V (2004) Physical detwinning of hemihedrally twinned hexagonal crystals of bacteriorhodopsin. Biophys. J., 87, 36083613.

80. Yeates TO (1997) Detecting and overcoming crystal twinning. Methods Enzymol., 276, 344-358.

81. Edman K, Royant A, Larsson G, Jacobson F, Taylor T, van der Spoel D, Landau EM, Pebay-Peyroula E, Neutze R (2004) Deformation of helix С in the low temperature L-intermediate of bacteriorhodopsin. J. Biol. Chem, 279,2147-2158.

82. Sauter С, Ng JD, Lorber B, Keith G, Brion P, Hosseini MW, Lehn JM, Giege R (1999) Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids. Journal of Crystal Growth, 196, 365-376.

83. Borshchevskiy V, Efremov R, Moiseeva E, Buldt G, Gordeliy V (2010) Overcoming merohedral twinning in crystals of bacteriorhodopsin grown in lipidic mesophase. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr66, 26-32.

84. Ivetac A, Sansom MS (2008) Molecular dynamics simulations and membrane protein structure quality. Eur. Biophys. J., 37, 403-409.

85. White SH (2004) The progress of membrane protein structure determination. Protein Science, 13, 1948-1949.

86. Johansson LC, Wohri AB, Katona G, Engstrom S, Neutze R (2009) Membrane protein crystallization from lipidic phases. Curr. Opin. Struct. Biol., 19, 372-378.

87. Rummel G. Hardmeyer A, Widmer G, Chiu ML, Nollert P, Locher KP, Pedruzzi I, I, Landau EM, Rosenbusch JP (1998) Lipidic Cubic Phases: New Matrices for the Three-Dimensional Crystallization of Membrane Proteins. J. Struct. Biol., 121, 82-91.

88. Cherezov V, Peddi A, Muthusubramaniam L, Zheng YF, Caffrey M (2004) A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 60, 1795-1807.

89. Oesterhelt D, Stoeckenius W (1973) Functions of a new photoreceptor membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 70, 2853-2857.

90. Dencher NA, Heyn MP (1978) Formation and properties of bacteriorhodopsin monomers in the non-ionic detergents octyl-beta-D-glucoside and Triton X-100. FEBS Lett., 96, 322-326.

91. Tatulian SA (2003) Attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy: a method of choice for studying membrane proteins and lipids. Biochemistry, 42, 11898-11907.

92. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. (1994) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr50, 760-763.

93. Leslie AG (2006) The integration of macromolecular diffraction data. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 62, 48-57.

94. Борщевская Ю.А. (2009) Рентгеноструктурное исследование влияние полярного окружения на кристаллизацию мембранных белков. Московский Физико-Технический Институт (ГУ) .

95. Perrakis A, Morris R, Lamzin VS (1999) Automated protein model building combined with iterative structure refinement. Nat. Struct. Biol., 6, 458-463.

96. Murshudov GN, Vagin AA, Dodson EJ (1997) Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 53, 240-255.

97. Emsley P, Cowtan К (2004) Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 60, 2126-2132.

98. Duschl A, Lanyi JK, Zimanyi L (1990) Properties and photochemistry of a halorhodopsin from the haloalkalophile, Natronobacterium pharaonis. J. Biol. Chem, 265, 1261-1267.

99. Caffrey M, Cherezov V (2009) Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protoc., 4, 706-731.

100. Решстняк А.Б., Борщевский В.И., Кларе Й., Моисеева Е.С., Энгельгардт М., Бюлдт Г., Горделий В.И. (2008) Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 12, 78-84.

101. Nollert Р, Royant A, Pebay-Peyroula Е, Landau ЕМ (1999) Detergent-free membrane protein crystallization. Febs Letters, 457, 205-208.

102. Ефремов Р.Г. (2005) Исследование структуры и механизма функционирования ретиналь-содержащих мембранных белков: кристаллизация и фиксация промежуточных состояний белков в кристаллах. Московский Физико-Технический Институт (ГУ) .

103. Michel Н, Oesterhelt D (1980) Three-dimensional crystals of membrane proteins: bacteriorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 77, 1283-1285.

104. Силачева M.A. (2008) Роль неламеллярных липидов (моноолеина) в кристаллизации мембранных белков. Московский Физико-Технический Институт (ГУ) .

105. Tsuchiya Т, Saito S (1984) Use of n-octyl-beta-D-thioglucoside, a new nonionic detergent, for solubilization and reconstitution of membrane proteins. J. Biochem., 96, 1593-1597.

106. Saito S, Tsuchiya T (1984) Characteristics of n-octyl beta-D-thioglucopyranoside, a new non-ionic detergent useful for membrane biochemistry. Biochem. J., 222, 829832.

107. Lorber B, Bishop JB, DeLucas LJ (1990) Purification of octyl beta-D-glucopyranoside and re-estimation of its micellar size. Biochim. Biophys. Acta, 1023, 254-265.

108. Newstead S, Ferrandon S, Iwata S (2008) Rationalizing alpha-helical membrane protein crystallization. Protein Sci., 17, 466-472.

109. Lantzch G, Binder H, Heerklotz H, Wendling M, Klose G (1996) Surface areas and packing constraints in POPC C^EOn membranes. A time-resolved fluorescence study. Biophys. Chem, 58,289-302.

110. Фукс H. (1935) О зарождении кристаллов. Успехи Физических Наук, XV, 496521.

111. Anatrace. www.anatrace.com. Catalogue Anatrace Inc. 2010 ed. 2010.

112. Iverson TM, Luna-Chavez C, Cecchini G, Rees DC (1999) Structure of the Escherichia coli fumarate reductase respiratory complex. Science, 284, 1961-1966.

113. Dawson RJ, Locher KP (2006) Structure of a bacterial multidrug ABC transporter. Nature, 443, 180-185.

114. Cartailler JP, Luecke H (2003) X-ray crystallographic analysis of lipid-protein interactions in the bacteriorhodopsin purple membrane. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 32, 285-310.

115. Redinbo MR, Cascio D. Choukair MK, Rice D, Merchant S, Yeates TO (1993) The 1.5-A crystal structure of plastocyanin from the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry, 32, 10560-10567.