Исследование двухкомпонентных белковых сигнальных систем: комплекс сенсорного родопсина с трансдюсером NpSRII/NpHtrII тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Рижиков Юрий Леонидович

• Рижиков Юрий Леонидович
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Рижиков Юрий Леонидович

СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Двухкомпонентные белковые сигнальные системы (ТСБб)

1.2 Комплекс сенсорного родопсина II (^р8М1) с его родственным трансдюсером

1.3 Методы решения пространственной структуры белков ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Приготовление образцов

2.1.1 Трансформация плазмиды и белковая экспрессия

2.1.2 Хроматография

3.1.3 Сборка нанодисков и реконституция мембранных белков

2.2 Метод малоуглового рассеяния

2.2.1 Общие сведения

2.2.2 Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и нейтронов

2.2.3 Методы интерпретации малоугловых данных 2.2.3.1 Корреляционная функция плотности

2.2.3.2 Инварианты рассеяния 2.2.3.4 Метод вариации контраста

2.3 Установки малоуглового рассеяния

2.3.1 BM29, синхротрон ESRF

2.3.2 ЮМО, ИБР-2, ОИЯИ

2.3.3 Ригаку, МФТИ

ГЛАВА 3. Методические особенности применения метода малоуглового рассеяния для структурных исследований мембранных белков на примере комплекса

3.1 Учёт влияния детергентного пояса при обработке данных МУР

3.2 Учёт влияния наличия олигомеров разного порядка при обработке данных Выводы главы

ГЛАВА 4. Исследование комплекса солюбилизированного в

детергенте

4.1 Димеризация NpSRII/NpHtrII, сосотояние частичной разупорядоченности и применение модели гибких шарниров для описания пространственной конфигурации трансдюсера

4.2 Исследование влияния ионной силы раствора на конформацию и олигомерное состояние NpSRII/NpHtrII солюбилизированного в детергенте (ОБМ)

4.3 Модель высокого разрешения тримера димеров NpSRII/NpHtrII

4.4 Обобщение результатов обработки данных МУР для комплекса NpSRII/NpHtrII солюбилизированного в детергенте

4.5 Негативное контрастирование для ^р8М1/^рН1:г11 солюбилизированного в ББМ

Выводы главы

ГЛАВА 5. Исследование комплекса ^р8М1/^рН1:г11 реконструированного в фосфолипидные нанодиски

5.1 Кристаллы реконструированного в нанодиски ^р8М1/^рН1:г11

5.2 Малоугловые измерения ^р8М1/^рН1:г11 реконструированного в нанодиски

5.3 Криоэлектронная микроскопия одиночных частиц для комплекса ^р8МЩрН1:г11 реконструированного в нанодиски

Выводы главы

БЛАГОДАРНОСТИ

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование двухкомпонентных белковых сигнальных систем: комплекс сенсорного родопсина с трансдюсером NpSRII/NpHtrII»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы

Двухкомпонентные сигнальные системы (ДСС) являются самыми распространенными белковыми системами сигнализации в природе, обеспечивающей основную связь микроорганизмов с окружающей средой. Первый компонент - рецепторы TCS, как правило, мембранные белки. Существует три основных типа мембранных сенсоров ДСС: гистидинкиназы, хеморецепторы и фоторецепторы. Они имеют похожую модульную структуру. Учитывая их отсутствие у млекопитающих, ДСС являются потенциальными мишенями противомикробных препаратов. Для полного понимания молекулярных механизмов передачи сигналов рецепторами ДСС через мембрану необходимо иметь информацию об атомарной структуре белка. Несмотря на важность ДСС, в настоящее время доступны только структуры с высоким разрешением фрагментов этих белков. Полноразмерный белок может быть довольно динамичным, что затрудняет кристаллизацию. По этой причине структурные методы с низким разрешением, такие как малоугловое рассеяние (МУР), в сочетании с компьютерным моделированием, объединяющим МУР и структуры фрагментов белка с высоким разрешением, могут обеспечить надежную модель с высоким разрешением полноразмерных сенсоров ДСС. Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы заключалась в изучении структуры фоторецепторного комплекса сенсорного подопсина 2 (SRII) с его родственным трансдюсером (HtrII) из Natronomonas pharaonis (NpSRII/NpHtrII) с помощью метода малоуглового рассеяния.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи исследования: - ко-экспрессия в клетках Escherichia coli и ко-очистка методами аффинной и ионообменной хроматографии, а также гель-фильтрации компонентов комплекса NpSRII/NpHtrII;

- изучение степени упорядоченности вторичной структуры белка в зависимости от условий (ионная сила раствора) с помощью спектроскопии кругового дихроизма;

- исследование олигомерного состояния и структуры комплекса методами малоуглового рассеяния рентгеновских лучей и нейтронов;

- биоинформатический анализ последовательности гена и трехмерной структуры белка с целью поиска консервативных аминокислот, отвечающих за цитоплазматический контакт димеров при образовании тримеров димеров;

- получение трёхмерной структуры комплекса димера и тримера димеров Лр8Ш1/ЛрИМ1.

Научная новизна работы

В данной работе впервые представлена атомарная модель тримера димеров полноразмерного фоторецептора двухкомпонентной сигнальной системы. Комбинация методов малоуглового рассеяния и молекулярной динамики впервые применена для получения атомарной структуры мембранного сенсора ДСС. Практическая значимость работы

Двухкомпонентные системы являются наиболее распространенными сигнальными системами прокариот и имеют представителей в эукариотах. Учитывая их отсутствие у млекопитающих, двухкомпонентные сигнальные системы считаются потенциальными мишенями противомикробного препарата. Для этих целей необходимо понимать механизмы передачи сигналов сенсорами двухкомпонентных систем через мембрану, что невозможно без понимания атомарного строения сенсоров. В данной работе предложена атомарная модель сенсора двухкомпонентной системы, полученная с помощью метода малоуглового рассеяния в комбинации с молекулярным моделированием. Результаты данной работы имеют ключевое значение для рационального планирования исследований с помощью прямых методов получения структуры с высоким разрешением -рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии. Положения, выносимые на защиту

1. С помощью методов малоуглового рентгеновского и нейтронного рассеяния было впервые показано, что комплекс NpSRII/NpHtrlI образует димеры при гетерологической ко-экспрессии в E.coli, целостность которых не нарушается в процессе солюбилизации в детергенте и очистки.

2. Обнаружено, что димеры NpSRII/NpHtrII при стандартных физиологических условиях (150 mM NaCl, pH 7.0-8.0) частично разупорядочены: доля белка, свёрнутого в a-спирали, составляет 29%. При увеличении ионной силы раствора доля a-спиралей увеличивается до 63% (при 4.0 М NaCl).

3. Показано, что димеры NpSRII/NpHtrII при стандартных физиологических условиях обладают высокой степенью полидисперсности, которая может быть описана в рамках модели гибких шарниров.

4. С помощью малоуглового рассеяния показано, что при увеличении ионной силы раствора образуются тримеры димеров комплекса NpSRII/NpHtrII, в которых контакт между димерами происходит только по цитоплазматической части, трансмембранные части димеров при этом не контактируют друг с другом.

5. На основе полученных нами данных малоуглового рассеяния и молекулярной динамики предложена (построена) модель тримера димеров комплекса NpSRII/NpHtrII с атомарным разрешением. Установлено в рамках этой модели, что формирование цитоплазматических контактов происходит посредством контактов высоко-консервативных участков цитоплазматических частей, аналогично формированию контактов цитоплазматических участков димеров хеморецепторов. Также показано, что сайты метилирования в этой модели доступны для ферментов CheR и CheB.

Степень достоверности и апробация результатов

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, рецензируемых ВАК,

Scopus, Web of Science. Результаты исследований доложены на семи конференциях:

59-я, 60-я, 61-я и 62-я Научные конференции МФТИ (г. Долгопрудный) в 2016,

2017, 2018 и 2019 годах соответственно, 42nd FEBS Congress 2017: from molecules

to cells and back (42й Конгресс Федерации Европейских Биохимических Сообществ

2017) в 2017 году (Израиль, Иерусалим), International Conference

"BIOMEMBRANES 2018" (Международная конференция Биомембраны-2018) в 2018 году (г. Долгопрудный), VII European Conference on Neutron Scattering (ECNS 2019) (7-я Европейская Конференция по Нейтронному Рассеянию) в 2019 году (г. Санкт-Петербург).

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Двухкомпонентные белковые сигнальные системы (ТС8э)

Двухкомпонентные сигнальные системы представлены по всех доменах, представляющих многообразие живых существ. ДСС наиболее распространены в природе, однако отсуттвуют у млекопитающих, что делает их потенциальными мишенями противомикробных преператов [1]. Недавняя работа показала, что ДСС, экспрессируемые в клетках млекопитающих, могут опосредовать ортогональные сигнальные пути [2]. Однако, для этого потребуются более подробные сведения на атомном уровне относительно связи их структуры и функций. На сегодняшний день, была получена подробная информация о хемотаксисе и фоторецепторе TCS подвижных кишечных бактерий и архей соответственно [3], [4]. Представители этого семейства ДСС состоят из трансмембранного рецептора, который взаимодействует с гистидин-киназой (CheA) и адапторными белками (CheW), прикрепленными к их крайним частям их цитоплазматическим доменов. Регуляторы ответа CheY и CheB фосфорилируются CheA и функционируют либо как фактор переключения для жгутикового двигателя (CheY), либо как компонент адаптации (CheB) [5] (Рис. 1). Рецепторы хемотаксиса подвижных бактерий образуют гомодимеры, состоящие из внеклеточного сенсорного домена и трансмембранных областей и длинного стержневидного цитоплазматического домена. Для фоторецепторов сенсорный домен представляет собой микробный родопсин, который образует комплекс 2: 2 со своим родственным трансдюсером (Шг). Трансдюсеры имеют длинный цитоплазматический домен, аналогично хеморецепторам, с которыми они имеют высокий уровень гомологичности [4], [6] (Рис. 2).

Рисунок 1.1. Сигнальный каскад в случае двухкомпонентной системы фототаксиса из Ыа№опотопа8 ркагаот8 [5]. Активированный при воздействии света Ыр\ВЯЛ индуцирует структурные и/или динамические изменения в трансдюсере, которые преобразуются двумя НАМР-доменами и передаются вдоль цитоплазматического киназного модуля длиной 200 А до крайней области цитоплазматической части области ^рНМ! Активированная трансдюсером гистидинкиназа СИеА (связанная с адаптерным белком CheW) подвергается автофосфорилированию и дополнительно переносит фосфатную группу в регуляторы ответа ОДеУ или ОДеВ. ОДеУ влияет на смещение вращения жгутикового двигателя, в то время как метилэстераза ОДеВ наряду с метилтрансферазой ОДеЯ контролирует механизм адаптации.

Цитоплазматический домен Шг имеет модульную конструкцию, включающую трансмембранную (ТМ) область, два НАМР домена (соединенные спиральной Мег-НАМР [7] областью) и адаптационный модуль, содержащий обратимые сайты метилирования и глициновый (01у) гибкий шарнир. Смежная сигнальная область содержит сайты связывания для белка-адаптера CheW и гистидинкиназы ОДеА. Интересно, что хеморецепторы кишечных бактерий обладают только одним

HAMP-доменом [8], в то время как трансдюсеры архей могут включать два HAMP-домена.

Рисунок 1.2. Доменная архитектура хемо- и фоторецепторов. Изображения димера хеморецептора (Tar и Tsr в комплексе с киназами) из E.coli и фотосенсорного димера комплекса сенсорного родопсина II с его родственным трансдюсером NpHtrII и киназ из N. pharaonis показаны слева и справа, соответственно.

Несмотря на множество биохимических данных, молекулярный механизм передачи сигнала с помощью ДСС еще предстоит полностью раскрыть. Общее схема предполагает последовательные динамические изменения в цитоплазматических доменах. Как хеморецепторы, так и трансдюсеры демонстрируют различную динамику в соседних модулях, что коррелирует с передачей сигнала вдоль цитоплазматического стержня [5], [9]. Возможная роль гибких шарниров (связанных с HAMP-доменами и глициновым гибким шарниром киназного домена) может заключаться в достижении стерически не запрещённых

конфигураций димеров при образовании тримеров димеров и олигомеров более высокого порядка [10], [11]. Эти тримеры димеров составляют функциональную единицу, способную активировать CheA [12]. Вместе с CheA и CheW, тримеры димеров образуют структурно-функциональную единицу при образовании сигнальных 2D-массивов [13] - компактных мембранные супер комплексов, отвечающих за усиление входящего сигнала [14]-[16].

Важным условием полного понимания механизма передачи сигнала с помощью тримеров димеров является структурная информация высокого разрешения для полноразмерного рецептора ДСС. Однако трехмерные рентгеновские структуры с атомным разрешением были опубликованы только для фрагментов хеморецепторов [17]-[19] и для усеченного комплекса из N. pharaonis [20], для которого также доступны структурные данные, полученные с помощью метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [21]. Кроме того, несколько атомистических моделей хеморецепторов E.coli были построены на основе данных EM низкого разрешения, в частности, гомодимера аспартатного рецептора Tar [10], тримеров димеров цитоплазматических доменов сериновых хеморецепторов в разных сигнальных состояниях [22], и центральный сигнальный блок хемосенсорного 2D-массива, образованного смесью рецепторов с различными адаптационными модификациями [23]. Эта недостаточность описаний с высоким разрешением структур полноразмерных сенсоров TCS, вероятно, связана с присущей им гибкостью их цитоплазматических доменов [5], [9], [10]. Однако малоугловое рассеяние является методом низкого разрешения, который может быть очень эффективным в сочетании с доступными структурами фрагментов белка с высоким разрешением с использованием компьютерного моделирования [24], [25]. Важным преимуществом МУР является то, что структурные данные могут быть собраны для солюбилизированных белковых комплексов в условиях, близких к их естественной среде.

1.2 Комплекс сенсорного родопсина II (NpSRII) с его родственным трансдюсером A^HtrII

Сенсорный родопсин II (SRII) из Natronobacterium pharaonis представляет собой фотоактивный трансмембранный белок с семью спиралями, ответственный за отрицательный фототаксис. Воздействие света на SRII в комплексе с его трансдюсером (HtrII) вызывает каскад цитоплазматических сигналов за счет вращения спирали преобразователя TM2. Согласно структуре белка SRII в комплексе с укороченным трансдюсером Htr114 (остатки 1-114) (1H2S) комплекс функционирует в димерной форме. По аналогии с хеморецепторами ожидается, что полный комплекс NpSRII/NpHtrII функционирует как тример димеров. NpSRII/NpHtrII опосредует отрицательный фототаксис в галобактерии N. pharaonis и представляет собой сенсор ДСС, который аналогичен хеморецепторам по доменной архитектуре [26] и образует тримеры димеров в мембране N. Pharaonis [27]. Оптимальные условия роста N. pharaonis соответствуют концентрации соли 3.5 M NaCl [28]. Было показано, что труктура и олигомерное состояние цитоплазматического домена NpHtrII сильно зависит от концентрации соли [29]. В настоящей работе предложена структура полноразмерного комплекса сенсорного родопсина с его родственным трансдюсером, полученная с помощью описанных в интегрирования описанных в литературе атомарных структур фрагментов сенсоров ДСС с данными МУР. Структурная информация для NpSRII была получена в комплексе с TM доменом NpHtrII, которые показывают димерную организацию в различных активированных состояниях [20], [30], [31]. Для остальной части NpHtrII, были выбраны гомологи, включая HAMP-домены цитоплазматического сенсора Aer2 [19] и для гипотетического трансмембранного рецептора AF1503 [32], гистидинкиназы NarQ [33], [34], и киназные модули, включая метил-акцептирующий белок хемотаксиса I (Tsr) из E.coli [18] и белок хемотаксиса из Thermatoga maritima [35], [36]. Наша работа как подтверждает зависимость олигомерного состояния от ионной силы, так и дает атомные модели димеров и и тримеров димеров полноразмерного комплекса. Полученные результаты

позволяют предложить модель в форме «триноги» («tripod», англ.) для полноразмерного тримера димеров NpSRII/NpHtrII димеров, в котором димеры контактируют между собой исключительно через контакты между их цитоплазматическими доменами.

Рисунок 1.3. Схема передачи сигналов негативного фототаксиса, принципиальная структура комплекса ^рВЯП/^рН1гП из Ка1хопоЬас1егшт phaгaonis и схема структурных изменений тримеров димеров в передаче сигналов негативного фототаксиса, полученные с помощью молекулярного моделирования. Двухкомпонентные сигнальные системы с участием фосфорилируемых остатков гистидина и аспартата наиболее часто встречаются у бактерий. Аналогичные системы обнаружены в организмах прокариот, но в этом случае преобладают сигнальные каскады с переносом фосфата между остатками серина, треонина и тирозина.

В 2002 г. методом рентгеноструктурного анализа была получена структура комплекса сенсорного родопсина II с укороченным трансдьюсером ^Ы1/ШгПп4) с разрешением в 1.94А, что позволило объяснить первый этап передачи фотосигнала комплексом [37]. Также в данной работе была представлена подробная схема фрагмента комплекса, где трансдюсер связывается с SRII.

Рисунок 9. Трехмерное изображение водородных и ван-дер-Ваальсовых связей между ^^МТ (красный) и (зеленый).

1.3 Методы решения пространственной структуры белков

Получение детальной информации об атомной структуре белка может осуществляться такими методами, как ядерный магнитный резонанс (ЯМР), криоэлектронная микроскопия одиночных частиц (крио-ЕМ) и рентгеноструктурный анализ (РСА).

Метод ЯМР основан на измерении химического сдвига, которым характеризуют положение пиков поглощения электромагнитной энергии во внешнем магнитном поле атомными ядрами с ненулевым спином. Главным недостатком ЯМР является ограничение по массе исследуемого белка ~ 40кДа, что делает его пригодным лишь для узкого класса задач. Популярность этого метода снизилась за последние 10 лет, в соответствии со статистикой, приведённой на рисунке 1.

3

1000 -800 -600 -£ 400 -^ 200 -

-1-

NM _

О S3

Vh

0

ш

1990

1995

2000

2005

2010

2015

2020

1400 1200 -I

0

o1000 h 800 "р 600 ^ 400 О 200

Vh

CP

^ 10000 ^ 8000 ¡>н 6000 4000 2000 0

cryo-EM

нПП1

1990

1995

2000

2005

2010

2015

2020

X-ray

--.-.ПпПППП П

1990

1995

2000

2005

Year

2010

2015

2020

Рисунок 1. Статистика числа структур, решаемых ежегодно методами ЯМР, крио-ЕМ и РСА [38].

Один из видов ЯМР спектроскопии - двухмерная ядерная магнитно-резонансная спектроскопия (2D NMR), в котором данные распределены в пространстве по двум осям. Виды двухмерной ЯМР включают в себя корреляционную спектроскопию (COSY), J-спектроскопию, обменную спектроскопию (EXSY), а также ядерную спектроскопию с эффектом Оверхаузера (NOESY). Двухмерная ЯМР представляет

больше сведений о структуре молекулы, чем одномерные ЯМР спектры и особенно удобна в установлении структуры молекулы, особенно сложных молекул.

Рисунок 2. Пример 2D спектра COSY, а также структура высокого разрешения в растворе для комплекса дигидрофолатредуктазы (16 кДа) с триметопримом и НАДФН.

Крио-ЕМ - вид просвечивающей электронной микроскопии, в котором измерения проводятся при криогенных температурах (-180 °С и ниже). Этот метод набирает популярность в структурной биологии. Однако пока крио-ЕМ годится только для исследования крупных белков. Так, масса бета-галактозидазы кишечной палочки, для которой была решена структура с разрешением 2.2 А, состовляет 467 кДа [39]. Структуры с разрешением 4.5 А удалось получить для ряда объектов (вирусов, рибосом, митохондрий, ионных каналов и белковых комплексов), масса которых была не ниже 170 кДа [40].

Рисунок 3. Пример восстановления 3Э структуры по данным крио-ЕМ на примере белка холестерил-переносчика эфиров, помеченного Fab-фрагментами из трех различных моноклональных антител.

РСА, в свою очередь, основан на обработке набора дифрактограмм, получаемых при рассеянии рентгеновских лучей на белковых кристаллах. Их получение является главным ограничением данного метода - на сегодняшний день нет универсального понимания механизмов белковой кристаллизации.

Рисунок 4. Микрофотография кристаллов мембранной протонной помпы бактериородопсин (ЬЯ), пример рентгеновской дифрактограммы и структура ЬЯ. Этим вызван интерес как к разработке и совершенствованию методов кристаллизации, так и расшифровке структуры с более низким разрешением другими способами, например, методом малоуглового рассеяния (МУР) [41].

МУР является методом низкого разрешения, это способ получения информации о характерных размерах исследуемого объекта, о форме частицы и распределении рассеивающей плотности внутри неё.

Рисунок 5. Восстановленная форма частицы по данным малоуглового рассеяния на примере 50S субчастицы рибосомы.

Техника вариации контраста [41], [42] позволяет разделить вклады в рассеяние от частей с разной плотностью длины рассеяния, например, от мембранных белков и их липидного окружения.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Приготовление образцов 2.1.1 Белковая экспрессия

Белковая экспрессия включает в себя несколько этапов.

Она начинается с выбора клеточной культуры, в которой белок будет экспрессироваться. В зависимости от сложности фолдинга клеточная культура будет определять сложность работы и качество рекомбинантного белка на выходе. Если для фолдинга белка не требуется помощи белков-шаперонов и других специальных белковых комплексов, с большой вероятностью лучшим решением будет использование клеток прокариот.

Прокариотические и эукариотические системы отличаются процентным соотношением транспортных РНК, что оказывает заметное влияние на выход белка. При выборе клеточной культуры необходимо это учитывать. При выбранной клеточной культуре необходимо сиквенировать плазмиду таким образом, чтобы оптимизировать производство аминокислот, кодируемых разными вариантами кодонов,

Клетки, в которые трансформирована плазмида, тратят больше ресурсов, которые могли быть использованы для более эффективного клеточного деления. В этой связи клетки без плазмиды получают преимущество и делятся быстрее, в конечном счёте уменьшая эффективность экспрессии.

Чтобы лишить клетки без плазмиды преимущества, производится селекция с помощью антибиотиков. В плазмиду встраиваются дополнительные белки, обеспечивающие резистентность к конкретным антибиотикам (например, хлорамфеникол). Эти антибиотики добавляются на этапе роста клеток для того и уменьшают число клеток без плазмиды.

Следующий этап модификации плазмиды - это прикрепление различных дополнительных аминокислотных последовательностей (тагов), которые могут быть использованы для последующей очистки целевого белка с помощью аффинной хроматографии.

На сегодняшний день большое распространение получили метки His-tag и Strep-tag. Они способствуют значительно улучшению качества очистки целевого рекомбинантного белка.

2.1.2 Хроматография

Хроматография является необходимым этапом очистки мембранных белков. С помощью метода аффинной хроматографии удаётся отделить целевой белок от остальных белков, присутствующих в клетках, которые использовались для экспрессии. Это происходит за счёт сродства целевого белка и используемой смолы. К этому типу относятся металл-хеллатная хроматография и очистка на смоле 31гер4ас1т.

Металл-хелатная аффинная хроматография и используемая в ней метка His-tag (несколько гистединов) получили широкое распространение. Метка слабо влияет на функции белка и его активность, а также на эффективность экспрессии. Сорбенты, как правило, заряженны ионами двухвалентных металлов (таких, как М2+), которые способны специфично связываться с белками, содержащими полигистидиновый таг.

Рисунок 12. Координационные химические связи, образованные двумя аминокислотными остатками гистидина и ионом М2+, иммобилизованном на металл-хелатном сорбенте М-ОТА.

В металл-хелатной аффинной хроматографии используется свойство белков связываться с иммобилизованными ионами металлов, таких как ^2+, 7п2+, М2+,

Co2+, Fe2+. Специфическое связывание осуществляется за счет наличия на поверхности белка свободных электродонорных групп.

Многие белки имеют остатки гистидина и/или цистеина и они могут связываться с металл-хелатным сорбентом так же, как и белок с His-тагом. Поэтому в ряде случаев возникает необходимость использовать металл-хелатную хроматографию совмесно с другими видами аффинной хроматографии.

Хроматография с использованием Strep-tag меток является еще одним широко используемым методом для очистки рекомбинантных белков. Strep-tag представляет собой последовательность из 8 аминокислот (WRHPQFGG), которая проявляет высокое сродство к D-биотину. Изначально Strep-tag был получен в ходе случайного перебора на предмет сродства к стрептавидину, и в дальнейших исследованиях была получена оптимизированная версия Strep-tag, которая известна как Strep-tag II (WSHPQFEK).

Главными преимуществами использования Strep-tag II являются стабильность метки, большой выход рекомбинантного белка и слабое влияние метки на активность белка.

Ниже приведена схема очистки с использованием Strep-tag:

Рисунок 13. Схематическое изображение цикла очистки с помощью Strep-tag. 1,2 - ^Ьекомбинантный белок взаимодействует с иммобилизованным Strep-tactin;

3 - вымывание белков без Strep-tag;

4 - удаление рекомбинантного белка при промывки D-биотином;

5 - вымывание D-биотина с помощью HABA;

6 - вымывание HABA с помощью буфера.

Гель-фильтрация (эксклюзионная хроматография - size exclusion chromatography -SEC) представляет собой хроматографический метод разделения фракций от размера частиц (гидродинамическому радиусу).

Исследуемый образец наносится на колонку, заполненную специальной мелкопористой средой. Сорбент устроен таким образом, что при протекании вдоль колонки более крупные частицы не заходят в поры и поэтому движутся быстрее. Мелким частицам на своем пути приходится заходить в разные поры внутри колонки и поэтому вниз колонки они приходят последними.

Рисунок 14. Принцип работы эксклюзионной хроматографии. SEC является лишь комплементарным методом очистки, который имеет смысл использовать для очистки белков лишь в комбинации с каким-либо методом аффинной хроматографии.

2.1.3 Сборка нанодисков и реконституция мембранных белков

Приготовление нанодисков со встроенными в них белками включает в себя несколько основных стадии. Это экспрессия и очистка белка MSP, приготовление липидных мицелл с использованием детергента.

Далее необходимо смешать липид/детергентные мицеллы (обычно соотношение липид/детергент =1 / 2) с белком MSP. На этом этапе необходимо добавить солюбилизированный мембранный белок, если планируется провести реконституцию этого белка в нанодиски. Необходимо придерживаться правильных пропорций перечисленных выше компонентов. Эти соотношения для сборки пустых нанодисков приводятся в таблице:

Таблица 2. Белок - липидные соотношения для пустых нанодисков.

POPC DPPC DMPC

MSP1D1 65 90 80

MSP1E1D1 85 115 100

MSP1E2D1 105 145 130

MSP1E3D1 130 180 160

При реконституции МБ в нанодиски требуется меньше липидных молекул, так как часть площади бислоя будет занимать белок.

Смесь инкубируется в течение 1 -2 часов при температуре, близкой к точке фазового перехода используемого липида.

Для завершения формирования нанодисков детергент необходимо удалить. Существует два способа сделать это: диализ, понижающий концентрацию детергента в 102 - 103 раз за один подход, и использование шариков Bio-Beads, которые адсорбируют детергент на себя. Процедура отбора детергента проводится при температуре выше температуры фазового перехода липида.

Рисунок 15. Этапы сборки нанодисков.

Последний этап приготовления нанодисков - гель-фильтрация, суть которой заключается в разделении компонентов суспензии по размерам. Этот этап необходим для отделения конгломератов и других нежелательных образований от нормальных нанодисков.

2.2. Метод малоуглового рассеяния 2.2.1. Общие сведения о методе МУР

Малоугловое рассеяние (МУР) - дифракционный метод, который широко используется для изучения надатомной структуры вещества [41]. В молекулярной биологии и биофизике метод МУР получил распространение в исследованиях растворов белков и др. высокомолекулярных соединений, а также изучения мембран, длиннопериодических структур (в т. ч. липидных мезофаз) и т. д. Как правило, в малоугловом рассеянии применяется излучение с длиной волны в несколько ангстрем. Такой же порядок величины имеют межатомные расстояния, поэтому регистрации дифракционной картины в области малых углов оказывается достаточно для изучения надатомной структуры.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Рижиков Юрий Леонидович, 2020 год

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

[1] A. E. Bem, N. Velikova, M. T. Pellicer, P. Van Baarlen, A. Marina, and J. M. Wells, "Bacterial histidine kinases as novel antibacterial drug targets," ACS Chemical Biology, vol. 10, no. 1. American Chemical Society, pp. 213-224, Jan. 16, 2015, doi: 10.1021/cb5007135.

[2] A. Mazé and Y. Benenson, "Artificial signaling in mammalian cells enabled by prokaryotic two-component system," Nat. Chem. Biol., vol. 16, no. 2, pp. 179187, 2020, doi: 10.1038/s41589-019-0429-9.

[3] G. L. Hazelbauer, J. J. Falke, and J. S. Parkinson, "Bacterial chemoreceptors: high-performance signaling in networked arrays," Trends Biochem. Sci., vol. 33, no. 1, pp. 9-19, 2008.

[4] J. P. Klare, I. Chizhov, and M. Engelhard, "Microbial rhodopsins: Scaffolds for ion pumps, channels, and sensors," Results and Problems in Cell Differentiation, vol. 45. Springer Nature, pp. 73-122, 2008, doi: 10.1007/400_2007_041.

[5] P. S. Orekhov et al., "Signaling and Adaptation Modulate the Dynamics of the Photosensoric Complex of Natronomonas pharaonis," PLOS Comput. Biol., vol. 11, no. 10, p. e1004561, Oct. 2015, doi: 10.1371/journal.pcbi.1004561.

[6] W. D. Hoff, K. H. Jung, and J. L. Spudich, "Molecular mechanism of photosignaling by archaeal sensory rhodopsins.," Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., vol. 26, pp. 223-58, 1997, doi: 10.1146/annurev.biophys.26.1.223.

[7] M. K. Koch, W. F. Staudinger, F. Siedler, and D. Oesterhelt, "Physiological sites of deamidation and methyl esterification in sensory transducers of Halobacterium salinarum," J. Mol. Biol, vol. 380, no. 2, pp. 285-302, 2008, doi: S0022-2836(08)00530-5 [pii];10.1016/j.jmb.2008.04.063 [doi].

[8] L. Aravind and C. P. Ponting, "The cytoplasmic helical linker domain of receptor histidine kinase and methyl-accepting proteins is common to many prokaryotic signalling proteins," FEMSMicrobiol. Lett, vol. 176, no. 1, pp. 111-116, 1999.

[9] N. L. Bartelli and G. L. Hazelbauer, "Differential backbone dynamics of companion helices in the extended helical coiled-coil domain of a bacterial chemoreceptor," Protein Sci, vol. 24, no. 11, pp. 1764-1776, 2015, doi:

10.1002/pro.2767.

[10] N. Akkaladevi, F. Bunyak, D. Stalla, T. A. White, and G. L. Hazelbauer, "Flexible hinges in bacterial chemoreceptors," J. Bacteriol., vol. 200, no. 5, pp. 200:e00593-17, 2018, doi: 10.1128/JB.00593-17.

[11] D. Stalla, N. Akkaladevi, T. A. White, and G. L. Hazelbauer, "Spatial restrictions in chemotaxis signaling arrays: A role for chemoreceptor flexible hinges across bacterial diversity," Int. J. Mol. Sci., vol. 20, no. 12, p. 2989, Jun. 2019, doi: 10.3390/ijms20122989.

[12] M. Li, C. M. Khursigara, S. Subramaniam, and G. L. Hazelbauer, "Chemotaxis kinase CheA is activated by three neighbouring chemoreceptor dimers as effectively as by receptor clusters," Mol. Microbiol., vol. 79, no. 3, pp. 677-685, 2011.

[13] M. Li and G. L. Hazelbauer, "Core unit of chemotaxis signaling complexes," Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 108, no. 23, pp. 9390-9395, 2011, doi: 10.1073/pnas.1104824108.

[14] J. S. Parkinson, G. L. Hazelbauer, and J. J. Falke, "Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update," Trends in Microbiology, vol. 23, no. 5. pp. 257-266, 2015, doi: 10.1016/j.tim.2015.03.003.

[15] V. Sourjik and J. P. Armitage, "Spatial organization in bacterial chemotaxis," EMBO J, vol. 29, no. 16, pp. 2724-2733, 2010.

[16] D. Bray, M. D. Levin, and C. J. Morton-Firth, "Receptor clustering as a cellular mechanism to control sensitivity," Nature, vol. 393, no. 6680, pp. 85-88, 1998.

[17] M. V Milburn et al., "Three-dimensional structures of the ligand-binding domain of the bacterial aspartate receptor with and without a ligand," Science (80-.)., vol. 254, pp. 1342-1347, 1991.

[18] K. K. Kim, H. Yokota, and S. H. Kim, "Four-helical-bundle structure of the cytoplasmic domain of a serine chemotaxis receptor," Nature, vol. 400, no. 6746, pp. 787-792, Aug. 1999, doi: 10.1038/23512.

[19] M. V. Airola, K. J. Watts, A. M. Bilwes, and B. R. Crane, "Structure of Concatenated HAMP Domains Provides a Mechanism for Signal Transduction,"

Structure, vol. 18, no. 4, pp. 436-448, Mar. 2010, doi: 10.1016/j.str.2010.01.013.

[20] V. I. Gordeliy et al., "Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin II-transducer complex," Nature, vol. 419, no. 6906, pp. 484-487, Oct. 2002, doi: 10.1038/nature01109.

[21] M. Etzkorn et al., "Complex Formation and Light Activation in Membrane-Embedded Sensory Rhodopsin II as Seen by Solid-State NMR Spectroscopy," Structure, vol. 18, no. 3, pp. 293-300, 2010, doi: 10.1016/j.str.2010.01.011.

[22] W. Yang et al., "In situ conformational changes of the escherichia coli serine chemoreceptor in different signaling states," MBio, vol. 10, no. 4, pp. e00973-19, Jul. 2019, doi: 10.1128/mBio.00973-19.

[23] A. Burt et al., "Complete structure of the chemosensory array core signalling unit in an E. coli minicell strain," Nat. Commun., vol. 11, no. 1, pp. 1-9, Dec. 2020, doi: 10.1038/s41467-020-14350-9.

[24] C. D. Putnam, M. Hammel, G. L. Hura, and J. A. Tainer, "X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: Defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution," Quarterly Reviews of Biophysics, vol. 40, no. 3. pp. 191-285, Aug. 2007, doi: 10.1017/S0033583507004635.

[25] G. Tria, H. D. T. Mertens, M. Kachala, and D. I. Svergun, "Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering," IUCrJ, vol. 2, pp. 207-217, Feb. 2015, doi: 10.1107/S205225251500202X.

[26] P. Zhang, C. M. Khursigara, L. M. Hartnell, and S. Subramaniam, "Direct visualization of Escherichia coli chemotaxis receptor arrays using cryo-electron microscopy.," Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 104, no. 10, pp. 3777-81, Mar. 2007, doi: 10.1073/pnas.0610106104.

[27] P. Orekhov et al., "Sensory Rhodopsin I and Sensory Rhodopsin II Form Trimers of Dimers in Complex with their Cognate Transducers," Photochem. Photobiol., vol. 93, no. 3, pp. 796-804, May 2017, doi: 10.1111/php.12763.

[28] M. Falb et al., "Living with two extremes: Conclusions from the genome sequence of Natronomonas pharaonis," Genome Res., vol. 15, no. 10, pp. 1336-1343, Oct.

2005, doi: 10.1101/gr.3952905.

[29] I. L. Budyak, V. Pipich, O. S. Mironova, R. Schlesinger, G. Zaccai, and J. Klein-Seetharaman, "Shape and oligomerization state of the cytoplasmic domain of the phototaxis transducer II from Natronobacterium pharaonis," Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 103, no. 42, pp. 15428-15433, Oct. 2006, doi: 10.1073/pnas.0607201103.

[30] R. Moukhametzianov et al., "Development of the signal in sensory rhodopsin and its transfer to the cognate transducer," Nature, vol. 440, no. 7080, pp. 115-119, Mar. 2006, doi: 10.1038/nature04520.

[31] A. Ishchenko et al., "New Insights on Signal Propagation by Sensory Rhodopsin II/Transducer Complex," Sci. Rep., vol. 7, p. 41811, Feb. 2017, doi: 10.1038/srep41811.

[32] H. U. Ferris et al., "The mechanisms of HAMP-mediated signaling in transmembrane receptors," Structure, vol. 19, no. 3, pp. 378-385, Mar. 2011, doi: 10.1016/j.str.2011.01.006.

[33] I. Gushchin et al., "Mechanism of transmembrane signaling by sensor histidine kinases," Science (80-. )., vol. 356, no. 6342, Jun. 2017, doi: 10.1126/science.aah6345.

[34] I. Melnikov et al., "Fast iodide-SAD phasing for high-throughput membrane protein structure determination," Sci. Adv., vol. 3, no. 5, p. e1602952, May 2017, doi: 10.1126/sciadv.1602952.

[35] X. Li et al., "The 3.2 Â Resolution Structure of a Receptor:CheA:CheW Signaling Complex Defines Overlapping Binding Sites and Key Residue Interactions within Bacterial Chemosensory Arrays," Biochemistry, vol. 52, no. 22, pp. 3852-3865, Jun. 2013, doi: 10.1021/bi400383e.

[36] C. K. Cassidy et al., "CryoEM and computer simulations reveal a novel kinase conformational switch in bacterial chemotaxis signaling," Elife, vol. 4, no. N0VEMBER2015, p. e08419, Nov. 2015, doi: 10.7554/eLife.08419.

[37] V. I. Gordeliy et al., "Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin II-transducer complex.," Nature, vol. 419, no. 6906, pp. 484-7, Oct.

2002, doi: 10.1038/nature01109.

[38] "RCSB PDB Statistics."

http : //www.rcsb .org/pdb/static. do?p=general_information/pdb_statistics/index.ht ml.

[39] A. Bartesaghi et al., "2.2 Â resolution cryo-EM structure of ß-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor.," Science, vol. 348, no. 6239, pp. 114751, Jun. 2015, doi: 10.1126/science.aab1576.

[40] W. Kühlbrandt, "Cryo-EM enters a new era.," Elife, vol. 3, p. e03678, Jan. 2014, Accessed: Mar. 04, 2016. [Online]. Available:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=4131193&tool=pmcen trez&rendertype=abstract.

[41] L. A. Feigin and D. I. Svergun, Structure Analysis by Small-Angle X-Ray and Neutron Scattering. Boston, MA: Springer US, 1987.

[42] Ю. М. Останевич and И. Н. Сердюк, "Нейтронографические исследования структуры биологических макромолекул," Успехи физических наук, vol. 137, no. 5, pp. 85-116, 1982.

[43] "ESRF - European Synchrotron Radiation Facility." http://www.esrf.eu/about (accessed Jun. 28, 2016).

[44] P. Pernot et al., "Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution," J. Synchrotron Rad, vol. 20, pp. 660-664, 2013, doi: 10.1107/S0909049513010431.

[45] "BsxCuBE - data collection software."

http : //www. esrf.eu/home/UsersAndScience/Experiments/MX/About_our_beamlin es/bm29/computing-environment/bsxcube.html (accessed Jun. 28, 2016).

[46] "О реакторе ИБР-2." http://flnp.jinr.ru/5/ (accessed Jun. 29, 2016).

[47] A. I. Kuklin, A. K. Islamov, and V. I. Gordeliy, "Scientific Reviews: Two-Detector System for Small-Angle Neutron Scattering Instrument," Neutron News, vol. 16, no. 3, pp. 16-18, Jul. 2005, doi: 10.1080/10448630500454361.

[48] "ЮМО - основные характеристики инструмента." http://flnp.jinr.ru/201/ (accessed Jun. 29, 2016).

[49] T. C. Huang, H. Toraya, T. N. Blanton, and Y. Wu, "X-ray powder diffraction analysis of silver behenate, a possible low-angle diffraction standard," J. Appl. Crystallogr., vol. 26, no. 2, pp. 180-184, Apr. 1993, doi:

10.1107/S0021889892009762.

[50] JJ X-Ray Systems ApS, "Saxsgui SOFTWARE." http://www.saxsgui.com (accessed Jun. 29, 2016).

[51] D. Franke and D. I. Svergun, "DAMMIF , a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering," J. Appl. Crystallogr., vol. 42, no. 2, pp. 342-346, Jan. 2009, doi: 10.1107/S0021889809000338.

[52] D. S. Molodenskiy, H. D. T. Mertens, and D. I. Svergun, "An automated data processing and analysis pipeline for transmembrane proteins in detergent solutions," Sci. Rep., vol. 10, no. 1, pp. 1-11, Dec. 2020, doi: 10.1038/s41598-020-64933-1.

[53] P. S. Orekhov, "Signaling and Adaptation in Prokaryotic Receptors as Studied by Means of Molecular Dynamics Simulations," PhD thesis, 2016, Accessed: Aug. 01, 2018. [Online]. Available: https://repositorium.ub.uni-osnabrueck.de/handle/urn: nbn: de:gbv: 700-2016081014821.

[54] J. Pérez and A. Koutsioubas, "Memprot: a program to model the detergent corona around a membrane protein based on SEC-SAXS data.," Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., vol. 71, no. Pt 1, pp. 86-93, Jan. 2015, doi:

10.1107/S1399004714016678.

[55] G. V. Jensen, R. Lund, J. Gummel, M. Monkenbusch, T. Narayanan, and J. S. Pedersen, "Direct observation of the formation of surfactant micelles under nonisothermal conditions by synchrotron SAXS," J. Am. Chem. Soc., vol. 135, no. 19, pp. 7214-7222, May 2013, doi: 10.1021/ja312469n.

[56] M. T. Ivanovic, M. R. Hermann, M. Wojcik, J. Pérez, and J. S. Hub, "Small-Angle X-ray Scattering Curves of Detergent Micelles: Effects of Asymmetry, Shape Fluctuations, Disorder, and Atomic Details," J. Phys. Chem. Lett., vol. 11, no. 3, pp. 945-951, Feb. 2020, doi: 10.1021/acs.jpclett.9b03154.

[57] G. S. H. Soliman and H. G. Trueper, "Halobacterium pharaonis sp.nov., a new,

extremely haloalkaliphilic archaebacterium with low magnesium requirement," Zentralblatt fur Bakteriol. Angew. und Okol. Microbiol. Abt.1 Orig.C Hyg., vol. 3, no. 2, pp. 318-329, May 1982, doi: 10.1016/S0721-9571(82)80045-8.

[58] D. R. Ortega, C. Yang, P. Ames, J. Baudry, J. S. Parkinson, and I. B. Zhulin, "A phenylalanine rotameric switch for signal-state control in bacterial chemoreceptors," Nat. Commun., vol. 4, no. 1, pp. 1-8, Dec. 2013, doi: 10.1038/ncomms3881.

[59] M. K. Koch, W. F. Staudinger, F. Siedler, and D. Oesterhelt, "Physiological Sites of Deamidation and Methyl Esterification in Sensory Transducers of Halobacterium salinarum," J. Mol. Biol., vol. 380, no. 2, pp. 285-302, Jul. 2008, doi: 10.1016/j.jmb.2008.04.063.

[60] Q. Gao, A. Cheng, and J. S. Parkinson, "Conformational shifts in a chemoreceptor helical hairpin control kinase signaling in Escherichia coli," Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 116, no. 31, pp. 15651-15660, 2019, doi: 10.1073/pnas.1902521116.

[61] M. Doebber et al., "Salt-driven equilibrium between two conformations in the HAMP domain from Natronomonas pharaonis: The language of signal transfer?," J. Biol. Chem., vol. 283, no. 42, pp. 28691-28701, Oct. 2008, doi: 10.1074/jbc.M801931200.

[62] I. L. Budyak et al., "Flexibility of the Cytoplasmic Domain of the Phototaxis Transducer II from Natronomonas pharaonis," J. Biophys., vol. 2008, pp. 1-11, 2008, doi: 10.1155/2008/267912.

[63] J. P. Klare et al., "Effects of solubilization on the structure and function of the sensory rhodopsin II/transducer complex.," J. Mol. Biol., vol. 356, no. 5, pp. 1207-21, Mar. 2006, doi: 10.1016/j.jmb.2005.12.015.

[64] I. L. Budyak et al., " Flexibility of the Cytoplasmic Domain of the Phototaxis Transducer II from Natronomonas pharaonis ," J. Biophys., vol. 2008, pp. 1-11, 2008, doi: 10.1155/2008/267912.

[65] K. H. Jung, E. N. Spudich, V. D. Trivedi, and J. L. Spudich, "An archaeal photosignal-transducing module mediates phototaxis in Escherichia coli," J. Bacteriol., vol. 183, no. 21, pp. 6365-6371, 2001, doi: 10.1128/JB.183.21.6365-

6371.2001.

[66] I. Orban-GlaB et al., "Clustering and dynamics of phototransducer signaling domains revealed by site-directed spin labeling electron paramagnetic resonance on SRII/HtrII in membranes and nanodiscs," Biochemistry, vol. 54, no. 2, pp. 349-362, Jan. 2015, doi: 10.1021/bi501160q.

[67] K. K. Kim, H. Yokota, and S. H. Kim, "Four-helical-bundle structure of the cytoplasmic domain of a serine chemotaxis receptor," Nature, vol. 400, no. 6746, pp. 787-792, 1999.

[68] K. Inoue, J. Sasaki, J. L. Spudich, and M. Terazima, "Laser-induced transient grating analysis of dynamics of interaction between sensory rhodopsin II D75N and the HtrII transducer," Biophys. J.., vol. 92, no. 6, pp. 2028-2040, Mar. 2007, doi: 10.1529/biophysj .106.097493.

[69] D. Klose et al., "Light-induced switching of HAMP domain conformation and dynamics revealed by time-resolved EPR spectroscopy," FEBSLett., vol. 588, no. 21, pp. 3970-3976, Nov. 2014, doi: 10.1016/j.febslet.2014.09.012.

[70] A. A. Gapchenko et al., "Light-induced structure changes in Bacteriorhodopsin D96N by SAXS," J. Bioenerg. Biomembr., vol. 50, no. 6, pp. 540-540, 2018, doi: 0145-479x.

[71] M. Cammarata et al., "Tracking the structural dynamics of proteins in solution using time-resolved wide-angle X-ray scattering," Nat. Methods, vol. 5, no. 10, pp. 881-886, Sep. 2008, doi: 10.1038/nmeth.1255.

[72] R. L. Gustavsen et al., "Time resolved small angle X-ray scattering experiments performed on detonating explosives at the advanced photon source: Calculation of the time and distance between the detonation front and the x-ray beam," J. Appl. Phys, vol. 121, no. 10, p. 105902, Mar. 2017, doi: 10.1063/1.4978036.

[73] C. S. Yang and J. L. Spudich, "Light-induced structural changes occur in the transmembrane helices of the Natronobacterium pharaonis HtrII transducer," Biochemistry, vol. 40, no. 47, pp. 14207-14214, Nov. 2001, doi: 10.1021/bi010985c.

[74] A. I. Ryzhykau, Y. L., Nikolaev, M. Y., Soloviov, D. V., Ivankov, O. I., Kovalev,

Y. S., Murugova, T. N., Zinovev, E. V., Vlasov, A. V., Rogachev, A. V.,Borshchevskiy, V. I., Gordeliy, V. I., Kuklin, "Small-angle scattering studies of phospholipids phase transition in membrane mimicking systems," in FEBS Journal Volume 282, Issue Supplement s1, 2015, p. 235, [Online]. Available: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/febs.13339/epdf.