Исследование механизма транспорта протона бактериородопсином: получение высококачественных рентгеноструктурных данных функциональных состояний тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат физико-математических наук Борщевский, Валентин Иванович

• Борщевский, Валентин Иванович
• кандидат физико-математических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Борщевский, Валентин Иванович

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Бактериородопсин.

1.1.1. Научная значимость и общая характеристика.

1.1.2. Фотоцикл.

1.1.3. Методы кристаллизации.

1.1.4. Моноэдрическое двойникование кристаллов.

1.1.5. Кристаллографические структуры основного состояния.

1.1.6. Кристаллографические структуры переходных состояний.

1.2. Радиационное повреждение белковых кристаллов.

1.2.1. Исторический обзор.

1.2.2. Глобальные и специфические проявления.

1.2.3. Механизмы возникновения.

1.2.4. Исследования кристаллов бактериородопсина.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Получение и кристаллизация бактериородопсина.

2.2. Тестирование качества дифракции кристаллов.

2.3. Определение фактора двойникования.

2.4. Зависимость роста В-фактора от дозы рентгеновского излучения, поглощенной кристаллом белка.

2.5. Экспериментальные разностные Фурье-карты электронных плотностей.

2.6. Исследование радиационного повреждения кристаллов бактериородопсина.

2.6.1. Сбор, интегрирование и шкалирование кристаллографических данных.

2.6.2. Построение и уточнение моделей.

2.6.3. Построение карт электронных плотностей.

2.7. Исследование образования оранжевой формы бактериородопсина.

2.7.1. Сбор, интегрирование и шкалирование кристаллографических данных.

2.7.2. Построение и уточнение моделей.

2.7.3. Спектроскопические методы исследования.

2.8. Исследование структуры основного состояния бактериородопсина.

2.8.1. Сбор, интегрирование и шкалирование кристаллографических данных.

2.8.2. Построение и уточнение моделей.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

3.1. Двойникование кристаллов бактериородопсина.

3.1.1. Прямое наблюдение двойниковых доменов.

3.1.2. Связь скорости роста и фактора двойникования.

3.1.3. Механизмы образования двойникования.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование механизма транспорта протона бактериородопсином: получение высококачественных рентгеноструктурных данных функциональных состояний»

Ключевым явлением в биоэнергетике клетки является синтез аденозинтрифосфата (АТФ). Создание АТФ требует наличия градиента электрохимического потенциала на мембранах клеток или органелл, его синтезирующих. Данный градиент создается посредством контролируемых ферментами окислительно-восстановительных или фотохимических реакций. Простейшим и наиболее изученным белком, преобразующим энергию света в электрохимический потенциал, является бактериородопсин (БР). Этот трансмембранный белок археи Halobacterium salinarum, поглощая свет, переносит протоны из цитоплазмы во внеклеточное (ВК) пространство. БР, благодаря доступности в сравнительно больших количествах, простоте очистки и стабильности, в течение последних 30 лет остается одним из самых интенсивно изучаемых мембранных белков.

Актуальность и состояние исследуемых проблем. Для понимания молекулярного механизма работы БР необходимо знать структурные изменения, вызванные поглощением света ретиналем, которые сопровождают фотоцикл белка и приводят к направленному транспорту протона. Наиболее эффективным подходом к решению данной задачи в настоящее время является получение атомарных структур функциональных состояний рабочего цикла БР с помощью рентгеновской кристаллографии высокого разрешения. Использование данного метода требует наличия высокоупорядоченных трехмерных кристаллов белка с одной стороны и эффективных методов фиксирования промежуточных состояний с другой. Способы получения переходных состояний были исследованы ранее [1]. Кристаллы же могут быть получены при использований нового метода кристаллизации in meso, заключающегося в использовании липидной биконтинуальной мезофазы для кристаллизации мембранных белков [2]. Кристаллизация in meso остается в настоящее время недостаточно изученным методом, что существенно ограничивает его потенциальную применимость для мембранных белков. Несмотря на это, in meso подход уже позволил получить структуру .основного и некоторых промежуточных состояний БР. Однако, опубликованные структуры промежуточных состояний, полученные разными группами, сильно различаются, что ведет к противоречивым заключениям относительно механизмов переноса протона [3-7]. Причины этого в настоящее время остаются до конца невыясненными. Предположительно, отсутствие согласованности может быть связано с недостаточно высоким качеством дифракционных данных, моноэдрическим двойникованием и радиационным повреждением кристаллов, а также возникновением новых состояний белка под действием рентгеновских квантов.

Целью исследования являлось выяснение причин, приводящих к возникновению противоречий в области рентгеноструктурного анализа функциональных состояний БР, и поиск путей преодоления сопряженных с ними проблем. Дополнительными задачами работы являлись исследование основного состояния БР с разрешением 1.26 А, достигнутым для данного белка впервые, а также исследование липидного окружения молекулы белка в кристаллах, полученных в мезофазах моноолеина (МО) и 1-0-(3,7,11,15)-тетраметилгексадецил-Р-0-ксилозы (Р-Ху10С1б+4) с участием детергентов различного типа.

Научная новизна. В работе впервые найдены кристаллизационные условия, при которых фактор двойникования кристаллов БР симметрии Р63 можно определить путем визуального изучения. Это позволило значительно упростить процедуру поиска недвойниковых кристаллов, необходимых для получения высококачественных ренттеноструктурных данных функциональных состояний БР. Впервые систематически исследована проблема специфического повреждения БР рентгеновскими квантами. В результате продемонстрировано, что специфическое радиационное разрушение, происходящее преимущественно в активном центре молекулы, может приводить к артефактам при анализе структур переходных состояний белка, а также впервые получена количественная зависимость доли белка с разрушенным активным центром от дозы радиации, поглощенной кристаллом белка. В данных расчетах была впервые использована методика оценки дозы, поглощенной белковым кристаллом, основанная на увеличении его В-фактора при радиационном повреждении кристалла.

Благодаря использованию высокоупорядоченных кристаллов, а также методике снятия структурных данных со смещением измерительного пучка вдоль кристалла БР, впервые оказалось возможным установить структуру оранжевой формы БР, образующейся при поглощении белком сверхмалых доз рентгеновского излучения. При этом кристалл поглощал около О.ОАМГр при сборе одного набора данных, что на один-два порядка ниже, чем доза рентгеновского облучения, которую поглощали кристаллы БР при сборе рентгеноструктурных данных, опубликованных в литературе.

В работе обсуждается структура основного состояния БР с разрешением 1.26А, которое впервые достигнуто для БР. Высокое разрешение модели позволило обнаружить новые структурные элементы, необходимые для понимания транспорта протона белком.

В рамках работы впервые проводится систематическое исследование роли детергента в стабилизации кристаллов БР симметрии Р63, демонстрируется, что молекула детергента не входит в состав кристаллов.

Кроме этого, в работе впервые продемонстрирована возможность использования р-ХуЮС]б+4 в качестве матричного липида для in meso кристаллизации, и показано, что молекулы матричных липидов (МО, p-XylOCi6+4) входят в кристалл и стабилизируют белковый тример, образуя специфические контакты с аминокислотными (АК) остатками в цитоплазматических (ЦП) частях спиралей А-В и Тир 157 в E-спирали соседней молекулы БР.

Практическая значимость работы. В ходе работы были решены основные противоречия в области рентгеноструктурного анализа функциональных состояний БР и показаны пути решения основных проблем. Разработанные подходы позволяют получить достоверные структуры основного и переходных состояний, что имеет важное фундаментальное значение, поскольку позволяет установить атомарные детали одного из наиболее общих процессов в жизни клетки - создание электрохимического потенциала на мембране.

Кроме этого, решение конкретных подзадач работы имеет собственное практическое значение. Так работа представляет интерес для белковой кристаллографии вообще. Новые подходы к решению проблемы двойникования могут быть использованы в • других лабораториях для устранения данного дефекта кристаллов белка. Результаты исследования радиационного повреждения активного центра БР могут быть использованы при интерпретации рентгеноструктурных данных кристаллов других белков. Методика оценки дозы, поглощенной кристаллом БР, основанная на увеличении В-фактора кристалла, может быть использована, когда размер кристалла белка больше или сравним с размером измерительного пучка.

Исследования роли молекул детергента и матриксообразующего липида в кристаллизации белка важны для понимания механизма кристаллизации in meso и дальнейшего развития метода, поскольку дают представление о роли данных молекул в стабилизации кристалла.

Диссертационная работа состоит из введения, трех глав и заключения. Во введении рассмотрены актуальность и современное состояние исследуемой темы, выделены основные проблемы и сформулированы цели данной работы, а также описана структура диссертации. Первая глава представляет собой литературный обзор. Особое внимание уделено опубликованным рентгеновским структурам основного состояния и переходных состояний БР, отличиям между существующими моделями переходных состояний и радиационному повреждению белковых кристаллов рентгеновским излучением при криогенных температурах. Во второй главе описаны материалы, экспериментальные процедуры, оборудование и рентгеноструктурные методы,

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Борщевский, Валентин Иванович

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ РАБОТЫ

I) Исследованы основные проблемы, препятствующие получению высококачественных рентгеноструктурных данных функциональных состояний БР:

1) Впервые найдены кристаллизационные условия, при которых фактор двойникования кристаллов БР симметрии Р63 можно определить путем визуального изучения. Это позволило значительно упростить процедуру поиска недвойниковых кристаллов, необходимых для получения высококачественных рентгеноструктурных данных функциональных состояний БР.

2) Путем статистического анализа показано, что замедленный рост кристаллов БР (в течение более 3 месяцев) благоприятствует образованию кристаллов с низким и нулевым фактором двойникования. Этот результат позволил увеличить выход низко- и недвойниковых кристаллов при кристаллизации БР.

3) Показано, что активный центр БР подвержен-радиационному повреждению при дозах, порядка которых поглощали кристаллы при получении опубликованных рентгеноструктурных моделей белка. Впервые продемонстрировано, что радиолиз активного центра может быть ошибочно истолкован как функциональные К- и Ь-состояние белка.

4) Получена количественная оценка зависимости доли белка с поврежденным активным центром от поглощенной дозы. Показано, что поглощение кристаллом \МГр рентгеновского излучения приводит к повреждению активного центра у -10% белковых молекул. Для этого разработана методика количественной оценки дозы рентгеновского излучения, поглощенной кристаллом, основанная на изменении его глобальных характеристик при радиационном повреждении кристалла. Данная информация необходима при планировании эксперимента для получения достоверных моделей переходных состояний БР.

5) Установлены структурные изменения, сопровождающие образование оранжевой формы БР. Использование высокоупорядоченных кристаллов, а также методики снятия структурных данных со смещением измерительного пучка вдоль кристалла БР позволили уменьшить дозу, поглощенную кристаллом во время измерения набора до -0.04 МГр. Данная информация необходима для корректной интерпретации структурных данных переходных состояний БР.

II) Исследован ряд моделей основного состояния белка с разрешением, достигающим 1.26Á. Показаны новые структурные элементы, необходимые для понимания транспорта протона белком.

III) Исследованы рентгеноструктурные данные от кристаллов БР с разрешением 1.26-1.94Á, выращенных in meso с использование 6 различных детергентов. Молекулы детергента не обнаружены в составе белковых кристаллов.

IV) Показано, что 1Ю-(3,7,11,15)-тетраметилгексадецил-[3-0-ксилоза может быть использована в качестве матричного липида для in meso кристаллизации. Исследование рентгеноструктурных данных от кристаллов, полученных в кубических фазах моноолеина и 1-0-(3,7,11,15)-тетраметилгексадецил-р-0-ксилозы, показало, что молекулы матричных липидов входят в белковый кристалл в обоих случаях и стабилизируют белковый тример, образуя специфические контакты с АК остатками в ЦП частях спиралей А-В и Тир157 в E-спирали соседней молекулы белка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Борщевский, Валентин Иванович, 2011 год

1. Efremov R. et al., Time-resolved microspectroscopy on a single crystal ofbacteriorhodopsin reveals lattice-induced differences in the photocycle kinetics, BiophysJ. 91 (2006) 1441-1451.

2. V.I.Gordeliy et al., Crystallization in lipidic cubic phases: A case study with

3. Bacteriorhodopsin, в: Membrane Protein Protocols: Expression, Purification, and Crystallization, под ред. B.Selinsky, изд.: Humana Press, Totowa NJ, (2003) 305-316.

4. Lanyi J.K., What is the real crystallographic structure of the L photointermediate ofbacteriorhodopsin?, Biochim.Biophys.Acta 1658 (2004) 14-22.

5. Matsui Y. et al., Specific damage induced by X-ray radiation and structural changes inthe primary photoreaction of bacteriorhodopsin, J.Mol.Biol. 324 (2002) 469-481.

6. Yamamoto M. et al., Crystal structures of different substates of bacteriorhodopsin's Mintermediate at various pH levels, J.Mol.Biol. 393 (2009) 559-573.

7. Hirai T. et al., Structural snapshots of conformational changes in a seven-helix membraneprotein: lessons from bacteriorhodopsin, Current Opinion in Structural Biology 19 (2009) 433-439.

8. Borshchevskiy V. et al., Overcoming merohedral twinning in crystals ofbacteriorhodopsin grown in lipidic mesophase, Acta Crystallogr.D.Biol. Crystallogr. 66 (2010) 26-32.

9. Oesterhelt D. et Stoeckenius W., Rhodopsin-like protein from the purple membrane of

10. Halobacterium halobium, Nat.New Biol. 233 (1971) 149-152.

11. Henderson R., The structure of the purple membrane from Halobacterium hallobium:analysis of the X-ray diffraction pattern, J.Mol.Biol. 93 (1975) 123-138.

12. Spudich J.L., The multitalented microbial sensory rhodopsins, Trends Microbiol. 142006) 480-487.

13. Cherezov V. et al., High-resolution crystal structure of an engineered human beta2adrenergic G protein-coupled receptor, Science 318 (2007) 1258-1265.

14. Hanson M.A. et al., A specific cholesterol binding site is established by the 2.8 angstromstructure of the human beta(2)-adrenergic receptor, Structure 16 (2008) 897-905.

15. Wacker D. et al., Conserved Binding Mode of Human beta(2) Adrenergic Receptor1.verse Agonists and Antagonist Revealed by X-ray Crystallography, Journal of the American Chemical Society 132 (2010) 11443-11445.

16. Jaakola V.P. et al., The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosinereceptor bound to an antagonist, Science 322 (2008) 1211-1217.

17. Wu B. et al., Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and

18. Cyclic Peptide Antagonists, Science (2010)

19. Sprang S.R., Structural biology: a receptor unlocked, Nature 450 (2007) 355-356.

20. Lefkowitz R.J. et al., A crystal clear view of the beta2-adrenergic receptor,

21. Nat.Biotechnol. 26 (2008) 189-191.

22. Schobert В. et al., Crystallographic structure of the К intermediate of bacteriorhodopsin:

23. Conservation of free energy after photoisomerization of the retinal, J.Mol.Biol. 321 (2002)715-726.

24. Kolbe M. et al., Structure of the light-driven chloride pump halorhodopsin at 1.8 Aresolution, Science 288 (2000) 1390-1396.

25. Luecke H. et al., Crystal structure of sensory rhodopsin II at 2.4 angstroms: insights intocolor tuning and transducer interaction, Science 293 (2001) 1499-1503.

26. Luecke H. et al., Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven protonpump with a dual chromophore, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 105 (2008) 1656116565.

27. Okada T. et al., The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of anew 2.2 A crystal structure, J.Mol.Biol. 342 (2004) 571-583.

28. Murakami M. et Kouyama T., Crystal structure of squid rhodopsin, Nature 453 (2008)363.367.

29. Warne T. et al., Structure of a beta 1-adrenergic G-protein-coupled receptor, Nature 4542008)486-491.

30. Ефремов Р.Г., Исследование структуры и механизма функционирования ретинальсодержащих мембранных белков: кристаллизация и фиксация промежуточных состояний белков в кристаллах, Московский физико-технический институт (ГУ) (2005).

31. Neutze R. et al., Bacteriorhodopsin: a high-resolution structural view of vectorial protontransport, Biochim.Biophys.Acta 1565 (2002) 144-167.

32. Cao Y. et al., Relationship of proton release at the extracellular surface to deprotonationof the schiff base in the bacteriorhodopsin photocycle, Biophys.J. 68 (1995) 15181530.

33. Brown L.S. et al., Glutamic acid 204 is the terminal proton release group at theextracellular surface of bacteriorhodopsin, J.Biol. Chem. 270 (1995) 27122-27126.

34. Balashov S.P. et al., Glutamate-194 to cysteine mutation inhibits fast light-inducedproton release in bacteriorhodopsin, Biochemistry 36 (1997) 8671-8676.

35. Henderson R. et Unwin P.N., Three-dimensional model of purple membrane obtained byelectron microscopy, Nature 257 (1975) 28-32.

36. Henderson R. et al., Model for the structure of bacteriorhodopsin based on highresolution electron cryo-microscopy, J.Mol.Biol. 213 (1990) 899-929.

37. Grigorieff N. et al., Electron-crystallographic refinement of the structure ofbacteriorhodopsin, J.Mol.Biol. 259 (1996) 393-421.

38. Kimura Y. et al., Surface of bacteriorhodopsin revealed by high-resolution electroncrystallography, Nature 389 (1997) 206-211.

39. Mitsuoka K. et al., The structure of bacteriorhodopsin at 3.0 A resolution based onelectron crystallography: implication of the charge distribution, J.Mol.Biol. 286 (1999) 861-882.

40. Michel H. et Oesterhelt D., Three-dimensional crystals of membrane proteins:bacteriorhodopsin, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 77 (1980) 1283-1285.

41. Landau E.M. et Rosenbusch J.P., Lipidie cubic phases: A novel concept for thecrystallization of membrane proteins, Proc.Natl.Acacl.Sci.USA 93 (1996) 1453214535.

42. Pebay-Peyroula E. et al., X-ray structure of bacteriorhodopsin at 2.5 angstroms frommicrocrystals grown in lipidic cubic phases, Science 277 (1997) 1676-1681.

43. Caffrey M. et Cherezov V., Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases,

44. Nature Protocols 4 (2009) 706-731.

45. Scriven L.E., Equilibrium Bicontinuous Structure, Nature 263 (1976) 123-125.

46. Cherezov V. et al., Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase forin meso crystallization of membrane proteins, Biophys.J. 81 (2001) 225-242.

47. Chung H. et Caffrey M., The curvature elastic-energy function of the lipid-water cubicmesophase, Nature 368 (1994) 224-226.

48. Chung H. et Caffrey M., The neutral area surface of the cubic mesophase: location andproperties, Biophys.J. 66 (1994) 377-381.

49. Nollert P. et al., Molecular mechanism for the crystallization of bacteriorhodopsin inlipidic cubic phases, FEBSLett. 504 (2001) 179-186.

50. Caffrey M., Membrane protein crystallization, J.Struct.Biol. 142 (2003) 108-132.

51. Моисеева E.C., Кристаллизация мембранных белков методом in meso, Московскийфизико-технический институт (ГУ) (2010).

52. Luecke H. et al., Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 angstrom résolution, J.Mol.Biol.291 (1999)899-911.

53. Royant A. et al., X-ray structure of sensory rhodopsin II at 2.1-angstrom resolution,

54. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98 (2001) 10131-10136.

55. Vogeley L. et al., Anabaena sensory rhodopsin: A photochromic color 0 sensor at 2.0angstrom, Science 306 (2004) 1390-1393.

56. Gordeliy V.I. et al., Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin1.-transducer complex, Nature 419 (2002) 484-487/

57. Cherezov V. et al., In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 Aresolution, J.Mol.Biol. 364 (2006) 716-734.

58. Cherezov V. et al., In meso crystal structure and docking simulations suggest analternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin, Proteins 71 (2008) 24-34.

59. Wadsten P. et al., Lipidic sponge phase crystallization of membrane proteins, J.Mol.Biol.364 (2006) 44-53.

60. Cherezov V. et al., Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidicmesophases, J.Mol.Biol. 357(2006) 1605-1618.

61. Hofer N. et al., Crystallizing Transmembrane Peptides in Lipidic Mesophases, Biophys.J.99 (2010) L23-L25.

62. Kouyama T. et al., Polyhedral assembly of a membrane protein in its three-dimensionalcrystal, J.Mol.Biol. 236 (1994) 990-994.

63. Takeda K. et al., A novel three-dimensional crystal of bacteriorhodopsin obtained bysuccessive fusion of the vesicular assemblies, J.Mol.Biol. 283 (1998) 463-474.

64. Denkov N.D. et al., Electron cryomicroscopy of bacteriorhodopsin vesicles: mechanismof vesicle formation, Biophys.J. 74 (1998) 1409-1420.

65. Deniaud A. et al., Crystallography of membrane proteins: from crystallization tostructure, Methods Mol.Biol. 654 (2010) 79-103.

66. Faham S. et Bowie J.U., Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membraneproteins yields a monomelic bacteriorhodopsin structure, J.Mol.Biol 316 (2002) 1-6.

67. Schertler G.F. et al., Orthorhombic crystal form of bacteriorhodopsin nucleated onbenzamidine diffracting to 3.6 A resolution, J.Mol.Biol. 234 (1993) 156-164.

68. Essen L. et al., Lipid patches in membrane protein oligomers: crystal structure of thebacteriorhodopsin-hpid complex, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95 (1998) 1167311678.

69. V.Gordeliy et E.Moiseeva, Crystallization of membrane proteins, в: Soft matter: From

70. Synthetic to Biological Materials , под ред. J.K.G.Dhont et al., изд.: FZ-Juelich , Juelich, (2008)

71. Michel H., Crystallization of Membrane Proteins, (1991)

72. Parsons S., Introduction to twinning, Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 59 (2003)1995-2003.

73. Dauter Z., Twinned crystals and anomalous phasing, Acta Cryst.D 59 (2003) 2004-2016.

74. Efremov R. et al., Physical detwinning of hemihedrally twinned hexagonal crystals ofbacteriorhodopsin, Biophys.J. 87 (2004) 3608-3613.

75. Yeates Т.О., Detecting and overcoming crystal twinning, Methods Enzymol. 276 (1997)344.358.

76. Royant A. et al., Detection and characterization of merohedral twinning in two proteincrystals: bacteriorhodopsin and p67(phox), Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 58 (2002)784-791.

77. Redinbo M.R. et al., The 1.5-A crystal structure of plastocyanin from the green alga

78. Chlamydomonas reinhardtii, Biochemistry 32 (1993) 10560-10567.

79. Henderson R. et Moffat J.K., The difference Fourier technique in protein crystallography:errors and their treatment, Acta Cryst.B 27 (1971) 1414-1420.

80. Schlichting I. et al., Crystal-Structure of Photolyzed Carbonmonoxy-Myoglobin, Nature371 (1994) 808-812.

81. Srajer V. et al., Photolysis of the carbon monoxide complex of myoglobin: nanosecondtime-resolved crystallography, Science 274 (1996) 1726-1729.

82. Srajer V. et al., Protein conformational relaxation and ligand migration in myoglobin: ananosecond to millisecond molecular movie from time-resolved Laue X-ray diffraction, Biochemistry 40 (2001) 13802-13815.

83. Schotte F. et al., Watching a protein as it functions with 150-ps time-resolved x-raycrystallography, Science 300 (2003) 1944-1947.

84. Genick U.K. et al., Structure of a protein photocycle intermediate by millisecond timeresolved crystallography, Science 275 (1997) 1471-1475.

85. Genick U.K. et al., Structure at 0.85 A resolution of an early protein photocycleintermediate, Nature 392 (1998) 206-209.

86. Perman B. et al., Energy transduction on the nanosecond time scale: early structuralevents in a xanthopsin photocycle, Science 279 (1998) 1946-1950.

87. Ren Z. et al., A molecular movie at 1.8 A resolution displays the photocycle ofphotoactive yellow protein, a eubacterial blue-light receptor, from nanoseconds to seconds, Biochemistry 40 (2001) 13788-13801.

88. Moukhametzianov R. et al., Development of the signal in sensory rhodopsin and itstransfer to the cognate transducer, Nature 440 (2006) 115-119.

89. Edman K. et al., High-resolution X-ray structure of an early intermediate in thebacteriorhodopsin photocycle, Nature 401 (1999) 822-826.

90. Sass H.J. et al., Structural alterations for proton translocation in the M state of wild-typebacteriorhodopsin, Nature 406 (2000) 649-653.

91. Royant A. et al., Helix deformation is coupled to vectorial proton transport in thephotocycle of bacteriorhodopsin, Nature 406 (2000) 645-648.

92. Kouyama T. et al., Crystal structure of the L intermediate of bacteriorhodopsin: Evidencefor vertical translocation of a water molecule during the proton pumping cycle, J.Mol.Biol. 335 (2004) 531-546.

93. Edman K. et al., Deformation of helix C in the low temperature L-intermediate ofbacteriorhodopsin, J.Biol.Chem. 279 (2004) 2147-2158.

94. Takeda K. et al., Crystal structure of the M intermediate of bacteriorhodopsin: allostericstructural changes mediated by sliding movement of a transmembrane helix, J.Mol.Biol. 341 (2004) 1023-1037.

95. Lanyi J. et Schobert B., Crystallographic structure of the retinal and the protein afterdeprotonation of the Schiff base: the switch in the bacteriorhodopsin photocycle, J.Mol.Biol. 321-(2002) 727-737.

96. Lanyi J.K. et Schobert B., Mechanism of proton transport in bacteriorhodopsin fromcrystallographic structures of the K, L, M-l,' M-2, and M-2 ' intermediates of the photocycle, J.Mol.Biol. 328 (2003) 439-450.

97. Schobert B. et al., Crystallographic structures of the M and N intermediates ofbacteriorhodopsin: assembly of a hydrogen-bonded chain of water molecules between Asp-96 and the retinal Schiff base, J.Mol.Biol. 330 (2003) 553-570.

98. Lanyi J.K. et Schobert B., Structural changes in the L photointermediate ofbacteriorhodopsin, J.Mol.Biol. 365 (2007) 1379-1392.

99. Facciotti M.T. et al., Structure of an early intermediate in the M-state phase of thebacteriorhodopsin photocycle, Biophys.J. 81 (2001) 3442-3455.

100. Belrhali H. et al., Protein, lipid and water organization in bacteriorhodopsin crystals: amolecular view of the purple membrane at 1.9 A resolution, Structure. 7 (1999) 909-917.

101. Luecke H. et al., Proton transfer pathways in bacteriorhodopsin at 2.3 angstromresolution, Science 280 (1998) 1934-1937.

102. Kandori H., Role of internal water molecules in bacteriorhodopsin, Biochim.Biophys.Acta1460(2000) 177-191.

103. Maeda A. et al., Water as a cofactor in the unidirectional light-driven proton transfersteps in bacteriorhodopsin, Photochem.Photobiol. 82 (2006) 1398-1405.

104. Hatanaka M. et al., Trp86 —> Phe replacement in bacteriorhodopsin affects a watermolecule near Asp85 and light adaptation, Biochemistry 36 (1997) 5493-5498.

105. Marti T. et al., The retinylidene Schiff base counterion in bacteriorhodopsin,

106. J.Biol.Chem. 266 (1991) 18674-18683.

107. Ihara K. et al., Met-145 is a key residue in the dark adaptation of bacteriorhodopsinhomologs, BiophysJ. 61 (1994) 1187-1191.

108. Weidlich O. et al., Steric interaction between the 9-methyl group of the retinal andtryptophan 182 controls 13-cis to all-trans reisomerization and proton uptake in the bacteriorhodopsin photocycle, Biochemistry 35 (1996) 10807-10814.

109. Sonar S. et al., A redirected proton pathway in the bacteriorhodopsin mutant Tyr-57-

110. Asp. Evidence for proton translocation without Schiff base deprotonation, J.Biol.Chem. 269 (1994) 28851-28858.

111. Delaney J.K. et al., Molecular mechanism of protein-retinal coupling inbacteriorhodopsin, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 92 (1995) 11120-11124.

112. Earnest T.N. et al., Orientation of the Bacteriorhodopsin Chromophore Probed by

113. Polarized Fourier-Transform Infrared Difference Spectroscopy, Biochemistry 25 (1986) 7793-7798.

114. Luecke H. et al., Coupling photoisomerization of retinal to directional transport inbacteriorhodopsin, J.MolBiol. 300 (2000) 1237-1255.

115. Luecke H. et al., Structural changes in bacteriorhodopsin during ion transport at 2angstrom resolution, Science 286 (1999) 255-261.

116. Rouhani S. et al., Crystal structure of the D85S mutant of bacteriorhodopsin: Model of an

117. O-like photocycle intermediate, Journal of Molecular Biology 313 (2001) 615628.

118. Okumura H. et al., Crystal structures of acid blue and alkaline purple forms ofbacteriorhodopsin, Journal of Molecular Biology 351 (2005) 481-495.

119. Facciotti M.T. et al., Crystal structure of the bromide-bound D85S mutant ofbacteriorhodopsin: Principles of ion pumping, Biophys.J. 85 (2003) 451-458.

120. Facciotti M.T. et al., Specificity of anion binding in the substrate pocket ofbacteriorhodopsin, Biochemistry 43 (2004) 4934-4943.

121. Facciotti M.T. et al., Crystal structures of bR(D85S) favor a model of bacteriorhodopsinas a hydroxyl-ion pump, Febs Letters 564 (2004) 301-306.

122. Maeda A. et al., Interaction of aspartate-85 with a water molecule and the protonated

123. Schiff base in the L intermediate of bacteriorhodopsin: a Fourier-transform infrared spectroscopic study, Biochemistry 33 (1994) 1713-1717.

124. Liu K. et al., Far-infrared VRT spectroscopy of two water trimer isotopomers:vibrationally averaged structures and rearrangement dynamics, Mol.Phys. 89 (1996) 1373-1396.

125. Garczarek F. et Gerwert K., Functional waters in intraprotein proton transfer monitoredby FTIR difference spectroscopy, Nature 439 (2006) 109-112.

126. Eigen M., Proton transfer, acid-base catalysis, and. enzymatic hydrolysis. Part I:

127. Elementary processes., Angew.Chem.Int.Edn Engl. 3 (1964) 1-19.

128. G.Zundel, в: The Hydrogen Bond—Recent Developments in Theoiy and Experiments,под ред. C.Sandoriy, изд.: Nort-Holland, Amsterdam, (1976) 683-766.114.115.116.117.118.119.120.121.122.123.124.125.126.127.128.129.130.131.132.

129. Keefe LJ. et al., The alpha aneurism: a structural motif revealed in an insertion mutant of staphylococcal nuclease, Proc.Natl.Acacl.Sci.U.S.A 90 (1993) 3275-3279.

130. Joshi M.K. et al., Importance of specific native lipids in controlling the photocycle of bacteriorhodopsin, Biochemistry 37 (1998) 14463-14470.

131. Subramaniam S. et Henderson R., Molecular mechanism of vectorial proton translocation by bacteriorhodopsin, Nature 406 (2000) 653-657.

132. Dracheva S. et al., Specific lipid requirements for normal function of bacteriorhodopsin (BR) photocycle, Biophys.J. 70 (1996) SU442-SU442.

133. Moukhametzianov R., X-ray Crystallographic Study on the Mechanisms of Bacteriorhodopsin and the Sensory Rhodopsin/Transducer Complex, FZ-Juelich (2006).

134. Zscherp C. et Heberle J., Infrared difference spectra of the intermediates L, M, N, and O of the bacteriorhodopsin photoreaction obtained by time-resolved attenuated total reflection spectroscopy, Journal of Physical Chemistry B 101 (1997) 1054210547.

135. Garman E., Radiation damage in macromolecular crystallography: what is it and why should we care?, Acta Crystallographica Section D 66 (2010) 339-351.

136. Blake C.C.F. et Phillips D.C., Effects of X-irradiation on single crystals of myoglobin, Proc.Symp.Biol.Effectrs Ionizing Mol.Level (1962) 183-191.

137. Helliwell J.R., Protein Crystal Perfection and the Nature of Radiation-Damage, J. Cryst. Growth 90 (1988) 259-272.

138. Augenstein L.G., Symposium on Information Theory in Biology, (1958) 287-292.

139. Hendrickson W.A., Radiation damage in protein crystallography, J.Mol.Biol. 106 (1976) 889-893.

140. Hendrickson W.A., Structural effects accompanying ligand change in crystalline lamprey hemoglobin, Biochim.Biophys.Acta 310 (1973) 32-38.

141. Fletterick R.J. et al., Low-resolution structure of the glycogen phosphorylase alpha monomer and comparison with phosphorylase beta, J.Mol.Biol. 103 (1976) 1-13.

142. Southworth-Davies R.J. et al., Observation of decreased radiation damage at higher dose rates in room temperature protein crystallography, Structure. 15 (2007) 15311541.

143. Sygusch J. et Allaire M., Sequential radiation damage in protein crystallography, Acta Crystallogr.A 44 ( Pt 4) (1988) 443-448.

144. Blundell T.L. et Johnson L., Protein Crystallography, ( 1976)

145. King M.V., Improved Resolution of X-Ray Diffraction Patterns of Protein Crystals at Low Temperature, Nature 181 (1958) 263-264.

146. Haas DJ. et Rossmann M.G., Crystallographic Studies on Lactate Dehydrogenase At-75 Degrees C, Acta Crystallographica Section B-Striictural Crystallography and Crystal Chemistry B 26 (1970) 998-&.

147. Hope H., Cryocrystallography of Biological Macromolecules A Generally Applicable Method, Acta Crystallographica Section B-Stnictural Science 44 (1988) 22-26.

148. Teng T.Y., Mounting of Crystals for Macromolecular Crystallography in A Freestanding Thin-Film, Journal of Applied Crystallography 23 (1990) 387-391.

149. Cosier J. et Glazer A.M., A Nitrogen-Gas-Stream Cryostat for General X-Ray-Diffraction Studies, Journal of Applied Crystallography 19 (1986) 105-107.

150. Rodgers D.W., Practical cryocrystallography, Macromolecular Crystallography, Pt A 276(1997) 183-203.

151. Garman E., Cool data: quantity AND quality, Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography 55 (1999) 1641-1653.

152. Garman E.F. et Schneider T.R., Macromolecular cryocrystallography, Journal of Applied Crystallography 30 (1997) 211-237.

153. Pflugrath J.W., Macromolecular cryocrystallography methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures, Methods 34 (2004) 415-423.

154. Garman E.F. et Nave C., Radiation damage in protein crystals examined under various conditions by different methods, J.Synchrotron.Radiat. 16 (2009) 129-132.

155. Nave C. et Garman E.F., Towards an understanding of radiation damage in cryocooled macromolecular crystals, Journal of Synchrotron Radiation 12 (2005) 257-260.

156. Diederichs K., Some aspects of quantitative analysis and correction of radiation damage, Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 62 (2006) 96-101.

157. Murray J. et Garman E., Investigation of possible free-radical scavengers and metrics for radiation damage in protein cryocrystallography, Journal of Synchrotron Radiation 9 (2002) 347-354.

158. Ravelli R.B.G. et al., Unit-cell volume change as a metric of radiation damage in crystals of macromolecules, Journal of Synchrotron Radiation 9 (2002) 355-360.

159. Kmetko J. et al., Quantifying X-ray radiation damage in protein crystals at cryogenic temperatures, Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 62 (2006) 1030-1038.

160. Weik M. et al., Specific chemical and structural damage to proteins produced by synchrotron radiation, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 97 (2000) 623-628.

161. Burmeister W.P., Structural changes in a cryo-cooled protein crystal owing to radiation damage, Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography 56 (2000) 328-341.

162. Ravelli R.B.G. et McSweeney S.M., The 'fingerprint' that X-rays can leave on structures, Structure 8 (2000) 315-328.

163. Weik M. et al., Evidence for the formation of disulfide radicals in protein crystals upon X-ray irradiation, Journal of Synchrotron Radiation 9 (2002) 342-346.

164. Holton J.M., A beginner's guide to radiation damage, Journal of Synchrotron Radiation 16 (2009) 133-142.

165. Leiros H.K.S. et al., Atomic resolution structures of trypsin provide insight into structural radiation damage, Acta Ciystallographica Section D-Biological Crystallography 57 (2001)488-497.

166. O'Neill P. et al., Physical and chemical considerations of damage induced in proteincrystals by synchrotron radiation: a radiation chemical perspective, Journal of Synchrotron Radiation 9 (2002) 329-332.

167. Nukaga M. et al., Ultrahigh resolution structure of a class A beta-lactamase: On themechanism and specificity of the extended-spectrum SHV-2 enzyme, Journal of Molecular Biology 328 (2003) 289-301.

168. Fuhrmann C.N. et al., The 0.83 A resolution crystal structure of alpha-lytic proteasereveals the detailed structure of the active site and identifies a source of conformational strain, J.Mol.Biol. 338 (2004) 999-1013.

169. Carugo O. et Carugo K.D., When X-rays modify the protein structure: radiation damageat work, Trends in Biochemical Sciences 30 (2005) 213-219.

170. Dubnovitsky A.P. et al., Strain relief at the active site of phosphoserine aminotransferaseinduced by radiation damage, Protein Science 14 (2005) 1498-1507.

171. Roberts B.R. et al., Oxidized and synchrotron cleaved structures of the disulfide redoxcenter in the N-terminal domain of Salmonella typhimurium AhpF, Protein Science 14 (2005) 2414-2420.

172. Yano J. et al., X-ray damage to the Mn4Ca complex in single crystals of photosystem II:

173. A case study for metalloprotein crystallography, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102 (2005) 12047-12052.

174. Leiros H.K. et al., Is radiation damage dependent on the dose rate used duringmacromolecular crystallography data collection?, Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr. 62 (2006) 125-132.

175. Fioravanti E. et al., Specific radiation damage to acidic residues and its relation to theirchemical and structural environment, Journal of Synchrotron Radiation 14 (2007) 84-91.

176. Schiltz M. et Bricogne G., Modelling and refining site-specific radiation damage in

177. SAD/MAD phasing, J.Synchrotron Radiat. 14 (2007) 34-42.

178. Sliz P. et al., How does radiation damage in protein crystals depend on X-ray dose?,

179. Structure. 11 (2003) 13-19.

180. Ward J.F., DNA damage produced by ionizing radiation in mammalian cells: identities,mechanisms of formation, and reparability, Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol. 35 (1988) 95-125.

181. Jones G.D. et al., Structure and mobility of electron gain and loss centres in proteins,

182. Nature 330 (1987) 772-773.

183. Symons M.C.R., Electron-Spin-Resonance Studies of Radiation-Damage to Dna and to

184. Proteins, Radiation Physics and Chemistry 45 (1995) 837-845.

185. Dick L.A. et al., Cryogenic electron tunneling within mixed-metal hemoglobin hybrids:

186. Protein glassing and electron-transfer energetics, Journal of the American Chemical Society 120 (1998) 11401-11407.

187. Mroczka N.E. et al., The effects of lattice water on free radical yields in x-irradiatedcrystalline pyrimidines and purines: A low-temperature electron paramagnetic resonance investigation, Radiation Research 147 (1997) 560-568.

188. Sevilla M.D. et al., Electron-Spin Resonance Study of Gamma-Irradiated Frozen

189. Aqueous-Solutions Containing Dipeptides Mechanisms of Radical Reaction, Journal of Physical Chemistry 83 (1979) 2887-2892.

190. Meents A. et al., Origin and temperature dependence of radiation damage in biological samples at cryogenic temperatures, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107 (2010) 10941099.

191. Ravelli R.B. et Garman E.F., Radiation damage in macromolecular cryocrystallography, Curr. Opin.Struct.Biol. 16 (2006) 624-629.

192. Oesterhelt D. et Stoeckenius W., Isolation of the cell membrane of Halobacteriumhalobium and its fractionation into red and purple membrane, Methods Enzymol. 31 (1974) 667-678.

193. Oesterhelt D. et Stoeckenius W., Functions of a new photoreceptor membrane, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 70 (1973) 2853-2857.

194. Collaborative Computational Project N.4., The CCP4 suite: programs for protein crystallography, Acta Cryst.D 50 (1994) 760-763.

195. Fisher R.G. et Sweet R.M., Treatment of Diffraction Data from Protein Crystals Twinned by Merohedry, Acta Crystallographica Section A 36 (1980) 755-760.

196. Kabsch W., Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially

197. Unknown Symmetry and Cell Constants, Journal of Applied Crystallography 26 (1993)795-800.

198. Bourenkov G.P. et Popov A.N., A quantitative approach to data-collection strategies, Acta Crystallogr.DBiol.Crystallogr. 62 (2006) 58-64.

199. Murray J.W. et al., X-ray absorption by macromolecular crystals: the effects ofwavelength and crystal composition on absorbed dose, Journal of Applied Crystallography 37 (2004) 513-522.

200. Nanao M.H. et al., Improving radiation-damage substructures for RIP, Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 61 (2005) 1227-1237.

201. Brunger A.T. et al., Crystallography & NMR system: A new software suite formacromolecular structure determination, Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr. 541998) 905-921.

202. Adams P.D. et al., PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecularstructure solution, Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 66 (2010) 213-221.

203. Bourgeois D., New processing tools for weak and/or spatially overlappedmacromolecular diffraction patterns, Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 551999)1733-1741.

204. Perrakis A. et al., Automated protein model building combined with iterative structure refinement, Nat.Struct.Biol. 6 (1999) 458-463.

205. Murshudov G.N. et al., Refinement of macromolecular structures by the maximumlikelihood method, Acta Crystallogr.D Biol. Crystallogr. 53 (1997) 240-255.

206. McGeehan J. et al., Colouring cryo-cooled crystals: online microspectrophotometry,

207. J.Synchrotron.Radiai. 16 (2009) 163-172.

208. Ерофеев И., Микроспектроскопическое исследование состоянийбактериородопсина, Московский физико-технический институт (ГУ) (2009).

209. Bourenkov G.P. et Popov A.N., Optimization of data collection taking radiation damage into account, Acta 66 (2010) 409-419.

210. Leslie A.G., The integration of macromolecular diffraction data, Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 62 (2006) 48-57.

211. Emsley P. et Cowtan K., Coot: model-building tools for molecular graphics, Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 60 (2004) 2126-2132.

212. DeLano W.L., The PyMOL Molecular Graphics System, (2008)

213. Pettersen E.F. et al., UCSF Chimera—a visualization system for exploratory research andanalysis, J.Comput.Chem. 25 (2004) 1605-1612.

214. Markov I.V., Crystal growth for the begginers: Fundamentals of Nucleation, Crystal

215. Growth and Epitaxy, second (2003)

216. Grabe M. et al., Protein interactions and membrane geometry, BiophysJ 84 (2003) 854868.

217. Box H.C. et al., Magnetic Resonance Studies of Oxidation and Reduction of Organic

218. Molecules by Ionizing Radiations, Journal of Physical Chemistry 74 (1970) 40&.

219. Rahman A. et Stilling F.H., Hydrogen-Bond Patterns in Liquid Water, Journal of the

220. American Chemical Society 95 (1973) 7943-7948.

221. Speedy R.J. et al., Network Topology in Simulated Water, Journal of Physical Chemistry91 (1987) 909-913.

222. Corongiu G. et Clemeni E., Molecular-Dynamics Simulations with A Flexible and

223. Polarizable Potential Density of States for Liquid Water at Different Temperatures., Journal of Chemical Physics 98 (1993) 4984-4990.

224. Teeter M.M., Water structure of a hydrophobic protein at atomic resolution: Pentagonrings of water molecules in crystals of crambin, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 81 (1984)6014-6018.

225. Karplus P.A. et Schulz G.E., Refined structure of glutathione reductase at 1.54 Aresolution, J.MolBiol. 195 (1987) 701-729.

226. Jeffrey G.A. et Saengler W., Hydrogen Bonding in Biological Structures, (1991)

227. Chaumont A. et al., Potential proton-release channels in bacteriorhodopsin,

228. Chemphyschem. 9 (2008) 2751-2758.

229. Tanimoto T. et al., Altered hydrogen bonding of Arg82 during the proton pump cycle ofbacteriorhodopsin: a low-temperature polarized FTIR spectroscopic study, Biochemistry 43 (2004) 9439-9447.

230. Sobolewski A.J. et Domcke W., Ab Initio Investigation of the Structure and

231. Spectroscopy of Hydronium Water Clusters, J.Phys.Chem.A 106 (2002) 41584167.

232. Grudinin S. et al., Water molecules and hydrogen-bonded networks in bacteriorhodopsin-molecular dynamics simulations of the ground state and the M-intermediate, BiophysJ. 88 (2005) 3252-3261.

233. Tsuchiya T. et Saito S., Use of n-octyl-beta-D-thioglucoside, a new nonionic detergent,for solubilization and reconstitution of membrane proteins, J.Biochetn. 96 (1984) 1593-1597.

234. Борщевская Ю.А., Рентгеноструктурное исследование влияния полярногоокружения на кристаллизацию мембранных белков, Московский физико-технический институт (ГУ) (2009).

235. Cartailler J.P. et Luecke H., X-ray crystallographic analysis of lipid-protein interactionsin the bacteriorhodopsin purple membrane, Annu.Rev.Biophys.Biomol. Struct. 32 (2003)285-310.

236. Seddon A.M. et al., Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera,

237. Biochim.Biophys.Acta 1666 (2004) 105-117.

238. Misquitta Y. et al., Rational design of lipid for membrane protein crystallization,

239. J.Struct.Biol. 148 (2004) 169-175.

240. Hato M. et al., Alkylglycosides with an lsoprenoid-type hydrophobic chain can affordgreater control of aqueous phase structures at low temperatures, Langmuir 18 (2002) 3425-3429.

241. Hato M. et al., Aqueous phase behavior of lipids with isoprenoid type hydrophobicchains, J.Phys. Chem.B 113 (2009) 10196-10209.

242. Borshchevskiy V. et al., Isoprenoid-chained lipid beta]-XylOC16+4—A novel moleculefor in meso membrane protein crystallization, Journal of Crystal.Growth 312 (2010) 3326-3330.M