Молекулярно-генетический анализ штаммов Vibrio cholerae не01/не0139 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Фадеева, Алевтина Викторовна

• Фадеева, Алевтина Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Фадеева, Алевтина Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Современные представления об организации генома холерных 19 вибрионов

1.2 Факторы патогенности и их генетическая детерминированность у 31 холерных вибрионов не01/не0139 серогрупп

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Использованные штаммы V.ско1егае и условия их культивирова- 41 ния

2.2 Методы изучения культурально-морфологических, биохимиче- 45 ских, серологических и других свойств холерных вибрионов

2.3 Определение чувствительности штаммов У.ско1егае к антибиоти- 47 кам

2.4 Определение чувствительности штаммов к амебе Dictyostelium 47 IИзсогйеит

2.5 Выделение ДНК

2.6 Проведение полимеразной цепной реакции

2.7 Электрофоретический учет результатов

2.8 Определение нуклеотидной последовательности генов

2.9 Компьютерный анализ и построение филогенетических 51 деревьев штаммов У.ско1егае

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ 52 У.ско1егае не01/не

3.1 Сравнительный анализ культурально-морфологических, биохими- 52 ческих и серологических свойств холерных вибрионов не01/не0139, 01 и 0139 серогрупп

3.2 Изучение чувствительности к антибиотикам у штаммов холерных 57 вибрионов различных серогрупп

ГЛАВА 4. АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ

ОСОБЕННОСТЕЙ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ не01/не0139 СЕРОГРУПП, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ И ЗА РУБЕЖОМ

4.1 Генетические особенности штаммов холерных вибрионов не 62 О Уне 0139 серогрупп, выделенных в Астраханской области

4.2 Генетическая характеристика штаммов У.ско1егае не 01/не0139, 67 полученных в различных регионах Российской Федерации и в пограничных странах

4.3 Генетические свойства штаммов У.сИо1егае не01/не0139, выде- 76 ленных в Юго-Восточной Азии

ГЛАВА 5. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТОКСИГЕННЫХ 86 У.Мегае не01/не0139, ВЫДЕЛЕННЫХ В УЗБЕКИСТАНЕ

5.1 Молекулярно-генетические особенности токсигенных узбекских 88 штаммов У.ско1егае не01/не

5.2 Разработка ПЦР с универсальными праймерами для детекции ^ различных вариантов гена ^рА

ГЛАВА 6. АНАЛИЗ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ГЕНОВ СИСТЕМ

СЕКРЕЦИИ И ТЕРМОСТАБИЛЬНОГО ТОКСИНА У ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ РАЗЛИЧНЫХ СЕРОГРУПП

6.1 Распространение генов системы секреции третьего типа типа у 108 холерных вибрионов различных серогрупп

6.2 Анализ распространения генов системы секреции шестого типа и 113 их экспрессии у холерных вибрионов не01/не0139 серогрупп

6.3 Детекция гена я/и термостабильного токсина у штаммов 121 V. ско1егае неО 1 /неО

ГЛАВА 7. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ГЕНЕТИЧЕСКОГО РОДСТВА ШТАММОВ У.сШегае МЕТОДОМ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ГЕНОВ gmhD, ог/2 И ФЛАНКИРУЮЩИХ КЛАСТЕР ГЕНОВ БИОСИНТЕЗА О-АНТИГЕНА

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетический анализ штаммов Vibrio cholerae не01/не0139»

Холера продолжает оставаться одной из наиболее важных социально-значимых инфекций и представляет серьезную проблему для мирового здравоохранения, требующую постоянного и всестороннего контроля и интегрированного подхода к ее решению. Наряду с ростом заболеваемости типичной холерой, этиологическими агентами которой являются холерные вибрионы Vibrio cholerae 01 и 0139 серогрупп [Москвитина Э.А. с соавт., 2012; Cholera, Wkly.Epid.Rec., 2011], в различных регионах мира все чаще регистрируются множественные случаи и вспышки острых кишечных инфекций, вызываемых представителями других серогрупп. К настоящему моменту известно более двухсот серогрупп холерных вибрионов, отличающихся по структуре О-боковых цепей основного соматического антигена [Онищенко Г.Г. с соавт., 2001; Beltran P. et al., 1999]. Патогенный и эпидемический потенциал холерных вибрионов не01/не0139 серогрупп остается малоисследованным. Известны случаи, когда эти вибрионы явились причиной крупных вспышек холеры, таких как вспышка в Судане и Чехословакии в 1968 г., в Перу в 1994 г., в Индии в 1996 г. [Aldova Е. et al., 1968; Dalsgaard A. et al., 1995a; Rudra S. et al., 1996; Faruque S.M. et al., 1998]. Чаще патогенные вибрионы не01/не0139 серогрупп вызывают небольшие локальные вспышки холероподобных инфекций или отдельные случаи гастроэнтеритов, септицемий, кожных и других болезней [Rivera I.N.G. et al., 2001; Ottaviani D. et al., 2011].

Случаи кишечных инфекций, обусловленных V.cholerae не01/не0139 регистрируются и в Российской Федерации - в Поволжском регионе (в Астраханской, Саратовской, Самарской, Нижегородской областях, Калмыкии, Башкирии, Мордовии), других регионах России (в Ростовской, Челябинской, Пермской областях) и в ближнем зарубежье (в Узбекистане, Туркмении, Украине) [Онищенко Г.Г. с соавт., 2001]. В то же время свойства штаммов

V.cholerae не01/не0139, выделенных на этих территориях, исследованы лишь фрагментарно. В литературе имеется ограниченное число публикаций по фенотипическим и генетическим особенностям штаммов V.cholerae не01/не0139, в том числе и по изучению распространения у них основных и дополнительных факторов патогенности, характерных для возбудителей холеры 01 и 0139 серогрупп [Лукьянова О.И., Щуркина И.И., 1988; Авдеева Е.П. с соавт., 2006; Монахова Е.В., 2012].

Основными факторами вирулентности эпидемических холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп являются холерный токсин и токсинкорегули-руемые пили адгезии, которые кодируются генами ctxAB умеренного фила-ментозного фага СТХф, и tcp, входящими в состав острова патогенности VPI [Taylor R.K. et al., 1987; Waldor M.K., Mekalanos J.J., 1996; Karaolis D.K.R. et al., 1998]. К числу других факторов патогенности относят токсины Асе и Zot, кодируемые генами асе и zot фага СТХф; нейраминидазу, ген которой папН входит в состав острова патогенности VPI-2; а также гемагглюти-нин/протеазу, мультифункциональный токсин RTX, гемолизин/цитолизин, кодируемые генами hapA, rtx, hlyA, расположенными в коровой части генома [Karaolis D.K.R. et al., 1998; Lin W. et al., 1999; Kimsey H.H., Waldor M.K., 1998; Chow K.H. et al., 2001; Jermyn W.S., Boyd E.F., 2002; Fulner K.J., Satchell К J, 2007; Cordero C.L. et al., 2007; Prochazkova R. et al., 2009; Cinar H.N. et al., 2010; Isac S.R. et al., 2012; Sahu S.N et al., 2012]. Распространение этих факторов и их истинная роль в патогенезе инфекций, вызываемых вибрионами не01/не0139 серогрупп, остаются малоисследованными [Монахова Е.В. с соавт., 2004; Монахова Е.В., Писанов Р.В., 20056; Монахова Е.В., 2012; Sanyal S.C. et al., 1983; Arita M. et al., 1986; Yamamoto K. et al., 1990; Bhattacharyya S. et al., 2004; Begum K. et al., 2006]. В литературе встречаются сообщения о выявлении у клинических штаммов V.cholerae не01/не0139 генов таких факторов патогенности как ТКПА, ряд протеолитических ферментов и других факторов, содержащихся в геноме вирулентных штаммов 01 и

0139 серогрупп [Finkelstein R.A., Наше I.F., 1982; Ghosh A.R. et al., 1997; Wu Z. et al., 2000]. Описан также ряд факторов патогенности холерных вибрионов не01/не0139 серогрупп, как правило, не встречающихся у традиционных возбудителей холеры. Среди них выявлены: фактор элонгации Cef, термостабильный токсин ST, шигоподобный токсин, не повреждающий мембрану токсин NMDCY, токсины парагемолитических вибрионов [Sanyal S.C. et al., 1983; O'Brien A.D. et al., 1984; Ogawa A. et al., 1990; Terai A. et al., 1991; Pal A. et al., 1992; Nitshibuchi M., Kaper J.B., 1995; Dalsgaard A. et al., 1995b; Saha P.K., Nair G.B., 1997; Coelho A. et al., 2000; McCardell B.A. et al., 2002]. В

2005 г. у вибриона 031 серогруппы выявлено наличие системы секреции третьего типа, о присутствии которой у холерных вибрионов ранее не было известно [Dziejman М. et al., 2005; Chen Y. et al., 2007; Shin O.K. et al., 2011]. В

2006 г. еще у одного штамма не01/не0139 серогруппы установлено наличие системы секреции шестого типа [Монахова Е.В., Божко Н.В., 2010; Pukatzki S. et al., 2006; Pukatzki S. et al., 2007; Ma A.T., Mekalanos J.J., 2010; Maclntyre D.L. et al., 2010; Zheng J. et al., 2010]. Однако определение значимости многих из этих факторов в патогенности V.cholerae не01/не0139 находится лишь на начальных этапах изучения, и требуется проведение дальнейших исследований для получения более точного представления о роли и месте каждого из них в патогенезе инфекций, вызываемых холерными вибрионами разных серогрупп [Монахова Е.В., 2012; Sanyal S.C. et al., 1983; Yamamoto К. et al., 1990; Saha P.K. et al., 1996; Coelho A. et al, 2000; McCardell B.A. et al., 2002].

Практически не изучены по содержанию генов и продукции факторов патогенности штаммы V.cholerae не01/не 0139, выделяемые на территории Поволжского и других регионов Российской Федерации и ближнего зарубежья, которые служат причиной развития инфекций при локальных вспышках или отдельных случаях гастроэнтеритов или септицемий. Изучению распространения генов, кодирующих токсины Асе и Zot, мультифункциональный токсин RTX, термостабильный токсин, системы секреции третьего и шестого типов, как и генов основных факторов вирулентности - XT и ТКПА у штаммов V.cholerae не01/не0139, выделенных на территории России, посвящено ограниченное число работ [Водопьянов С.О. с соавт., 2003; Монахова Е.В. с соавт., 2001; 2004; 2010; 2012].

Неясны механизмы патогенности V.cholerae не01/не0139, лишенных основных факторов вирулентности [Монахова Е.В. с соавт., 2004; 20056; 2010; 2012; Sanyal S.C. et al., 1983; Arita M. et al., 1986; Yamamoto K. et al., 1990; Saha P.K. et al., 1996; Coelho A. et al., 2000; McCardell B.A. et al., 2002; Begum K. et al., 2006]. Их выявление представляет собой важную задачу, в том числе и для практического здравоохранения.

По мнению ряда авторов, штаммы не01/не0139 серогрупп являются природными резервуарами генов факторов патогенности, которые они могут передавать другим холерным вибрионам [Ghosh A.R. et al., 1997; Mukho-padhyay A. K. et al., 2001; Singh D.V. et al., 2001; Chatterjee S. et al., 2009]. Такие штаммы не01/не0139 серогрупп, содержащие ряд генов факторов патогенности, потенциально опасны, поскольку в случае приобретения других детерминант они могут значительно повысить свой патогенный и эпидемический потенциал.

Важное значение имеет изучение токсигенных штаммов не01/не0139 серогрупп, продуцирующих основные факторы вирулентности - XT и ТКПА. Исследование таких штаммов необходимо для получения ответа на вопрос о механизмах образования вирулентных штаммов V.cholerae различных серогрупп и определения наиболее вероятных путей формирования новых опасных вариантов V.cholerae, которые могут оказаться способными к эпидемическому распространению и представить значительную проблему для здравоохранения в связи с отсутствием специфических средств диагностики и профилактики вызываемой ими инфекции.

Цель исследования:

Определение распространения генов факторов патогенности и перси-стенции и проведение их структурно-функционального анализа у штаммов Vibrio cholerae не01/не0139 серогрупп. Задачи исследования:

1. Получить комплексную фенотипическую характеристику штаммов V.cholerae не01/не0139, выделенных в Российской Федерации, в ближнем и дальнем зарубежье, на основе анализа данных по их культу-рально-морфологическим, биохимическим, серологическим свойствам и по антибиотикоустойчивости.

2. Определить распространение генов основных и дополнительных факторов вирулентности возбудителя холеры у холерных вибрионов не01/не0139 серогрупп, выделенных в Поволжском и других регионах Российской Федерации и на территории пограничных государств в периоды различных эпидемических ситуаций.

3. Установить генетические особенности штаммов V.cholerae не01/не0139, изолированных на эндемичных по холере территориях в Юго-Восточной Азии.

4. Провести анализ организации геномов токсигенных вибрионов не01/не0139 серогрупп, выделенных в Юго-Восточной Азии и Узбекистане. Установить молекулярные механизмы их формирования.

5. Определить распространение у штаммов V.cholerae не01/не0139 генов систем секреции третьего и шестого типов, некоторых токсинов. Разработать способ детекции различных вариантов структурного гена токсинкорегулируемых пилей адгезии tcpA у холерных вибрионов разных серогрупп и выявить с его помощью новые варианты этого гена.

6. Разработать способ определения генетического родства штаммов холерных вибрионов различных серогрупп на основе вариабельности генов gmhD, orfl и rjg, фланкирующих кластер генов биосинтеза Оантигена.

Научная новизна работы

Впервые получена комплексная фенотипическая и генетическая характеристика штаммов V.cholerae не01/не0139, выделенных на территории Поволжского и других регионов Российской Федерации, а также в ближнем зарубежье. Установлена высокая однородность биохимических свойств V.cholerae не01/не0139, не зависящая от их серогрупповой принадлежности и места выделения. Выявлен ряд антибиотикоустойчивых (к стрептомицину, ампициллину, канамицину, сульфаметаксазолу и тетрациклину) штаммов холерных вибрионов не01/не0139 серогрупп, циркулирующих на эндемичных по холере территориях.

Впервые установлено, что в геноме большинства штаммов V.cholerae не01/не0139, выделенных в Поволжском регионе, как и в других регионах Российской Федерации, отсутствуют гены основных факторов вирулентности - ХТ и ТКПА, а также гены островов патогенности VPI, VPI-2; панде-мичности VSP-I, VSP-II; конъюгативных транспозонов. В тоже время у всех этих штаммов имеются гены hapA, rtxA, hlyA, кодирующие биосинтез факторов патогенности - гемагглютининпротеазы, мультифункционального авто-процессируемого токсина RTX, гемолизина/цитолизина, комплексное действие которых может обусловливать патогенные свойства этих штаммов. Установлено, что в эпидемически значимые периоды времени на этих территориях выделяются потенциально опасные штаммы не01/не0139 серогрупп с различным набором генов вирулентности. В геноме штамма 050 серогруп-пы, выделенного в 1974 г. в Ростовской области, выявлен остров пандемич-ности VSP-II и конъгативный транспозон SXT, которые в геномах эпидемических штаммов 01 серогруппы биовара эльтор и 0139 серогруппы были обнаружены значительно позже - в 1992-1993 гг.

Показано, что холерные вибрионы не01/не0139 серогрупп, циркулирующие на эндемичных территориях в Юго-Восточной Азии, содержат большее число генов патогенности, что делает их потенциально опасными штаммами, а также природными резервуарами этих генов.

Впервые проведен развернутый анализ генетической организации ток-сигенных штаммов не01/не0139 серогрупп, выделенные в Узбекистане. Установлено, что они имеют уникальный состав генов вирулентности и содержат новые аллели генов вирулентности го/, асе, га/С, ^рА, /охТ\ не встречающиеся у эпидемических штаммов 01 и 0139 серогрупп, что подтверждает принадлежность этих штаммов к независимым линиям эволюции вирулентных У.ско1егае.

Впервые разработана ПЦР с универсальными праймерами, обеспечивающая выявление различных типов структурного гена гсрА токсинкорегули-руемых пилей адгезии. С ее помощью выявлены новые алелли этого гена у штаммов У.ско1егае не01/не0139.

Установлено, что в геноме 30 % нетоксигенных холерных вибрионов не01/не0139 серогрупп, выделенных в Российской Федерации и за рубежом, содержатся гены системы секреции третьего типа, и у всех штаммов - системы секреции шестого типа, которые могут отвечать за патогенные свойства этих вибрионов. Впервые показано, что у токсигенных штаммов У.ско1егае 01, 0139 и не01/не0139 серогрупп гены системы секреции третьего типа отсутствуют, и, следовательно, она не вносит своего вклада в патогенность эпидемически значимых холерных вибрионов.

Впервые разработан эффективный способ определения генетического родства штаммов У.сИо1егае различного происхождения, основанный на вариабельности генов gmhD, ог]7 и фланкирующих кластер генов О-антигена. Приоритетность разработки подтверждена получением патента на изобретение «Способ определения генетического родства холерных вибрионов различных серогрупп методом секвенирования генов, фланкирующих кластер генов биосинтеза О-антигена» (№ патента №2393231, приоритет от 28 декабря 2008 г., зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 июня 2010 г.). С помощью этого метода впервые установлено, что штаммы V.cholerae, имеющие клональное происхождение, могут относиться к различным серогруппам, что свидетельствует о наличии механизма изменения серогрупповой принадлежности, не связанного с горизонтальным переносом генов кластера О-антигена.

Практическая значимость работы

По результатам работы оформлены и утверждены методические рекомендации «Способ определения генетического родства штаммов холерных вибрионов методом секвенирования генов, фланкирующих кластер генов биосинтеза О-антигена», утвержденных директором института 12 декабря 2008 г.

Разработаны методические рекомендации «Детекция различных вариантов гена tcpA токсинкорегулируемых пилей адгезии возбудителя холеры в ПЦР с универсальными праймерами», утвержденные директором института 20 апреля 2012 г.

Данные молекулярно-генетического исследования используются для паспортизации штаммов, хранящихся в ГКПБ при РосНИПЧИ «Микроб». В Государственной коллекции патогенных бактерий при РосНИПЧИ «Микроб» депонирован штамм Vibrio cholerae KM 227, в качестве модельного штамма холерного вибриона не01/не0139 серогруппы, содержащего в геноме остров пандемичности VSP-II, SXT элемент и кластеры генов системы секреции III и VI типа, для изучения роли этих генетических элементов в па-тогенности холерных вибрионов.

Полученные в ходе выполнения работы данные по генетической организации штаммов V.cholerae не 01/не 0139 используются при чтении лекций на курсах «ПЦР в диагностике инфекционных болезней и индикации патогенных микроорганизмов» при РосНИПЧИ «Микроб».

Положения, выносимые на защиту:

1. Штаммы У.ско1егае не01/не0139 серогрупп, выделенные в Поволжском и других регионах Российской Федерации, как правило, не содержат генов сЬсА и ^рА основных факторов патогенности - холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей адгезии, но несут гены карА биосинтеза гемагглютинин/протеазы, МхА мультифункционального ав-топроцессируемого токсина ЮГХ, МуА гемолизина/цитолизина. В геномах 30 % этих штаммов присутствуют гены системы секреции третьего типа, и у всех штаммов содержатся гены системы секреции шестого типа. Сочетанное действие этих факторов может обеспечивать патогенность штаммов У.ско1егае не01/не0139.

2. Холерные вибрионы не01/не0139 серогрупп, выделенные в эпидемически значимые периоды, а также циркулирующие на эндемичных территориях, содержат большее число генов патогенности, что делает их потенциально опасными штаммами, а также природными резервуарами этих генов.

3. Токсигенные штаммы не01/не0139 серогрупп имеют уникальный состав генов факторов патогенности, не встречающийся в таком сочетании у эпидемических штаммов 01 и 0139 серогрупп. Значительные отличия в нуклеотидных последовательностях их генов от эпидемических изолятов Уско1егае свидетельствуют о принадлежности большинства изученных токсигенных штаммов не01/не0139 серогрупп к независимым линиям эволюции токсигенных холерных вибрионов.

4. Впервые на основе использования вариабельности генов gmhD, ог/2 и фланкирующих кластер генов биосинтеза О-антигена, установлено, что штаммы Уско1егае не01/не0139, имеющие клональное происхождение, могут относиться к различным серогруппам, что подтверждает наличие у них механизма изменения серогрупповой принадлежности, не связанного с горизонтальным переносом генов кластера Оантигена.

Апробация работы

Материалы работы доложены на 10-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2007; на VI Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика - 2007», Москва, 2007; на заседаниях проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» Межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации, Ростов-на-Дону, 2008, 2009, 2011 гг.; на 3-ей научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», Оболенск, 2011; на IV ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 2012 г.; на X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2012 г.; на итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб», 2009, 2012 гг.

Публикации результатов исследований Материалы исследований отражены в 12 работах, из них 4 - в периодических изданиях из «Перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России».

Структура и объем диссертации Диссертация представлена на 170 страницах текста, состоит из введения, главы обзора литературы, пяти глав собственных исследований (в том числе одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 19 рисунками. Библиографический указатель содержит 55 отечественных и 143 зарубежных источников.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Фадеева, Алевтина Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Комплексный анализ фенотипических свойств штаммов V.cholerae не01/не0139 серогрупп, выделенных в Российской Федерации, в ближнем и дальнем зарубежье, показал их биохимическую однородность, не зависящую от их серогрупповой принадлежности и от региона выделения. Обнаружен ряд антибиотикоустойчивых штаммов не01/не0139 серогрупп, выявление которых свидетельствует о возможности распространения резистентности к лекарственным препаратам в популяциях этих вибрионов.

2. В геноме большинства штаммов V.cholerae не01/не0139, выделенных в Поволжском и других регионах России, отсутствуют гены основных факторов патогенности - холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей адгезии, а также генов островов патогенности VPI, VPI-2, панде-мичности VSP-I, VSP-II, конъюгативных транспозонов. В тоже время в геномах всех этих штаммов содержатся гены hapA, rtx, МуА, кодирующие биосинтез факторов патогенности - гемагглютининпротеазы, мультифункционального автопроцессируемого токсина RTX, гемолизина/цитолизина.

3. Холерные вибрионы не01/не0139 серогрупп, выделенные в эпидемически значимые периоды, а также циркулирующие на эндемичных территориях, содержат содержат большее число генов факторов патогенности, что делает их потенциально опасными штаммами, а также природными резервуарами этих генов.

4. Изученные токсигенные штаммы не01/не0139 серогрупп, выделенные в Узбекистане и Юго-Восточной Азии имеют состав генов патогенности, не встречающийся в таком сочетании у эпидемических штаммов 01 и 0139 серогрупп. Выявлены значительные отличия в нуклеотидных последовательностях их генов патогенности от генов эпидемических V.cholerae 01 и 0139 серогрупп.

5. Разработанная нами ПЦР с универсальными праймерами позволяет выявлять различные варианты структурного гена 1срА. С ее помощью у штаммов У.ско1егае не01/не0139 серогрупп обнаружены новые аллели этого гена.

6. В геноме 30 % нетоксигенных холерных вибрионов не01/не0139 серогрупп, выделенных в Российской Федерации и за рубежом, содержатся гены системы секреции третьего типа, и в геномах всех штаммов - системы секреции шестого типа, которые могут отвечать за патогенные свойства этих вибрионов

7. С помощью разработанного нами метода определения генетического родства штаммов Кско1егае на основе вариабельности генов gmhD, ог/2 и 1фланкирующих кластер генов О-антигена, впервые установлено, что штаммы У.ско1егае, принадлежащие к одному клону, могут относиться к различным серогруппам.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вид У.ско1егае представлен генетически разнообразной группой холерных вибрионов, включающей 206 известных к настоящему моменту серогрупп. Из них наибольшее значение имеют У.ско1егае 01 и 0139 серогрупп, которые могут вызывать эпидемии и даже пандемии холеры. Остальные серогруппы, получившие общее обозначение как У.ско1егае не01/не0139, обычно не связывают с эпидемиями холеры, но они могут служить причиной локальных вспышек диаррейных болезней или отдельных случаев острых кишечных и раневых инфекций и даже сеп-тицемий. Эпидемические вибрионы 01 и 0139 серогрупп образуют ХТ и ТКПА, в то время как вибрионы не01/не0139 серогрупп, как правило, лишены этих двух основных факторов вирулентности, но в их геноме присутствуют другие гены, совместное действие продуктов которых может приводить к развитию холеропо-добных болезней. Однако холерные вибрионы не01/не0139 серогрупп являются малоисследованной группой УсИо1егае, патогенный и эпидемический потенциал которых остается неясным. Мало изучены особенности генетической организации этой обширной группы холерных вибрионов, являющихся естественными обитателями водных экосистем в различных ландшафтно-географических зонах.

В этой работе проведен комплексный анализ фенотипических и генетических свойств штаммов У.ско1егае не01/не0139, выделенных в различных регионах Российской Федерации, в сопредельных странах и в дальнем зарубежье. Исследовано распространение и проведен структурно-функциональный анализ генов патогенности, обычно присутствующих в геноме вирулентных штаммов 01 и 0139 серогрупп, а также генов, связываемых с патогенностью У.ско1егае не01/не0139, с тем, чтобы определить патогенный и эпидемический потенциал последних, а также оценить возможные пути формирования вирулентных холерных вибрионов различных серогрупп.

Всего нами исследовано 305 штаммов У.ско1егае различных серогрупп, выделенных в Российской Федерации, в ближнем и дальнем зарубежье. Среди них изучены 270 штаммов V.cholerae не01/не0139 серогрупп, из которых 197 штаммов выделены а Поволжском (Астраханская, Саратовская, Самарская, Ульяновская области, Калмыкия, Башкирия, Мордовия) и других регионах России - в Ростовской, Пермской, Оренбургской областях; 35 штаммов из ближнего (Узбекистан, Туркмения, Украина) и 38 штаммов из дальнего (Юго-Восточная Азия) зарубежья.

Проведенный на первых этапах исследования сравнительный анализ куль-турально-морфологических, серологических и биохимических свойств штаммов V.cholerae различных серогрупп, относящихся к 02-039 серогруппам (коллекция Р.Саказаки); к 041, 042, 045, 047, 048, 049, 050, 051, 052, 054 серогруппам (Россия); к 09, 015. 022. 028, 043, 062, 074, 084 серогруппам (Узбекистан), а также большого числа штаммов неидентифицированных серогрупп, выявил высокую биохимическую однородность этих штаммов, которая не зависела от их серо-групповой принадлежности и от региона выделения. Штаммы V.cholerae не01/не0139, изолированные в Поволжском регионе, в ближнем (Туркмения, Узбекистан, Украина), а также и в дальнем зарубежье (Юго-Восточная Азия -Индия, Филиппины) практически не отличались по биохимической активности, как не отличались по ней и токсигенные V.cholerae не01/не0139, изолированные в Юго-Восточной Азии и в Узбекистане. Биохимическая однородность штаммов V.cholerae не01/не0139 связана, вероятно, с тем, что холерные вибрионы всех серогрупп большую часть своего сложного жизненного цикла проводят во внешней среде в условиях ограниченного доступа к органическим питательным ресурсам, что требует поддержания в активном состоянии ферментов их метаболического обмена.

Анализ гемолитической активности показал, что она характерна для значительного большинства холерных вибрионов не01/не0139 серогрупп, а выборочное исследование этих штаммов (33 штамма) по их питательным потребностям позволило установить, что все они являются прототрофами. Анализ наличия у 40 штаммов V.cholerae не01/не0139 разного происхождения устойчивости к ряду антибиотиков, показал, что штаммы, циркулирующие в России, как правило, чувствительны к ним, в то время как часть штаммов из дальнего зарубежья является антибиотикоустойчивой. Среди штаммов, выделенных в Юго-Восточной Азии, выявлено 6 антибиотикоустойчивых изолятов, резистентных (в разных сочетаниях) к сульфаметаксазолу, стрептомицину, ампициллину, канамицину, тетрациклину. Эта распространенность, скорее всего, связана с широким применением антибактериальных лекарственных препаратов, используемых для лечения острых кишечных инфекций на эндемичных территориях.

В рамках нашей работы выполнен масштабный анализ распространения генов основных факторов патогенности - ХТ и ТКПА, а также других генов, расположенных на островах патогенности УР1 и УР1-2, пандемичности У8Р-1, УБР-Н и конъюгативных транспозонах, у штаммов не01/не0139 серогрупп, выделенных от больных людей и из воды на территории Российской Федерации и в пограничных странах в периоды различных эпидемических ситуаций. Проведено сравнение генетических свойств этих штаммов со свойствами штаммов не01/не0139 серогрупп, изолированных на эндемичной территории - в Юго-Восточной Азии. До начала наших исследований практически отсутствовали сведения об особенностях генетической организации штаммов У.ско1егае не01/не0139. выделенных в Поволжском регионе - в Астраханской, Саратовской, Самарской, Ульяновской областях, в Калмыкии, Башкирии, Мордовии. На этих территориях часто регистрируются случаи болезней, вызываемых холерными вибрионами не01/не0139 серогрупп, в том числе такие вибрионы практически ежегодно выделяются в Астраханской области от людей с различными формами гастроэнтеритов, энтероколитов, острых кишечных инфекций неясной этиологии. Проведенный ПЦР анализ 45 штаммов УсИо1егае, выделенных в Астраханской области в период между 1976 и 2003 гг., не выявил наличия у них генов с(хА, асе, кодируемых фагом СТХср а также гена го/С фага 1181ср, и, следовательно, эти штаммы не могли образовывать ХТ, а также токсины Zot и Асе. Только у одного из изученных штаммов -клинического изолята У.ско1егае 14520 серогруппы 041, выделенного в Астрахани в 1976 г., обнаружены гены островов патогенности УР1: ген ТКПА ¿срАС1ая\ ре-гуляторные гены /срР/Н, альдолазы - аША; УР1-2: нейраминидазы папН; а также специфический сайт интеграции фага СТХср - последовательность аПЯЗ. Наличие обогащенного набора генов патогенности у этого штамма, выделенного в эпидемически значимый период, свидетельствует о его потенциальной опасности. В коровой части геномов всех исследованных астраханских штаммов выявлены гены: ^хЯ глобального регуляторного белка ТохЛ, карА многофункционального белка гемагглютинин/протеазы, г1хА широко распространенного мультифункцио-нального автопроцессируемого бактериального токсина ЯТХ и ЫуА порообразу-ющего токсина — гемолизина-цитолизина. Комплексное действие этих факторов может обусловливать патогенные свойства штаммов не01/не0139 серогрупп. В геноме многих астраханских штаммов присутствовали тэкА!С), кодирующие синтез гемагглютинирующих пилей адгезии, которые могут играть важную роль на начальных этапах образования биопленки, и , возможно, принимают участие в колонизации тонкого кишечника.

Нами также проведен развернутый анализ генетических свойств У.ско1егае не01/не0139 холерных вибрионов, полученных в других областях Поволжского региона - в Саратовской, Самарской, Ульяновской областях, в Калмыкии, Башкирии, Мордовии, в других регионах России - Ростовской, Пермской, Оренбургской областях и на территории бывших республик Советского Союза - в Туркмении, Узбекистане, Украине в 1968 -2003 гг. Как показал проведенный ПНР анализ, подавляющее большинство изученных штаммов не01/не0139 серогрупп лишено бактериофагов СТХф и 1181ср, кодирующих биосинтез ХТ, а также островов патогенности УР1 и УР1-2 с генами 1срА, гсрР/Н, (охТ, аЫА и папН, пандемичности У8Р-1, У8Р-П и конъюгативный транспозон 8ХТ. Однако у всех штаммов в хромосоме содержатся гены 1охЯ, карА, ША, ЫуА. У значительного числа штаммов присутствуют тякА/£), а у части штаммов выявлена последовательность аМЯЗ. В геноме двух штаммов 041 и 049 серогрупп, выделенных в Ростовской области в эпидемически значимый период - начала 70-х годов, в ПЦР выявлены гены острова патогенности VPI - tcp, íoxT, aldA. Один из этих штаммов содержит ген tcpAclas\ свойственный вирулентным штаммам OI серогруппы классического биовара, а другой - ген tcp А типа эльтор. У еще одного штамма Р-8845 серогруппы 050, изолированного в Ростовской области в 1974 г., обнаружено наличие генов VC0502, VC0514 острова VSP-II и intSxi SXT элемента. Анализ структуры выявленного SXT элемента, показал, что у него отсутствуют гены устойчивости к стрептомицину, триметоприму и сульфаметаксазолу- strB, dfrl8 и suñl, но содержится интактный оперон гитАВ, целостность которого доказывает отсутствие внедрения в него сложной транспозоноподобной структуры с генами антибиоти-коустойчивости, характерной для большинства SXT транспозонов или констинов эпидемических V.cholerae 0139. По-видимому, нами обнаружен «антибиотико-чувствительный» (гитАВ+) предшественник SXT КОНСТИНОВ, который может быть использован для изучения роли этих элементов в эволюции патогенных вибрионов.

Проведенный ПЦР анализ 38 штаммов V.cholerae 02- 039 серогрупп (коллекция Р.Саказаки), выделенных на эндемичных по холере территориях в Юго-Восточной Азии (Индия, Филиппины), в 1960-е годы (Р.Саказаки, 1970), по более, чем двадцати генам патогенности и жизнеобеспечения показал, что в их геноме содержится достаточно большое число генов факторов патогенности, которые выявляются в различных сочетаниях. Из этих штаммов только один штамм 1322-69 серогруппы 037 был токсигенным и включал гены ctxAB, zot, асе, rstC, TLC элемент, tcpA, tcpP/H, toxT, aldA, nanH VPI-2, кодируемые МГЭ, а также гены коровой части хромосомы - toxR, hapA, rtxA, hlyA, гены msh. В тоже время в геноме штамма 1322-69 отсутствовали YSP-I, VSP-II и SXT. Остальные штаммы из коллекции Р. Саказаки не содержали генов ХТ, но достаточно большая часть из них несла гены ТКПА. Наличие генов tcpA классического типа выявлено нами у штаммов V.cholerae 02, 014, 018, 020, 025 серогрупп, а генов tcp А типа эльтор -у штаммов 010, 017, 019, 027, 031 серогрупп. Практически у всех tcpA-содержащих штаммов присутствовали также другие гены острова патогенности

VPI - toxT и aldA. Некоторые штаммы содержали ген папН. У шести штаммов в геноме присутствовал ген VC0180 острова VSP-I, а у пяти - ген VC0502 острова VSP-II. В геноме еще двух эндемических штаммов 031 и 035 серогруппы содержался ген интегразы /«¿sxt 'Элемента SXT. При этом в штамме 035 серогруппы выявлено наличие гена suRl устойчивости к сульфаметаксазолу, а у штамма 031 серогруппы - присутствовали гены устойчивости к отдельным антибиотикам, которые, по-видимому, кодировались другими МГЭ. Геномы всех 38 штаммов не01/не0139 серогрупп из коллекции Р.Саказаки содержали гены коровой части хромосомы - toxR, hapA, rtxA и hlyA. Из полученных данных следует, что штаммы V.cholerae не01/не0139 серогрупп, изолированные в 1960-е годы (во время начала 7-ой пандемии холеры) на территории Юго-Восточной Азии - Индия, Филиппины имели достаточно большое содержание генов патогенности, состав которых был смешанным, не встречающимся в таких комбинациях у эпидемических штаммов 01 и 0139 серогрупп, из чего следует что эти штаммы не являются производными последних, а, вероятно, произошли от авирулентных штаммов в результате горизонтального переноса в их геном различных МГЭ с генами патогенности. Данные проведенного нами RAPD ПЦР штаммов из коллекции Р.Саказаки подтвердили, что эти штаммы представляют собой независимые филогенетические линии эволюции, поскольку они имеют различные профили амплификации, отличные друг от друга и от вирулентных штаммов 01 и 0139 серогрупп.

Нами впервые проведен развернутый анализ генетической организации ток-сигенных штаммов V.cholerae не01/не0139, выделенных на территории бывшей республики Советского Союза - Узбекистана. Всего изучено 22 токсигенных штамма, выделенных в 1971, 1986, 1987 и 1990 гг. В Узбекистане на протяжении нескольких последних десятилетий наряду с нетоксигенными холерными вибрионами выделяются токсигенные V.cholerae не01/не0139. До сих пор свойства токсигенных узбекских штаммов остаются малоисследованными. Неясно их филогенетическое положение относительно других холерных вибрионов. Большинство изученных нами токсигенных штаммов V.cholerae не01/не0139 выделено в летнеосенний период в 1990 г. на территории сразу нескольких регионов Узбекистана, что свидетельствует о достаточно широком распространении на этой территории в тот период таких штаммов. Отличительной особенностью этой вспышки 1990 г. было то, что вызвавшие ее штаммы относились к разным - 09, 015, 028, 074, 084 и не идентифицированным серогруппам, что на первый взгляд свидетельствовало об отсутствии клонального происхождения этих штаммов. Как показал проведенный ПЦР анализ, все 22 штамма содержали ген ХТ - ctxA и другие гены факторов патогенности - zot, асе, rstC, íoxT, aldA, tcpP/H. Однако у штаммов V.cholerae не01/не0139, выделенных в 1987-1990 гг., не выявлялись кодирующие ТКПА гены tcpAclass или tcpAelt, хотя ген tcpclass присутствовал у штамма КМЗ (1971 г.), а ген tcpAe" - у штамма КМ159 (1986 г.) и у штамма Р16150 (1987 г.). Все узбекские штаммы содержали ген нейраминидазы папН и гены mshAJQ биосинтеза MSHA. У штаммов, выделенных в 1987-1990 гг., присутствовал TLC элемент, но отсутствовали VSP-I, VSP-II и SXT. В геномах токсигенных узбекских штаммов содержалась инсерционная последовательность IS/558 и гены rjg, gmhD, orf2, фланкирующие кластер биосинтеза О-антигена. Таким образом, состав генов токсигенных штаммов, выделенных в Узбекистане, значительно отличался от такового у токсигенных штаммов V.cholerae OI серогруппы биовара эльтор и 0139 серогруппы, что означает, что токсигенные узбекские штаммы не имеют клонального родства с эпидемическими штаммами OI и 0139 серогрупп.

Секвенирование генов вирулентности токсигенных узбекских штаммов показало, что их последовательности значительно отличались от таковых эпидемических вибрионов 01 и 0139 серогрупп. Нами выявлено наличие новых вариантов (аллелей) генов вирулентности, не описанных в литературе ранее и отсутствующих в базах данных NCBI GenBank. В том числе у токсигенных узбекских штаммов обнаружены две новые аллели гена zot, три новые аллели гена асе, четыре новые аллели гена toxT. Это подтверждает сделанный выше на основании анализа состава генов вывод о том, что узбекские штаммы представляют независимую линию эволюции токсигенных V.cholerae. В тоже время все штаммы, выделенные в 1987, 1988 и 1990 гг. (за исключением одного штамма 1987 г.) на территории разных областей Узбекистана, имели одинаковый состав генов вирулентности и идентичные последовательности этих генов, что свидетельствует о кло-нальном происхождении этих штаммов. Проведенное молекулярное типирование методом RAPD ПЦР, показало, эти штаммы имели идентичные RAPD ПЦР профили, отличные от профилей штаммов, выделенных в Узбекистане в 1971 и 1986 гг., а также от эпидемических штаммов 01 и 0139 серогрупп. Построение филогенетического дерева (Maximum parsimony tree с категорическим коэффициентом) с помощью программы Bionumerics 6.6 (Applied Maths, Belgium) выявило наличие отдельного кластера, представленного этими токсигенными штаммами из Узбекистана.

Проведенный выше ПЦР анализ не выявил наличия у токсигенных узбекских штаммов, выделенных в Узбекистане в 1987, 1988 и 1990 гг., структурного гена ТКПА - tcpA. Однако способность этих вибрионов вызывать острые кишечные инфекции и наличие гена холерного токсина ctxA указывали на присутствие у них и гена tcpA второго обязательного фактора патогенности - ТКПА, нуклеотид j Class ная последовательность которого, возможно, существенно отличалась от tcpA и tcpAelt. На основе компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей генов tcpA у штаммов V.cholerae разных серогрупп, представленных в базе данных NCBI GenBank, нами были выявлены консервативные участки ДНК, на которые были сконструированы универсальные праймеры для выявления различных вариантов этого гена. С их помощью нам удалось выявить наличие генов tcpA у токсигенных штаммов, выделенных в Узбекистане. В ПЦР с универсальными праймерами у этих штаммов образовывались специфические амплификаты размером 732 п.н. секвенирование которых выявило наличие на 3' вариабельном конце гена tcpA 165 нуклеотидных замен относительно штамма Ol серогруппы биовара эльтор N16961 (NCBI GenBank). Такая последовательность отсутствовала в базе данных NCBI GenBank и, следовательно, была новым вариантом (аллелью) этого гена, который мы обозначили как tcpAuzb . С помощью разработанной ПЦР был проведен поиск новых аллелей гена ^рА у других штаммов У.ско1егае не01/не0139, выделенных в различных регионах. Были выявлены еще два штамма, относившиеся к 023 и 038 серогруппам (коллекция Р.Саказаки), которые также содержали новые варианты гена (срА. Из этих данных следует, что разработанный метод позволяет выявлять большее число штаммов Кско1егае, содержащих гены 1срА, по сравнению с традиционно используемыми ПЦР. Среди 138 исследованных штаммов выявлен 21 штамм (16 % от числа изученных), содержавший гены №рА, отличные от классического и эльтор вариантов.

Для установления причин вариабельности серогрупповой принадлежности токсигенных узбекских штаммов мы провели секвенирование у них фрагментов генов gmhD, ог/2 и rjg, фланкирующих кластер мЬ* биосинтеза О-антигена. В се-квенированном фрагменте (1328 п.н.) гена rjg у всех штаммов 1987, 1988 и 1990 гг. содержалось одинаковое число замен- 35, относительно штамма N16961 СЫСВ1 вепВапк), а у других токсигенных штаммов из Узбекистана оно составляло от 21 до 31 замен. Фрагмент гена gmhD размером 930 п.н. у штаммов токсигенно-го клона 1987-1990 гг. содержал 37 замен, в то время как у других штаммов число замен колебалось от 27 до 47. В фрагменте гена ог/2 1350 п.н. у штаммов токси-генного клона присутствовало 63 замены нуклеотидов, а у других штаммов их количество составляло от 41 до 44 замен. Таким образом, протяженные фрагменты генов gmhD, оф и ^ были идентичными у штаммов 1987, 1988 и 1990 гг. выделения, что означает, что м?Ь* кластер сформировался у них в результате единого рекомбинационного события, и что эти штаммы, несмотря на их принадлежность к различным серогруппам, представляют собой один и тот же клон. Из этого также следует, что принадлежность к различным серогруппам вызвана у них не переносом генов О-антигена, а перестройками внутри кластера генов биосинтеза О-антигена, которые обусловлены последовательностью 187358, присутствующей в этом кластере у всех 22 токсигенных узбекских штаммов, или другим пока не выявленным механизмом изменения кластера О-антигена.

Теоретически существуют два возможных пути образования токсигенных холерных вибрионов различных серогрупп. Первый из них предполагает их происхождение от вирулентных холерных вибрионов 01 серогруппы в результате горизонтального переноса и последующей замены wbe кластера генов биосинтеза 01-антигена на кластеры других серогрупп - например, серогруппы 0139 (Bik Е.М. et al., 1995; Sozhamannan S. et al., 1999). Проведенный нами ретроспективный анализ токсигенных холерных вибрионов, вызвавших вспышку холеры в Узбекистане в 1990 г., подтвердил наличие и другого независимого от вирулентных холерных вибрионов OI серогруппы пути формирования опасных холерных вибрионов, связанного с постепенным накоплением генов патогенности и образованием новых вирулентных холерных вибрионов, не родственных традиционным возбудителям холеры.

Нами было также исследовано распространение у штаммов V.cholerae не01/не0139 их собственных факторов, ассоциируемых с патогенностью этих вибрионов, таких как системы секреции третьего (ССЗТ) и шестого (СС6Т) типов и термостабильного токсина ST.

Изучение распространения генов ССЗТ, проведенное нами у 86 штаммов 01-037, 041-043, 050, 052, 056, 062, 074, 082, 084, 0139 и неидентифициро-ванных серогрупп, полученных в период с 1963г. по 2003 г. на территории Российской Федерации - в Астраханской, Ростовской, Саратовской, Куйбышевской областях, Калмыкии, Башкирии, в Туркмении, Узбекистане и странах Юго-Восточной Азии, показало, что в геноме всех изученных эпидемических штаммов 01 серогруппы классического и эльтор биоваров, 0139 серогруппы, токсигенных штаммов не01/не0139 серогрупп отсутствует кластер ССЗТ с генами vcsC2, vcsN2, vcsV2, vspD, из чего следует, что у токсигенных штаммов V.cholerae она, как правило, не встречается и, следовательно, не вносит своего вклада в вирулентность этих штаммов. У нетоксигенных штаммов не01/не0139 серогрупп, напротив, кластер генов ССЗТ достаточно широко распространен. При изучении 48 штаммов 09, 017, 041, 050, 085, 087 и неидентифицированных серогрупп, выделенных в различных областях Поволжского и других регионов России, в сопредельных странах, а также в Юго-Восточной Азии, обнаружено 14 штаммов, которые содержали гены ССЗТ. Таким образом, штаммы не01/не0139 серогрупп, содержащие ССЗТ, выделяются на различных территориях в разные годы и, по-видимому, они могут использовать ее в качестве одного из факторов патогенно-сти.

Нами также исследовано распространение СС6Т или VAS системы, применяемой вибрионами для экстрацеллюлярной транслокации эффекторных белков в клетки-мишени макроорганизмов. На основе компьютерного анализа 18 генов СС6Т у штаммов V.cholerae, представленных в базе данных NCBI GenBank, нами в программе Primer Express были рассчитаны праймеры на консервативные участки пяти из них - hep, vas A, vasF, vas К, vgrG и подобраны оптимальные условия проведения ПЦР. С помощью разработанных ПЦР было исследовано присутствие генов СС6Т у 42 штаммов холерных вибрионов различных серогрупп. Установлено, что у всех изученных штаммов V.cholerae в геноме присутствуют практически все 5 выбранных генов СС6Т, что предполагает наличие у них всего кластера генов этой системы. Гены vas A, vasF, vasK, vgrG, hep выявлялись как у токсигенных штаммов V.cholerae 01,0139 и не01/не0139, так и у нетоксигенных не01/не 0139 вибрионов, выделенных в Астраханской. Саратовской, Ростовской областях, Калмыкии и за рубежом. Для изучения экспрессии СС6Т холерными вибрионами, содержащими гены этой системы, нами была использована модель амебы Dicty-ostelium discoideum штамм ХМЗ (Dicty Stock Center, Columbia University, USA), предложенная S.Pukatzki et al. [2006]. В результате проведенных экспериментов установлено, что при нанесении амеб на газон вирулентных штаммов V.cholerae Ol, 0139 и не01/не0139, негативные пятна на их культурах образуются достаточно быстро, что свидетельствует об отсутствии у этих культур устойчивости к поеданию D.discoideum и об отсутствии у них функциональной активности СС6Т. В тоже время 29 исследованных нетоксигенных штаммов V.cholerae не01/не0139 были устойчивы к поеданию амебой D.discoideum, что предполагает наличие у них функционально активной СС6Т. Полученные данные свидетельствуют о широком распространении генов ССЗТ и СС6Т у нетоксигенных холерных вибрионов различных серогрупп, которые могут быть факторами патогенности этих вибрионов.

Нами также было исследовано распространение гена термостабильного токсина ЭТ, который был впервые обнаружен у холерных вибрионов не01 серо-группы [Агйа М. е1 а1., 1986]. Детекция гена в ПЦР у 85 штаммов V, ско1егае не01/не0139, выделенных в Астраханской, Саратовской, Ростовской областях, Калмыкии, в Узбекистане и в Юго-Восточной Азии с 1963 по 2003 гг., показала, что ни в одном из этих штаммов в ПЦР не было получено положительного сигнала, свидетельствовавшего о присутствии этого гена в их геноме, что подтверждает справедливость отнесения токсина БТ к редко встречаемым токсинам холерных вибрионов [Монахова Е.В. 2012; Агка М. ег а1., 1986].

Выявленная нами вариабельность других генов - ог/2, фланкирующих кластер м>Ь* биосинтеза О-антигена, была использована для разработки способа молекулярного типирования холерных вибрионов различных серогрупп. Нами были рассчитаны праймеры, отличные от ранее сконструированных ^гое-Ьег 1Ш. е! а1., 1998; 8огЬатаппап Б, е1 а1., 1999] и обеспечивающие получение в ПЦР меньших (для упрощения анализа) фрагментов этих генов. При секвениро-вании полученных в ПЦР фрагментов генов г/^, gmhD, ог/2 у 30 штаммов У.ско1егае было установлено, что у вирулентных штаммов 01 серогруппы биовара эльтор последовательности генов rjg, gmhD, ог/2 идентичны между собой и близки (но не идентичны - содержат несколько замен нуклеотидов) вирулентным штаммам классического биовара и в тоже время значительно отличаются от ави-рулентных штаммов 01 серогруппы биовара эльтор, изолированных из внешней среды. При сравнении их с вирулентными штаммами 0139 серогруппы установлено, что последовательность гена ог/2 у них идентична, в то время как в гене ^ у штаммов 0139 серогруппы содержится 13 замен нуклеотидов, а в гене gmhD -7 замен. Наличие этих замен подтверждает, что штаммы 0139 серогруппы, произошли от штаммов 01 серогруппы биовара эльтор в результате горизонтального переноса им генов 0139 антигена и последующей рекомбинации по генам gmhD, (но не ог/2), фланкирующим этот кластер. В тоже время авирулентный штамм этой серогруппы, выделенный в Иркутской области из воды, имел существенные отличия по генам gmhD, ог/2 и rjg (11, 22 и 16 замен) относительно вирулентных штаммов 01 серогруппы биовара эльтор. Последовательности генов rjg, gmhD, ог/2 были идентичны у токсигенных узбекских штаммов 1990 г. выделения, и в то же время они существенно отличались от вирулентных штаммов 01 и 0139 серо-групп, что еще раз доказывает отсутствие у них близкого филогенетического родства с этими эпидемическими штаммами.

Шесть исследованных нетоксигенных штаммов У.ско1егае не01/не0139 се-рогрупп, выделенных в Ростовской, Астраханской и Саратовской областях имели вариабельные последовательности gmhD, ог/2 и отличавшиеся друг от друга и от токсигенных штаммов 01, 0139 и не01/не0139 серогрупп и, следовательно, принадлежали к независимым филогенетическим линиям эволюции холерных вибрионов. Таким образом, разработанный способ молекулярного типирования, основанный на определении нуклеотидной последовательности фрагментов генов gfnhD и ог/2, фланкирующих кластер генов биосинтеза О-антигена, позволяет проводить дифференциацию штаммов холерных вибрионов различного происхождения и определять наличие родственных связей между ними.

Подводя общий итог выполненных в этой работе исследований следует заключить, что нами проведен развернутый молекулярно-генетический анализ 270 штаммов У.ско1егае не01/не0139, выделенных на территории Российской Федерации, ближнего и дальнего зарубежья. В результате проведенных исследований установлено, что большинство клинических штаммов У.ско1егае не01/не0139 серогруппы, выделенных в Поволжском и других регионах Российской Федерации а также в ближнем зарубежье, не содержат двух основных факторов вирулентности - ХТ и ТКПА и кодирующих их генов, и. следовательно, они не относятся к эпидемически значимым штаммам У.ско1егае. В тоже время в их геноме присутствуют гены rtx, hapA, ЫуА, кодирующие мультифункциональный токсин RTX, ге-магглютинин/протеазу, гемолизин/цитолизин, комплексное действие которых может отвечать за патогенность штаммов V.cholerae не01/не0139. У части этих штаммов содержатся гены системы секреции третьего типа, а также у всех них присутствуют гены системы секреции шестого типа, которые могут вносить существенный вклад в патогенность V.cholerae не01/не0139. В эпидемически значимые периоды времени в некоторых регионах России выделяются штаммы с обогащенным набором генов вирулентности, которые представляют повышенную опасность для здоровья населения. На эндемичных по холере территориях в Юго-Восточной Азии циркулируют вибрионы не01/не0139 серогрупп. содержащие значительное число генов патогенности в различных сочетаниях. Эти штаммы представляют собой, как правило, независимые филогенетические линии эволюции патогенных вибрионов. Они являются природными резервуарами генов вирулентности, и на их основе могут возникать вирулентные штаммы V.cholerae с новыми свойствами, идентификация и профилактика которых может быть затруднена в связи с отсутствием соответствующих средств их диагностики и лечения.

На территории ближнего зарубежья - в Узбекистане выделяются токсиген-ные штаммы V.cholerae не01/не0139 серогрупп. Эти штаммы относятся к эпидемически опасным штаммам. Они содержат смешанный набор генов вирулентности, отличный от такового вирулентных штаммов OI и 0139 серогрупп. и представляют независимые линии эволюции вирулентных V.cholerae.

В целом штаммы V.cholerae не01/не0139 являются природными резервуарами генов вирулентности, многие из них обладают патогенными свойствами, что требует проявления к ним пристального внимания и проведения постоянного мониторинга этих потенциально опасных холерных вибрионов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фадеева, Алевтина Викторовна, 2012 год

1. Авдеева Е.П., Мазрухо Б.Л., Воронежская Л.Г. с соавт. Особенности циркуляции различных по происхождению холерных вибрионов не01/не0139 серогрупп // Эпидемиология и инф. болезни. 2006. -№2.-С. 19-22.

2. Авдеева Е.П., Мазрухо Б.Л., Воронежская Л.Г. с соавт. Характеристика энтеропатогенности холерных вибрионов не01/0139 серогрупп, выделенных в Узбекистане // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005. - №3. - С.80-82.

3. Балахонов C.B., Миронова Л.В., Марамович A.C. с соавт. ПЦР-детекция маркеров эпидемической значимости штаммов Vibrio cholerae 0139, изолированных в Сибири // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол— 2001.-Х® 2. С.24-26.

4. Бароян О.В. Холера Эль-Тор. // М., «Медицина 2». 1971. - С.254.

5. Власов В.П., Монахова Е.В., Ушакова И.Е. с соавт. Гемолизин Vibrio cholerae eltor: клонирование и экспрессия генов в Escherichia coli И Мол. генет. микробиол. и вирусол. 1992. - X® 7-8. - С.14-20.

6. Волков Ю.П., Ерошенко Г.А. Анализ эффективности некоторых методов пострения филогенетических деревьев, используемых при оценке эволюционного родства микроорганизмов // Пробл. Особо опасных инф.-2009.-Вып 1(99). С.41.

7. Ганин B.C., Урбанович Л.Я., Сомова А.Г. с соавт. Серологическое ти-пирование не агглютинирующихся О-холерной сывороткой вибрионов, выделенных на территории СССР // ЖМЭИ. 1979. - №4. - С.49-53.

8. Гинцбург А.Л., Янишевский Н.В., Мотин В.Л. и др. Организация и клонирование структурных генов энтеротоксина Vibrio cholerae eltor RV79 // Мол. генетика. 1984. - №9. - С. 12-19.

9. Заднова С.П., Лозовский Ю.В. Механизмы секреции грамотрицатель-ных бактерий // Пробл. особо опасных инф. 2005. - Вып.90. - С.11-16.

10. Костромитина Е.А. Молекулярно-генетические свойства штаммов холерного вибриона эльтор с различной эпидемической значимостью: Ав-тореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 2004. - 22с.

11. Кузьмиченко И.А., Грачева И.В., Плотников О.П. Деструктивная активность и рост холерного вибриона в присутствии твинов // Пробл. особо опасных инф. 2001. - Вып.82. - С.101-105.

12. Кутырев В.В., Смирнова Н.И., Черкасский Б.Л. Влияние биологических свойств возбудителя холеры на характер эпидемического процесса // Эпидемиология и инф. болезни. 2006. - №4. - С.43-47.

13. Кутырев В.В., Смирнова Н.И. Генодиагностика и молекулярное типи-рование возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 2003. - № 1. - С. 6-13.

14. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство // Под ред. акад. РАМН, проф. Г.Г. Онищенко и чл.-корр. РАМН, проф. В.В. Кутырева. М: ОАО «Из-во «Медицина», из-во «Шик», 2009,472 с.

15. Лукьянова О.И. Щуркина И.И. Исследование О-антигенной структуры нетипирующихся штаммов энтеропатогенных вибрионов // Профилактика особо опасн. инф. 1988 - С. 72-80.

16. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // Пер. с англ. М.: Мир, 1984. - 480с.

17. Маркина О.В., Монахова Е.В., Алексеева Л.П., Писанов Р.В. Изучение биологического действия гемагглютинин/протеазы холерных вибрионов на модели культур клеток // Пробл. особо опасных инф. 2007. - Вып.2 (94).- С.58-61.

18. Миронова Л.В., Балахонов C.B., Урбанович Л .Я. с соавт. Обнаружение гибридных штаммов штаммов Vibrio cholerae El Tor при эпидемических осложнениях в Сибири и на Дальнем Востоке // Журн. Микро-биол., эпидемиол. и иммунобиол. 2011.-35. - С. 12-18.

19. Мишанькин Б.Н., Шиманюк Н.Я., Рябухина О.Ю. с соавт. Молекулярное клонирование генов нейраминидазы Vibrio cholerae El Tor: перспективы использования // Вестник Всес. Микробиол. Общества (Ростовское отд.). 1989. -№1. -С.149-156.

20. Монахова Е.В. Факторы патогенности нехолерогенных штаммов Vibrio cholerae: Автореф. дис.доктора биол. наук Саратов, 2012 -48 с.

21. Монахова Е.В., Божко Н.В. Изучение экспрессии контакт-зависимых систем секреции холерными вибрионами на модели Dictyostelium dis-coideum II Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2010. - № 4. - С.89-92.

22. Монахова Е.В., Михась Н.К., Писанов Р.В. с соавт. Характеристика дополнительных диареегенных и цитотоксических факторов, продуцируемых холерными вибрионами // Пробл. особо опасных инф. 2004. -Вып. 1(87).- С.51-54.

23. Монахова Е.В., Писанов Р.В. Токсины холерных вибрионов// Мол. ге-нет., микробиол. и вирусол- 20056. -№1. С.7-18.

24. Монахова Е.В., Писанов Р.В., Гончарова JI.A. с соавт. Клонирование и экспрессия гена гемагглютинин/протеазы QiapA) Vibrio cholerae в Escherichia coli II Биотехнология 2006. - №6. - C.8-15.

25. МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры».

26. Москвитина Э.А., А.Б. Мазрухо, Адаменко О.Л. с соавт. Холера в начале XXIi века// Пробл. особо опасных инф 2012 - Вып. 1 (111). -С.11-16.

27. МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

28. Мухамедов СМ, Инжеватова MB, Середин ВГ, Иногамова ИА. Вспышка холеры (Эль-тор) в Самаркандской области Узбекистана в1990 г. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол 1992. - №9-10.-С. 34-37.

29. Онищенко Г.Г., Ганин И.С., Голубинский Е.П. Вибрионы не01 серологической группы и их значение в патологии человека. М.: ГОУ ВУНМЦМЗРФ, 2001.-384с.

30. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Покровский В.И. с соавт. Актуальные проблемы холеры // Под редакцией Покровского В.И. М., 2000: 62-126.

31. Осин A.B. Фенотипический и генетический анализ вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae 0139: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2002. - 22с.

32. Осин A.B., Ерошенко Г.А., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. Сравнительный ПЦР-анализ структуры генома вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae серогруппы 0139 // Пробл. особо опасных инф. 2003. - Вып.85. - С.97-103.

33. Осин A.B., Краснов Я.М. Гусева Н.П., Смиронова Н.И. Разработка алгоритма MLST -типирования пандемических и препандемичесеких штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор // Пробл. особо опасных инф.-2011. -Вып.107 (1). С.58-61.

34. Парамонов И.В., Вахнов Е.Ю., Воробьев A.A. Обнаружение и идентификация холерных вибрионов с использованием полимеразной цепной реакции // Проблемы особо опасн. инф. Саратов, 1999. - № 79. - С. 95102.

35. Писанов Р.В., Монахова Е.В., Шалу O.A. Точковая мутация в гене cef (СНО cell elongating factor) Vibrio cholerae 0139 приводит к изменению субстратной специфичности его продукта // Генетика. 2012. - Т.48. -№2. - С.275-279.

36. Савельев В.Н. Сравнительное изучение клинических проявлений эпидемической и неэпидемической холеры // Холера. Материалы VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «ХОЛЕРА». -Ростов-на-Дону, 2003. С. 244-245.

37. Савельев В.Н., Винокурова С.И., Дорошенко И.Г. с соавт. Эпидемическая и неэпидемическая формы холеры Эль-Тор: этиология, клиника, эпидемиология // Эпидемиолог, и инфек. болезни. 2009. - №5. - С.13-15.

38. Смирнова Н.И., Горяев A.A., Заднова С.П. с соавт. Генетическая характеристика клинических штаммов Vibrio cholerae, завезенных на территорию Российской Федерации в современный период // Журнал мик-робиол., эпид. и иммунобиол. 2011. - №3- С.3-10.

39. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Шашкова A.B., Кутырев В.В. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio cholerae биовара эль-тор, изолированных на территории России в современный период // Мол. генетика. 2011. - №3. - С.11-18.

40. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Сравнительный анализ молекулярно-генетических особенностей геномов и их эволюционных преобразований у возбудителей холеры, чумы и сибирской язвы // Молекул.генет, микробиол. и вирусол. 2005 - ТЗ. - С.9-19.

41. Урбанович JI. Я. С соавт. Роль и значение поверхностных водоемов в становлении и развитии VII пандемии холеры // Эпидемиология и инф. болезни.- 1995.-№2.-С. 101-108.

42. Ушакова И.Е. Гемолитическая активность холерных вибрионов: клонирование и экспрессия гена гемолизина: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1993. - 22с.

43. Челдышова Н.Б. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae Ol с различной эпидемической значимостью на основании четырех генов вирулентности: ctxA, tcpA, toxR и hapA: Автореф. дис. . канд. биол. наук. -Саратов, 2002. 24с.

44. Шиманюк Н.Я., Дуванова О.В., Сучков И.Ю., Мишанькин Б.Н. Нейра-минидаза Vibrio cholerae 0139 «Бенгал»: обнаружение, очистка и некоторые свойства // Биотехнология. 1999. - №3. - С.56-62.

45. Щуркина И.И., Адамов А.К. Серологическая идентификация патогенных НАГ-вибрионов // Пробл. особо опасн. инф. 1973. - №5. - С.89.

46. Щуркина И.И., Адамов А.К. Серотипирование НАГ-вибрионов группы Саказаки, выделенных в разных странах // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1974. Вып.З. - С.76-78.

47. Alam A., Miller K.A., Chaand M. et al. Identification of Vibrio cholerae type III secretion system effector proteins I I Infect. Immun. 2011. - Vol.79, No.4. - P. 1728-1740.

48. Albert MJ. Personal reflections on the discovery of Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal: a tribute to team work and international collaboration // J. Diarrhoeal. Dis. Res. 1993. - Vol.11, No.4. - P.207-210.

49. Aldova E., Laznickova K., Stepankova E., Leitava J. Isolation of nonagglu-tinable vibrios from an enteritis outbreak in Czechoslovakia // J Infect Dis. -1968. Vol. 118. - P.25-31.

50. Anderson A.M., Varkey J.B., Petti C.A. et al. Non-Ol Vibrio cholerae septicemia: case report, discussion of literature, and relevance to bioterrorism // Diagn. Microbiol, Infect. Dis. 2004. - Vol.49. - P. 295-297.

51. Arita M., Takeda T., Honda T. et al. Purification and characterization of Vibrio cholerae non-Ol heat-stable enterotoxin // Infect. Immun. 1986. -Vol.52, No.l. -P.45-49.

52. Attridge S.R., Manning P.A., Holmgren J., Jonson G. Relative significance of mannose-sensitive hemagglutinin and toxin-coregulated pili in colonization of infant mice by Vibrio cholerae El Tor // Infect. Immun. 1996. -Vol.64, No.8. - P.3369-3373.

53. Bakhshi B., Mohammadi-Barzelighi H., Sharifhia A. Presence of CTX gene cluster in environmental non-01/0139 Vibrio cholerae and its potential clinical significance // Indian. J. Med. Microbiol. 2012. - Vol.30, No.3. -P.285-289.

54. Bag P.K., Bhowmik P., Hajra T.K. et al. Putative virulence traits and pathogenicity of Vibrio cholerae non-Ol, non-Ol39 isolates from surface waters in Kolkata, India // Appl. Environ. Microbiol. 2008. - Vol.74, No. 18. -P.5635-5644.

55. Begum K., Ahsan C.R., Ansaruzzaman M. et al. Toxin(s), other than cholera toxin, produced by environmental nonOl, non0139 Vibrio cholerae II Cell Mol. Immunol. 2006. - Vol.3, No.2. - P.l 15-121.

56. Beltran P., Delgado G., Navarro A. et al. Genetic diversity and population structure of Vibrio cholerae II J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37, No.3. -P. 581-590.

57. Bertran P., Delgado G., Navarro A. et al. Genetic diversity and population structure of Vibrio cholera II J. Clin. Microbiol. -1999. V.37. - P.581-590.

58. Bhattacharyya S., Gosh S., Shant J. et al. Effect of WO-7 toxin on gut physiological response in mice // Micro.Pethogen. 2004a. - Vol. 37, No.l. -P. 1-9.

59. Bhattacharyya S., Gosh S., Shant J. et al. Role of the W07-toxin on Vibrio cholerae-induced diarrhoea // Biochim. Biophys. Acta. 2004b. - Vol.1670. -P.69-80.

60. Bhuiyan N.A., Nusrin S, Ansaruzzaman M. Genetic characterization of Vibrio cholerae 01 strains isolated in Zambia during 1996-2004 possessing the unique VSP-II region of El Tor variant // Epidemiol. Infect. 2012. - V.140, No.3. -P.510-518.

61. Boardman B.K., Meehan B.M., Fullner Satchell K.J. Growth phase regulation of Vibrio cholerae RTX toxin export // J. Bacteriol. 2007. - Vol.189, No.5-P. 1827-1835.

62. Booth B.A., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. Vibrio cholerae soluble hemagglutinin/protease is a metalloenzyme // Infect. Immun. 1983. -Vol.42., No.2-P. 639-644.

63. Boyd E.F., Heilpern A.J., Waldor M.K. Molecular analyses of a putative CTXphi precursor and evidence for independent acquisition of distinct CTX(phi)s by toxigenic Vibrio cholera II J. Bacteriol. 2000. - V.182, No.19. -P.5530-5538.

64. Boyd E.F., Waldor M.K. Evolutionary and functional analyses of variants of the toxin-coregulated pilus protein TcpA from toxigenic Vibrio cholerae non-Ol/non-0139 serogroup isolates // Microbiology. 2002. - Vol.149. -P.1655-1666.

65. Cariri F.A., Costa A.P., Melo C.C. et al. Characterization of potentially virulent non-Ol/non-Ol 39 Vibrio cholerae strains isolated from human patients II Clin. Microniol. Infect. 2012. - Vol.16, No.l. - P.62-67.

66. Chakraborty S., Mukhopadhyay A.K., Bhadra R.K. et al. Virulence genes in environmental strains of Vibrio cholera II Appl. Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66, No.9. - P. 4022-4028.

67. Chen Y., Johnson J.A., Pusch G.D. et al. The genome of non-Ol Vibrio cholerae NRT36S demonstrates the presence of pathogenic mechanisms that are distinct from Ol Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2007. - Vol.75, No.5. - P. 2645-2647.

68. Chiavelli D.A., Marsh J.W., Taylor R.K. The mannose-sensitive hemagglutinin of Vibrio cholerae promotes adherence to zooplankton // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - Vol. 67, No.7. - P. 3220-3225.

69. Chow K.H., Ng T.K., Yuen K.Y. et al. Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholerae by PCR 11 J. Clin. Microbiol. 2001. - V.39, No.7. - P.2594-2597.

70. Cinar H.N., Datta A.R., Tall B.D. et al. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay and intestinal vacuolation in Caeno-rhabditis elegans // PLoS. 2010. - Vol.10. - P. 1371.

71. Coelho A., Andrade J.R.C., Vicente A.C.P. et al. Cytotoxic cell vacuolating activity from Vibrio cholerae hemolysin // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, No.3.-P. 1700-1705.

72. Cordero C.L., Sozhamannan S., Fullner Satchell K.J. RTX toxin actin cross-linking activity in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae II J. Clin. Microbiol. 2007. - Vol.45, No.7. - P.2289-2292.

73. Craig J.P. Preparation of the vascular permeability factor of Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 1966. - Vol.92, No.3. - P.793-795.

74. Crumb J.A., Bopp C.A., Greene K.D. et al. Toxigenic Vibrio cholerae serogroup Ol41-associated cholera-like diarrhea and bloodstream infection in the United States // J.Infect.Dis. 2003. - V.187. - P.866-868.

75. Dalsgaard A., Albert M. J., Taylor D. N. et al. Characterization of Vibrio cholerae non-Ol serogroups obtained from an outbreak of diarrhea in Lima, Peru // J. Clin. Microbiol. 1995a. - Vol. 33, No.10. - P.2715-2722.

76. Davis B.M., Moyer K.E., Boyd E.F., Waldor M.K. CTX profages in classical biotype Vibrio cholerae: functional phage genes but disfunctional phage genome // J. Bacteriol. 2000. - Vol.182, No.24. - P.6992-6998.

77. Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental cholera in infant rabbits: a method for chemotherapeutic investigation // Brit. J. Pharmacol. 1955. - Vol.5, No.2.-P. 153-159.

78. Dziejman M., Serruto D., Tam V.C. et al. Genomic characterization of non-Ol, non-0139 Vibrio cholerae reveals genes for a type III secretion system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - Vol.102, No.9. - P.3465-3470.

79. Dziejman M., Balon M., Boyd D. et al. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with endemic and pandemic disease // Proc. Natl. Acad.Sci. 2002. - Vol.99. - P. 1556-1561.

80. Falbo V., Carattoli A., Tossini F. et al. Antibiotic resistance conferred by a conjugative plasmid and a class I integron in Vibrio cholerae 01 El Tor strains isolated in Albania and Italy // Antimicrob. Agents Chemother. -1999.-Vol.43.-P.693-696.

81. Faruque S.M., Albert M.J., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics and ecology of toxigenic Vibrio cholerae II Microbiol. Mol. Biol. Rew. 1998. -Vol.62, No.4. -P.1301-1314.

82. Faruque S.M., Asadulghani, Kamruzzaman M. et al. RSI element of Vibrio cholerae can propagate horizontally as a filamentous phage exploiting themorphogenesis genes of CTX(j) // Infect. Immun. 2002. - Vol.70, No.l. -P.163-170.

83. Faruque S.M., Mekalanos J.J. Pathogenicity islands and phages in Vibrio cholerae evolution // Trends Microbiol. 2003. - Vol.11. - P.505-510.

84. Faruque S.M., Nair G.B. Vibrio cholerae'. Genomics and Molecular Bilogy. Caister Academic Press. 2008. ISBN978-1-904455-33-2.

85. Faruque S.M., Tam V.C., Chowdhury N. et al. Genomic analysis of the Mozambique strain of Vibrio cholerae Ol reveals the origin of El Tor strains carrying classical CTX prophage // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. -Vol. 104.-P. 5151-156.

86. Fasano A. Regulation of intercellular tight junctions by zonula occludens toxin and its eucaryotic analogue zonulin // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2001. -No.915. - P.214-222.

87. Fields P.I., Popovic T., Wachsmuth K., Olsvik J. Use of polymerase chain reaction for detection of of toxigenic Vibrio cholerae strains from the Latin American cholera epidemic // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol.30. -P.2118-2121.

88. Finkelstein R.A., Hanne L.F. Purification and characterization of the soluble hemagglutinin (cholera lectin) produced by Vibrio cholerae II In-fect.Immun. 1982. - Vol.36, No.3. - P. 1999-1208.

89. Fullner K.J., Boucher J.C., Hanes G.R. et al. The contribution of accessory toxins of Vibrio cholerae Ol El Tor to the proinflammatory response in a murine pulmonary cholera model I I J. Exp. Med. 2002. - Vol.195, No.l 1. -P.1455-1462.

90. Fullner K.J., Satchell K.J. MARTX, multifunctional autoprocessing re-peats-in-toxin toxins // Infect. Immun. 2007. - Vol.75, No.ll. - P.5079-5084.

91. Garza D.R., Thompson C.C., Loureiro E.C. et al. Genome-wide study of the defective sucrose fermenter strain of Vibrio cholerae from the Latin American cholera epidemic // PLoS. 2012. - Vol.7, No.5. - P.37283.

92. Ghosh A.R., Nandy R.K., Dasgupta S. et al. A search for cholera toxin (CT), toxin corregulated pilus (TCP), the regulatory element ToxR and other virulence factors in non01/non0139 V.cholerae II Microb. Pathog. 1997. -Vol.22, No.4.- P. 199-208.

93. Grim C.J., Choi J., Chun J., Jeon Y.S., Taviani E., Hasan N.A., Haley B., Huq A., Colwell R.R. Occirence of the Vibrio cholerae seventh pandemic VSP-I island and a new variant // OMICS-2010. Vol.14, No.l. - P. 1-7.

94. Hase C.C. Mekalanos J.J. TcpP protein is a positive regulator of virulence gene expression in Vibrio cholera II Proc.Natl.Acad.Sci. 1998. - Vol.95. -P.730-734.

95. Hassan F., Kamruzzaman M., Mekalanos J.J., Faruque S.M Satellite phage TLCcp enables toxigenic conversion by CTX phage through dif site alteration // Nature. 2010. - Vol.467, No.7318. - P.982-985.

96. He H., Cooper J.N., Mishra A., Raskin D.M. Stringent response regulation of biofilm formation in V.cholerae // J.Bacteriol 2012. - Vol.194, No.l 1. - P.2962-2972.

97. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C. et al. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae II Nature. 2000. -No.406. - P.477-483.

98. Honda T., Lertpocasombat K., Hata A. et al. Purification and characterization of a protease produced by Vibrio cholerae non-Ol and comparison with a protease of V.cholerae 01 // Infect. Immun. 1989. - Vol.57, No.9. -P.2799-2803.

99. Hochhut B., Lotfi Y., Mazel D., Faruque S.M., Woodgate R., Waldor M.K. Molecular analysis of antibiotic resistance gene clusters in Vibrio cholerae 0139 and 01 constins 11 Antimicrob. Agents Chemother. 2001. -Vol.45.-P.2991-3000.

100. Hochhut B., Waldor M.K. Site-specific integration of the conjugal Vibrio cholerae SXT element into prfC // Mol. Microbiol. 1999. - Vol.32, No.l. -P.99-110.

101. Isac S.R., Nair G.B., Singh D.V. Purification and characterization of cyto-toxin produced by a clinical isolate of Vibrio cholerae 054 TV113 // Appl. Bochem. Biotechnol. 2012. - V.167, No.4. - P.809-823.

102. Iwanaga M., Toma C., Miazato T. et al. Antibiotic resistance conferred by a class I integron and SXT constin in Vibrio cholerae Ol strains isolated in Laos // Antimicrob. Agents Chemother. 2004. - Vol.48. - P.2364-2369.

103. Jermyn W.S., Boyd E.F. Characterization of a novel Vibrio pathogenicity island (VPI-2) encoding neuraminidase {nanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates // Microbiology. 2002. - Vol. 148. - P. 3681-3693.

104. Kaper J.B., Morris J.G., Levine M.M. Cholera // Clin.Microbiol.Rev. -1995. V.8. - P.48-86.

105. Karaolis D.K.R., Johnson J.A., Bailey C.C. et al. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and endemic strains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol.95. -P.3134-3139.

106. Keasler S.P., Hall R.N. Detecting and biotyping Vibrio cholerae Ol with multiplex polymerase chain reaction // Lancet. 1993. - V. 341. - P. 1661.

107. Kimsey H.H., Waldor M.K. Vibrio cholerae hemagglutinin/protease inactivates CTXphi. II Infect.Immun. 1998. - V.66, No.9. - P.4025-4029.

108. Kirn T.J., Lafferty M.J., Sandoe C.M. et al. Delineation of pilin domains required for bacterial association into microcolonies and intestinal colonization by Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2000. - V.35, No.4. - P.896-910.

109. Kudryashov D.S., Cordero C.L., Reisler E., Satchell K.J. Characterization of the enzymatic activity of the actin cross-linking domain from the Vibrio cholerae MARTXvc toxin // J. Biol. Chem. 2008. - Vol.283, No.l. -P.445-452.

110. Kumar P., Thulaseedharan A., Chowdhury G. et al. Characterization of novel alleles of toxin co-regulated pilus A gene (tcpA) from environmental isolates of Vibrio cholerae II Curr. Microbiol. 2011. - DOI 10.1007/s00284-010-9774-3.

111. Lin W., Fullner K.J., Clayton R. et al. Identification of a Vibrio cholerae RTX toxin gene cluster that is tightly linked to the cholera toxin prophage // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol.96, No.2. - P. 1071-1076.

112. Ma A.T., Mekalanos J.J. In vivo actin cross-linking induced by Vibrio cholerae type VI secretion system is associated with intestinal inflammation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. - Vol.107, No.9. - P.4365-4370.

113. Maclntyre D.L., Miyata S.T., Kitaoka M. et al. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. - Vol.107, No.45. - P. 19520-19524.

114. Marsh J.W., Taylor R.K. Genetic and transcriptional analysis of the Vibrio cholerae mannose-sensitive hemagglutinin type 4 pilus gene cluster // J. Bacteriol. 1999. - Vol.181, No.4. - P. 1110-1117.

115. Matson J.S., Withey J.H., DiRita V.J. Regulatory networks controlling Vibrio cholerae virulence gene expression 11 Infec.Immun. 2007. - Vol. 75. -P.5542-5549.

116. Mekalanos J.J. Duplication and amplification of toxin genes in Vibrio cholerae II Cell. 1983. - V.35. - P.253-263.

117. McCardell B.A., Sathyamoorthy V., Michalski J. et al. Cloning, expressionand characterization of the CHO cell elongating factor (Cef) from Vibrio cholerae 01 // Microb. Pathog. 2002. - Vol.32, No.4. - P. 165-172.

118. Mitra R.K., Nandy R.K., Ramamurthy T., Bhattacharya SK et al. Molecular characterisation of rough variants of Vibrio cholerae isolated from hospitalised patients with diarrhoea // J Med Microbiol. 2001. - V.50, No.3. P.268-276.

119. Mitra R., Saha P.K., Basu I. et al. Characterization of non-membrane-damaging cytotoxin of non-toxigenic Vibrio cholerae Ol and its relevance to disease // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - Vol.169, No.2. - P.331-333.

120. Mohapatra H., Mohapatra S.S., Mantry S.K. et al. Vibrio cholerae non-01/non-0139 isolated before 1992 from Varanasi, India, are multiple drug resistant, contain intSXT, dfr 18 and aadA5 genes // Environm. Microbiol. -2008. V. 10, No.4. - P.866-873.

121. Morris J.G. Jr. Cholera and other types of vibriosis: a story of human pandemics and oysters on the half shell // Clin. Infect. Dis. 2003. - V.37-P.272-280.

122. Morris J.G., Takeda T., Tall B.D. et al. Experimental non-Olgroup 1 Vibrio cholerae gastroenteritis in humans // J. Clin. Invest. 1990. - Vol.85, No.3. -P.697-705.

123. Mukhopadhyay A. K., Chakaraborty S., Takeda Y. et al. Characterization of VPI pathogenicity island and CTXq> prophage in environmental strains of Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183. - P.4737^746.

124. Murphy R.A., Boyd E.F. Three pathogenicity islands of Vibrio cholerae can excise from the chromosome and form circular intermediates // J. Bacteriol. 2008. - V. 190, No.2. - P.636-647.

125. Nandi B., Nandy R.K., Vicente A. C., Ghose A.C. Molecular characterization of a new variant of toxin-coregulated pilus protein (TcpA) in a toxigenic non-01/non-0139 strain of Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2000. -Vol.68. -P.948-952.

126. Na-Ubol M., Srimanote P., Chongsa-nguan M et al. Hybrid and El Tor variant biotypes of Vibrio cholerae Ol in Thailand // Ind. J. Med. res. -2011.-V.133 (4). -P.387-394.

127. Nitshibuchi M., Kaper J.B. Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus: a virulence gene acquired by a marine bacterium // Infect. Immun. 1995. - Vol.63. - P.2093-2099.

128. Novais R.C., Coelho A., Salles C.A., Vicente A.C.P. Toxin-co-regulated pilus cluster in non-Ol, non-toxigenic Vibrio cholerae: evidence of a third allele of pilin gene II FEMS Microbiol. Lett. 1999. - Vol.171. - P.49-55.

129. O'Brien A.D., Chen M.E., Holmes R.K. et al. Environmental and human isolates of Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus produce a Shigella dysenteriae 1 (Shiga)-like cytotoxin // Lancet. 1984. - Vol.1, No.8368. -P.77-78.

130. Ogawa A, Kato J.I., Watanabe H. et al. Cloning and nucleotide sequence of a heat-stable enterotoxin gene from Vibrio cholerae non-Ol isolated from patients with traveller's diarrhea // Infect. Immun. 1990. - Vol.58, No.10. -P.3325-3329.

131. Ottaviani D., Leoni F., Rocchegiani E. et al. Prevalence and virulence properties of Vibrio cholerae non-Ol non-139 strains isolated from seafood and clinical samples in Italy // J. Clin Microbiol 2011- V.49, No.2. -P.757-759.

132. Park K.S., Ono T., RokudaM. et al. Functional characterization of two type III secretion systems of Vibrio parahaemolyticus // Infect. Immune. -2004. V.72, No. 11. - P.6659-6665.

133. Pascual J., Macian M. K., Arachal D.R., Garay E., Pujalte M.J/ Multilocus sequence analysis of the central clade of the genus Vibrio by the 16S rRNA, recA, pyrh, rpoD, gyrB, red and toxR genes // Int.J.Syst.Evol.Microbiol. -2010.-V.60.-P. 154-165.

134. Pearson G.D., Woods A., Chiang S.L. et al. CTX genetic element encodes a site-specific recombination system and an intestinal colonization factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V.90, No.8. - P.3750-3754.

135. Pérez Chaparro P.J., McCulloch J.A., Cerdeira L.T. et al. Whole genome sequencing of environmental Vibrio cholerae Ol from 10 nanograms of DNA using short reads // J. Microbiol. Methods. 2011. - V.87, No.2. -P.208-212.

136. Prochazkova R., Shuvalova L.A., Minasov D. et al. Structural and molecular mechanism for autoprocessing of MARTX toxin of Vibrio cholerae atmultiple sites I I J. Biol.Chem. 2009. - Vol.284, No.39. - P. 26557-26568.

137. Pukatzki S., Ma A.T., Revel A.T. Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. - Vol.104, No.39. - P.15508-15513.

138. Pukatzki S., Ma A.T., Sturtevant D. et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. - Vol.103, No.5. -P.1528-1533.

139. Ramachandran D., Bhanumathi R., Singh D.V. Multiple PCR for detection of antibiotic resistance genes and the SXT element; application in the characterization of Vibrio cholera II J. Med. Microbiol. 2007. - V.56. -P.346-351.

140. Rudra S., Mahajan R., Mathur M.et al. Cluster of cases of clinical cholera due to Vibrio cholerae 010 in east Delhi I I Indian J. Med. Res 1996. - Vol. 103. -P.71-73.

141. Safa A., Suitana J., Dac Cam P., Mwansa J.A., Kong R.Y. Vibrio cholerae Ol hybrid El Tor strains, Asia and Africa // Emerg.Infect.Dis. 2008. -V.14. -P.1987-1988.

142. Saha P.K., Koley H., Nair G.B. Purification and characterization of an extracellular secretogenic non-membrane-damaging cytotoxin produced by clinical strains of Vibrio cholerae non-Ol // Infect. Immun. 1996. -Vol.64,No.8.-P.3101-3108.

143. Sahu S.N., Lewis J., Patel I. et al. Genomic analysis of immune response against Vibrio cholerae hemolysin in Caenorhabditis elegans // PLoS One. -2012. V.7, No.5. - P.38200.

144. Sakazaki R., Tamura K., Gomes S.Z., Sen R. Serological studies on the cholera group of vibrios // Jap. J. Med. Sci.Biol. 1970. - V.23, No.l. -P. 13-20.

145. Salles C.A., Momen H., Vicente A.C. et al. Vibrio cholerae in South America: polymerase chain reaction and zymovar analysis // Trans R Soc Trop Med Hyg. -1993. -V.87, No.3. P. 272.

146. Sanyal S.C., Alam K., Neogi P.K.B. et al. A new cholera toxin // Lancet. -1983.-No.8337.-P.1337.

147. Sarkar B., Bhattacharya T., Ramamurty T. et al. Preferntial association of heat-stable enterotoxin gene (stn) with environmental strains of Vibrio cholerae belonging to the OMserogroup // Epidemiol. Infect. 2002. - V.129. -P.245-251.

148. Sarkar A., Nandy R.K., Nair G.B.et al. Vibrio pathogenicity island and cholera toxin genetic element-associated virulence genes and their expression in non-Ol non-0139 strains of Vibrio cholerae II Infect. Immun. -2002. V.70, No.8. - P.4735-4742.

149. Sawabe T., Kita-Tsukamoto K., Thompson F.I. Inferring the evolutionary history of vibrios by means of multilocus sequence analysis // J.Bactertiol. -2007. V.189. - P.7932-7936.

150. Sharma C., Thungapathra M., Ghosh A. et al. Molecular analysis of non-Ol, non 0139 Vibrio cholerae associated with an unusual upsurge in the incidence of cholera-like disease in Calcutta, India // J. Clin. Microbiol. -1998. Vol.36, No.3. - P.756-763.

151. Sheahan K.L., Satchell K.J, Inactivation of small Rho GTPases by the multifunctional RTX toxin from Vibrio cholera II Cell. Microbiol. 2007. -V.9, No.5. - P.1324-1335.

152. Shin O.K., Tarn V.C., Suzuki M. et al. Type III secretion is essential for the rapidly fatal diarrheal disease caused by non-Ol, non-0139 Vibrio chol-erae // mBio. 2011. - Vol. 2, No.3. - eOO 106-11.

153. Silva A J., Leitch G.G., Camilli A., Benitez J. A. Contribution of hemag-glutinin/protease and motility to the pathogenesis of El Tor biotype cholera // Infect. Immun. 2006. - Vol.74, No.4. - P.2072-2079.

154. Singh D.V., Matte M.H., Matte G.R. et al. Molecular analysis of Vibrio cholerae 01, 0139, non-Ol, and non-0139 strains: clonal relationships between clinical and environmental isolates // Appl. Environ. Microbiol. -2001. Vol.67, No.2. - P. 910-921.

155. Sozhamannan S., Deng Y.K., Li M. et al. Cloning and sequencing of the genes downstream of the wbf gene cluster of Vibrio cholerae serogroup 139 and analysis of the junction genes in other serogroups // Infect. Immun. -1999. Vol 67. - P.5033-5040.

156. Stroeher U.N., Jedrani k.E., Manning P.A. Genetic organization of the region associated with surface polysaccharide synthesis in Vibrio cholerae Ol, 0139, and Vibrio anguillarum Ol and 02: a review // Gene. -1998. -V.223.

157. Tacket C.O., Taylor R.K., Losonsky G. et al. Investigation of the roles of toxin-coregulated pili and mannose-sensitive hemagglutinin pili in the pathogenesis of Vibrio cholerae 0139 infection // Infect. Immun. 1998. -Vol.66, No2. - P.692-695.

158. Taylor R.K., Miller V.L, Furlong D.B. et al. Use of phoA gene fusion toidentify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V. 84. - P. 2833-2837.

159. Taviani E., Grim C.J., Choi J. et al. Discovery of novel Vibrio cholerae VSP-II genomic islands using comparative genomic analysis // FEMS microbial. Lett. 2010. - V.308, No.2. - P.130-137.

160. Tobin-D'Angelo M., Smith A.R., Bulens S.N. et al. Severe diarrhea caused by cholera toxin-producing Vibrio cholerae serogroup 075 infections acquired in the Southeastearn United states. 2008. - V.47. - P. 1035-1040.

161. Toma C, Kuroki H, Nakasone N, Ehara M & Iwanaga M. Minor pilin sub-units are conserved in Vibrio cholerae type IV // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2002. - V.33. - P.35-40.

162. Trucksis M., Galen J.E., Michalski J. et al. Accessory cholera enterotoxin (Ace), the third toxin of a Vibrio cholerae virulence cassette // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol.90, No.l 1. - P.5267-5271.

163. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin // Science. 1996. - Vol.272, No.5269. -P.1910-1914.

164. Waldor M.K., Rubon E.J., Pearson G.D. et al. Regulation, replication, and integration functions of the Vibrio cholerae СТХф are encoded by region RS2 // MolMicrobiol. 1997. - V.272. - P.1910-1924.

165. Wu Z., Nybon A., Magnusson K.E. Distinct effects of Vibrio cholerae he-magglutinin/protease on the structure and localization of the tight junction-associated proteins occludin and ZO-l // Cell Microbiol. 2000. - Vol.2, No.l.-P.11-17.

166. Zhang R., Scott D., Westbrook M. et al. The three-dimensional crystal structure of cholera toxin. J. Mol. Biol.-1995. V.251, No.4. - P. 563-573.

167. Zheng J., Shin O.S., Cameron D.E. et al. Quorum sensing and a global regulator TsrA control expression of type VI secretion and virulence in Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. - Vol.107, No.49. -P.21128-21133.

168. Zinnaka Y., Carpenter C.C. An enterotoxin produced by non-cholerae vibrios // John Hopkins Med.J. 1972. - V. 131. - P.403-411.