Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO для экспрессии генетической информации в организме млекопитающих и птиц тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Логунов, Денис Юрьевич

• Логунов, Денис Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Логунов, Денис Юрьевич

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурно-функциональная характеристика аденовируса

CELO.

1.1.1. Общая характеристика аденовируса CELO.

1.1.2. Структурно-функциональная организация генома аденовируса

CELO.

1.1.3. Структурные особенности вируса CELO.

1.2. Эукариотические векторы на основе генома аденовируса птиц CELO.

1.3. Опухолевый супрессор р53.

1.3.1 Структурно-функциональная характеристика р53.

1.3.2. Биологическая роль гена р53.

1.3.3. Активация белка р53.

1.3.4. Мишени белка р53.

1.3.5. Применение р53 в генной терапии.

1.4. Аденовирусные векторы, экспрессирующие ген опухолевого супрессора человека р53.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы.

2.1.2. Клеточные линии.

2.1.3. Плазмидные векторы.

2.1.4. Ферменты и другие реактивы.

2.1.5. Животные.

2.2. Методы.

2.2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.2.2. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК.

2.2.3. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазам.

2.2.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.

2.2.5. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля.

2.2.6. Лигирование фрагментов ДНК.

2.2.7. Трансформация клеток Е. coli.

2.2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.2.9. Полимеразная цепная реакция.

2.2.10. Синтез дезоксиолигонуклеотидов.

2.2.11. Трансфекция клеток линии 293 или LMH для получения рекомбинантных аденовирусов.

2.2.12. Накопление вирусов.

2.2.13. Очистка и концентрирование аденовирусов.

2.2.14. Титрование вирусов.

2.2.15. Выделение вирионной ДНК.

2.2.16. Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом.

2.2.17. Определение авктивности секретируемой щелочной фосфатазы.

2.2.18. Определение экспрессии /?-галактозидазы in vitro и в подкожных трансплантатах опухолей.

2.2.19. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН (PAGE - SDS)

2.2.20. Иммуноблотинг (WESTERN BLOT IMMUNOASSAY)

2.2.21. Иммуноферментный анализ (ELISA)

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Конструирование рекомбинантных аденовирусов на основе генома CELO и генома аденовируса человека 5 серотипа.

3.2. Трансдукция клеточных культур.

3.2.1. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы in ovo.

3.3. Исследование векторной системы CELO in vivo.

3.3.1. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы в пермиссивной модели.

3.3.2. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы в непермиссивных моделях.

3.4. Исследование векторной системы CELO, как геннотерапевтического агента.

3.4.1. Исследование влияния гуморального иммунного ответа на уровень экспрессии целевых трансгенов при внутриопухолевых инъекциях вируса CELO.

3.4.2. Детекция экспрессии гена р53 в составе генома вектора

CELO in vitro.

3.4.3. Экспрессия гена р53 в составе генома вектора CELO in vivo.

3.4.4. Ингибирование роста подкожных трансплантатах опухолей вирусом CELO-p53.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO для экспрессии генетической информации в организме млекопитающих и птиц»

1. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Аденовирусы, наряду с другими ДНК-содержащими вирусами, представляют собой широко используемую модель в молекулярно-биологических, биомедицинских и ветеринарных исследованиях. Это обусловлено рядом особенностей их структуры и цикла развития.

Экспрессию аденовирусных генов осуществляет ферментативный аппарат клетки-хозяина, что позволило эффективно использовать аденовирусы для изучения фундаментальных механизмов транскрипции и трансляции.

На поздних стадиях инфекции происходит селективный синтез вирусных белков, в то время как трансляция мРНК клетки-хозяина блокируется. Это делает аденовирус идеальной моделью для экспрессии чужеродных генов, встроенных в вирусный геном. С другой стороны, трансформирующие, а в ряде случаев, онкогенные потенции аденовирусов, обусловленные активностью ранних вирусных генов, позволяют использовать их в качестве ценного инструмента для изучения путей молекулярных взаимодействий продуктов ранних вирусных генов с регуляторными элементами клеточного цикла.

Накоплены обширные знания о возможностях применения аденовирусов человека в качестве векторов для лечения заболеваний человека и животных. Масштабные научные исследования и наличие значительного количества точек практического приложения аденовирусных векторов обусловлены целым рядом их биологических свойств. Широкая тропность, высокая пакующая емкость и способность расти в высоком титре определили преимущество аденовирусов над большинством других вирусных векторов.

Значительное распространение получили аденовирусные векторы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа (Ад5). Наряду с неоспоримыми преимуществами этих векторов существует ряд недостатков, среди которых значимыми являются их иммуногенность и наличие у большинства людей предсуществующего иммунного ответа.

Активация иммунной системы на введение вирусного вектора существенно ограничивает время экспрессии целевых генов в организме человека, что в свою очередь отрицательно влияет на эффективность генной терапии. В связи с этим, многих исследователей привлекают возможности создания векторов на основе аденовирусов животных и птиц.

Новой и перспективной представляется векторная система на основе аденовируса птиц 1 серотипа (CELO). Вирус неспособен реплицироваться в клетках млекопитающих, обладает повышенной пакующей емкостью и большей физической стабильностью по сравнению с Ад5. Иммунная система человека несенсибилизирована к вирусу, что позволяет предположить эффективное применение векторов на основе CELO (отдельно или последовательно с Ад5) для увеличения периода экспрессии целевых генов в организме человека.

Важным достоинством CELO является его способность к высокопродуктивной инфекции в куриных эмбрионах. Это делает процесс накопления вируса технологичным и экономически привлекательным.

Структурно-функциональная организация элементов капсида (пентонов) CELO позволяет их направленную модификацию для повышения тропности вируса по отношению к определенным типам клеток, что может быть значимо для практического применения вектора.

В настоящее время опубликовано незначительное количество работ, посвященных изучению биологии вируса CELO, и практически отсутствуют экспериментальные данные характеризующие "поведение" рекомбинантных вирусов in vivo. В связи с чем, исследование основных характеристик (иммуногенности, эффективности доставки целевых генов, времени экспрессии и др.) векторной системы CELO в различных организмах представляет самостоятельный научный интерес.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы являлось изучение векторной системы на основе аденовируса птиц CELO в различных животных моделях, с использованием генов SEAP и р53.

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:

1.Получение рекомбинантных аденовирусов, несущих ген SEAP или р53 под контролем CMV-промотора в сайте делеции несущественной области генома CELO.

2. Получение рекомбинантных аденовирусов, несущих ген SEAP или р53 под контролем CMV-промотора в месте делеции фрагмента El области аденовируса человека 5 серотипа.

3. Сравнение эффективности векторных систем на основе Ад5 и CELO путем трансдукции различных культур клеток.

4 . Изучение кинетики накопления трансгенов на модельном примере SEAP в аллонтоисе куриного эмбриона, в зависимости от количества инокулированных частиц вируса CELO-SEAP.

5. Изучение экспрессии целевых генов, встроенных в геном вируса CELO, в организме пермиссивных и непермиссивных животных.

6. Определение функциональной активности гена р53, встроенного в геном CELO in vitro и in vivo.

7. Изучение возможности ингибирования опухолевого роста вектором CELO, экспрессирующим ген опухолевого супрессора р53.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

В результате проведенной работы впервые получены рекомбинантные векторы CELO-SEAP и CELO-p53. Путем трансдукции различных клеточных культур определена эффективность вектора CELO-SEAP, в сравнении с аналогичным вектором на основе Ад5.

Впервые была изучена кинетика накопления трансгенов, встроенных в геном CELO, в аллонтоисе куриных эмбрионов.

Впервые показана принципиальная возможность детекции экспрессии трансгена (SEAP), встроенного в геном CELO, в сыворотке крови животных, при различных путях введения вектора CELO-SEAP.

Определено время персистенции экспрессии трансгена (SEAP) при многократных внутриопухолевых инъекциях CELO-SEAP, и влияние на уровень экспрессии трансгена гуморального иммунного ответа.

В ходе работы была показана экспрессия и функциональная активность гена р53, встроенного в геном CELO, в различных линиях опухолевых клеток.

Впервые показано ингибирование роста опухолей вектором CELO-p53.

Результаты работы могут быть использованы в лабораторной практике для решения проблем доставки генетической информации в клетки млекопитающих и птиц.

Работа представляет не только научный интерес, но и в перспективе может иметь практическое приложение. Векторы на основе CELO могут быть использованы для создания средств профилактики различных заболеваний, и в качестве терапевтических агентов для коррекции повреждений в геноме эукариотических клеток.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Логунов, Денис Юрьевич

ВЫВОДЫ

1) Впервые получены рекомбинантные аденовирусы CELO, содержащие под контролем ЦМВ-промотора гены SEAP и р53. In vitro в клетках линий HCT116/wafIConA, H1299/wafIConA, A431/wafIConA, HeLa/waflConA, LMH, A54 9 и др. показана эффективная экспрессия генов SEÄP и р53 в составе вирусных геномов. Изучена кинетика накопления продуктов экспрессии целевых генов в культуральной среде.

2) Впервые показана экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы (SEAP) в сыворотке крови животных (мышей, крыс, кур) после различных видов инъекций (внутриопухолевой, внутривенной, внутримышечной, интраназальной) рекомбинантного вируса CELO-SEAP. Впервые определен период экспрессии целевого гена SEAP в организме иммунокомпетентных животных, получавших инъекции рекомбинантного вируса CELO-SEAP. Максимальное время экспрессии SEAP в сыворотке крови составило 21 день.

3) Определена корреляция между временем и уровнем экспрессии целевого гена SEAP (при многократных внутриопухолевых инъекциях вируса CELO-SEAP) и уровнем вирусспецифических антител в сыворотке крови лабораторных животных (мышей линии C57BL/6) . Титр вирусспецифических антител достигал максимального значения (1:3200) к 24 дню. Одновременно детектировали четырехкратное снижение уровня экспрессии целевого гена.

4) Определена кинетика накопления продукта экспрессии целевого гена SEAP in ovo (в аллонтоисной жидкости

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Логунов, Денис Юрьевич, 2002 год

1. Гловер Д. Новое в клонировании ДНК. Методы.// Москва. Мир,1989, с.209-236

2. Григорьев В.П., Хилько С.Н., Тихоненко Т. И. Условия стабильности четвертичной структуры и антигенная активность гексона аденовирусов. // Биохимия. 1985. Т5 0. С. 258-263.

3. Коровин Р.Н, Рождественский И.К. Аденовирусные инфекции птиц. Ленинград. 1990.

4. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Дж. Молекулярное клонирование. М.1984.

5. Патрушев Л.И. Экспрессия генов.// Москва. Наука,1999, с. 353-356.

6. Сюрин В. Н., Белоусова Р. В., Фомина Н. В. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник. М. Агропромиздат. 1991, стр. 159-166.

7. Фомина Н.В. Аденовирусная инфекция животных. М. Колос19 95.

8. Ярилин A.A. Основы иммунологии.// Москва. Медицина,2000, с. 350-362.

9. Abe T, Wakimoto H, Bookstein R, Maneval DC, Chiocca EA, Basilion JP. Intra-arterial delivery of p53-containing adenoviral vector into experimental brain tumors.//Cancer Gene Ther. 2002 Mar; 9 (3):228-35.

10. Agoff SN, Hou J, Linzer DI, Wu B. Regulation of the human hsp70 promoter by p53.// Science. 1993 Jan 1; 259 (5091):84-7.

11. Akhiles K. Nagaich et al. Architectural accomodiation in the complex of four p53 DNA binding domain peptides with the p21/wafl/cipl DNA response element. J. Biol. Chemistry. 1997, v7, p. 14380-14382.

12. Akopian T.A., Doronin K.K., Karpov V.A., Naroditsky B.S./ Sequence of the avian adenovirus FAV-1 (CELO) DNA encoding the hexon-associated protein pVI and hexon. Arch.Virol.1996, vl41, p.11759-65.

13. Akopian T.A., Kaverina E.N., Naroditsky B.S., T. I.Tikhonenko. Nucleotide sequence analysis of the avian adenovirus CELO (FAV-1) DNA fragment (92-100%) Mol. Gen. Microbiol. Virol. 1992, vll, p. 19-23

14. Anderson J., V.J. Yates, et al. The in vitro transformation by an avian adenovirus (CELO). I.Hamster-embryo fibroblastic cultures. J. Natl.Cancer Inst. 1969, v4 2, pl-7.

15. Anderson J., V.J. Yates, et al. The in vitro transformation by an avian adenovirus (CELO). III.Human amnion cell cultures. J. Natl.Cancer Inst. 1969, v4 3, p575-580.

16. Baohong Cao, John R. Mytinger, Johnny Huard. Adenovirus mediated gene transfer to skeletal muscle.// Microscopy Research and Technique. 2002 Jul 58 (1):45-51

17. Benihoud K, Yeh P, Perricaudet M. Adenovirus vectors for gene delivery.// Curr Opin Biotechnol. 1999 Oct; 10 (5) :440-7 .

18. Berger J, Hauber J, Hauber R, Geiger R, Cullen BR Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells.// Gene. 1988 Jun 15; 66 (1):1-10.

19. Bett A. J., L.A. Prevec, and F.L. Graham. Packaging capacity and stability of the human adenovirus type 5 vector. J.Virol. 1983, v67, p 5911-5921.

20. Buttgereit P, Schakowski F, Marten A, Brand K, Renoth S, Ziske C, Schottker B, Ebert 0, Schroers R, Schmidt-Wolf IG. Effects of adenoviral wild-type p53 gene transfer in p53-mutated lymphoma cells.//Cancer Gene Ther. 2001 Jun; 8 (6) :4 30-9 .

21. Caravokuri C., K.N.Leppard. Constitutive episomal expression of a polipeptide pIX in a 293-based cell line complements the defiency of pIX mutant adenovirus type 5. J. Virol. 1995, v69, p 6627-6633.

22. Chin KV, Ueda K, Pastan I, Gottesman MM. Modulation of activity of the promoter of the human MDRl gene by Ras and p53.//Science. 1992 Jan 24;255(5043):459-62.

23. Chiocca S, Kurtev V, Colombo R, Boggio R, Sciurpi MT, Brosch G, Seiser C, Draetta GF, Cotten M. Histone deacetylase 1 inactivation by an adenovirus early gene product.// Curr Biol. 2002 Apr 2; 12 (7) :594-8 .

24. Chiocca S., Adam Baker, Matt Cotten. Identification of a novel antiapoptotic protein, GAM-1, encoded by the CELO adenovirus. Journal of Virology, 1997, v80, p. 3168-3177.

25. Chiocca S., Robert Kurzbauer, Gotthold Schaffner, Adam Baker, Vivien Mautner, Matt Cotten. The complette DNA sequence and genomic organization of the avian adenivirus CELO.

26. Chowdary DR, Dermody JJ, Jha KK, Ozer HL Accumulation of p53 in a mutant cell line defective in the ubiquitin pathway.//Mol Cell Biol. 1994 Mar; 14 (3) :1997-2003.

27. Chumakov P.M. Function of the p53 gene: choice between life and death .//Biochemistry (Mose). 2000 Jan;65(1):28-40. Review.

28. Cirielli C, Riccioni T, Yang C, Pili R, Gloe T, Chang J, Inyaku K, Passaniti A, Capogrossi MC. Adenovirus-mediated gene transfer of wild-type p53results in melanoma cell apoptosis in vitro and in vivo.//Int J Cancer. 1995 Nov 27;63(5):673-9.

29. Clayman GL, Dreiling LK. Injectable modalities as local and regional strategies for head and neck cancer.//Hematol Oncol Clin North Am. 1999 Aug; 13 (4):787-810, Review.

30. Clayman GL, el-Naggar AK, Roth JA, Zhang WW, Goepfert H, Taylor DL, Liu TJ. In vivo molecular therapy with p53 adenovirus for microscopic residual head and neck squamous carcinoma.//Cancer Res. 1995 Jan 1;55(1) :1-6 .

31. Cowen B, Calnek BW, Menendez NA, Ball RF. Avian adenoviruses: effect on egg production, shell quality, and feed consumption. // Avian Dis., 1978, v.- 22(3), pp.- 459-470.

32. Dameron KM et ai. Control of angiogenesis in fibroblast by p53 regulation of trombospondin-1 Science. 1994. v265, p 1582-1584.

33. De Stanchina E, McCurrach ME, Zindy F, Shieh SY, Ferbeyre G, Samuelson AV, Prives C, Roussel MF, Sherr CJ, Lowe SW. E1A signaling to p53 involves the pl9(ARF) tumor suppressor.//Genes Dev. 1998 Aug 1; 12 (15) :24 3 4-4 2.

34. Deichman GJ, Matveeva VA, Kashkina LM, Dyakova NA, Uvarova EN, Nikiforov MA, Gudkov AV. Cell transforming genes and tumor progression: in vivo unified secondary phenotypic cell changes.// Int J Cancer. 1998 Jan 19; 7 5 (2) : 277-83 .

35. Donehower LA, Harvey M, Slagle BL, McArthur MJ, Montgomery CA Jr, Butel JS, Bradley A. Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumours.//Nature. 1992 Mar 19; 356(6366) :215-21.

36. Eastham JA, Grafton W, Martin CM,Williams BJ. Suppression of primary tumor growth and the progression to metastasis with p53 adenovirus in human prostate cancer.J Urol 2000,164(3 Pt 1),814-9.

37. Eizenberg 0, Faber-Elman A, Gottlieb E, Oren M, Rotter V, Schwartz M. p53 plays a regulatory role in differentiation and apoptosis of central nervous system-associated cells.//Mol Cell Biol. 1996 Sep; 16 (9) :5178-85.

38. Francois A, Eterradossi N, Delmas B, Payet V, Langlois P.// Construction of avian adenovirus CELOrecombinants in cosmids. J.Virol. 2001 Jun;75. 11:5288-301. J Virol. 2001. 11:5288-301.

39. Giatromanolaki A. et al. Vascular endothelial growth factor, wild-type p53, and angiogenesis in early operable non-small cell lung cancer. Clinic.Cancer Res. 1998, v4, p. 3017-3024.

40. Glotzer JB, Saltik M, Chiocca S, Michou AI, Moseley P, Cotten M. Activation of heat-shock response by an adenovirus is essential for virus replication. Nature. 2000 Sep 14; 407 (6801) :207-ll.

41. Gottlieb TM, Oren M. p53 in growth control and neoplasia.//

42. Biochim Biophys Acta. 1996 Jun 7;1287(2-3):77-102. Review.

43. Graeber TG, Osmanian C, Jacks T, Housman DE, Koch CJ, Lowe SW, Giaccia AJ. Hypoxia-mediated selection of cells with diminished apoptotic potential in solid tumours.//Nature. 1996 Jan 4; 379 ( 6560) :88-91.

44. Graham F.L. and Prevec L. Manipulation of adenovirus vectors. // Methods in Mol.Biol., 1994, v.-7, pp.-109-127. (Ed.), The Humana Press Inc., Clifton, NJ.

45. Graham F.L. and van der Eb A.,J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.// Virology, 1973, v.- 52, pp.- 456-467.

46. Green M., Wold W.S.M. Human adenoviruses: growth, purification and transfection assay. Metotds Enzymology.,1980, v58, p.425-431.

47. Guenal I, Risler Y, Mignotte B. Down-regulation of actin genes precedes microfilament network disruption and actin cleavage during p53-mediated apoptosis.//J Cell Sci. 1997 Feb;110 ( Pt 4) :489-95.

48. Hamada K, Alemany R, Zhang WW, Hittelman WN, Lotan R, Roth JA, Mitchell MF. Adenovirus-mediated transfer of a wild-type p53 gene and induction of apoptosis in cervical cancer.//Cancer Res. 1996 Jul 1; 56 (13) : 304754 .

49. Hanahan D. Studies of transformation of Escherichia coli with plasmids. // Journal of Molecular Biology, 1983, v.166, pp.- 557-580.

50. Hermeking H, Lengauer C, Polyak K, He TC, Zhang L, Thiagalingam S, Kinzler KW, Vogelstein B. 14-3-3 sigma is a p53-regulated inhibitor of G2/M progression.//Mol Cell. 1997 Dec;1(1):3-11.

51. Hess M et al. The avian adenovirus penton: two fibers and one base. J.Mol.Biol. 1995, v252, p397-385

52. Holmes D., Quigley M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. // Anal. Biochem., 1981, V.-114, p.- 193.

53. Introgen therapeutics News Release (www.introgen.com)

54. Jacks T, Remington L, Williams BO, Schmitt EM, Halachmi S, Bronson RT, Weinberg RA. Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice.//Curr Biol. 1994 Jan 1;4 (1) : 1-7 .

55. Jiang D, Lenardo MJ, Zuniga-Pflucker C. p53 prevents maturation to the CD4+CD8+ stage of thymocyte differentiation in the absence of T cell receptor rearrangement.//J Exp Med. 1996 Apr 1; 183 ( 4):1923-8.

56. Kastan MB, Onyekwere 0, Sidransky D, Vogelstein B, Craig RW. Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage.//Cancer Res. 1991 Dec 1;51(23 Pt 1) :6304-11.

57. Ko LJ, Prives C. p53: puzzle and paradigm.//Genes Dev. 1996 May 1;10(9):1054-72. Review.

58. Komarova EA, Diatchenko L, Rokhlin OW, Hill JE, Wang ZJ, Krivokrysenko VI, Feinstein E, Gudkov AV. Stress-induced secretion of growth inhibitors: a novel tumor suppressor function of p53.//Oncogene. 1998 Sep 3; 17 (9) :1089-96.

59. Komarova EA, Gudkov AV. Suppression of p53: a new approach to overcome side effects of antitumor therapy.//Biochemistry (Mosc). 2000 Jan;65(1):41-8. Review.

60. Kopnin BP. Targets of oncogenes and tumor suppressors: key for understanding basic mechanisms of carcinogenesis.//Biochemistry (Mosc). 2000 Jan;65(1):2-27. Review.

61. Kristen K. Walker and Arnold J. Levine Identification of a novel p53 functional domain that is necessary for efficient growth suppression // PNAS 93: 15335-15340

62. Labow D, Lee S, Ginsberg RJ, Crystal RG, Korst RJ. Adenovirus vector-mediated gene transfer to regional lymph nodes.//Hum Gene Ther. 2000 Mar 20; 11 ( 5) :759-69.

63. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 . // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

64. Lane DP. Cancer. p53, guardian of the genome.// Nature. 1992 Jul 2;358(6381):15-6.

65. Laver WG, Younghusband HB, Wrigley NG. Purification and properties of chick embryo lethal orphan virus (an avian adenovirus). // Virology, 1971, v.- 45(3), pp. -598-614.

66. Legerski R., Robberson D. Analysis and optimization of recombinant DNA joining reactions. // Journal of Molecular Biology, 1985, v.- 181, pp.- 297-312.

67. Lehrmann H., M. Cotten. Characterization of CELO virus protein that modulate the pRB/E2F pathway. J.Virol., 1999, v7 3, p. 6517-6525.

68. Leppard K. . E4 gene function in adenovirus, adenovirus vector and adeno-associated virus infections. J.Gen. Virol. 1997, v78, 2131-2138.

69. Levine AJ, Momand J, Finlay CA. The p53 tumor supressor gene.Nature. 1991, v351, 453-6.

70. Li R, Waga S, Hannon GJ, Beach D, Stillman B. Differential effects by the p21 CDK inhibitor on PCNA-dependent DNA replication and repair.//Nature. 1994 Oct 6; 371(6497) :534-7 .

71. Li Z., A. Rakkar,et al. Efficacy of multiple administration of a recombinant adenovirus expressing wild-type p53 in an immune-competent mouse tumor model. Gene Therapy. 1998, v5, 605-613.

72. Li.P et al. The structural proteins of chick embrio lethal orphan virus (FAV-1). J.Gen.Virol. 1984 , v.65, p. 1803-1815.

73. Liu X, CW Miller, PH Koeffler, and AJ Berk The p53 activation domain binds the TATA box-binding polypeptide in Holo-TFIID, and a neighboring p53 domain inhibits transcription.//Mol. Cell. Biol. 1993 13: 3291-3300.

74. Loser Peter et al. Advances in the development of non-human viral DNA-vectors for gene delivery.// Curr.Gen.Ther, 2001,2,161-171.

75. Lowe SW, Bodis S, McClatchey A, Remington L, Ruley HE, Fisher DE, Housman DE, Jacks T. p53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo.//Science. 1994 Nov 4; 266 (5186) :807-10.

76. Maltzman W, Czyzyk L. UV irradiation stimulates levels of p53 cellular tumor antigen in nontransformed mouse cells.//Mol Cell Biol. 1984 Sep; 4 ( 9) :1689-94.

77. Mancini LO, J. Anderson, V.Jasty, V.J. Yates. Tumor induction in hamster inoculated with an avian adenovirus (CELO). Arch. Gesamte Virusforsch 1970, v3 0, p.261-262.

78. Michou A-I. et al. Mutational analysis of the avian adenovirus CELO, which provides a basis for gene delivery vectors. J. Virol.,1999, v73, p.1399-1410.

79. Miyashita T, Harigai M, Hanada M, Reed JC. Identification of a p53-dependent negative response element in the bcl-2 gene.//Cancer Res. 1994 Jun 15;54 (12) :3131-5 .

80. Miyashita T., et al Tumor supressor p53 is regulator of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in vivo. Oncogene 1994, v.9,12028-32.

81. Murphy M, Hinman A, Levine AJ. Wild-type p53 negatively regulates the expression of a microtubule-associated protein.//Genes Dev. 1996 Dec 1;10 (23) .-2971-80.

82. Nagayama Y, Yokoi H, Takeda K, Hasegawa M, Nishihara E, Namba H, Yamashita S, Niwa M. Adenovirus-mediated tumor suppressor p53 gene therapy for anaplastic thyroid carcinoma in vitro and in vivo.//J Clin Endocrinol Metab. 2000 Nov;85(11):4081-6.

83. Nakane P.K.,Kawaio A.S. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. // J.Histochem.Cytochem. 1974. V. 22. P. 1084-1091.

84. Nishizaki M., T. Fujiwara et al. Recombinant adenovirus expressing wild-type p53 is antiangiogenic: a proposed mechanism for bystander effect. Clinic. Cancer Res., 1999, v5, 1015-1023.

85. Oakley R, Phillips E, Hooper R, Wilson D, Partridge M. A Preclinical Model of Minimal Residual Cancer in the Muscle Highlights Challenges Associated with Adenovirus-mediated p53 Gene Transfer.//Clin Cancer Res. 2002 Jun;8(6):1984-94.

86. Okuda Y, Ono M, Yazawa S, Imai Y, Shibata I, Sato S. Pathogenicity of serotype 1 fowl adenovirus in commercial broiler chickens. // Avian Dis., 2001, v.-45(4), pp.- 819-827.

87. Okuda Y, Ono M, Yazawa S, Shibata I, Sato S. Experimental infection of specific-pathogen-free chickens with serotype-1 fowl adenovirus isolated from a broiler chicken with gizzard erosions. // Avian Dis., 2001, v.- 45(1), pp.- 19-25.

88. Ono M, Okuda Y, Yazawa S, Shibata I, Tanimura N, Kimura K, Haritani M, Mase M, Sato S Epizootic outbreaks of gizzard erosion associated with adenovirus infection in chickens. // Avian Dis., 2001, v.- 45 (1), pp.- 268-275.

89. Parker LP, Wolf JK, Price JE. Adenoviral-mediated gene therapy with Ad5CMVp53 and Ad5CMVp21 in combination with standard therapies in human breast cancer cell lines.//Ann Clin Lab Sci. 2000 Oct;30(4):395-405.

90. Payet V. et al. Transcriptional organization of the avian adenivirus CELO. J. Virol.,1998, p. 9278-9285.

91. Pickles RJ, McCarty D, Matsui H, Hart PJ, Randell SH, Boucher RC. Limited entry of adenovirus vectors into well-differentiated airway epithelium is responsible for inefficient gene transfer.//J Virol. 1998 Jul; 72 (7) :6014-23 .

92. R.N. de Jong, P.C. van der Viet. Mechanism of DNA replication in eucariotic cells: cellular host factors stimulating adenovirus DNA replication. Gene, 236, 1999,1-12. .

93. Ravi R, Mookerjee B, van Hensbergen Y, Bedi GC, Giordano A, El-Deiry WS, Fuchs EJ, Bedi A. p53-mediated repression of nuclear factor-kappaB RelA via the transcriptional integrator p300.//Cancer Res. 1998 Oct 15; 5 8(20) :4531-6.

94. Riccioni T.et al. Adenovirus-mediated wild-type p53 overexpression inhibits endothelial cell differentiation in vitro and angiogenesis in vivo. Gene Therapy, 1998,v5, p. 747-754.

95. Rosse T, Olivier R, Monney L, Rager M, Conus S, Fellay I, Jansen B, Borner C. Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c.//Nature. 1998 Jan 29; 391 ( 6666) :496-9.

96. Sakamuro D, Sabbatini P, White E, Prendergast GC. The polyproline region of p53 is required to activate apoptosis but not growth arrest.// Oncogene. 1997 Aug 18; 15 (8) : 887-98

97. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, pp.-5463-5467.

98. Schwartz D, Goldfinger N, Rotter V. Expression of p53 protein in spermatogenesis is confined to the tetraploid pachytene primary spermatocytes.// Oncogene. 1993 Jun;8(6):1487-94.

99. Serrano M, Lin AW, McCurrach ME, Beach D, Lowe SW. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and pl6INK4a.//Cell. 1997 Mar 7; 88 ( 5) : 593-602 .

100. Seto E,Usheva A, et al. Wild-type p53 bins to the TATA-binding protein and repress transcription. Pros. Natl. Acad.Sci. USA 1992, v89, p 12028-32.

101. Shaulian E, Haviv I, Shaul Y, Oren M. Transcriptional repression by the C-terminal domain of p53.//Oncogene. 1995 Feb 16; 10 (4):671-80.

102. Shenk T. Adenoviridae: The viruses and their replication. Philadelphia. 1996. Raven Publisher.2115-2119 .

103. Shimada H, Shimizu T, Ochiai T, Liu TL, Sashiyama H, Nakamura A, Matsubara H, Gunji Y, Kobayashi S, Tagawa M, Sakiyama S, Hiwasa T. Preclinical study of adenoviral p53 gene therapy for esophageal cancer.//Surg Today. 2001; 31 ( 7):597-604.

104. Smith ML, Chen IT, et al . Interaction of the p53-regulated protein GADD45 with proliferating cell nuclear antigen. Science 1994, v266, p 1376-80.

105. Soussi T., P. May. Structural aspect of the p53 protein in relation to gene evolution: a second look. J.Mol. Biol. 1996, v2 60, p.623-637.

106. Srinivasula SM, Ahmad M, Fernandes-Alnemri T, Alnemri ES. Autoactivation of procaspase-9 by Apaf-1-mediated oligomerization.//Mol Cell. 1998 Jun; 1(7): 949-57 .

107. Tan M. et al. PTGF-fi, a type ¡3 transforming growth factor (TGF-/3) superf amily member, is a p53 target gene that inhibits tumor cell growth via TGF-/? signaling pathway.

108. Tan P.K., Michou A., Bergelson J.M., Cotten M. Defining CAR as a cellular receptor for the avianadenovirus CELO using a genetic analysis of the two viral fibre proteins. //J Gen Virol. 2001 Jun;82 6: 14 65-,72 .

109. Tishler RB, Lamppu DM, Park S, Price BD. Microt.ubule-active . drugs taxol, vinblastine, and nocodazole increase the levels of transcriptionally active p53.//Cancer Res. 1995 Dec 15; 55 ( 24) :6021-5.

110. Trant R, Xiao H, Ingles CJ, Greenblatt J. Direct interaction between the transcriptional activation domain of human p53 and the TATA box-binding protein.

111. Valenzuela MT, Nunez MI, Villalobos M, Siles E, McMillan TJ, Pedraza V, Ruiz de Almodovar JM. A comparison of p53 and pl6 expression in human tumor cells treated with hyperthermia or ionizing radiation.//Int J Cancer. 1997 Jul 17;72 (2) :307-12 .

112. Van der Eb A. J., van Kesteren J.W., van Bruggen E.F.J. Structural properties of adenovirus DNAs. // Biochem. Biophys. Acta, 1969, v.- 182, pp.- 530-541.

113. W.S.M. Wold, K. Doronin et al. Immune responses to adenoviruses: viral evasion mechanisms and theirimplications for the clinic. Current opinion in immunology. 1999, vll, p.380-386.

114. Waldman T, Kinzler KW, Vogelstein B. p21 is necessary for the p53-mediated G1 arrest in human cancer cells.//Cancer Res. 1995 Nov 15; 55 (22) :5187-90.

115. Weill D, Mack M, Roth J, Swisher S, Proksch S, Merritt J, Nemunaitis J. Adenoviral-mediated p53 gene transfer to non-small cell lung cancer through endobronchial injection.//Chest. 2000 Oct;118(4):966-70 .

116. Wickham TJ. Targeting adenovirus.//Gene Ther. 2000 Jan;7 (2) :110-4 .

117. Wilson Deborah R. Viral-mediated gene transfer for cancer treatment.// Curr. Phar. Biotech. 2002,3,151164 .

118. Woo RA, McLure KG, Lees-Miller SP, Rancourt DE, Lee PW. DNA-dependent protein kinase acts upstream of p53 in response to DNA damage.//Nature. 1998 Aug 13; 394 (6694) : 700-4.

119. Wu Q. et al. Growth supression of human ovarian carcinoma OV-MZ-2a and OV-MZ-32 cells mediated by gene transfer of wild-type p53 enhanced by chemotherapy in vitro.

120. Xiong Y, et al. p21 is a universal inhibitor of cycline kinases . Nature 1993, v366, p701-4

121. Y Yang, FA Nunes, K Berencsi, EE Furth, E Gonczol, and JM Wilson Cellular Immunity to Viral Antigens Limits El-Deleted Adenoviruses for Gene Therapy PNAS 91: 4407-4411.