АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE О1 КЛАССИЧЕСКОГО И ЭЛЬ ТОР БИОВАРОВ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат медицинских наук Кульшань, Татьяна Алексеевна

• Кульшань, Татьяна Алексеевна
• кандидат медицинских наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Кульшань, Татьяна Алексеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ Стр.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особенности генетической организации Vibrio cholerae 15 классического и Эль Тор биоваров

1.1.1. Гетические особенности V. cholerae классического биовара

1.1.2. Генетические особенности V. cholerae биовара Эль Тор

1.1.3. Вариабельность генома V. cholerae биовара Эль Тор 29 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы V. cholerae, используемые в работе

2.2. Питательные среды и реактивы

2.3. Методы

2.3.1. Культивирование штаммов

2.3.2. Определение гемолитической, протеазной активности и 39 подвижности

2.3.3. Определение продукции холерного токсина с помощью 39 иммуноферментного анализа GM¡ELISA

2.3.4. Выяснение резистентности природных штаммов к лекарственным

препаратам (триметоприму, стрептомицину, сульфаметоксазолу), кодируемых БТХ - генетическим элементом

2.3.5 Оценка способности штаммов к формированию биопленки

2.3.6. Изучение конкурентной способности штаммов

2.3.7. Определение устойчивости культур к осмотическому и 41 окислительному стрессам

2.3.8. Определение вирулентности и колонизирующей способности

штаммов V. ско1егае

2.3.9. Электрофоретическое изучение белкового состава клеток

2.3.10. Протеомный анализ

2.3.11. Выделение ДНК, ДНК - ДНК гибридизация по Саузерну

2.3.12. ПЦР - анализ генома исследуемых штаммов с использованием

различных специфических олигонуклеотидных праймеров и секвенирование

ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОМОВ ПРИРОДНЫХ 49 ШТАММОВ V. СНОЬЕВАЕ КЛАССИЧЕСКОГО И ЭЛЬ ТОР БИОВАРОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РАЗЛИЧНЫХ РЕГИОНОВ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ И ЗАРУБЕЖНЫХ СТРАН

3.1. Молекулярно-генетические особенности штаммов V. скокгае 50 классического биовара

3.2. Молекулярно-генетический анализ клинических штаммов V. скокгае 61 биовара Эль Тор

3.3. ПЦР - анализ штаммов V. скокгае биовара Эль Тор, изолированных 71 из воды открытых водоемов

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ АДАПТАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ 81 ХОЛЕРЫ К ДЕЙСТВИЮ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

4.1. Выявление генетической изменчивости типичных штаммов и 81 геновариантов возбудителя холеры Эль Тор при их попадании в водную среду

4.2. Изучение структуры профага СТХф у с1хА~ мутантов

4.3. Сравнительный анализ фенотипических свойств исходных 88 вирулентных штаммов и их спонтанных нетоксигенных мутантов

4.3.1. Сравнительная оценка токсигенности и вирулентности исходных 88 штаммов V. скокгае и их с£Ы"Б"мутантов

4.3.2. Определение продукции гемолизина, растворимой 90 гемагглютинин/протеазы, белков внешней мембраны (ОтрИ и ОшрТ),

а также подвижности и способности формировать биопленку

4.3.3. Сравнительный протеомный анализ исходного токсигенного 95 штамма V. скокгае биовара Эль Тор и его спонтанного нетоксигенного мутанта

4.4. Сопоставление жизнеспособности и устойчивости исходных 99 штаммов и их нетоксигенных мутантов к действию неблагоприятных

факторов окружающей среды

4.4.1. Определение устойчивости изогенных с(хА~В' и с(хА+В+ штаммов к 99 различным стрессовым воздействиям

4.4.2. Определение конкурентной способности изогенных токсигенных и 101 нетоксигенных мутантов V. ско1егае биовара Эль Тор

ГЛАВА 5. МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ ТИПИЧНЫХ И 105 ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫХ ПРИРОДНЫХ ШТАММОВ V. СНОЬЕМЕ БИОВАРА ЭЛЬ ТОР МЕТОДОМ МЬУА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

123

127

129

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

СТ - холерный токсин

TCP - токсин-корегулируемые пили адгезии

РГАП - растворимая гемагглютинин/протеаза

MSHA - маннозочувствительные гемагглютинирующие пили адгезии OmpU, ОшрТ - белки внешней мембраны V. cholerae МГЭ - мобильные генетические элементы ОП — остров патогенности

СТХф - умеренный нитевидный бактериофаг CTXclass(p - СТХ профаг V. cholerae classica CTXEltor(p - СТХ профаг V. cholerae eltor ctxAB - гены, кодирующие биосинтез холерного токсина асе - ген, кодирующий биосинтез дополнительного холерного

токсина

zot - ген, кодирующий синтез токсина зонального поглощения

tcpA - ген, кодирующий синтез основной субъединицы токсин-

корегулируемых пилей адгезии toxR - глобальный регуляторный ген

rtxA - ген, кодирующий синтез токсина RTX холерного вибриона

atf/RS - участок хромосомы, в который внедряется фаг СТХф hapA - ген, кодирующий синтез растворимой гемагглютинин/про-теазы

toxT - регуляторный ген

RS1 ф - повторяющая последовательность, фланкирующая профаг СТХф VPI - МГЭ, «остров патогенности» (от Vibrio Pathogenicity Island)

VSP - МГЭ, «остров пандемичности» (от Vibrio Seventh Pandemic Island)

SXT - МГЭ, коньюгативный транспозон (от sulfamethoxazole, trimethoprim)

кДа - килодальтон

п.н. - пар нуклеотидов

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов ПНР - полимеразная цепная реакция

АТС - антитоксическая сыворотка

ПААГ - полиакриламидный гель

ABTS - 2,2 arino-di-thylbenz thiazoline sulphonate

ДСН - додецилсульфата натрия

ТХУ - трихлоруксусная кислота

CHAPS - 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-l-propanesulfonate EPS - экзополисахарид (от exopolysaccharide)

RTX - repeatsintoxin

TLC - toxin-linked cryptic

МАМА-ПЦР - Mismatch Amplification Mutation Assay ПЦР

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE О1 КЛАССИЧЕСКОГО И ЭЛЬ ТОР БИОВАРОВ»

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Холера - острая диарейная инфекционная болезнь, вызываемая токсигенными штаммами холерного вибриона, которая представляет серьезную угрозу общественному (Бароян О.В., 1971; Ломов Ю.М. и др., 2004; Онищенко Г.Г. и др., 2005; Москвитина Э.А. и др., 2012; Weil А.А., et al., 2012). Без своевременного лечения смерть может наступить в течение нескольких часов после появления симптомов заболевания. Известно три эпидемически опасных варианта возбудителя холеры: Vibrio cholerae OI серогруппы классического биовара, V. cholerae OI серогруппы Эль Тор биовара и V. cholerae 0139 серогруппы. Этиологическим агентом 5 - 6-ой пандемий холеры из 7-ми известных были V. cholerae 01 классического биовара. Возбудителем текущей, 7-ой, пандемии, начавшейся в 1961 году и продолжающейся до сих пор, является V. cholerae 01 биовара Эль Тор (Бароян О.В., 1971; Ломов Ю.М. и др., 2004; Faruque S.M. et al., 1993; Mekalanos J.J. et al., 1997). В течение этой пандемии геном возбудителя претерпел существенные изменения. Одним из наиболее эволюционно значимых событий явилось появление в начале 90-х годов прошлого столетия новых генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор (Смирнова Н.И. и др., 2010; Nair G.B. et al., 2002; Morita M. et al., 2008; Safa A. et al., 2010; Borkakoty В. et al., 2012). Эти штаммы отличались от типичных штаммов возбудителя холеры Эль Тор присутствием в геноме профага СТХф, кодирующего холерный токсин (СТ от англ. cholera toxin), гена ctxB классического типа {ctxBl), характерного для V. cholerae классического биовара. В результате этих и других изменений генома геноварианты стали более вирулентными по сравнению с типичными Эль Тор штаммами (Nair G.B. et al., 2002; Morita M. et al., 2008; Okada К. et al., 2012). В настоящее время геноварианты вытеснили типичные штаммы V. cholerae биовара Эль Тор во многих эндемичных по холере регионах, что определяет реальную возможность завоза данного возбудителя и на территорию Российской Федерации (в Башкирию 2008 г., Москву 2010 г., Таганрог 2011 г.) (Ломов Ю.М. и др., 2010, 2011; Смирнова Н.И. и др., 2010, 2011 ; Миронова Л.В. и др., 2011; Москвитина Э.А. и др., 2011; Савельев В.Н. и др., 2012; Nair G.B. et al., 2006; Safa A. et al., 2010; Tappero J.W. et al. 2011).

Возбудитель холеры способен обитать не только в организме человека, заселяя его тонкий кишечник, но и является естественным обитателем морей и устьев рек, где обычно в составе биопленки способен выживать на биотических (хитине ракообразных и зоопланктоне) и абиотических поверхностях (Tamplin M.L., et al., 1990; Halpern M. et al., 2004). Способность возбудителя адаптироваться к различным условиям существования определяется присутствием на двух хромосомах различных мобильных генетических элементов (МГЭ), несущих гены вирулентности и жизнеобеспечения. Среди МГЭ к важнейшим относятся профаги (СТХср и RSlcp), острова патогенности VPI-1 и VPI-2 (от англ. Vibrio pathogenicity island), острова пандемичности VSP-I и VSP-II (от англ. Vibrio seventh pandemic island), остров персистенции в окружающей среде EPI (от англ. environmental persistence island), SXT элемент (от англ. sulfamethoxazole, trimethoprim) с генами резистентности к лекарственным препаратам, а также интегронный остров (от англ. integron island), способный к захвату чужеродных генов (Ильина Т.С. и др., 2003; Смирнова Н.И., Кутырев В.В., 2004; Karaolis D.K. et al., 1998; Hochhut В. et al., 2001; Dziejman M. et al., 2002; Heidelberg J.F. et al., 2002; Mutreja A., 2011; Taylor J.L. et al., 2012). Мозаичная структура генома V. cholerae обуславливает широкое фенотипическое и генетическое разнообразие штаммов. Такая ситуация определяет необходимость изучения распространенности основных генов патогенности, пандемичности, персистенции и резистентности к лекарственным препаратам среди штаммов V. cholerae классического и Эль Тор биоваров, выделенных на различных территориях и в разные годы для оценки вариабельности их генома. Несмотря на то, что V. cholerae классического биовара был выделен более 120 лет назад и давно утратил эпидемическую значимость, этот возбудитель остается природным резервуаром генов патогенности. В то же время, до сих пор отсутствуют полные данные о генетическом разнообразии штаммов возбудителя холеры этого биовара, что связано с наличием в международных коллекциях микроорганизмов лишь нескольких известных изолятов. В этой связи очевидна актуальность исследований, направленных на изучение вариабельности генома штаммов V. cholerae классического биовара, поскольку полученные данные будут способствовать пониманию механизма возникновения новых

вариантов V. cholerae различных серогрупп, возникших в результате пробретения генетической информации от возбудителя азиатской холеры. Актуальным остается вопрос о причинах изменчивости вирулентных свойств холерного вибриона Эль Тор, изолированных как от больных, так и из объектов окружающей среды. Кроме того, до сих пор нет убедительных ответов на вопрос, за счет каких механизмов происходит формирование потенциально опасных нетоксигенных штаммов, сохранивших токсин-корегулируемые пили (TCP) (от англ. toxin-coregulated pilus), являющиеся не только основным фактором колонизации, но и рецептором для профага СТХф с генами холерного токсина. Открытым остается вопрос о генетических связях типичных и генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, а так же о генетическом разнообразии последних.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Сравнительный анализ вариабельности генома различных штаммов V. cholerae Ol серогруппы классического и Эль Тор биоваров, выделенных от больных, вибрионосителей и объектов окружающей среды. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Оценить вариабельность участков генома, содержащих мобильные элементы с основными генами вирулентности и жизнеобеспечения, у природных штаммов V. cholerae 01 классического и Эль Тор биоваров, изолированных в разные временные периоды на различных территориях с помощью современных молекулярно-генетических методов.

2. Выявить и изучить в модельных экспериментах вариабельность генома типичных и генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор при их попадании в водную среду.

3. Провести сравнительный анализ фенотипических свойств вирулентных штаммов и их спонтанных нетоксигенных мутантов после пребывания V. cholerae в водной среде.

4. Изучить конкурентную способность и устойчивость исходных вирулентных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор и их спонтанных нетоксигенных мутантов к действию неблагоприятных факторов окружающей среды.

5. Провести молекулярное типирование типичных и генетически измененных штаммов V. скокгае биовара Эль Тор методом МЬУА по пяти УЫТЯ-локусам мс0147, ус0436-7, ус1650, уса0171, уса0283.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Получены новые данные о генетическом разнообразии штаммов V. скокгае классического и Эль Тор биоваров, выделенных в разные годы на различных территориях. На основании комплексного изучения штаммов, циркулирующих в эндемичных по холере очагах и завезенных на территорию РФ, установлено, что геномный полиморфизм штаммов V. скокгае классического биовара выражается в разной структуре промоторной области оперона с£хАВ (3-7 копий повторов ТТГГСАТ), кодирующего холерный токсин, а также гена 1срА (однонуклеотидная замена в/Т в 117 позиции), определяющего продукцию основного белка токсин-корегулируемых пилей. Вместе с тем, при сравнении участков хромосомы, содержащих МГЭ с генами патогенности и жизнеобеспечения, была выявлена большая стабильность генома V. скокгае классического биовара по сравнению с таковой V. скокгае биовара Эль Тор. Обнаружено, что все изученные штаммы возбудителя азиатской холеры содержат СШЗРЯ-систему, защищающую клетку от проникновения чужеродной ДНК, что может быть одной из причин стабильности генома этого патогена.

В отличие от холерных классических вибрионов, в геноме штаммов V. скокгае биовара Эль Тор СГИБРЯ-система отсутствует, что, видимо, определило возможность приобретения этим возбудителем новой генетической информации от V. скокгае классического биовара и V. скокгае 0139.

Впервые обнаружено, что типичные клинические штаммы V. сИо1егае биовара Эль Тор при попадании в водную среду могут утрачивать профаг СТХф, несущий гены холерного токсина. Потеря профага СТХф сопровождатся изменением экспрессии ряда генов, кодирующих дополнительные факторы патогенности (гемолизин и подвижность).

Впервые проведен сравнительный протеомный анализ изогенных токсигенных и нетоксигенных штаммов V. скокгае биовара Эль Тор. Показано, что утрата профага СТХф сопровождается изменением уровня экспрессии 17 белков, включая белки, участвующие в энергетическом обмене, транспорте

глюкозы, хемотаксисе и биосинтезе пуриновых оснований. Впервые установлено, что потеря профага СТХф в 5-15 раз увеличивает устойчивость клеток нетоксигенных штаммов к различным стрессовым воздействиям (солевой и окислительный стрессы). Новыми являются данные о том, что при совместной инкубации изогенных токсигенных и нетоксигенных штаммов в водной среде нетоксигенные мутанты обладали в 2-5 раз большей выживаемостью, что, возможно, является одним из основных условий длительного сохранения бактериальной популяции в окружающей среде.

Показана возможность дифференциации типичных и генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, методом ML VA по пяти VNTR-локусам vc0147, vc0436-7, vcl650, vca0171, vca0283. Занесенные на территоршо РФ геноварианты V. cholerae биовара Эль Тор являются генетически неоднородными. Впервые показана возможность дифференциации геновариантов, различающихся между собой по эпидемическому потенциалу, методом ML VA.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

В государственной коллекции патогенных бактерий депонированы изогенные штаммы V. cholerae 01 биовара Эль Top (М888 cíxA+ tcpA+, М888 ctxA' 1срА+; M887 ctxA+ ícpA+, M887 ctxA' ícpA+, M887 ctxA+ zot ' tcpA+) с разным набором генов патогенности, которые могут быть использованы для изучения механизма образования нетоксигенных штаммов.

Оформлены методические рекомендации «Получение нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae 01 биовара Эль Тор», одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 20 апреля 2012 г.) и утвержденные директором института 20 апреля 2012 г.

Полученные данные по распространенности основных генов патогенности, пандемичности, персистенции и жизнеобеспечения среди природных штаммов V. cholerae могут быть использованы для последующей генетической паспортизации штаммов, хранящихся в Государственной коллекции патогенных бактерий.

Материалы исследований по изучению генетической организации штаммов V. cholerae 01 серогруппы используются при чтении лекций «Микробиология и генетика возбудителя холеры» на курсах первичной специализации и повышения

квалификации врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб».

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Геномный полиморфизм штаммов V. cholevae классического биовара, изолированных в разные годы на территории различных стран, проявляется в разной структуре промоторной области оперона ctxAB, а также гена tcpA, кодирующих основные факторы вирулентности - холерный токсин и основной белок токсин-корегулируемых пилей соответственно. Выявленная вариабельность выражается в присутствии 3-7 повторов TTTTGAT в промоторной области оперона ctxAB у различных штаммов, а также однонуклеотидной синонимической замене в гене tcpA (G/T). Вместе с тем, участки генома возбудителя азиатской холеры, связанные с патогенностыо и персистенцией, являются относительно стабильными, поскольку у проверенных штаммов присутствовали все тестируемые гены вирулентности и жизнеобеспечения (15 генов), локализованные в коровой области хромосомы (toxR, hapA, rtxA, cittRS) и на 4-х мобильных элементах (CTXcp, VPI-1 и VPI-2, EPI).

2. Геном клинических и изолированных из окружающей среды штаммов V. cholerae биовара Эль Тор является вариабельным, что проявляется как в утрате различных фрагментов ДНК, связанных с синтезом факторов патогенности (участки генома СТХф, VPI-1 и VPI-2) и адаптацией к меняющимся условиям окружающей среды (VSP-I и VSP-II), так и в приобретении новой генетической информации от V. cholerae классического биовара (аллель гена ctxBl) и V. cholerae 0139 (SXT-генетический элемент).

3. В водной среде значительная часть изученных типичных вирулентных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор (55%) утрачивают профаг СТХф, в состав которого входят гены ctxAB, кодирующие биосинтез ключевого фактора патогенности - холерного токсина. Делеция профага СТХф сопровождается изменением экспрессии ряда других генов, связанных с патогенностыо. Согласно данным протеомного анализа у нетоксигенных мутантов из 400 выявленных белков изменяется уровень экспрессии 17, включая 5 идентифицированных

протеинов, участвующих в энергетическом обмене, транспорте глюкозы, хемотаксисе и биосинтезе пуриновых оснований.

4. Отсутствие профага СТХср в 5-15 раз увеличивает устойчивость клеток нетоксигенных штаммов к различным стрессовым воздействиям (солевой и окислительный стрессы) и в 2-5 раз повышает их выживаемость в водной среде.

5. Молекулярное типирование штаммов V. ско1егае биовара Эль Тор методом МЬУА по пяти \TNTR - локусам (ус0147, ус0436-7, ус1650, уса0171, уса0283) позволяет дифференцировать их на типичные и генетически измененные, различающиеся между собой по вирулентности и эпидемическому потенциалу. Занесенные на территорию РФ варианты V. скокгае биовара Эль Тор являются генетически неоднородными.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:

Материалы диссертации доложены и представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005), Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербурге, 2007 г.), заседании проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Дону, 2005, 2012 гг.), на X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), на IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012), на научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов 2006, 2011- 2012 гг.). ПУБЛИКАЦИИ:

По теме диссертации опубликовано 10 работ, их них 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 234 цитируемых работы, из них 46

отечественных и 188 зарубежных. Общий объем диссертации составляет 153 страницы. Текст иллюстрирован 19 таблицами и 24 рисунком.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Кульшань, Татьяна Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Геномный полиморфизм штаммов V. cholerae классического биовара, изолированных в разные временные периоды на территории Азии и России проявляется в разной структуре промоторной области оперона ctxAB (3-7 повторов TTTTGAT), кодирующего холерный токсин, а также гена tcpA (одна нуклеотидная замена G/T), определяющего продукцию основного белка токсин-корегулируемых пилей. Вместе с тем, исследованные участки генома возбудителя азиатской холеры являются относительно стабильными, что выражается в присутствии у всех изученных штаммов 15 тестируемых генов, связанных с вирулентностью и жизнеобеспечением и размещенных в коровой части хромосомы (toxR, hapA, rtxA, attRS) и на МГЭ (СТХф, VPI-1, VPI-2, EPI).

2. Геном штаммов V. cholerae Эль Тор отличается от V. cholerae классического биовара присутствием протяженных вариабельных участков, в состав которых входят профаги СТХф и К81ф, остров патогенности VPI-2 и остров пандемичности VSP-II. Вариабельность генома возбудителя холеры Эль Тор выражается в потере различных фрагментов ДНК, связанных с патогенностью и эпидемическим потенциалом, а так же в приобретении нового генетического материала.

3. Обнаружено, что типичные клинические штаммы V. cholerae биовара Эль Тор при попадании в водную среду могут утрачивать профаг СТХф, несущий гены холерного токсина. Потеря профага СТХф сопровождатся изменением экспрессии ряда генов, кодирующих дополнительные факторы патогенности (гемолизин и подвижность).

4. При сравнительном анализе протеомов выявлены существенные различия между изогенными токсигенными и нетоксигенными штаммами V. cholerae биовара Эль Тор в уровне экспрессии белков, участвующих в энергетическом обмене, транспорте глюкозы, хемотаксисе и биосинтезе пуриновых оснований.

5. Установлено, что у нетоксигенных мутантов значительно повышен (в 5-15 раз) уровень устойчивости к солевому и окислительному стрессу, а также выживаемость (в 2-5 раз) в водной среде по сравнению с исходными токсигенными штаммами.

6. С помощью метода МЬУА по 5 локусам получены данные, позволяющие дифференцировать штаммы V. ско1егае биовара Эль Тор на типичные и генетически измененные, различающиеся между собой по вирулентности и эпидемическому потенциалу. Показано, что геноварианты генетически неоднородны и имеют поликлональное происхождение.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение генетического разнообразия штаммов V. cholerae Ol серогруппы, являющегося возбудителем 7-ми пандемий холеры является важным направлением в современной микробиологии холеры. Несмотря на давнее присутствие во многих коллекциях патогенных бактерий штаммов V. cholerae классического и Эль Тор вибрионов, выделенных из разных источников и в разные годы, до сих пор нет полной информации о структуре их генома. Вместе с тем, такие сведения необходимы для понимания механизмов эволюции возбудителя, идентификации и генетической дифференциации разных штаммов V. cholerae, отличающихся друг от друга по эпидемической значимости. В этой связи был проведен комплексный молекулярно-генетический анализ V. cholerae классического и Эль Тор биоваров. Изучение генетического разнообразия указанных штаммов показало, что геном штаммов V. cholerae классического биовара, несмотря на более древнее происхождение, является в целом более стабильным по сравнению с таковым V, cholerae биовара Эль Тор. Из восьми тестируемых мобильных элементов (СТХср, RSlcp, VPI-1, VPI-2, VSP-I, VSP-II, EPI, SXT) в геноме всех проверенных штаммов этого возбудителя присутствует только четыре (СТХср, VPI-1, VPI-2, EPI). Другая важная особенность этого возбудителя состоит в том, что в хромосоме всех штаммов V. cholerae классического биовара имеется CRISPR - система, обнаруженная ранее лишь у референс - штамма 0395. Поскольку CRISPR - система ограничивает два важных пути горизонтального переноса генов - трансдукцию и коныогацию, то её присутствие во всех изученных штаммах позволяет высказать предположение о том, что именно эта система могла создать препятствия получению этим возбудителем дополнительной генетической информации через горизонтальный перенос генов. Вместе с тем, мы впервые, независимо от недавно проведенных исследований (Миронова JI.B. и др., 2011; Halder К. et al., 2010), обнаружили у классических вибрионов вариабельность двух участков генома, связанных с вирулентностью - промоторной области оперона ctxAB и гена tcpA, входящих в состав профага СТХср и острова патогенности VPI-1, кодирующих биосинтез холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей. Выявленная вариабельность проявляется в разном количестве повторов ТТГГСАТ в промоторной области МхАВ у разных штаммов, а также однонуклеотидной синонимической замене в гене 1срА (О/Т). Следствием такой изменчивости структуры генома классических вибрионов может быть различный уровень продукции холерного токсина у разных штаммов.

Что касается эпидемически опасных штаммов V. ско1егае биовара Эль Тор, то для их генома характерно наличие протяженных вариабельных участков, в состав которых входят профаги СТХф и 1181 ф, остров патогенности УР1-2 и острова пандемичности УБР-П. Вариабельность генома возбудителя холеры Эль Тор выражается в потере различных фрагментов ДНК, связанных с патогенностыо и эпидемическим потенциалом. Так, среди 92 штаммов в 4,3% случаев были обнаружены изоляты, лишенные профага СТХф, либо несущие дефектный профаг без гена с1хА. Кроме того, были выявлены штаммы V. сИо1егае биовара Эль Тор, лишенные острова пандемичности УБР-П, либо в их острове пандемичности имелась протяженная делеция.

Другой важный механизм генетической изменчивости штаммов этого биовара заключается в том, что у них мог быть изменен состав генов за счет приобретения нового генетического материала через горизонтальный перенос. Эволюционно значимый результат таких событий - появление штаммов, несущих коныогативный БХТ-элемент с 4-мя генами устойчивости к лекарственным препаратам, а также возникновение геновариантов возбудителя с повышенной вирулентностью. Выявленное широкое генетическое разнообразие изученных штаммов V. скокгае биовара Эль Тор может быть отражением различных экологических условий обитания, а также продолжающейся эволюцией генома этого возбудителя.

Особый интерес на наш взгляд представляют полученные данные об изменении генома вирулентных штаммов при их попадании в водную среду. Во-первых, обнаружено, что типичные штаммы, содержащие одну копию профага СТХф, могут утрачивать гены этого мобильного элемента при их обитании в водной среде. Такое изменение генома вирулентных штаммов, видимо, связано с адаптацией патогена к условиям внешней среды. Более того, было установлено, что потеря профага СТХср клетками вирулентных штаммов сопровождалась изменением экспрессии других бактериальных генов. Так, при проведении сравнительного протеомного анализа впервые выявлены существенные различия между изогенными токсигенными и нетоксигенными штаммами в уровне экспрессии белков, участвующих в энергетическом обмене и метаболизме клетки. Установлено также, что у нетоксигенных мутантов значительно повышается уровень устойчивости к солевому и окислительному стрессу. Такая специфическая экспрессия бактериальных генов, возникшая в ответ на изменения окружающей среды, является, видимо, необходимым условием для выживания и функционирования патогена в этой экологической нише. Непосредственным подтверждением адаптивной природы изменения структуры и функций генома этого возбудителя являются результаты оценки конкурентной способности изогенных токсигенных и нетоксигенных штаммов V. скокгае биовара Эль Тор в водной среде. Оказалось, что в популяциях, состоящих из токсигенных и нетоксигенных клонов, выживаемость последних была выше в 2-5 раз. Кроме того, наши данные проливают свет на происхождение штаммов с1хА~В~ 1срА*, которые нередко присутствуют в природных популяциях. Такие штаммы представляют большой интерес, поскольку, во-первых, они сохраняют способность к колонизации тонкого кишечника и, следовательно, могут обусловить появление вибрионосителей, во-вторых, существует реальная возможность превращения их в токсигенные в результате фаговой конверсии. И хотя частота реверсии нетоксигенных клонов в токсигенные, по литературным данным, составляет лишь 10"6-10~9 степени (Рапщие 8.М.,е1 а1., 1998; Багияие Б.М., Ышг О.В., 2002) в условиях макроорганизма вероятность такого события повышается за счет массового размножения холерных вибрионов. Кроме того, указанные нетоксигенные варианты, сохранившие способность к продукции основных протективных антигенов - 01 - антигена и токсин-корегулируемых пилей адгезии, могут служить основой для конструирования на их основе живых холерных вакцин.

Важным результатом наших исследований являются также данные молекулярного типирования клинических типичных и генетически измененных штаммов V. скокгае биовара Эль Тор методом МЬУА. Во-первых, установлена степень генетического родства между различными изолятами возбудителя холеры Эль Тор, выделенными в разные периоды 7-ой пандемии, и характер их филогенетической связи по географическому признаку и молекулярно-генетическим особенностям. Во-вторых, показана возможность внутривидовой дифференциации штаммов V. скокгае биовара Эль Тор на типичные и генетически измененные, которые различаются между собой по вирулентности и эпидемическому потенциалу. В-третьих, получены данные о существенном генетическом разнообразии геновариантов и их поликлональном происхождении.

Обобщая изложенный материал, можно сделать заключение, что проведенное исследование позволило получить более полные сведения о структуре генома значительного количества коллекционных штаммов V. скокгае классического и Эль Тор биоваров, выделенных на разных эндемических по холере территориях и занесенных в Россию, а также выявить и дать оценку изменению экспрессии бактериальных генов, возникшей в ответ на действие неблагоприятных факторов внешней среды. Последнее является основой, для понимания механизмов, обеспечивающих длительное выживание холерных вибрионов в водных экосистемах.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Кульшань, Татьяна Алексеевна, 2013 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

2 Адамов А.К., Ломов Ю.М., Малеев В.В. с и др. Холера в СССР в период VII пандемии [Текст] / Под. ред. В.И. Покровского. - М., 2000. - 472 с.

3 Бароян О.В. Холера Эль-Тор [Текст]. - М.: Медицина, 1971.

4 Водопьянов A.C., Водопьянов С.О., Мишанькин М.Б., и др. Вариабельные тандемные повторы, выявленные при компьютерном анализе генома Vibrio cholerae [Текст] // Биотехнология. - 2001. - №6. - С. 85-88.

5 Водопьянов С.О., Олейников И.П., Гончаров Е.К. с соавт. Вариабельный тандемный повтор VcA Vibrio cholerae [Текст] // Мол. б иол. - 2002. - Т. 36, №6.- С. 1074-1079.

6 Гинцбург А.Л., Янишевский Н.Б., Мотин В.Л. с соавторами. Организация и клонирование структурных генов энтеротоксина Vibrio cholerae eltor RV 79 [Текст] II Мол. генетика, микробиол., вирусол. - 1984. - № 9. - С.12-19.

7 Жуков-Вережников H.H., Мусабаев И.К., Завьялов Н.К. Клиника, лечение и профилактика холеры [Текст]. - Ташкент: Медицина, 1966.-435 с.

8 Заднова С.П., Лозовский Ю.В. Механизмы секреции грамотрицательных бактерий [Текст]// Проблемы особо опасных инфекций - 2005. - № 2(90). - С. 11-16.

9 Заднова С.П., Шашкова A.B., Краснов Я.М., Смирнова Н.И. Фенотипический и генетический анализ измененных вариантов Vibrio cholerae биовара эльтор [Текст] // Проблемы особо опасных инфекций - 2012. - Вып. 1(111). - С. 5762.

10 Ильина Т.С. Механизмы горизонтального переноса генов: роль бактериофагов и интегронов в эволюции патогенных бактерий [Текст] // Мол. генетика, микробиол., вирусол. - 2003. - № 4. - С. 3-10.

11 Ильина Т.С. Суперинтегроны бактерий - источники новых генов с адаптивными функциями [Текст] // Генетика. - 2006. - Т. 42. - № 11. - С. 1536-1546.

12 Ильина Т.С., Романова Ю.М. Геномные острова бактерий: организация, функции, роль в эволюции [Текст] // Молекулярная биология. - 2002. - Т. 36. - № 2. - С. 228-239.

13 Кологоров А.И., Кедрова О.В., Кокушкин A.M. и др. Характеристика эпидемии холеры в СССР в 1941-1943 гг. [Текст] // РосНИПЧИ «Микроб». Саратов, 1993. - 12 с. - Деп. в ВИНИТИ. 15.04.93. -№ 963. -В93.

14 Костромитина Е.А. Молекулярно-генетические свойства штаммов холерного вибриона Эль Тор с различной эпидемической значимостью: диссертация... кандидата медицинских наук: 03.00.07, 03.00.15 Саратов, 2004 180 с.

15 Ломов Ю.М. Особенности эпидемических осложнений при холере на современном этапе [Текст] // Эпидемиол. инф. бол. - 2010. - № 2. - С. 7-11.

16 Ломов Ю.М. Эволюция возбудителя холеры и прогноз по этой инфекции на ближайшее будущее [Текст] // Эпидемиол. инф. бол. - 2004. -№ 1. - Р. 7-12

17 Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Арешина O.A., Адаменко О.Л. Оценка эпидемиологической обстановки по холере в мире в современный период. Прогноз [Текст] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - Вып. 1(107). -С. 16-19.

18 Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование [Текст]. Пер. с англ. - М.: Мир, 1984. - 480 с.

19 Миронова Л.В., Балахонов C.B., Урбанович Л.Я., Кожевникова A.C. и др. Молекулярно-генетический анализ эпидемически опасных штаммов Vibrio cholerae Eltor, изолированных в Сибирском и Дальневосточном регионах России [Текст] // Мол. генетика, микробил., вирусол. - 2012. -N2. - С. 13-20.

20 Мишанькин Б.Н., Романова Ю.М., Ломов Ю.М. и др. Vibrio cholerae 0139, выделенные от людей и из воды открытых водоемов: сравнительное генотипирование [Текст] // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2000. -N 3. - С. 3 - 7.

21 Монахова Е.В., Ломов Ю.М., Михась Н.К., Писанов Р.В. Структура и изменчивость неполного СТХ - элемента холерных вибрионов [Текст] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2007. - Вып. 93. - С. 58-61.

22 Монахова Е.В., Михась Н.К., Смоликова Л.М., Мишанькин Б.Н. Изучение генетических детерминант токсинов кассеты вирулентности и нейраминидазы холерных вибрионов с помощью молекулярного зондирования [Текст] // Журн. микробиол. - 2001. - № 2. - Р. 25-29.

23 Монахова Е.В., Писанов Р.В. Токсины холерных вибрионов [Текст] // Мол. генетика, микробиол., вирусол. - 2005. - № 1. - С. 7 - 18.

24 Москвитина Э.А., Мазрухо А.Б., Адаменко О.Л., Крутиков В.Д. Холера в начале XXI века. Прогноз на глобальном уровне [Текст] // Проблемы особо опасных инфекций-2012.-№ 1(111).-С. 11-16.

25 Нефедов К.С. Сравнительный анализ фенотипических и молекулярно-генетических свойств холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в период седьмой пандемии холеры диссертация... кандидата медицинских наук: 03.00.07 Саратов, 2009 153 с.

26 Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М. и др. Холера, обусловленная Vibrio cholerae Ol ctxAB'tcpA+ [Текст] // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. - 2007. -№1. - С. 23 - 29.

27 Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Жилина Н.Я. и др. Эпидемиологический надзор за холерой: обоснование к оценке его эффективности [Текст] // Проблемы особо опасных инфекций - 2005. - № 1(89).-С. 5-9.

28 Осин A.B., Ерошенко Г.А., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. Сравнительный ПЦР-анализ структуры генома вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae серогруппы 0139 [Текст] // Проблемы особо опасных инфукций -Саратов, 2003. - № 85 - С. 97-103

29 Подшивалова М.В., Захарова И.Б., Викторов Д.В., Алексеев В.В. Распространенность интегронов класса I и SXT-элементов в изолятах Vibrio

cholerae, выделенных на территории Волгоградской области [Текст] // Холера и патогенные для человека вибрионы. Материалы пробл. комиссии. Вып. 20, Ростов-на-Дону, 2007 г. - С. 105-108.

30 Покровский В.И, Онищенко Г.Г. и др. Современные представления об инфекционной патологии и основные направления совершенствования стратегии ее профилактики [Текст] // Вестник Рос. акад. мед. наук. - 2000. -№ 1.-С.З-7.

31 Пугач К.С., Лопатина A.B., Северинов К.С. CRISPR-системы адаптивного иммунитета прокариот [Текст] // Мол. биол. - 2012. - Вып. 46 (2). - С. 195203.

32 Романова Ю.М., Ильина Т.С., Гинцбург А.Л. Мобильные генетические элементы и их роль в эволюции патогенных бактерий [Текст] // Вестник РАМН.-2001.-№ 11.-С. 15-20.

33 Савельев В.Н., Савельева И.В., Бабенышев Б.В., Куличенко А.Н. Эволюция возбудителя и клинико-эпидемиологические особенности современной холеры Эль-Тор [Текст] // Эпидемиол. инф. бол. - 2012. - № 5. - С. 31 - 35.

34 Савельев В.Н., Савельева И.В., Васильева О.В., Бабенышев Б.В. и др. Эволюция Vibrio cholerae Eltor и их генотипических вариантов на Кавказе [Текст] // Проблемы особо опасных инфекций - 2012. - № 4. - С. 58 - 60.

35 Смирнова Н.И. Генетический контроль патогенности Vibrio cholerae: умеренный нитевидный фаг СТХ, кодирующий холерный токсин, и «остров патогенности» [Текст] // Молекул, генетика, микробиол., вирусол. - 1999. -№4. - С.3-11.

36 Смирнова Н.И., Горяев A.A., Заднова С.П., и др. Генетическая характеристика клинических штаммов Vibrio cholerae, завезенных на территорию Российской Федерации в современный период [Текст] // Микробиол. - 2011. - 3. - С. 3-10.

37 Смирнова Н.И., Заднова С.П., Шашкова A.B., Кутырев В.В. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, завезенных на

территорию России в современный период [Текст] // Мол. генетика., микробиол., вирусол. - 2011. - №4. - С. 11-18.

38 Смирнова Н.И., Костромитина Е.А., Осин A.B., Кутырев В.В. Вариабельность генома штаммов Vibrio cholerae биовара Эль-Тор [Текст] // Вестник Рос. акад. мед. наук. - 2005. - №7. - С. 19-26.

39 Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Эволюция возбудителя холеры [Текст] // Мол. генетика, микробиол., вирусол. - 2004. - № 4. - С. 3 - 13.

40 Сучков И.Ю., Водопьянов A.C., Водопьянов С.О., и др. Мультилокусный VNTR-анализ в изучении популяционной структуры Yersinia pestis в природных очагах [Текст] // Мол. генетика, микробиол., вирусол. - 2004. - С. 19-27.

41 Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М., Бардых И.Д., Винокур Н.И. Адгезивность холерных вибрионов с ТСР+СТХ- генотипом, изолированных из объектов внешней среды на территории Ростовской области в 2002 году [Текст] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2004. - Вып. 88. - С.42-44.

42 Челдышова Н.Б., Кириллина O.A., Ливанова Л.Ф., Куличенко А.Н., Смирнова Н.И., В.В. Кутырев В.В. ПЦР-анализ штаммов Vibrio cholerae Ol, выделенных на территории Нижнего Поволжья [Текст] // Материалы I Всеросс. науч.-практ. конф. Генная диагност, инф. болезней. - Саратов, 2000. - С. 28-29.

43 Шашкова A.B. Фенотипический и молекулярно-генетический анализ измененных вариантов Vibrio cholerae биовара эльтор... кандидата биологических наук: 03.02.03 Саратов, 2012 131 с.

44 Шашкова A.B., Горяев A.A., Заднова С.П., Краснов Я.М., Смирнова Н.И. , Кутырев В.В. Конструирование ПЦР-тест системы для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae Ol, определения их биовара и дифференциации штаммов эльтор на типичные и измененные [Текст] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - Вып. 4 (110) - С.49-52.

45 Шашкова A.B., Горяев A.A., Смирнова Н.И. Строение и функциональная роль CRISPR-системы бактерий [Текст] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - Вып. 2(108). - С.49-52.

46 Щелканова Е.Ю., Горяев А.А, Смирнова Н.И. Изменение генома профага СТХ 9 Vibrio cholerae биовара Эль-Тор, вызываемое транспозоном TN5-MOB [Текст] // Проблемы особо опасных инфекций - 2008. - Вып. 3. - С. 11-17.

47 Adair D. М., Worsham P. L., Hill К. К., Klevytska А. М. et al. Diversity in a variable-number tandem repeat from Yersinia pestis [Text] // J. Clin. Microbiol -2000 - P. 1516-1516.

48 Ali A. Johnson J.A., Franco A.A. et al. Mutations in the extracellular protein secretion pathway genes (<eps) interfere with rugose polysaccharide production in and motility of Vibrio cholerae [Text] // Infect. Immun. - 2000 - Vol. 68, N4. -P.l 967-1974.

49 Amita M., Chowdhury S.R., Thungapathra M., Ramamurthy Т., Nair G.B., Ghosh A. Class I integrons and SXT elements in El Tor strains isolated before and after 1992 Vibrio cholerae 0139 outbreak, Calcutta, India [Text] // Emerg. Infect. Dis. -2003. - Vol. 9, N4. - P. 500-502.

50 Ansaruzzaman M., Bhuiyan N.A., Nair G.B., Sack D.A., et al. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae [Text] // Emerg. Infect. Dis. - 2004. - Vol. 10-P. 2057-2059.

51 Badhai J., Kumari P., Krishnan P. et al. Presence of SXT integrating conjugative element in marine bacteria isolated from the mucus of the coral Fungia echinata from Andaman Sea [Text] // FEMS Microbiol. Lett. - 2013. - Vol. 338, N2. - P. 118-123.

52 Basu A., Mukhopadhyay A. K., Garg P. Diversity in the arrangement of the CTX prophages in classical strains of Vibrio cholerae 01 [Text] // FEMS Microbiol. Lett. - 2000. - Vol. 182, N1. - P. 35-40.

53 Baudry, В., Fasano A., Ketley J., Kaper J. B. Cloning of a gene additional support for, our new model describing production of (zot) encoding a new toxin produced by Vibrio cholerae [Text] // Infect. Immun. - 1992. - Vol. 60. P. 428-434.

54 Beyhan S., Bilecen K. Regulation of rugosity and biofilm formation in Vibrio cholerae: comparison of VpsT and VpsR regulons and epistasis analysis of vpsT, vpsR, and hapR [Text] // J. Bacteriol. - 2007. - Vol. 189, N 2. - P. 388-402.

55 Bhaskaran K., Rouley D., Nutritional stadies on Vibrio cholerae [Text] // Gen. Microbiol. - 1956. - V. 15, N 2. - P.417-422.

56 Bhuiyan N.A., Nusrin S., Ansaruzzaman M. et al. Genetic characterization of Vibrio cholerae 01 strains isolated in Zambia during 1996-2004 possessing the unique VSP-II region of El Tor variant [Text] // Epidemiol. Infect. - 2012. -Vol.140. N.3.- P. 510-518.

57 Biscri L., Bouvier M., Gufirout A.-M. Boisnard S., Mazel D. Comparative study of Class 1 integron and Vibrio cholerae superintegron integrase activités [Text] // J. Bacteriol.-2005.-Vol. 185, N5.-P. 1740-1750.

58 Boardman B. K., Meehan B. M., Fullner Satchell K. J. Growth phase regulation of Vibrio cholerae RTX toxin export [Text] // J Bacteriol. - 2007. - V.189, N 5. - P. 1827-1835.

59 Boardman B.K., Satchell K.J. Vibrio cholerae strains with mutations in an atypical type I secretion system accumulate RTX toxin intracellularly [Text] // J. Bacteriol. - 2004. - Vol. 186. - P. 8137-8143.

60 Borkakoty B., Biswas D., Devi U. et al. Emergence of classical ctxB genotype 1 and tetracycline resistant strains of Vibrio cholerae Ol El Tor in Assam, India [Text]//Trans R. Soc. Trop. Med. Hyg.-2012.-Vol. 106,N 6-P.382-386.

61 Boyd E.F., Heilpern A.J., Waldor M.K. Molecular analyses of a putative CTX precursor and evidence for independent acquisition of distinct CTX by toxigenic Vibrio cholerae [Text] // J. Bacteriol. - 2000. - Vol. 182. - P. 5530 - 5538.

62 Boyd E.F., Waldor M.K. Evolutionary and functional analyses of variants of the toxin-coregulatedpilus protein TcpA from toxigenic Vibrio cholerae non-Ol/non-0139 serogroup isolates [Text] // J. Microbiol. - 2002. - Vol. 148. - P. 1655-1666.

63 Burrus V., Marrero J., Waldor M.K. The current ICE age: Biology and evolution of SXT-related integrating conjugative elements [Text] // Plasmid. - 2006. - Vol. 55. -P. 173-183.

64 Butler S. M., Camilli A. Going against the grain: Chemotaxis and infection in Vibrio cholerae [Text] //Nat. Rev. Microbiol. - 2005. - Vol. 3. - P. 611-620.

65 Byun R., Elbourne L. D. II., Lan R., Reeves P. R. Evolutionary relationships of pathogenic clones of Vibrio cholerae by sequence analysis of four housekeeping genes [Text] // Infect. Immun. - 1999. - Vol. 67. N3- P. 1611-1124.

66 Chakraborti S., Mukhopadhyay A.K., Bhadra R.K. et al. Virulence genes in environmental strains of Vibrio cholerae [Text] // Appl. Env. Microbiol. - 2000. -P. 4022 -4028.

67 Chakraborty S., Waise T.M.Z., Hassan F. et al. Assessement of the evolutionary origin and possibility of CRISPR-Cas (CASS) mediated RNA interference pathway in Vibrio cholera 0395 [Text] // In Silico Biology. - 2009. - Vol. 9, N4. - P. 245254.

68 Chatterjee S., Parta T., Ghosh K. et al. Vibrio cholerae Ol clinical strains isolates in 1992 in Kolkata with progenitor traits of the 2004 Mozambique variant [Text] IIJ. Med. Microbiol - 2009 - Vol. 58. - P. 239 -247.

69 Chaudhuri K., Chatterjee S.N. Cholera Toxins [Text] // Berlin: Springer-Verlag Berlin Heidelberg - 2009. - P. 1 - 222.

70 Chen P.Y. Mu J.J., Lin H.Y. et al. Vibrio cholerae Ol infection in Taiwan [Text] //J. Infect. -2011. - Vol. 62, N 2. - P. 178-80.

71 Chiang S. L., Taylor R.K., Koomey M., Mekalanos JJ. Single amino acid substitutions in the N-terminus of Vibrio cholerae TcpA affect colonization, autoagglutination, and serum resistance [Text] // Mol. Microbiol. - 1995. - Vol. 17, N6.-P. 1133-1142.

72 Chiavelli D.A., Marsh J.W., Taylor R.K. The mannose-sensitive hemagglutinin of Vibrio cholerae promotes adherence to Zooplankton [Text] // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol. 67, N 7. - P. 3220 - 3225.

73 Chin C.S., Sorenson J., Harris J.B. et al. Origin of the Haitian cholera outbreak strain [Text] // N. Engl. J. Med. - 2011. - Vol.364, N1. - P.33-42.

74 Choi S. Y., J. IT. Lee, Jeon Y. S., et al. Multilocus variable-number tandem repeat analysis of Vibrio cholerae Ol EI Tor strains harbouring classical toxin B [Text] // J. Med. Microbiol. - 2010- Vol. 59, № 3. - P.763-769.

75 Chow K.H., Ng T. K., Yuen K. Y., Yam W. C. et al. Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholera by PCR [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2001. - Vol. 39. - P. 2594-2597.

76 Chun J., Grim C. J., Hasan N.A. et al. Comparative genomics reveals mechanism for short-term and long-term clonal transitions in pandemic Vibrio cholerae [Text] // PNAS - 2000. - Vol. 106, N 36. - P. 15442-15447.

77 Cotter P.A., DiRita V.J., Bacterial virulence gene regulation: an evolutionary perspective [Text] // Annu. Rev. Microbiol. - 2000. - V. 54. - P. 519-565.

78 Crawford J.A., Krukonis E.S., DiRita V.J. Membrane localization of the ToxR winged-helix domain is required for TcpP-mediated virulence gene activation in Vibrio cholerae [Text] // Mol. Microbiol. - 2003. - Vol. 47, N 5. - P. 1459 - 1473.

79 Dalsgaard A., Serichantalergs O., Forslund A. et al. Clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae serogroup 0141 carry the CTX phage and the genes encoding the toxin-coregulated pili [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2001. - Vol. 39, N11.-P. 4086-4092.

80 Danin-Poleg Y., Cohen L. A., Yoav H. G. et al. Vibrio cholerae strain typing and phylogeny study based on simple sequence repeats [Text] // J. Clin. Microbiol. -2007- Vol. 45, № 3. - P. 736-746.

81 Das B., Bischeroura J. and Barrea F. X. VGJ integration and excision mechanisms contribute to the genetic diversity of Vibrio cholerae epidemic strains [Text] // PNAS.-2011.-P. 1-6.

82 Davis B.M., Kimsey, H. H., Kane, A. V. et al. A satellite phage-encoded antirepressor induces repressor aggregation and cholera toxin gene transfer [Text] // EMBO. - 2002. - Vol. 21. - P. 4240 - 4249.

83 Davis B.M., Moyer K.E., Boyd E.F., Waldor M.K. CTX prophages in classical biotype Vibrio cholerae: functional phage genes but dysfunctional phage genomes [Text] // J. Bacteriol. - 2000. - Vol. 182, N 24. - P. 6992 - 6998.

84 Davis B.M., Waldor M.K. Filamentous phages linked to virulence of Vibrio cholerae [Text] // Curr. Opinion in Microbiol. - 2003. - Vol. 6, N 1. - P. 35-42.

85 Dong T.G., Mekalanos J.J. Characterization of the RpoNregulon reveals differential regulation of T6SS and new flagellar operons in Vibrio cholerae 037 strain V52 [Text] // Curr. Infect. Dis. Rep. - 2012. - Vol. 14. - P. 1-8.

86 Dubey R.S., Leindbland M., Olmgren J. Purification of El Tor cholera enterotoxins and comparisons with classical toxin [Text] // J. Gen. Microbiol. - 1990. - V.136. -P. 1839- 1847.

87 Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental cholera in infant rabbits: a method for chemotherapeutic investigation [Text] // Br. J. Pharmacol. Chemother. - 1955. -Vol. 10, N2.-P.l 53-159.

88 Dziejman M., Balon E., Boydet D. et al. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae'. genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease [Text] // Proc.Natl. Acad. Sei.-2002.-Vol. 99.-P. 1556-1561.

89 Faruque S.M., Abdul Alim A. R. M., Rahman M. M. et al. Clonal relationships among classical Vibrio cholerae 01 strains isolated between 1961 and 1992 in Bangladesh [Text] // J. Clin. Microbiol. - 1993. - P. 2513-2516.

90 Faruque S.M., Albert M.J., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics an ecology of toxigenic Vibrio cholerae [Text] // Microbiol. Mol. Rev. - 1998. - Vol. 62. - P. 1301 -1314.

91 Faruque S.M., Asadulghani, Kamruzzaman M. et al. RSI element of Vibrio cholerae can propagate horizontally as a filamentous phage exploiting the morphogenesis genes of CTXq> [Text] // Infect. Immun. - 2002. - Vol. 70, N 1. - P. 163 - 170.

92 Faruque S.M., Asadulghani, Rahman M.M., et al. Sunlight-induced propagation of the lysogenic phage encoding cholera toxin [Text] // Infect. Immune. - 2000. - Vol. 68.-N. 8.-P. 4795-4801.

93 Faruque S.M., Asadulghani, Saha M.N., et al. Analysis of clinical and environmental strains of nontoxigenic Vibrio cholerae for susceptibility to СТХФ: molecular basis for origination of new strains with epidemic potential [Text] // Infect. Immun. - 1998. - Vol. 66. -N12 - P.5819-5825.

94 Faruque S.M., Kamruzzaman M., Asadulghani, Sack D.A., Mekalanos J.J., Nair G.B. CTX(p-independent production of the RS 1 satellite phage by Vibrio cholerae [Text]//PNAS.-2003.-Vol. 100, N3.-P. 1280-1285.

95 Faruque S.M., Mekalanos J.J. Phage-bacterial interactions in the evolution oftoxigenic Vibrio cholerae [Text] // Review - 2012. - Vol. 3. N. 7. - P. 1-10.

96 Faruque S.M., Nair G.B. Molecular ecology of toxigenic Vibrio cholerae [Text] // Microbiol. Immunol.- 2002. - Vol. 46. N. 2. - P. 59-66.

97 Faruque S.M., Naser I.B., Islam M.J. Seasonal epidemics of cholera inversely correlate with the prevalence of environmental cholera phages [Text] // Proc. Natl. Acad. Sei.-2005.-Vol. 102.-P. 1702-1707.

98 Faruque S.M., Rahman M.M., Hasan A.K.M., et al. Diminished diarrheal response to Vibrio cholerae strains carrying the replicative form of the CTX(Phi) genome instead of CTX (Phi) lysogens in adult rabbits [Text] // Infect. Immun. - 2001. -Vol. 69.-P. 6084 -6090.

99 Fasano A., Baudry B., Pumplin D.W. et al. Vibrio cholerae produces a second enterotoxin, which affects intestinal tight junctions [Text] // PNAS. - 1991. - Vol. 15,N88(12).-P. 5242-5246.

100 Fields P.I., Popovic T., Wachsmuth K., Olsvik O.Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae Ol strains from the Latin American cholera epidemic [Text] // J. Clin. Microbiol. - 1992. - Vol. 30, N8. - P. 2118-2121.

101 Finkelstein R.A., Boesman-Finkelstein M., Chang Y. et al. Vibrio cholerae hemagglutinin/protease, colonial variation, virulence and detachment [Text] // Infect. Immun. - 1992. - V. 60. - P. 472-478.

102 Fong J.C.N., Yildiz F.H. The rbmBCDEF gene cluster modulates development of rugose colony morphology and biofilm formation in Vibrio cholerae [Text] // J. Bacteriol. - 2007. - Vol. 189, N 6. - P. 2319-2330.

103 Freier R., O'Brien P. C. M., Macsai M. S. Role of Chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies [Text] //Infect. Immun. -1981.- Vol. 34. - P. 234-240.

104 Fullner K.J., Mekalanos J.J. In vivo covalent cross-linking of cellular actin by the Vibrio cholerae RTX toxin [Text] // Embo. J. - 2000. - Vol. 19. - P. 5315-5323.

105 Galen J.E., Ketley J.M., Fasano A. et al. Role of Vibrio cholerae neuraminidase in the function of cholera toxin [Text] // Infect. Immun. - 1992. - Vol. 60. - P. 406 -415.

106 Gerdes J. C., Romig W. R. Genetic basis of toxin production and pathogenesis in Vibrio cholerae'. evidence against phage conversion [Text] // Infect. Immun. -1975.-Vol. 11.-P. 445-452.

107 Ghosh R., Nair G. B., Tang L. Epidemiological study of Vibrio cholerae using variable number of tandem repeats [Text] // FEMS Microbiol Lett. - 2008. - Vol. 288. - P.196-201.

108 Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae Ol compared to prototype El Tor and classical biotypes [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48, N 11. - P. 4283-4286.

109 Giron J.A., Ho A.S., Schoolnik G.K. An inducible bundle-forming pilus of enteropathogenic Escherichia coli [Text] // Science. - 1991. - V. 254. - P. 710-713.

110 Goel A. K., Jain M., Kumar P., Jiang S. C. Molecular characterization of Vibrio cholerae outbreak strains with altered El Tor biotype from southern India [Text] // J. Microbiol. Biotechnol. - 2010. - Vol. 26. N. 2. - P. 281-287.

111 Goel A.K., Jain M., Kumar P. et al. A new variant of Vibrio cholerae Ol El Tor causing cholera in India [Text] // J. Infect. - 2008. - Vol.57. - P.280-281.

112 Goldberg S., Murphy J. R. Molecular cloning of the hemolysin determinant from Vibrio cholerae El Tor [Text] // J. Bacteriol. - 1984. - Vol. 160. N. 1. - P. 239244.

113 Graig J.P., Yamamoto K., Takeda Y. et al. Production of cholera-like enterotoxin by Vibrio cholerae non-Ol strain isolated from the environment [Text] // Inf. Immun. - 1981. - V.34, N1. - P.77 - 90.

114 Grim C. J., Hasan N. A., Taviani E. Genome sequence of hybrid Vibrio cholerae Ol MJ-1236, B-33, and CIRS101 and comparative genomics with V. cholerae [Text]//J. Bacterid.-2010.-Vol. 192. N. 13. -P. 3524-3533.

115 Hacker J., Blum-Oehler G., Mühldorfer I., Tschäpe H. Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution [Text] // Mol. Microbiol. - 1996. - Vol. 23, N 6. - P. 1089-1097.

116 Hacker J., Kaper J.B. Pathogenicity islands and the evolution of microbes [Text] // Annu. Rev. Microbiol. - 2000. - Vol. 54. - P. 641-679.

117 Haines G.K., Sayed B. A., Rohrer M. S., Olivier V., Satchell K. J. Role of tolllike receptor 4 in the proinflammatory response to Vibrio cholerae Ol El tor strains deficient in production of cholera toxin and accessory toxins [Text] // Infect. Immun. - 2005. - Vol. 73. - P. 6157-6164.

118 Halder K., Das B., Nair B. et al. Molecular evidence favouring step-wise evolution of Mozambique Vibrio cholera Ol El Tor hybrid strain [Text] // Microbiology - 2010. - V. 156. - P.99- 107.

119 Halpern M., Broza Y.B., Mittler S. et al., Chironomid egg masses as a natural reservoir of Vibrio cholerae non-Ol and non-0139 in freshwater habitats [Text] // Microbal. Ecol. - 2004. - V.47. - P.341- 349.

120 Hang L., John M., Asaduzzaman M., et al. Use of in vivo-induced antigen technology (IVIAT) to identify genes uniquely expressed during human infection with Vibrio cholerae [Text] // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 2003. - V. 14, N 14. -P. 8508-8513.

121 Hung D. T., Mekalanos J. J. Bile acids induce cholera toxin expression in Vibrio cholerae in a ToxT-independent manner [Text] // Proc. Natl. Acad Sei. US A.-2005.-V.102- P. 3028-3033.

122 Hassan F., Kamruzzaman M., Mekalanos J.J., Faruque S.M. Satellite phage TLCcp enables toxigenic conversion by CTX phage through dif site alteration [Text] //Nature. - 2010. - Vol. 467, N7318. - p. 982-985.

123 Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C. et al. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae [Text] // Nature. - 2000. -

Vol. 406.-P. 477-483.

124 Heilpern A.J., Waldor M.K. CTXtp Infection of Vibrio cholerae requires the tolQRA gene products [Text] // J. Bacteriol - 2000. - Vol. 182, N6. - P. 17391747.

125 Heyningen V. and Seal J. R. Cholera: the American scientific experience [Text] // Westview Press Boulder. - 1993. - P. 1947-1980.

126 Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained Polyacrylamide gels [Text] // J.Bacteriol. - 1983. - V. 154, N 1. - P. 269-277.

127 Hochhut B., Waldor M. K. Site specific integration of thenon-conjugal Vibrio cholerae SXT element into prfC [Text] // Mol. Microbiol. - 1999. - Vol. 32. - P. 99-110.

128 Hochhut B., Lotfi Y., Mazel D. et al. Molecular analysis of antibiotic resistance gene clusters in Vibrio cholerae Ol39 and Ol SXT constins [Text] // Antimicrob. Agents Chemother. - 2001. - Vol. 45, N 11. - P. 2991-3000.

129 Huber K.E., Waldor M.K. Filamentous phage integration requires the host recombinasesXerC and XerD [Text] // Nature. - 2002. - Vol. 417. - P. 656 - 659.

130 Iwanaga M., Yamamoto K., Higa N. et al. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae Ol El Tor [Text] // Microbiol. Immunol. - 1986. - Vol. 30, N11. - P. 1075-1083.

131 Jermyn W.S., Boyd E.F. Characterization of a novel Vibrio pathogenicity island (VPI-2) encoding neuraminidase (nanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates [Text] //Microbiology.-2002.-Vol. 148.-P. 3681-3693.

132 Karaolis D. K. R., Johnson J. A., Bailey C. C. et al. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemik strains [Text] // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1998. - Vol. 95, N 6. - P. 3134 - 3139.

133 Karaolis D.K., Lan R., Kaper J.B., Reeves P.R. Comparison of Vibrio cholerae pathogenicity islands in sixth seventh pandemic strains [Text] // Infect. Immun. -2001.-Vol. 69.-N3-P. 1947-1952.

134 Keasler S.P., Hall R.H. Detecting and biotyping Vibrio cholerae 01 with multiplex polymerase chain reaction [Text] //Lancet. - 1993. - Vol.341. -P. 1661.

135 Keim P., Price L.B., Klevytska A.M., Smith K.L. et al. Multi-locus variable-namber tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis [Text] // J. Bacteriol. - 2000- Vol. 182 - P. 2928-2936.

136 Kendall E. A., Chowdhury F., Begum Y. et al. Relatedness of Vibrio cholerae 01/0139 isolates from patients and their household contacts, determined by multilocus variable-number tandem-repeat analysis [Text] // J. Bacteriol. - 2010-Vol. 192, № 17. - P. 4367-4376.

137 Kimsey H.H., Waldor M.K. Vibrio cholerae hemagglutinin/protease inactivates CTX(p [Text] // Infect. Immun. - 1998. -Vol. 66, N 9. - P. 4025- 4029.

138 Kirn T.J., Lafferty M.J., Sandoe C.M.P., Taylor R.K. Delineation of pilin domains required for bacterial association into microcolonies and intestinal colonization by Vibrio cholerae [Text] // Mol. Microbiol. - 2000. - V. 35, N 4. - P. 67-84.

139 Kirn T.J., Taylor R.K. TcpF Is a Soluble Colonization factor and protective antigen secreted by El Tor and classical Ol and 0139 Vibrio cholerae serogroups [Text] // Infect. Immun. - 2005. - Vol. 73, N 8. - P. 4461-4470.

140 Kojima S., Yamamoto K., Kawagishi I., Homma M. The flagellar motor of Vibrio cholerae is driven by a Na motive force [Text] I I J. Bacteriol. - 1999. -Vol. 181.-P. 1927-1930.

141 Kovach M.E., Shaffer M.D., Peterson K.M. A putative integrase gene defines the distal end of a large cluster of ToxR-regulated colonization genes in Vibrio cholerae [Text] // Microbiology. - 1996. - Vol. 142. - P. 2165 - 2174.

142 Krukonis E.S., DiRita V.J. From motility to virulence: sensing and responding to environmental signals in Vibrio cholerae [Text] // Current Opinion Microbiol. -2003. - V.6. -P.186-190.

143 Kumar P., Jain M., Goel A. K. A large cholera outbreak due to a new cholera toxin variant of the Vibrio cholerae Ol El Tor biotype in Orissa, Eastern India [Text] // J. Medical Microbiol. - 2009. - Vol.58. - P. 234-238.

144 Kumar P., Thulaseedharan A., Chowdhury G. et al. Characterization of novel alleles of toxin co-regulated pilus a gene (tcpA) from environmental isolates of Vibrio cholerae [Text] //Cur. Microbiol. - 2011. - Vol.62. N3. - P. 758-763.

145 Labbate M., Boucher Y., Joss M.J., Michael C.A., Gillings M.R., Stokes H.W. Use of chromosomal integrons arrays as a phylogenetic typing system for Vibrio cholerae pandemic strains [Text] // Microbiology. - 2007. - Vol. 153. - P. 14881498.

146 Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage [Text] //Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685.

147 Lam C., Octavia S., Reeves R.P., Lan R. Multi-locus variable number tandem repeat analysis of 7th pandemic Vibrio cholerae [Text] // BMC Microbiol. - 2012-Vol. 12, №82.-P. 1471-2180.

148 Lazar S., Waldor M.K. ToxR-Independent Expression of Cholera Toxin from the Replicative Form of CTXcp [Text] // Infect. Immun. - 1998. - Vol. 66, N 1. - P. 394-397.

149 Lee J. H., Choi S. Y., Jeon Y.S., et al. Classification of hybrid and altered Vibrio cholerae strains by CTX prophage and RS 1 element structure [Text] // J. Microbiol. - 2009. - Vol. 47, N 6. - P. 783-788.

150 Li W., Raoult D., Fournier P.E. Bacterial strain typing in the genomic era [Text] // FEMS - 2009- Vol. 35, № 5. - P.892-916.

151 Lin W., Fullner K.J., Clayton R., Sexton J. A., et al. Identification of a Vibrio cholerae RTX toxin gene cluster that is tightly linked to the cholera toxin prophage [Text] // Proc. Natl. Acad. Sei. - 1999. - Vol. 96, N 3. - P. 1071-1076.

152 Lindsted B.A. Vardund T., Aas L., Kapperud G. Multi-locus variable-number tandem-repeat of Salmonella enterica sabsp. enteritica serovar Typhimurium using PCR multiplexing and multicolor capillary electrophoresis [Text] // J. Microbiol. -2004-Vol. 59. - P.163-172.

153 Liu G.W., Yan M.Y., Qi G.M. et al. Studi on infection of different strains of Vibrio cholerae Ol by El Tor CTXcp [Text] I I Wei Shen. Wu. Xue. Bao. - 2005. -Vol. 45,N5.-P. 757-762.

154 Makarova K.S., Aravind L., Grishin N.V. et al. A DNA repair system specific for thermophilisarchaea and bacteria predicted by genomic context analysis [Text] //Nucl. Acids Res. - 2009. - Vol. 30. - P. 482-496.

155 Marsh J.W., Taylor R.K. Genetic and transcriptional analyses of the Vibrio cholerae mannose-sensitive hemagglutinin type 4 pilus gene locus [Text] // J. Bacteriol. - 1999. - V. 181, N 4. - P. 1110-1117.

156 McLeod S.M., Kimsey II.H., Davis B.M., Waldor M.K. CTX<p and Vibrio cholerae: exploring a newly recognized type of phage-host cell relationship [Text] // Mol. Microbiol. - 2005. - Vol. 57, N 2. - P. 347 - 356.

157 Mekalanos J.J., Swart D.J. Pearson G.D.N, et al. Cholera toxin genes: nucleotide sequence deletion analysis and vaccine development [Text] // Nature - 1983. -V.306. -P.551- 557.

158 Mekalanos J.J., Rubin E.J., Waldor M.K. Cholera: molecular basis for emergence and pathogenesis [Text] // FEMS Immun. Med. Microbiol. - 1997. - Vol. 18. - P. 241-248.

159 Merrell D. S., Camilli A. Regulation of Vibrio cholerae genes required for acid tolerance by a member of the "ToxR-Like" family of transcriptional regulators [Text] // J. Bacteriol - 2002. - V. 182, N 19. - P. 5342-5350.

160 Miller V.L., Mekalanos J.J. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR [Text] // J. Bacteriol. - 1988. -Vol. 170.N6.-P. 2575-2583.

161 Mohammadi-Barzelighi II., Bakhshi B., Lari A.R. et al. Characterization of pathogenicity island prophage in clinical and environmental strains of Vibrio cholerae [Text] //J. Med. Microbiol. - 2011. - Vol. 60 - P. 1742-1749.

162 Mooi F. R., Bik E. M. The evolution of epidemic Vibrio cholerae strains [Text] // Trends Microbiol. - 1997. - Vol. 5, N. 4. - P. 161 -165.

163 Morita M. Emergence and genetic diversity of El Tor Vibrio cholerae 01 that possess classical biotype ctxB among travel-associated cases of cholera in Japan [Text] //J. Medical Microbiol. -2010. - Vol. 59. - P. 708-712.

164 Morita M., Ohnishi M., Arakawa E. et al. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCR assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae 01 biotype El Tor [Text] // Microbiol. Immunol. - 2008 - Vol. 52 N6. - P.314-317.

165 Mukhopadhyay A.K., Chakraborty S., Takeda Y. et al. Characterization of VPI pathogenicity island and CTXcp prophage in environmental strains of Vibrio cholerae [Text] IIJ. Bacteriol. - 2001. -P. 4737-4746.

166 Mukhopadhyay A.K., Garg S., Saha P.K., Takeda Y., Bhattacharya S.K., Nair G.B. Comparative analysis of factors promoting optimal production of cholera toxin by Vibrio cholerae Ol (classical & ElTor biotypes) & 0139. [Text] // Indian J. Med.Res. - 1996. -V. 104. - P. 129 - 133.

167 Murley Y.M., Carroll P.A., Skorupski K. et al. Differential transcription of the tcpPH operon confers Hotype-specific control of the Vibrio cholerae ToxR virulence regulon [Text] // Infect. Immun. - 1999. - Vol. 67, N 10. - P. 5117 -5123.

168 Murphy R. A., Boyd E. F. Three pathogenicity islands of Vibrio cholerae can excise from the chromosome and form circular intermediates [Text] // J. Bacteriol. - 2008. - Vol. 190, N2. - P. 636 - 647.

169 Mutreja A. Thomson N.R., Connor T.R., et al. Evidence for several waves of global transmission in the seventh cholera pandemic [Text] // Nature. - 2011. -Vol. 477-P. 462-465.

170 Naha A., Pazhani G.P., Ganguly M. et al. Development and evaluation of a PCR assay for tracking the emergence and dissemination of Haitian variant ctxB in Vibrio cholerae Ol strains isolated from Kolkata, India [Text] // J. Clin. Microbiol. -2012.-Vol. 50.N. 8.

171 Nair G. B., Qadri F., Holmgren J., Svennerholm A. M. et al. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae Ol in Bangladesh [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol.44. - P. 4211-4213.

172 Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A. et al. New variants of Vibrio cholerae 01 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2002. -Vol. 40, N9.-P. 3296-3299.

173 Nesper J., Kapfhammer D., KloseK.E., Merkert H., Reidl J. Characterization of Vibrio cholerae 01 antigen as the bacteriophage K139 receptor and identification of IS1004 insertions aborting 01 antigen biosynthesis [Text] // J. Bacteriol. -2000. -Vol. 182,N 18. - P. 5097-5104.

174 Nguyen B.M., Lee J.H., Cuong N.T. et al. Cholera outbreaks caused by an altered Vibrio cholerae 01 El Tor biotype strain producing classical cholera toxin B in Vietnam in 2007 to 2008 [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2009. - Vol.47. - P.1568-1571.

175 Nusrin S., Gil A.I., Bhuiyan N.A. et al. Peruvial Vibrio cholerae 01 El Tor strains possess a distinct region in the Vibrio seventh pandemic island-II that differentiates them from the prototype seventh pandemic El Tor strains [Text] //J. Med. Microbiol - 2009 - Vol. 58. - P. 342 -354.

176 O'Shea Y. A., Finnan S., Reen F. J. et al. The Vibrio seventh pandemic island-II is a 26.9 kb genomic island present in Vibrio cholerae El Tor and 0139 serogroup isolates that shows homology to a 43.4 kb genomic island in V. vulnificus [Text] // Microbiol. - 2004. - Vol.150. - P.4053-4063.

177 O'Shea Y. A.,Reen F.J., Quirke A.M., Boyd F. Evolutionary genetic analysis of the emergence of the emergence of the basis of comparative nucleotide sequence analysis and multilocus virulence gene profiles [Text] // J. Clin. Microbiol. - 2004. -P.4657-4671.

178 O'Shea Y.A., Boyd E.F. Mobilization of the Vibrio pathogenicity island between Vibrio cholerae isolates mediated by CP-T1 generalized transduction [Text] // FEMS. Microbiol. Lett. -2002. - Vol. 214. - P. 153-157.

179 Odic D., Turk V., Stopar D. Environmental stress determines the quality of bacterial lysate and its utilization efficiency in a simple microbial loop [Text] // Microb. Ecol. - 2007. - Vol. 53. N4. - P. 639-649.

180 Okada K., Roobthaisong A., Nakagawa I. et al. Genotypic and PFGE/MLVA analyses of Vibrio cholerae Ol: geographical spread and temporal changes during the 2007-2010 cholera outbreaks in Thailand [Text] // PLOS. - Vol. 7, N1 - P. 110.

181 Olsvik O., Wahlberg J, Petterson B et al. Use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit B in Vibrio cholerae Ol strains [Text] // J. Clin. Microbiol. - 1993. -Vol. 31.-P. 22-35.

182 Pande K., Mendiratta D. K., Vijayashri D. et al. SXT constin among Vibrio cholerae isolates from a tertiary care hospital [Text] // Indian. J. Med. Res.. - 2012. - Vol.135. N.3.

183 Parsot C., Mekalanos J.J. Expression of the Vibrio cholerae gene encoding aldehyde dehydrogenase is under control of ToxR, the cholera toxin transcriptional activator [Text] // J. Bacteriol. - 1991. - Vol. 173, N9. - P. 2842-2851.

184 Piarroux R., Barrais R., Faucher B. et al. Understanding the cholera epidemic, Haiti [Text] // Emerg. Infect. Dis. - 2011.-Vol. 17, N7.-p. 1161-1168.

185 Pichel M., Rivas M., Chinen I. et al. Genetic diversity of Vibrio cholerae 1 in Argentina and emergence of a new variant [Text] // J. Clin. Microbiol - 2003. - P. 124 -134.

186 Pierce N.F., Cray W.C., Kaper J.B. Determinants of immunogenicity and mechanisms of protection by virulent and mutant Vibrio cholerae 01 in rabbits [Text] // Infect. Immun. - 1988. -P.142-148.

187 Prouty M.G., Osorio C.R., Klose K.E. Characterization of functional domains of the Vibrio cholerae virulence regulator ToxT [Text] // Mol. Microbiol. - 2005. -Vol. 58,N4.-P. 1143-1156.

188 Provensano D., Schumacher D.A., Barker J.L., Klose K.E. The virulence regulatoryprotein ToxR mediates enhanced bile resistance in Vibrio cholerae and other pathogenic Vibrio speicies [Text] // Infect. Immun. - 2000. - V.68, N 3. -P.1491-1497.

189 Ramachandran D., Bhanumathi R., Singh D.V. Multiplex PCR for detection of antibiotic resistance genes and the SXT element: application in the characterization

of Vibrio cholerae [Text] // J. Med. Microbiol. - 2007. - Vol. 56. - P. 346-351.

190 Reen F.J., Almagro-Moreno S., Ussery D., Boyd E. F. The genomic code: inferring Vibrionaceae niche specialization [Text] //Nat. Rev. Microbiol. - 2006. -V.7. - P.l-8.

191 Reguera G., Kolter R. Virulence and the environment: a novel role for Vibrio cholerae toxin-coregulated pili in biofilm formation on chitin [Text] //J. Bacteriol. -2005. - Vol. 187 - P. 3551-3555.

192 Reidl J., Klose K.E. Vibrio cholerae and cholera: out of the water and into the host [Text] // FEMS Microbiol. Rev. - 2002. - Vol. 26. - P. 125-139.

193 Reimer A.R., Van Domselaar G., Stroika S. et al. Comparative genomics of Vibrio cholerae from Haiti, Asia, and Africa [Text] // Emerg. Infect. Dis. - 2011 -Vol. 17, N11.-P. 2113-2121.

194 Rhine J.A., Taylor R.K. TcpA pilin sequences and colonization requirements for Ol and 0139 Vibrio cholerae [Text] // Mol. Microbiol. - 1994. - Vol. 13. - P. 1013- 1020.

195 Safa A., Nair G. B., Kong R. Y.C. Evolution of new variants of Vibrio cholerae Ol [Text] // Trends Micribiol. - 2010. - Vol. 18, N. 1. - P. 46-54.

196 Safa A., Sultana J., Cam P.D.et al. Classical cholera toxin producing Vibrio cholerae Ol hybrid El Tor strains in Asia and Africa [Text] // Emerg. Infect. Dis. -2008.-Vol.14.-P.987-988.

197 Salles C.A., Momen H., Vicente A.C., Coelho A. Vibrio cholerae in South America: polymerase chain reaction and zymovar analysis [Text] // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. - 1993. - Vol. 87, N3. - P. 272.

198 Sarkar A., Nande R.K., Nair G.B., Ghose A.C. Vibrio pathogenicity island and cholera toxin genetic element-associated virulence genes and their expression in non-Ol non-0139 strains of Vibrio cholerae [Text] // Infect. Immun. - 2002. -Vol. 70, N 8. - P. 4735 - 4742.

199 Sears C. L., Kaper J. B. Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to intestinal secretion [Text] // Microbiol. Rev. - 1996. - Vol. 60. -N. 1. -P. 167-215.

200 Sellek R.E., Niecewicz M., Olsen J.S. et al. Phenotypic and genetic analysis of 111 clinic and environmental 01, 0139, and non- OI/O 139 Vibrio cholerae strains from different geographical areas [Text] // Epidemiol. Infect. - 2011 - P. 1-11.

201 Sheahan K. L. Fullner Satchell K. J. Inactivation of small Rho GTPases by the multifunctional RTX toxin from Vibrio cholerae [Text] // Cell Microbiol. - 2007. -Vol. 9, N.5. - P. 1324-1335.

202 Siddique A.K., Zaman K., Akram K. et al. Emergence of a new epidemic strain of Vibrio cholerae in Bangladesh. An epidemiological study [Text] // Trop. Geogr. Med. - 1994. - Vol. 46, N3. - P. 147-150.

203 Singh D.V., Matte M.l I., Matte G.R. et al Molecular analyses of Vibrio cholerae 01, 0139, non-Ol and non-0139 strains: clonal relationships between clinical and environmental isolates [Text] //Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol. 67. -N. 2. -P. 910-921.

204 Singh D.V., Matte Mil., Matte G.R. et al. Molecular analysis of Vibrio cholerae 01, 0139, non-Ol, and non-0139 strains: clonal relationships between clinical and environmental isolates [Text] // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol. 67, N2. -P. 910-921.

205 Singleton F.L. Attwcll R.W., Jangi M.S., Colwell R. R. Influence of salinity and organic nutrient concentration on survival and growth of Vibrio cholerae in aquatic microcosms [Text] // Appl. Environ. Microbiol. - 1982. - Vol. 43. N5. - P. 1080-1085.

206 Stewart-Tull D. E. S., Ollar R. A., Scobie T. S. Studies on the Vibrio cholerae mucinase complex. Enzymatic activities associated with the complex [Text] // J. Med. Microbiol. - 1986.-Vol. 22-P. 325-333.

207 Sun D., Mekalanos J. J., Taylor R.K. Antibodies directed against the toxin-coregulated pilus isolated from Vibrio cholerae provide protection in the infant mouse experimental cholera model [Text] //J. Infect. Dis. - 1990. - Vol. 161. - P. 1231-1236.

208 Svennerholm A.M., Stromberg G J. Holmgren, J. Purification of Vibrio cholerae soluble haemagglutinin, development enzyme-linked immunosorbent assays for antigen, antibody quantitations [Text] // Infect. Immun. - 1983. - V. 41. - P. 237.

209 Talkington D., Bopp C., Tarr C. et al. Characterization of toxigenic Vibrio cholerae from Haiti, 2010-2011 [Text] // Emerg. Infect. Dis. - 2011. - Vol. 17, N11.-p. 2122-2129.

210 Tamplin M.L., Gauzens A.L., Huq A. Attachment of Vibrio cholerae serogroup 01 to Zooplankton and phytoplankton of Bangladesh waters [Text] // Appl. environ, microbiol. - 1990. - P. 1977-1980.

211 Tappero J.W., Tauxe R. V. Lessons learned during public health response to cholera epidemic in Haiti and the Dominican republic [Text] // Emerg. Infect. Dis. - 2011. - Vol. 17, N11. - P. 2087-2093.

212 Taviani E., Grim C.J., Choi J. et al. Discovery of novel Vibrio cholerae VSP-II genomic islands using comparative genomic analysis [Text] // FEMS Microbiol Lett. - 2010. - Vol. 308, N2. - P. 130-7.

213 Taylor J.L., De Silva R. S., Kovacikova G. et al. The crystal structure of AphB, a virulence gene activator from Vibrio cholerae, reveals residues that influence its response to oxygen and pH [Text] // Mol. Microbiol. - 2012. - Vol. 83. N. 3. - P. 457-470.

214 Taylor R. K., Miller V.L., Furlong D.B., Mekalanos J.J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin [Text] // Proc. Natl. Acad. Sei. - 1987. - Vol. 84 - P. 2833-2837.

215 Teh C.S J., Chua K.H., Thong K.L. Multi-locus variable-number tandem repeat analysis of Vibrio cholerae in comparison with pulsed field gel electrophoresis and virulotyping [Text] // J. Biomed. Biotechnol. - 2010 - P. 1-7.

216 Thelin K.H., Taylor R.K. Toxin-coregulatedpilus, but not mannose-sensitive hemagglutinin, is required for colonization by Vibrio cholerae Ol El Tor biotype and 0139 strains [Text] / Infect. Immun. - 1996. - Vol. 64, N 7. - P. 2853 - 2856.

217 Thompson C.C., Freitas F.S., Martin M.A. et al. Vibrio cholerae Ol lineages driving cholera outbreaks during seventh cholera pandemic in Chana [Text] // Inf. Genet. Evolut.-2011 - Vol. 11.-P. 1951 -1956.

218 Torna C., Kuroki H., Nakasone N. et al. Minor pilin subunits are conserved in Vibrio cholerae type IV pili [Text] // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2002. -Vol. 33.-P. 35-40.

219 Tran H.D., Alam M., Trung N. V. Multi-drug resistant Vibrio cholerae 01 variant El Tor isolated in northern Vietnam between 2007 and 2010 [Text] 11 J. Med. Microbiol. - 2012. - Vol. 63. - P. 431-437.

220 Trucksis M., Galen J.E., Michalski J., Fasano A., Kaper J.B. Accessory cholera enterotoxin (Ace), the third toxin of a Vibrio cholerae virulence cassette [Text] // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1993. - Vol. 90, N11. - p. 5267-5271.

221 Trucksis M., Galen J.E., Michalski J., Fasano A., Kaper J.B. Accessory cholera enterotoxin (Ace), the third toxin of a Vibrio cholerae virulence cassette [Text] // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1993. - Vol. 90, N11. - P. 5267-5271.

222 Udden S.M., Zahid M.S., Biswas K. et al. Acquisition of classical CTX prophage from Vibrio cholerae 0141 by El Tor strains aided by lytic phages and chitin-induced competence [Text] // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 2008. - Vol. 105, N33. -P. 11951-11956.

223 Val M.E., Skovgaard O., Ducos-Gahnd IV! Genome Engineering in Vibrio cholerae: A Feasible Approach to Address Biological Issues [Text] // PLOS - 2012. -Vol. 8.N1.-P. 1-10.

224 Wai S.N., Mizunoe Y.A., Kawabata T.S.. Yoshida S. Vibrio cholerae Ol strain TSI-4 produces the exopolysaccharide materials that determine colony morphology, stress resistance, and biofihn formation [Text] // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. -V.64.-P. 3648-3655.

225 Waldor M. K., Rubin E. J., Pearson G. D. et al. Regulation, replication, and integration functions of the Vibrio cholerae CTXcp are encoded by region RS2 [Text] // Mol. Microbiol. - 1997. - V. 24. - P. 917-926.

226 Waldor M.K., Mekalanos J i. I > s v. bacteriophage encoding cholera toxin [l'c\! 1910-1914.

227 WaturangiD.E., Piadita N., Linarla J. characterization of '\'v.o t'iol • ne ' Indonesia, using niL->: <n-obablj ji . .. 2012. - Vol.75. N4. -P.651-659.

228 Weil A.A., Ivers L.C., Hairis LB. UioLk // Curr. Infect. Dis. II.;\ - 201\ " !

229 Wong E., Vaaj^-T.oLtad Ci vj^j., . cholerae colonization [actor v bp A pos.w binding to different , ..t siiriV::e. ; ' l J '

230 Yamomoto K., T;>' - ' i " -a non-01 Vibrio c1 ' ■ < ^ //Inf. Immun. - 19,"3. -

231 Yildiz F.H., Lv rugosity in a Vibri

D i

07-

r 1 n T'

' u<;oc

2004. - V.53,N.2.

232 Yildiz F.H., Scl1 cluster required fc resistance, and bior1'^ f -h^i' 4033.

233 Yu R. R., DiRila » j. involves both aiiu. ^oj.u.» Microbiol. - 2002. _ .

234 Zhang D., Xu Z.. V, encoded mop proi i i ^ J. ' Vibrio cholerae [1

jn'c conversion by a filamentous J !' Science. - 1996. - Vol. 272. - P.

et al. Prevalence and molecular . and beverages sold in Jakarta, ...It , !cx PCR [Text] // J. Food Prot. -

. jssuns from Haiti and beyond [Text]

' o

" ).

... .:artado-Guerrero R. The Vibrio >es a modular structure that governs S 2012.-Vol. 8.N1.-P. 1-12. '1 »i fication and some proper ties of val to cholera enterotoxin [Text]

m

' G. K. Molecular analysis of -iant [Text] // Mol. Microbiol. -

( i El Tor: Identification of a gene * ^'saccharide production, chlorine ^" - 1999. - V.96, N.7. - P. 4028-

. 1 )l 1 OJ mIi ^ v,ion in Vibrio cholerae by ToxT

.... . .. ase stimulation [Text] // Mol.

..wi,, > ,, i he Vibrio pathogenicity island-and reactogenicity of epidemic rol. 71,N1.-P510-515.

P