Изучение токсинопродуцирующей способности штаммов Vibrio cholerae 01 и Vibrio cholerae 0139 с помощью иммуноферментного анализа и культуры клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Маркина, Ольга Владимировна

• Маркина, Ольга Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Маркина, Ольга Владимировна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Современные представления о структуре холерного токсина.

1.2 Методы обнаружения холерогена in vitro.

1.3 Моноклональные антитела к холерному токсину.

Собственные исследования

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Бактериальные штаммы и условия их выращивания.

2.2 Бактериальные токсины и антитоксические сыворотки.

2.3 Ганглиозиды.

2.4 Перевиваемые клеточные линии и их культивирование.

2.5 Лабораторные животные.

2.6 Гибридизация клеток.

2.7 Культивирование гибридом in vivo и in vitro.

2.8 Скрининг моноклональных антител в культуральных жидкостях гибридом.

2.9 Клонирование гибридом.

2.10 Криоконсервирование.

2.11 GMl-иммуноферментный анализ (GMl-ИФА).

2.12 GM1-дот-иммунологический анализ (GMi-ДИА).

2.13 СНО-иммуноферментный анализ (СНО-ИФА).

2.14 Сэндвич-иммуноферментный анализ двойных антител (ИФА-2АТ).

2.15 Тест в культуре клеток.

2.16 Иммуноблоттинг препаратов холерного токсина.

2.17 Фотографирование.

2.18 Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Монослойные клеточные линии в тестировании холерного токсина

3.1 Характеристика препаратов XT и антитоксических сывороток.

3.2 Особенности тестированиясупернатантов ctxf штаммов V.cholerae 01,

V.cholerae 0139 и V.cholerae non 01/поп в культуре клеток СН0-К1.

3.3 Тестирование супернатантов ctx" штаммов V.cholerae 01 в культуре клеток.

Глава 4. Варианты иммуноферментного метода для выявления холерогена с использованием ганглиозидов GM1 и поликлональных антитоксических сывороток

4.1 Применение варианта вМ1-ИФА для обнаружения и количественного определения ХТ.

4.2 Отработка условий постановки дот-иммунологического анализа (ДИА) с использованием ганглиозидов

0М1 и нитроцеллюлозной мембраны.

4.3 Разработка твердофазного СНО-ИФА для обнаружения ХТ.

Глава 5. Получение и характеристика моноклональных антител к холерному токсину

5.1 Получение гибридом- продуцентов МКА к ХТ и их первичный скрининг.

5.2 Определение эпитопной направленности моноклональных антител к ХТ.

5.3 Определение класса и подкласса моноклональных антител.

5.4 Изучение специфичности и активности МКА к ХТ.

5.5 Токсиннейтрализующие свойства МКА.

5.6 Получение препаративных количеств МКА.

5.7 Изучение способности МКА взаимодействовать с ХТ после его связывания с ганглиозидами вМ1.

5.8 Разработка ИФА с использованием МКА к холерному токсину (ИФА-2АТ).

5.9 Оценка чувствительности различных вариантов ИФА.

5.10 Изучение влияния различных биологически активных веществ на специфичность ИФА.

Глава 6. Аспекты применения методов in vitro для тестирования холерного токсина

6.1 Культура клеток в изучении биологической активности токсинов V.cholerae, продуцируемых рекомбинантными штаммами

Escherichia coli.

6.2. Изучение влияния условий хранения и обеззараживания препаратов холерогена на его активность с помощью ИФА и культуры клеток СНО-К1.

6.3 Влияние условий культивирования на токсинопродуцирующую активность штаммов V.cholerae OI и V.cholerae OI39.

6.4 Оценка качества очистки препаратов ХТ-0139 с использованием МКА к ЛПС-0139.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение токсинопродуцирующей способности штаммов Vibrio cholerae 01 и Vibrio cholerae 0139 с помощью иммуноферментного анализа и культуры клеток»

Актуальность проблемы

Своевременное определение токсигенности холерных вибрионов имеет большое значение при определении рационального объема противохолерных мероприятий. В настоящее время в лабораторной практике для оценки эпидемической значимости штаммов Vibrio cholerae используют такие методы как ПЦР, ДНК-зондирование, тестирование на кроликах-сосунках, определение гемолитической активности по Грейгу и чувствительности к холерным фагам ctx+ и ctx" (М.У.4.2 1097-02. Лабораторная диагностика холеры, 2002).

Из вышеупомянутых методов достаточно широкое применение нашли молекулярно- генетические и, в частности, ПЦР-анализ, который за 3-4 часа позволяет проанализировать значительное число проб. Последний может быть использован в экспресс- диагностике для прямого выявления ДНК токсигенных штаммов от больных людей (Савельев В.Н. с соавт., 2002; Касина И.В. с соавт., 2003; Miyagi К. et al., 1999), как ускоренный метод для идентификации подозрительных колоний, а также в научных работах и ретроспективном анализе с целью получения информации о вирулентности изолятов путем детекции фрагментов генов ctx A, tcp A, tox R, hap A, RS (Кутырев В.В. с соавт., 2000; Ефременко В.И. с соавт., 2003; Куличенко А.Н. с соавт., 2003; Водопьянов С.О. с соавт., 2006; Lyon W.J. et al., 2001; Kamnasagar I. et al., 2003; Lipp E.K. et al., 2003; Rivera I.N. et al., 2003; Gubala A.J., 2006). Однако известно, что мутации в различных генах могут снизить и даже полностью исключить продукцию хо-лерогена (Gardel C.L.et al., 1996; Haralalka S. et al., 2003; Lauriano C.M. et al., 2004). В лабораторной практике часто используют и такие методы, как определение гемолитической активности вибрионов и определение чувствительности к фагам ctx+, ctx". В то же время известно, что среди нетоксигенных холерных вибрионов можно нередко обнаружить штаммы негемолитичные по фенотипу (Кюрегян А.А с соавт., 2002; Лобанов В.В. с соавт., 2004), а некоторые штаммы ctx" могут оказаться чувствительными к фагам ctx+ (Безсмертный В.Е. с соавт., 2004; Нановская Н.Н. с соавт., 2004). В связи с этим эпидемический потенциал штаммов подтверждают другими методами, например, используя биологические модели, однако методы in vivo нестандартны, а получаемые результаты не всегда воспроизводимы ввиду индивидуальной реакции животных.

Альтернативой биологическим тестам считают культуру клеток. Установлены индикаторные для холерного токсина (XT) клеточные линии, которые позволяют по изменению морфологии клеток определять активность токсина с чувствительностью 10-30 пг/мл (Сальникова О.И., 1994; Guerrant R.L.et al., 1974). Однако в последнее время были обнаружены токсины, вызывающие удлинение клеток СНО-К1 подобно холерогену: Cef (CHO-cell elongating factor), S-CEP (secreted CHO elongating protein), W07 (novel toxin) (Sanial S.C. et al., 1984; Walia K. et al., 1999; McCardell B.A. et al., 2000; Bhattacharyya S. et al., 2004). Иммунологическое отличие этих токсинов от холерогена можно подтвердить только с помощью иммунохимических методов.

По мнению большинства исследователей, высокой специфичностью и чувствительностью отличаются некоторые варианты иммуноферментного анализа. Среди них можно выделить следующие: «двойной антительный» сэндвич, где выявляемый холероген, заключен между двумя слоями антитоксических антител (Bhadra R.K. et al., 1991), bead-ИФА - прямой метод выявления XT с применением полимерных носителей (Ramamurthy Т. et al., 1992,1996), GM1-ИФА с использованием в качестве твердой фазы планшетов, покрытых ганг-лиозидами GM1 (Honda Т. et al., 1984; Clark G.J. et al., 1988) и др. По данным зарубежных и отечественных авторов, чувствительность его колеблется от 1-30 пг/мл до 10-50 нг/мл. Поиск новых сорбентов привел к созданию новых улучшенных в практическом плане вариантов ИФА, где вместо полистироловых планшетов используются магнитные сорбенты (Покровский В.И. с соавт., 2000; Ефременко В.И. с соавт. 2003), пьезоэлектрические иммуносенсоры (Ewalt K.L. et al., 2001). Однако наиболее доступными в отечественной практике являются полимерные мембраны, в частности, нитроцеллюлозные (НЦМ). Последние очень удобны для проведения реакции, так как в порах из-за микроскопических размеров лучше происходят процессы массообмена, что во много раз ускоряет кинетику реакции. Так, чувствительность дот-ИФА относительно XT, по данным отечественных и зарубежных авторов, составляет от 10 до 160 нг/мл, а время проведения анализа сокращается до 2-3 часов (Федорова В.А. с соавт., 1996; Девдариани 3.JL с соавт., 1999; Beutin L. et al., 1984). К преимуществам иммуноферментного метода относятся также экспрессность, возможность тестирования большого числа проб одновременно, сравнительно невысокая себестоимость анализа.

Однако данные отечественных авторов относительно чувствительности и специфичности различных вариантов ИФА достаточно противоречивы, так как целенаправленных исследований по их сравнительной оценке не проводилось. Кроме того, мы не встретили отечественных публикаций, касающихся одновременного использования для тестирования холерного токсина культуры клеток и ИФА, как это принято в зарубежных лабораториях. Мало сведений и в отношении тестирования ctx" штаммов V.cholerae 01 и V.cholerae 0139 в культуре клеток СНО-К1. Заслуживает внимания также выяснение возможных причин появления ложно-положительных результатов при тестировании суперна-тантов ctx" штаммов холерных вибрионов как в ИФА, так и в культуре клеток СНО-К1.

Целью работы явилось изучение токсинопродуцирующей способности V.cholerae 01 и 0139 серогрупп с использованием комплекса методов in vitro, включающего варианты сэндвич иммуноферментного анализа и культуру клеток.

Задачи исследования

1. Отработать условия постановки различных вариантов сэндвич - ИФА на основе ганглиозидов GM1 и антитоксической сыворотки (GMl-ИФА, GM1-ДИА и СНО-ИФА) для тестирования XT, включающие подбор оптимального разведения антитоксической сыворотки и препарата XT, используемого в качестве положительного контроля, а также концентрации ганглиозидов и способа их адсорбции на полистироловом планшете и нитроцеллюлозной мембране.

2. Получить моноклональные антитела (МКА) к XT, оценить их специфичность и иммунохимическую активность.

3. Отработать и оптимизировать постановку сэндвич варианта ИФА-2АТ на основе МКА к ХТ и антитоксической сыворотки (АТС) для определения токсинопродуцирующих свойств штаммов холерных вибрионов Ol и Ol39 серогрупп.

4. Установить наиболее чувствительные монослойные клеточные линии в отношении цитотонического фактора Cef, токсина зонального поглощения (Zot) и гемагглютинин/протеазы (HA/P) V.cholerae Ol и V.cholerae 0139.

5. Сравнить специфичность и чувствительность методов in vitro, используемых для тестирования ХТ, и оценить возможные аспекты их применения.

Научная новизна и теоретическая значимость

Получены приоритетные данные, свидетельствующие о возможности использования ганглиозидов GM1, нанесенных на нитроцеллюлозную мембрану, в качестве твердой фазы для разработки нового варианта дот - иммунологического анализа -GMl-ДИА, позволяющего выявлять ХТ на уровне 75 нг/мл.

Впервые для тестирования ХТ отработан новый вариант СНО-ИФА на основе клеток монослойной линии СНО-К1, богатых ганглиозидами, с чувствительностью около 1 мкг/мл.

Созданы гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела классов G и М, направленные к эпитопам В-субъединицы ХТ, расположенным вблизи ганглиозид - связывающего участка и блокирующие взаимодействие ХТ с рецептором GM1. В результате целенаправленного скрининга отобраны моноспецифические антитела, в большей степени отвечающие диагностическим требованиям ИФА, на основе которых отработан и оптимизирован ИФА-2АТ с чувствительностью порядка 50 нг/мл.

Анализ в иммуноблоте с помощью АТС, МКА к ХТ и МКА к ЛПС спектра белковых и углеводных компонентов супернатантов атоксигенных штаммов V.cholerae Ol и V.cholerae Ol39, дающих ложноположительные результаты в ИФА, позволил выявить в их составе белковые соединения, вступающие в реакцию с антитоксическими антителами, по-видимому, из-за структурного сходства с отдельными эпитопами ХТ.

Получены новые данные о токсинопродуцирующей способности штаммов V.cholerae eltor и V.cholerae 0139 из коллекции музея РостРГИПЧИ. Среди них выявлены активные продуценты, отличающиеся высокой стабильной продукцией холерогена in vitro независимо от срока их хранения.

Впервые на монослойных перевиваемых клеточных линиях, имеющихся в Ростовском НИПЧИ, изучен биологический эффект дополнительных токсинов V.cholerae Ol и V.cholerae 0139, продуцируемых штаммами Escherichia coli, несущими рекомбинантные плазмиды со вставками генов cef, zot, гемагглютинин/протеазы. Установлены наиболее адекватные клеточные модели для их тестирования, а именно: L-929 и СН0-К1- для изучения цитотоническо-го фактора Cef (CHO-cell elongating factor), CaCo-2- токсина зонального поглощения (Zonula occludens toxin), a CH0-K1, L-929, M-HeLa, HEp-2, MDCK- re-магглютинин/ протеазы.

Теоретическая и практическая значимость результатов исследований

По материалам диссертации составлены и утверждены на Ученом совете РостНИПЧИ методические рекомендации «Оценка способности холерных вибрионов продуцировать холерный токсин в условиях in vitro» (протокол №8 от 17.06.04), которые могут быть использованы для оценки токсинопродуци-рующих свойств штаммов V.cholerae Ol и V.cholerae 0139 .

Получены гибридомы- продуценты МКА к XT, из которых отобрано две, в большей степени отвечающие диагностическим требованиям иммунофер-ментного анализа. Штамм гибридомы GCT-4F7, секретирующий МКА к XT, депонирован в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской Коллекции клеточных культур 3.03.1999 г. под номером РККК (П)654Д. 26.

Линии СНО-К1 и L-929 использованы для отбора рекомбинантных штаммов E.coli, продуцирующих биологически активный цитотонический фактор Cef (CHO-cell elongating factor). Штаммы E.coli Jml03pCef61 В, Jml03pCef69B, Jml03pCef49B, Jml03pCeßlB, экспрессирующие клонированные гены cef V.cholerae Ol обоих биоваров, V.cholerae 013 и V.cholerae Ol39 под контролем Pbad -промотора, депонированы в ГКПБ при Российском

НИПЧИ «Микроб» в качестве охраноспособных под номерами КМ 188, КМ189, КМ190, КМ191(2005).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Различные варианты ИФА на основе ганглиозидов GM1 и АТС (GM1-ИФА, GMl-ДИА) позволяют выявлять ХТ с чувствительностью примерно 75 нг/мл.

2. Полученные гибридомы продуцируют моноклональные антитела к В-субъединице ХТ, специфичность которых подтверждена в ИФА, иммуноблоте и в тесте нейтрализации холерогена в культуре клеток СНО-К1.

3. На основе МКА к ХТ, в большей степени отвечающих диагностическим требованиям иммуноферментного анализа, разработан ИФА двойных антител (ИФА-2АТ) с чувствительностью 50 нг/мл.

4. Перевиваемые монослойные линии можно использовать для оценки биологического эффекта гемаггшотинин/протеазы и таких дополнительных токсинов V.cholerae 01 и V.cholerae 0139 как Cef, Zot наряду с клетками СН0-К1, традиционно используемыми для обнаружения и количественного определения холерогена.

5. Совместное применение культуры клеток и ИФА позволяет одновременно определить иммунохимическую и биологическую активность препаратов холерогена, выявить наибольшее число токсинопродуцентов V.cholerae Ol и V.cholerae 0139.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на Всероссийских конференциях «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Саратов, 1998); на Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (С.-Петербург, 1998); на конференции «Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний» (Екатеринбург, 1999); на проблемных конференциях «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 1999-2003, 2005- 2007).

Исследования выполнены в рамках плановых научных тем: «Особенности токсинопродукции холерных вибрионов 0139 серогруппы и конструирование на основе их холерогена - токсина препаратов и тест-систем для диагностики холеры» (№ гос.регистрации 01.200.1 15555), «Антигены поверхностных структур холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения» (№ гос.регистрации 01.200.2 12989), «Совершенствование метода серологической идентификации холерных вибрионов не О Уне 0139 серогрупп» (№ гос.регистрации 01.200.2 12999), «Изучение структурно-функциональных особенностей и биологического действия дополнительных токсинов (Zot и Асе) кассеты вирулентности холерных вибрионов» (№ гос.регистрации 01.20.03 11548).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы в соавторстве 23 научные работы.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 139 страницах, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, содержит 10 таблиц и 22 рисунка. Библиография представлена 254 отечественными и зарубежными источниками.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Маркина, Ольга Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Отработаны и оптимизированы условия постановки сэндвич-ИФА и дот-иммунологического анализа на основе ганглиозидов GM1 и антитоксической сыворотки для обнаружения и количественного определения холерного токсина в надосадочных жидкостях холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп с чувствительностью около 75 нг/мл.

2. Получены стабильные культуры гибридом, продуцирующие моноютональные антитела к В-субъединице холерного токсина, специфичность которых подтверждена в ИФА, иммуноблоте и в тесте нейтрализации холерогена в культуре клеток СНО-К1.

3. Отобраны наиболее значимые диагностические моноютональные антитела к ХТ, определена их оптимальная концентрация и условия сенсибилизации на планшетах для постановки ИФА-2АТ, который позволяет оценить токсинопродукцию штаммов холерных вибрионов OI и 0139 серогрупп с чувствительностью метода 50 нг/мл.

4. Сравнительные исследования показали что, наиболее чувствительным является вариант ИФА-2АТ, позволяющий со специфичностью 85-95% выявлять в супернатантах холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп холерный токсин в количестве 50 нг/мл, тогда как в практическом плане предпочтительнее использовать новый вариант дот иммунологического анализа на основе ганглизидов GM1 (GM1 -ДИА) с чувствительностью 75 нг/мл ввиду его экспрессности и простоты технического исполнения.

5. На основании экспериментальных исследований установлено, что ложноположительные результаты в ИФА обусловлены наличием в антитоксических сыворотках антител к ЛПС, которые могут взаимодействовать с ним при тестировании супернатантов гомологичных штаммов V.cholerae, присутствием в антитоксических сыворотках антител к белкам, общим для вибрионов 01 и 0139 серогрупп, и продукцией некоторыми штаммами V.cholerae белковых соединений, имеющих эпитопы, структурно идентичные отдельным эпитопам XT.

6. Показано, что у штаммов V.cholerae 0139 (ctx+) и V.cholerae eltor (ctx+), хранящихся длительное время в музее, значительно снижается токсинопродукция, и в результате этого с помощью сэндвич-иммуноферментного анализа и культуры клеток СНО-К1 молено выявить холероген в супернатнатах 50-60% штаммов, тогда как в случае свежевыделенных вибрионов этот показатель повышается до 90%.

7. Совместное применение МКА к XT, ЛПС-Ol и ЛПС-0139 в ИФА и иммуноблоте позволяет оценить наличие примеси ЛПС в образцах, отобранных на всех этапах очистки препаратов холерогена.

8. Установлены наиболее адекватные клеточные модели для изучения дополнительных токсинов V.cholerae Ol и V.cholerae 0139: цитотонический фактор Cef (CHO-cell elongating factor) вызывает удлинение клеток СНО-К1 и L-929, токсин зонального поглощения (Zonula occludens toxin) ослабляет межклеточные контакты в культуре СаСо-2, гемагглютинин/протеаза вызывает округление клеток всех испытанных монослойных линий: СНО-К1, L-929, НЕр-2, HeLa, MDCK.

110

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Главным фактором вирулентности холерных вибрионов является термолабильный энтеротоксин- холероген, синтезируемый ctx+ штаммами V.cholerae. В настоящее время для определения токсигенности вибрионов используют молекулярно-генетические, биологические, цитологические и серологические методы. Так, использование ПЦР позволяет прогнозировать эпидситуацию по обнаружению у выделяемых штаммов генетической детерминанты вирулентности - гена холерного токсина. Однако этот метод свидетельствует только о потенциальной возможности продукции холерогена штаммами холерного вибриона, так как известно, что не все ctx+ штаммы экс-прессируют гены ХТ. Биологические методы с использованием лабораторных животных до сих пор являются незаменимыми при оценке вирулентности штаммов, кроме того, позволяют оценить биологическую активность препаратов токсинов и интенсивность продукции холерогена вибрионами. Альтернативой биологическим методам являются цитологические. Данные методы высокочувствительны и воспроизводимы, так как в работе используются стандартные среды и референтные клеточные линии. Они гуманны, нетрудоемки и экономически более выгодны. Чаще всего в работе с холерным токсином используют клеточные линии СНО-К1, Vero, Y-1. Клетки СНО-К1 под действие ХТ удлиняются, a Vero и Y-1-округляются. Наиболее чувствительной линией в отношении ХТ является культура СНО-К1, позволяющая выявлять до 20-30 пг/мл токсина (Сальникова О.И., 1994; Guerrant R.L. et al., 1977; Tornbull P.C. et al., 1985). Учитывая, что большинство штаммов продуцирует холерный токсин в среду культивирования в очень малых количествах, очевидно, что этот метод позволяет выявлять максимальное число токсинопроду-центов. Однако в процессе тестирования бульонных культур V.cholerae 01, выращенных на среде AKI по M.Iwanaga (1986), нами было зарегистрировано удлинение клеток СНО-К1, обусловленное действием супернатантов некоторых ctx~ штаммов, свидетельствующее о наличии в исследуемых образцах ци

§ тотонических факторов. К настоящему времени установлено, что такой биологический эффект в культуре клеток регистрируют под действием CHO-cell elongating factor (Cef) (McCardell В.A. et al., 2000), и, как было показано E.B. Монаховой с соавт. (2005), его ген широко представлен в геноме штаммов V.cholerae. В наших опытах с помощью специфической АТС нейтрализации эффекта удлинения клеток не наблюдалось, что дает основание говорить о продукции штаммами токсина, отличного от холерогена. Кроме того, часто в супернатантах и ctx ~ и ctx + холерных вибрионов присутствуют БАВ, которые вызывают гибель клеток СНО-К1, вследствие чего выявление XT становится невозможным. Так, при первичном тестировании мы не смогли обнаружить XT в супернатантах некоторых токсигенных штаммов V.cholerae eltor, V.cholerae 0139 и V.cholerae non01/non0139 из-за деструкции клеток. Ранее О.И. Сальниковой (1994) было установлено, что цитотоксичность супернатан-тов обусловлена наличием в них гемолизина и больших количеств ЛИС. В нашем эксперименте цитотоксическая активность супернатантов исключалась только с помощью специфической сыворотки к цитолизину, что и позволило затем выявить холерный токсин. Округление клеток, вызываемое протеазами, гемагглютинин/протеазой, компонентами цитотоксического комплекса RTX, также способствует снижению чувствительности теста и мешает выявлению холерогена. В этом случае, при отсутствии высокоспецифических сывороток к данным биологически активным веществам, обнаружение холерогена представляется затруднительным.

С учетом вышеизложенного, достоверность отрицательных или сомнительных результатов тестирования в культуре клеток необходимо подтверждать, привлекая другие методы, в частности, иммуноферментные.

Среди иммуноферментных способов детекции холерного токсина наиболее часто в зарубежных и отечественных исследованиях используется вариант с использованием ганглиозидов GM1 (GMl-ИФА). Нами был апробирован этот вариант ИФА для обнаружения и количественного определения XT в супернатантах бульонных культур холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп. В работе были использованы препараты ганглиозидов, полученные по методу А.-М. Svennerholm, и ганглиозиды («Serva»). Чувствительность данного варианта в отношении XT-Ol, очищенного на КМЦ, составила примерно 75 нг/мл. При исследовании супернатантов штаммов V.cholerae eltor ctx+ после выращивания на среде AKI холероген был обнаружен у 64,7% штаммов, в случае тестирования V.cholerae 0139 - 50%. Можно предположить, что такие результаты тестирования являются следствием изменения токсинопродуцирующих свойств вибрионов, хранившихся длительное время в музее, в результате чего продукция ХТ значительно снизилась и находится за пределами чувствительности анализа.

При дальнейшем выборе наиболее чувствительных методов обнаружения токсигенных штаммов наиболее приемлемым оказался дот - иммунологический анализ. Время его проведения сокращено до нескольких часов, а его постановка не требует наличия специального оборудования. Использование нами ганглиозидов GM1, сорбированных на нитроцеллюлозной мембране, позволило разработать новый вариант метода- GMl-ДИА. Чувствительность анализа оказалась на уровне планшетного варианта GMl-ИФА и составила примерно 75 нг/мл. Однако GMl-ДИА отличается наиболее высокой скоростью постановки реакции, возможностью применения в полевых условиях. Одновременно с GMl-ДИА нами был отработан новый вариант метода, где в качестве твердой фазы использовали клетки СНО-К1, богатые рецепторами GM1. При его отработке оказалось, что наибольшая трудность связана с подбором условий фиксации клеток на пластике. Сенсибилизация планшетов клетками, выращенными в полной ростовой среде по I.Ravdin с соавт. (1986), а также клетками, отмытыми от ростовой среды по методу М.А. Буркина с соавт. (1997), или высушенными на дне лунки, как предложено Д.Н. Носик с соавт. (1985), оказалась неэффективной. Предпринята была попытка фиксировать клетки с помощью 96° этилового спирта после их взаимодействия с токсииом, так как, известно, что этанол не влияет на возможность обнаружения ХТ в ИФА (Трофимов Е.Н. с соавт.,1987; Федорова В.А. с соавт,.1996). Однако в результате такой обработки положительной реакции не наблюдали: оптическая плотность опытных проб была на уровне отрицательных контролей. Прикрепления клеток СНО-К1 к пластику достигали только путем фиксации их раствором глютарового альдегида. Такая процедура, как установлено, не отражается на реакции связывания токсинов с мембранными рецепторами эу-кариот (ИататигШу Т. е! а1.,1996). Титрование препарата ХТ-569В показало, что чувствительность данного варианта составила всего 1 мкг/ мл, что не позволяет его использовать достаточно широко, принимая во внимание невысокий уровень токсинопродукции у большинства штаммов.

Как видно, нами было апробировано 3 различных варианта ИФА с применением ганглиозидов ОМ1. Наиболее приемлемыми оказались варианты ОМ1-ИФА и ОМ1-ДИА, которые позволяют выявлять холероген в суперна-тантах штаммов У.сИо1вгае 01 и V. ско1егае 0139 с чувствительностью 75 нг/мл. Обращает внимание факт, что в обоих вариантах метода регистрировали 10-15% ложноположительных результатов при тестировании некоторых атоксигенных штаммов. По всей видимости, какие-то биологически активные соединения из супернатантов имеют эпитопы сходные с ХТ, в результате чего и вступают в реакцию с АТС. Нам представлялось уместным, что применение в ИФА моноклональных антител к отдельным эпитопам холерогена, позволит повысить специфичность анализа, и поэтому были проведены работы по получению МКА к ХТ.

В качестве иммуногена использовали препараты ХТ У.ско1егае 01 и У.сИо1егае 0139, очищенные путем бач - адсорбции на КМЦ по методу, предложенному Л.С. Оленичевой (1988), так как в литературе описана возможность получения антитоксических сывороток при использовании токсинов, содержащих некоторые примеси различных БАВ (Мазрухо А.Б., 1999). Применение стандартных схем иммунизации мышей ВАЬВ/с позволило получить мышиные антитоксические сыворотки с титрами в пределах 1:10000-1:20000. Используя иммунные спленоциты мышей ВАЬВ/с и клетки миеломной линии N80 нами были проведены гибридизации. Итог их показал, что количество клонов, продуцирующих МКА к ХТ, составило 12%. Одновременно были получены МКА к ЛПС-0139 (10%) и ЛПС-01 (2%).

После детальной предварительной характеристики было отобрано пять гибридом - продуцентов МКА к ХТ. Изучение эпитопной направленности полученных МКА показало, что они выявляют три различных эпитопа на молекуле холерогена. Иммуноблоттинг препарата ХТ-01 с помощью МКА к ХТ позволил установить, что все они направлены к В-субъединице холерного токсина. МКА были испытаны также в ОМ1-ИФА, однако оказалось, что они не взаимодействовали с ХТ после связывания его с ганглиозидами, по-видимому, из-за направленности их к эпитопам ХТ, расположенным близко к рецепторному участку.

Полученные МКА апробировали в другом варианте метода - так называемом ИФА-2АТ. Нам удалось отработать вариант ИФА, согласно которому, на пластик наносили МКА (5 мкг/лунка), затем препарат ХТ и после добавляли раствор АТС-01 (1:10000). В результате оказалось, что чувствительность метода составляет примерно 50 нг/мл в отношении ХТ-569В. Можно было ожидать, что применение МКА полностью исключит ложноположительные результаты, однако оказалось, что супернатанты некоторых с!х" штаммов продолжали давать положительную реакцию в ИФА. Наиболее интенсивное окрашивание реакционной смеси (на 2 креста) регистрировали при испытании супернатанта штамма У.с1ю1егае еНог 9898 (с!х~), выделенного от человека. Возможно, МКА к ХТ взаимодействуют с каким-то белком из супернатанта У.ско1егае еког 9898, имеющим структурно сходные с ХТ эпитопы.

С целью изучения этого вопроса белки супернатанта штамма У.сИо/вгае еког 9898 осадили с помощью сульфата аммония, разделили в БОЭ-ПААГ и перенесли на мембрану. В качестве контроля использовали супернатант

У.сИокгае с1ахн[са 569В (с*х+). После обработки НЦМ препаратами монокло-нальных антител к ХТ в препарате У.сНо1егае Ыаьъчса 569В выявлены зоны, соответствующие В-субъединице холерогена. Реакции МКА с препаратом УсИо1егае еког 9898 не было зарегистрировано, что свидетельствует о специфичности МКА к ХТ, не смотря на то, что в последнее время все больше накапливается фактов, свидетельствующих о том, что некоторые МКА обладают потенциальной полиреактивностью. Так, например, Ь.Ойе е1 а1. (2006) показали, что МКА ТЕЗЗ, полученные к отдельному эпитопу холерного токсина, могут связать до 45 различных пептидов, выделенных от гетерологичных протеинов. В то же время АТС-01 (сер. 581) в разведении 1:5000 в препарате У.ско1егае еког 9898 окрашивала две зоны, первая - на уровне 44-46 кД, вторая - примерно 36-40 кД (отсутствующая у У.сИокгае с1а^1са 569В). Таким образом, АТС, полученная к ХТ-569В, в препарате У.скокгае еНог 9898 выявляет белковые детерминанты, отсутствующие у холерогена. Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование в ИФА поликлональных антитоксических сывороток может явиться причиной появления ложно-положительных результатов за счет взаимодействия иммуноглобулинов сыворотки с белками, имеющими сходные с ХТ эпитопы.

В нашем распоряжении была и антитоксическая сыворотка-01 (сер. 474), полученная к ХТ «СаИносЬет». Активность ее, по данным твердофазного ИФА, была ниже, чем у АТС-01 (сер.581) - не более 1:10000. Однако, использование данной сыворотки позволило полностью исключить ложно-положительные результаты в ИФА. Таким образом, применение сывороток, полученных к коммерческим препаратам холерогена, не содержащим посторонних примесей, обеспечивает наиболее высокую специфичность анализа. Это свидетельствует о необходимости наиболее тщательного отбора антитоксических сывороток для проведения реакции.

Отработанные варианты вМ1-ИФА и ИФА-2АТ параллельно с культурой клеток СНО-К1 использовали при тестировании 30 с1х+ штаммов, выделенных во время вспышки холеры в 2001 г. в г. Казани. Согласно полученным данным, у всех штаммов с помощью обоих методов была обнаружена токси-нопродукция. Тестирование штаммов через 6 месяцев после хранения на полужидком агаре показало снижение их токсинпродуцирующей способности в 4-6 раз, и поэтому XT в некоторых пробах не смогли выявить.

Количество секретируемого холерогена зависит и от состава питательных сред и условий культивирования вибрионов. Так, вибрионы классического биотипа характеризуются хорошей продукцией XT на среде LB при 30°С, тогда как для вибрионов эльтор эти условия не являются оптимальными. В основном это связано с различиями в активации генов-регуляторов экспрессии генов ctx в этих биотипах. Некоторые авторы считают, что для улучшения секреции XT V.cholerae eltor в отличие от V.cholerae classica необходимо проведение бифазного культивирования (статические условия роста- шутте-лирование при 37 С), при этом имеет большое значение объем и площадь аэрируемой поверхности флакона, фаза роста вибрионов (Medrano А. I. et al., 1999; Murley Y.M. et al., 2000). Tischler A. D. et al. (2002) предполагает, что XT V.cholerae eltor в наибольшем количестве секретируется в комплексной среде AKI, предложенной M.Iwanaga (1986), вероятно, из-за того, что в её составе содержатся ингредиенты, которые могут запускать регуляторную систему VieS секреции холерного токсина вибрионов эльтор в условиях in vitro. Культивирование в условиях неблагоприятных для токсинообразования (в присутствии солей Na, в бедных средах, высоких pH и др.) приводит к снижению продукции XT (Hase С.С., Mekalanos J.J., 1999; Lauriano C.M. et al., 2004; Nag S. et al., 2005). Испытание в ИФА супернатантов штаммов, выращенных в разных средах: AKI, бульон Мартена при различной степени аэрирования показало, что культивирование вибрионов на среде AKI с активным шуттелирова-нием является наиболее оптимальным, так как в этом случае было обнаружено в ИФА наибольшее число токсинопродуцентов. Культивирование можно проводить и в бульоне Мартена по способу, предложенному с. н. с. лаборатории микробиологии холеры РостНИПЧИ, д.м.н. В.В.Лобановым, хотя в этом случае число выявленных штаммов - токсинопродуцентов было несколько ниже.

Нельзя обойти вниманием и тот момент, что чувствительность ИФА напрямую зависит от качества препарата ХТ, который был использован в процессе его отработки. Очевидно, чем чище и активнее использован токсин, тем выше будет чувствительность метода. В наших опытах наибольшей активностью в сравнении с ХТ «Са1Ыос11ет» обладали препараты ХТ, очищенные на О-галактозе и КМЦ. Согласно характеристике, препараты ХТ, очищенные на КМЦ, содержали примесные компоненты. Чтобы минимизировать их влияние на структурную организацию холерогена и предотвратить диссоциацию субъединиц холерогена, препараты были разлиты по аликвотам и заморожены. Неоднократное размораживание токсинов с последующим их испытанием в культуре клеток и ИФА показало, что снижение биологической активности холерогена, регистрируемой на клетках СНО-К1, идет гораздо быстрее, чем иммунохимической. В связи с этим в работах по одновременному тестированию ХТ в цитологическом тесте и ИФА необходимо использовать однократно размороженные препараты ХТ.

Из веществ, присутствующих в препаратах, самое заметное влияние на чувствительность и специфичность ИФА оказывает ЛПС, именно он, как считают, наиболее часто является причиной ложноположительных результатов при тестировании ХТ. Однако освободиться полностью от ЛПС практически сложно по причине связывания его с различными белками (8а1та1 О. et а1., 1992; Ра1 8. е! а1., 1996). С учетом этого контроль наличия ЛПС в образцах токсина является необходимым. Из литературы известны такие достаточно трудоемкие методы выявления ЛПС в белковых препаратах, как окрашивание эндотоксина серебром после электрофореза препаратов в полиакриламидном геле (КлИеНэе^ег И. е1; а1.,1993), ЬАЬ- тест, как в оригинальной разработке, так и в различных модификациях с использованием хромогенных субстратов (Бондаренко В.М. с соавт., 2002; 1пас1а К. е! а1., 1991; ЫеЬзсЬ М. е1: аЦ 1995;

Tanaka S. et al., 1993), использование моноцитарных клеток - МопоМасб, J771A.1, Raw 264.7 (Moesby L. et al., 1999; Peterbauer A. et al., 1999). Однако, согласно имеющейся литературе, наиболее практичны методы ИФА, основанные на идентификации ЛПС соответствующими сыворотками. С помощью полученных нами МКА к ЛПС-0139, было установлено, что некоторые образцы ХТ-0139, очищенные на КМЦ, содержат ЛПС в значительных количествах. Именно такой препарат ХТ-0139 был использован нами для иммунизации мышей с целью получения гибридом- продуцентов МКА. Очевидно, что наличие ЛПС в образцах ХТ и послужило причиной обнаружения в процессе скрининга продуцентов МКА к ЛПС-0139. Мы полагаем, что применение в качестве иммуногена препаратов ХТ, максимально лишенных ЛПС, может существенно повысить выход гибридом - продуцентов МКА к ХТ. Как возможных кандидатов - продуцентов ХТ можно рассматривать рекомбинантные штаммы E.coli Jml03pCT110 и E.coli Jml03pCT105, из-за отсутствия в полученных препаратах ЛПС V.cholerae.

108

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Маркина, Ольга Владимировна, 2008 год

1. Адамов, А.К. Иммунология холеры / А.К. Адамов. Саратов, 1981.- 320 с.

2. Ашмарин, И.П.Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А.Воробьев. Л., 1962. - 180 с.

3. Бабицын, Н.С. Антиэнтеротоксические моноклональные антитела в диагностике холеры / Н.С. Бабицын // Автореф. дис. канд.мед.наук.-Алма1. Ата, 1992.- 22 с.

4. Бардахчьян, Э.А. Особенности ультраструктурных изменений в тонкой кишке кроликов-сосунков при действии vet- штамма холерных вибрионов / Э.А. Бардахчьян, Ю.М. Ломов, Н.Г. Харланова, и др. // Архив патологии. 2000. -№1.-С.24-29.

5. Бахуташвили, В.И. Взаимодействие вибрионов с культурами клеток / В.И. Бахуташвили, В.Г. Бочоришвили, И.Г. Велиджанашвили, и др. // Журн. мик-робиол., эпидемиол. и иммунол.- 1973. №10. - С.82-86.

6. Белая, Ю.А. Определение холерного энтеротоксина с помощью реакции ко-агглютинации / Ю.А. Белая, И.Н. Гайлонская, С.М. Быстрова, Г.К.Ферапонтова // Вестник АМН СССР,- 1984. №10. - С.69-73.

7. Владимирцева, И.В. Иммунофлюоресцентный метод обнаружения холерного энтеротоксина / И.В. Владимирцева, В.И. Ефременко, В.Г. Пушкарь и др. //Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол.-1986. №12. - С.62-65.

8. Власов, В.П. Штамм бактерий Escherichia coli-продуцент гемолизина Vibrio cholerae eltor / В.П. Власов, H.K. Михась, E.B. Монахова, и др. // Авт. свид.№1649809.-1991.

9. Водопьянов, С.О. ПЦР с флюоресцентной детекцией результатов. Перепек-тивы возможного применения при эпиднадзоре за холерой / С.О. Водопьянов // Пробл. комиссия: «Холера и патогенные для человека вибрионы».-Ростов н/Д., 2006.-Вып. 19.- С.62-64.

10. Гайлонская, И.Н. Определение холерного энтеротоксина в супернатантах гомогенатов стенки тонкой кишки кролика в реакции пассивного иммунного