Холестерингидроксилаза/лиаза млекопитающих: топогенез и функционирование в дрожжах и бактериях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, доктор биологических наук Новикова, Людмила Александровна

• Новикова, Людмила Александровна
• доктор биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации доктор биологических наук Новикова, Людмила Александровна

I. ВВЕДЕНИЕ

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА П.1. МОНООКСИГЕНАЗНЫЕ СИСТЕМЫ ЦИТОХРОМОВ Р

II. 1.1. Цитохромы Р

И. 1.2. Монооксигеназные системы

И. 1.3. Биосинтез стероидных гормонов в клетках млекопитающих

II. 1.4. Реконструкция стероидтрансформирующих систем и взаимозаменяемость электронтранспортных белков микроорганизмов и млекопитающих

ГЛАВА П.2. ХОЛЕСТЕРИНГИДРОКСИЛАЗНАЯ/ЛИАЗНАЯ СИСТЕМА КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

И.2.1. Состав и функционирование холестерингидроксилазной/лиазной системы

И.2.2. Характеристика цитохрома P450scc (CYP11А1)

И.2.2.1. Структурная организация цитохрома P450scc

И.2.2.2. Топогенез и топология цитохрома P450scc

И.2.3. Характеристика адренодоксина

И.2.4. Характеристика адренодоксинредуктазы •

ГЛАВА II.3. МОДЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ И ПОДХОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ IN VIVO

II.3.1. Методические подходы, используемые для совместной экспрессии белков

И.3.2. Экспрессия гибридных (слитых) молекул, включающих компоненты Р450-монооксигеназных систем

II.3.3. Системы гетерологической экспрессии белков-компонентов холестеринмонооксигеназной/лиазной системы

ГЛАВА II.4. МЕХАНИЗМЫ, ВОВЛЕЧЕННЫЕ В КОНТРОЛЬ ЗА СБОРКОЙ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕМ МИТОХОНДРИЙ

II.4.1. Импорт белков в митохондрии

И.4.2. Деградация митохондриальных белков

ГЛАВА II.5. РЕКОНСТРУКЦИЯ СТЕРОИДГИДРОКСИЛИРУЮЩИХ СИСТЕМ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В КЛЕТКАХ МИКРООРГАНИЗМОВ

IL5.1. Трансгенные микроорганизмы для биотехнологии и фармакологических исследований

II.5.1.2. Дрожжи Yarrowia lipolytica 80 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 84 III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1П.1. Материалы

III.I.1. Реактивы и ферменты 86 III.I.2. Использованные штаммы микроорганизмов и плазмиды

III.2. Методы

111.2.1. Общие методы

111.2.2. Методы работы с ДНК

111.2.3. Конструирование плазмид

111.2.4. Методы, использованные при работе с клетками Escherichia coli

111.2.5. Методы, использованные при работе с дрожжами

Saccharomyces cerevisiae

111.2.6. Методы, использованные при работе с дрожжами

Yarrowia lipolytica

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА IV.1. ИЗУЧЕНИЕ ИМПОРТА ЦИТОХРОМА P450SCC С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИСТЕМ ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ IV. 1.1. Импорт предшественника цитохрома P450scc быка в митохондрии из различных источников

IV. 1.1.1. Импорт pP450scc быка в растительные митохондрии

IV. 1.1.2. Гетерологический импорт предшественника цитохрома P450scc с модифицированной N-концевой последовательностью

ГЛАВА IV.2. СИНТЕЗ И НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ТОПОГЕНЕЗА ЦИТОХРОМА P450SCC БЫКА В ДРОЖЖАХ Saccharomyces cerevisiae

IV.2.1. Экспрессия модифицированной формы цитохрома P450scc с препоследовательностью субъединицы IV дрожжевой цитохром с оксидазы

IV.2.2. Роль митохондриальных протеиназ и системы шаперонов в топогенезе цитохрома P450scc

IV.2.3 Влияние цитохрома P450scc на дыхательную систему и сопрягающий аппарат дрожжевых митохондрий

ГЛАВА IV.3. ИЗУЧЕНИЕ ТОПОГЕНЕЗА ЦИТОХРОМА P450SCC С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДЕЛЬНОЙ ПРОКАРИОТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

1У.3.1. Экспрессия цитохрома P450scc в клетках Escherichia coli: внутриклеточная локализация и взаимодействие с бактериальными редокс-белками

IV.3.2. Сравнительное изучение топогенеза цитохрома P450scc и его гибридов с адренодоксином при экспрессии в клетках Escherichia coli

ГЛАВА IV.4. РЕКОНСТРУКЦИЯ СТЕРОИДГИДРОКСИЛИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ ЦИТОХРОМА P450SCC МЛЕКОПИТАЮЩИХ В КЛЕТКАХ МИКРООРГАНИЗМОВ

IV.4.1. Совместная экспрессия всех белков холестерингидроксилзной/лиазной млекопитающих в клетках Escherichia coli

IV.4.2. Особенности формирования и функционирования слитых рекомбинантных белков, составленных из компонентов холестерингидроксилзной/лиазной системы

IV.4.2.1. Гетерологическая экспрессия слитых белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae

IV.4.2.2. Свойства слитых белков, синтезированных в клетках Escherichia coli

ГЛАВА IV.5. ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИХ НАЧАЛЬНЫЕ СТАДИИ СТЕРОИДОГЕНЕЗА МЛЕКОПИТАЮЩИХ, В ДРОЖЖАХ Yarrowia ljpolytjca: НОВЫЙ ПОДХОД К КОНСТРУИРОВАНИЮ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Холестерингидроксилаза/лиаза млекопитающих: топогенез и функционирование в дрожжах и бактериях»

Центральную роль в биосинтезе физиологически активных веществ (стероидов, витаминов группы D, желчных кислот и др.) и окислении ксенобиотиков играют ферментные системы с цитохромом Р450 в качестве терминальной оксидазы, осуществляющей стереоселективное гидроксилирование молекул субстратов [Nelson et al., 1996; Werck-Reichardt, Feyereisen, 2000; Pachecka et al., 2008; Miller, 2008].

Цитохромы P450, обеспечивающие синтез стероидных гормонов, регулируют жизненно-важные функции в организме млекопитающих и, в частности, человека регуляция беременности, эмбриональное развитие, процесс половой дифференциации,

- » углеводный и водно-солевой обмен, ответ на стресс и т.д.); любые нарушения синтеза стероидных гормонов приводят к серьезным заболеваниям и даже летальному исходу [Luft, 2001; Schuster, Bernhardt, 2007]. Изучение структурно-функциональных свойств этих цитохромов Р450 и механизмов регуляции биосинтеза стероидных гормонов служит необходимой предпосылкой для выяснения биохимических основ различных нарушений стероидогенеза и разработки подходов к коррекции дисфункции коры надпочечеников.

Первую ключевую стадию синтеза стероидных гормонов в организме I млекопитающих осуществляет холестерингидроксилазная/лиазная ■ (ХГ/Л) система, включающая цитохром P450scc, железосодержащий белок адренодоксин (Ad) и FAD-содержащий белок адренодоксинредуктазу (AdR). AdR и Ad обеспечивают перенос электронов от NADPH к цитохрому P450scc, катализирующему трансформацию холестерина в прегненолон, являющийся предшественником всех стероидных гормонов (кортикостероидов, минералкортикоидов, андрогенов и эстрогенов) [Payne, Hales, 2004; Miller, 2008].

Объективные сложности изучения белков ХГ/Л системы в митохондриях стероидогенных органов (наличие в клетках стероидогенных органов нескольких изоформ цитохромов Р450 и ограниченное количество материала для исследований) являются стимулом для создания искусственных моделей для их изучение in vitro, а также in vivo, осуществляя гетерологическую экспрессию белков в клетках микроорганизмов.

Трансгенные микроорганизмы, экспрессирующие белки ХГ/Л системы, могут быть использованы в качестве гетерологической модели для изучения ряда фундаментальных проблем биохимии и молекулярной биологии (регуляция биосинтеза физиологически активных веществ на субклеточном и молекулярном уровнях; структурно-функциональные аспекты белок-белкового и белок-лигандного узнавания; молекулярная организация ферментных систем, осуществляющих согласованные процессы электронного транспорта, взаимодействия с субстратами и активации молекулярного кислорода; взаимозаменяемость электронтранспортных белков в Р450-системах и др.).

Есть основания полагать, что исследования белков XT/JI системы и их вариантов (полученных с использованием методов генной инженерии) в гетерологических моделях' расширят общие представления о топогенезе митохондриальных белков и о принципах формирования сложных митохондриальных систем, компоненты которых в виде . предшественников адресуются в митохондрии (где они подвергаются процессингу, ковалентной модификации, связывают простетические группы и т.д.), принимают определенную конформацию и встраиваются в мембраны. В/ частности, изучение особенностей импорта предшественника P450scc в гетерологические митохондрии представляет интерес для выяснения судьбы чужеродных белков, попадающих в эти органеллы в результате ошибочного адресования, что имеет место при некоторых патологических состояниях. л1

С учетом консервативности молекулярной организации монооксигеназных систем и универсальности построения цитохромов, Р450, знания, полученные при изучении XT/JI системы, могут быть использованы и-для других цитохром Р450-монооксигеназ.

Результаты исследований в.областигмонооксигеназного катализа, накопленные за последние 30 лет, позволяют в настоящее время реализовать ряд задач прикладного характера. К ним относятся, в частности, (1) создание тест-систем . на основе субстратспецифичных цитохромов Р450 для использования при разработке и анализе новых противомикробных средств и модификаторов путей. биосинтеза стероидов и (2) разработка экономически эффективных и экологически чистых методов ферментативного синтеза гормонов (химический синтез которых не эффективен, энергоемок, экологически опасен или вообще невозможен).

Результаты исследований стероидтрансформирующих Р450-монооксигеназ в гетерологических моделях служат основой для развития новых подходов, имеющих целью реконструкцию монооксигеназных систем в клетках микроорганизмов для создания метаболических аналогов стероид синтезирующих органов млекопитающих. По-прежнему актуальны работы, направленные на разработку новых методов создания рекомбинантных штаммов.

Изучение цитохрома P450scc представляется особенно важным и в теоретическом, и в прикладном плане,, поскольку экспрессия в микроорганизмах монооксигеназной системы цитохрома P450scc позволит решить, ключевую проблему синтеза С21-стероидных гормонов, т.е. обеспечить превращение холестерина (или его аналогов) в прегненолон.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Новикова, Людмила Александровна

VI. выводы

1. Установлено, что предшественник цитохрома P450scc (pP450scc) из клеток коры надпочечников быка с собственной или модифицированной N-концевой адресующей препоследовательностью способен импортироваться в митохондрии из разных источников (семядоли сои, печень и сердце крысы, дрожжи Candida valida и Saccharomyces cerevisiae), что обеспечивает возможность изучения его топогенеза в модельных системах на основе нестероидогенных клеток. Структура адресующей препоследовательности является важным фактором, влияющим на тканеспецифичность импорта pP450scc в митохондрии.

2. Процесс топогенеза цитохрома P450scc в дрожжах S. cerevisiae осложнен на стадиях сворачивания полипептидной цепи в митохондриях и/или включения белка в митохондриальную мембрану. Критическим моментом топогенеза pP450scc в дрожжах являются конкурирующие процессы, протекающие при импорте белка в митохондрии: протеолиз под действием растворимой митохондриальной протеиназы Pimlp и агрегация импортированного белка в матриксе, которые контролируются митохондриальной системой шаперонов Ssclp(mtHsp70)/Mdjlp/Mgelp.

3. Впервые показано, что субстратная специфичность митохондриальных протеиназ дрожжей S. cerevisiae - растворимой протеиназы Pimlp и мембранной протеиназы Ytal0p/Ytal2p - может перекрываться.

4. Установлено, что ориентация в мембране, каталитические и спектральные свойства рекомбинантного цитохрома P450scc, синтезированного в клетках Escherichia coli, соответствуют характеристикам нативного белка, что указывает на возможность использования данной модельной системы для изучения деталей топогенеза цитохрома P450scc. Встраивание синтезированных полипептидных цепей цитохрома P450scc в мембрану является необходимой стадией для формирования каталитически активного белка. С-Концевая область последовательности P450scc более чем N-концевая, важна для обеспечения правильного сворачивания и стабильности белка; N-концевая область молекулы P450scc обеспечивает поддержание структуры каталитически активного фермента.

5. Впервые показано, что цитохром P450scc млекопитающих способен осуществлять ферментативную реакцию, используя в качестве редокс-партнеров белки бактериальной клетки.

6. Впервые осуществлена совместная экспрессия в клетках Е. coli всех белков-компонентов холестерингидроксилазной/лиазной системы млекопитающих, однако трансгенные штаммы Е. coli осуществляют биотрансформацию холестерина в прегненолон с низкой эффективностью.

7. Созданы системы эффективной экспрессии в клетках S. cerevisiae и Е. coli трех- и двухкомпонентных гибридных (слитых) белков, составленных из компонентов холестерингидроксилазной/лиазной системы. Показано, что формирование активных центров каталитических доменов в гибридных белках зависит от порядка расположения аминокислотных последовательностей, составляющих гибридный белок. В слитых белках наблюдается деформация активных центров каталитических доменов, и, кроме того, существуют структурные ограничения для их взаимодействия.

8. Объединение аминокислотных последовательностей белков холестерингидроксилазной/лиазной системы в гибридную молекулу не приводит к увеличению холестерингидроксилазной/лиазной активности гибридного белка по сравнению с системой, в которой активность обеспечивается взаимодействием индивидуальных компонентов.

9. Разработан новый способ конструирования рекомбинантных штаммов Yarrowia lipolytica, способных осуществлять совместную экспрессию нескольких гетерологических белков, который включает (1) коинтеграцию множества копий разных кассет экспрессии с чужеродными кДНК с использованием интегративных векторов в области повторяющихся элементов генома гаплоидных дрожжей (rDNA или участки LTR zeta) и (2) конструирование диплоидных штаммов путем скрещивания разных гаплоидных трансформантов. Таким путем можно конструировать дрожжи Y. lipolytica, способные одновременно экспрессировать 6 гетерологических белков.

10. Получены рекомбинантные штаммы дрожжей Y. lipolytica, способные коэкспрессировать все белки холестерингидроксилазной/лиазной системы, а также белки холестерингидроксилазной/лиазной системы и цитохром Р45017а, и осуществлять начальные стадии стероидогенеза млекопитающих - биотрансформацию холестерина в прегненолон и далее в 17а-гидроксипрегненолон. Продукты биотрансформации холестерина секретируются в культуральную жидкость.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интенсивное изучение ферментов, осуществляющих процесс стероидогенеза, заметно расширило представления о строении и функционировании монооксигеназных систем и стероид-гидроксилаз, участвующих в синтезе стероидных гормонов. Успешное клонирование кДНК этих ферментов открыло дорогу для современных молекулярно-биологических исследований с использованием систем гетерологической экспрессии на основе клеток млекопитающих, дрожжей и бактерий.

Первые работы в этой области бьши посвящены клонированию и изучению свойств экспрессированных индивидуальных белков стероид-трансформирующих систем [Morochashi et al., 1984; Sikorski et al., 1989; Sakaki et al., 1992 и др.]. С развитием белковой инженерии появились работы, направленные на изменение свойств цитохромов Р450, таких как связывание с мембраной или субстратная специфичность, а с развитием рекомбинантных технологий, позволяющих осуществлять коэкспрессию белков, появились работы по созданию трансгенных штаммов, синтезирующих не отдельные белки, а все компоненты какой-либо из Р450-монооксигеназных систем. Последнее поколение работ основано на идее создания микроорганизмов, способных синтезировать компоненты нескольких Р450-монооксигеназных систем и осуществлять несколько стадий или даже весь каскад последовательных реакций стероидогенеза млекопитающих [Urban et al., 1993; Duport et al., 1998; Hayashi et al., 2000; Inouye et al., 2001; Bernhardt, 2006; Szczebara et al., 2003]. Такие работы проводятся как с целью создания моделей для фундаментальных исследований (изучения свойств и молекулярных механизмов функционирования и взаимодействия отдельных ферментов и монооксигеназных систем, участвующих в процессе стероидогенеза), так и с практическими целями - например, с целью создания моделей для скрининга лекарственных препаратов или трансгенных штаммов для синтеза различных стероидов.

Многочисленные работы, представленные в литературе, продемонстрировали возможность осуществления экспрессии активных белков-компонентов полиферментных стероидтрансформирующих систем в клетках микроорганизмов. Однако к настоящему моменту еще нет информации о создании биотехнологически перспективного трансгенного микроорганизма, содержащего эффективно функционирующую систему цитохрома P450scc и, благодаря этому, осуществляющего лимитирующую стадию стероидогенеза млекопитающих - конверсию холестерина (или его аналогов) в прегненолон. В мировой практике давно предпринимаются попытки экспрессии белков ХГ/Л системы в микроорганизмах, однако как следует из результатов данной работы, основная проблема заключается в экспрессии функционально активного цитохрома P450scc.

Очевидно, что функционирование чужеродного белка или ферментативной системы может зависеть от типа клетки или тканеспецифического контекста, в котором проявляется его активность, и что для успешного создания трансгенных микроорганизмов необходимо предварительное изучение свойств гетерологических белков (в частности, особенностей их топогенеза) в используемых организмах-хозяевах.

Изучать топогенез цитохрома P450scc (CYP11A) в нативных условиях - в митохондриях клеток стероидогенных тканей, на фоне существующих в них молекул четырех разных цитохромов Р450, находящихся на разных стадиях топогенеза - очень сложно. Данная работа была направлена на поиск подходящей гетерологической модели для изучения деталей топогенеза и функционирования данного белка. Нами было создано несколько гетерологических систем экспрессии цитохрома P450scc и-других белков ХГ/Л системы млекопитающих in vivo и in vitro. Мы попытались выяснить возможности разных модельных систем для изучения указанных белков и системы в целом.

К моменту начала данной работы в отношении топогенеза P450scc было известно, что он синтезируется в цитоплазме стеридогенных клеток в виде предшественника, импортируется в митохондрии, подвергается в них протеолитическому процессингу и включается во внутреннюю митохондриальную мембрану. Эти данные были получены в, исследованиях с использованием синтезированного in vitro pP450scc и изолированных S митохондрий коры надпочечников [Ogishima et al., 1985]. На основании результатов, полученных при изучении импорта белка in vitro в митохондрии разных тканей (см., например, [Matocha, Waterman, 1986]), считалось, что топогенез цитохрома P450scc тканеспецифичен и в природе сборка комплекса белков ХГ/Л системы происходит только в стероидогенных клетках. В данной работе в модельной системе in vitro нам удалось осуществить импорт предшественника цитохрома P450scc с собственной или модифицированной N-концевой адресующей препоследовательностью в гетерологические митохондрии из разных источников (семядолей сои, печени и сердца крысы, дрожжей Candida valida и Saccharomyces cerevisiae). Наши данные и данные по экспрессии активного P450scc в COS-1 клетках [Zuber et al., 1988] продемонстрировали, что способность импортировать и процессировать pP450scc не является свойством, строго-присущим митохондриям стероидогенных тканей. Позже было показано, что цитохром P450scc действительно синтезируется и обеспечивает синтез важных биологически-активных стероидов не только в стероидогенных тканях, но и в клетках центральной и периферической нервной системы [Compagnone et al., 1995] и в сердечной ткани [Kayes-Wandover, White, 2000].

Использование трансгенных дрожжей, экспрессирующих предшественник P450scc и его рекомбинантные формы с разными адресующими препоследовательностями, оказалось непригодным для изучения деталей процесса топогенеза белка, в частности, включения цитохрома P450scc во внутреннюю мембрану митохондрий и его превращения в холо-фермент. В данной гетерологической системе pP450scc преимущественно накапливается в митохондриальном матриксе вместо того, чтобы включаться во внутреннюю мембрану, как это происходит в митохондриях коры надпочечников - лишь незначительная часть гетерологического белка встраивается в мембрану, приобретая нативную конформацию, в которой P450scc способен взаимодействовать с добавленными извне адренодоксином и адренодоксинредуктазой, проявляя ХГ/Л активность.

Используя модельную in vitro систему, мы установили, что топогенез P450scc в дрожжах S. cerevisiae существенно осложнен на стадиях сворачивания полипептидной цепи в митохондриях и/или включения белка в митохондриальную мембрану, и что критическим моментом его топогенеза является не собственно импорт pP450scc, а побочные процессы, имеющие место при импорте белка в митохондрии — протеолиз (под действием протеиназы Pimlp) и агрегация импортированного белка в матриксе, которые контролируются митохондриальной системой шаперонов mtHsp70/Mdjlp/Mgelp. То есть, топогенез pP450scc в дрожжах находится под контролем определенных регуляторных механизмов (включающих взаимодействие транспортирующих систем с механизмами, в которые вовлечены митохондриальные протеиназы).

Полученные результаты стимулировали поиск адресующих последовательностей дрожжевых белков, способствующих более эффективному встраиванию P450scc в мембрану дрожжевых митохондрий. При изучении поведения в митохондриях белка Su9(l 12)-ДР450, который эффективно связывался с внутренней мембраной, было обнаружено, что цитохром P450scc и в этом случае не приобретал нативной конформации и также подвергался протеолизу, но уже под действием связанного с внутренней мембраной протеолитического комплекса Ytal0p/Ytal2p (ш-ААА протеиназа).

Несмотря на то, что дрожжевая система гетерологической экспрессии оказалась неподходящей для изучения особенностей формирования и функционирования P450scc, при ее использовании нам удалось получить некоторые интересные результаты. Так, в данной работе впервые показано, что субстратные специфичности митохондриальных АТФ-зависимых протеиназ - растворимой протеиназы Pimlp и мембранной протеиназы Ytal0p/Ytal2p, перекрываются. Представленные данные предполагают существование универсального механизма удаления из митохондрий развернутых (неспособных свернуться в третичную структуру) полипептидных цепей, склонных к агрегации и, вследствие этого, представляющих помеху для функционирования митохондрий и жизнедеятельности клетки в целом.

Кроме того, впервые было изучено влияние массивных количеств чужеродных белков (P450scc и гибрида AdR-Ad), импортированных in vivo в дрожжевые митохондрии, на биогенез этих органелл и получены данные о том, какие количества импортированных гетерологических белков способны составить конкуренцию за шапероны и протеиназы с природными мишенями последних. Данные о том, что гибрид AdR-Ad, импортированный в матрикс дрожжевых митохондрий in vivo (не агрегируя в нем) в количестве до 0,2% от общего митохондриального белка, не влияет на развитие дыхательного аппарата клетки, но подавляет протеолиз и стимулирует агрегацию P450scc, включенного в те же митохондрии, свидетельствуют об ограниченных размерах фонда митохондриальных шаперонов и протеиназ, играющих ключевую роль в формировании дыхательных комплексов, что устанавливает определенные рамки для экспрессии гетерологических митохондриальных белков в дрожжах.

На следующем этапе работы мы изучали свойства цитохрома P450scc в модельной прокариотической системе - клетках Е. coli, синтезирующих зрелую форму данного белка. Поскольку P450scc бьш обнаружен не только в мембранной, но и в растворимой фракции рекомбинантных клеток, в первую очередь заслуживал внимания следующий вопрос: является ли встраивание в мембрану необходимым условием для правильного сворачивания полипептидной цепи цитохрома P450scc. При проведении детального анализа установлено, что в «растворимой» фракции активный цитохром P450scc находится исключительно в составе сложных липопротеидных частиц, следовательно, встраивание в мембрану является необходимой стадией топогенеза для формирования каталитически-активной конформации P450scc.

В связи с тем, что в бактериях в случае экспрессии митохондриальных белков нет необходимости экспрессировать белки-предшественники, возникают вопросы о структурно-функциональной организации этих белков в отсутствие митохондриальных адресующих последовательностей. Изучение характеристик зрелого P450scc в клетках Е. coli показало, что каталитические и спектральные свойства, а также ориентация в мембране P450scc, синтезирующегося в клетках бактерий, аналогичны характеристикам нативного белка. На основании того, что экспрессия зрелой формы белка (лишенной N-концевой препоследовательности) приводит к формированию активного фермента, можно заключить, что сворачивание полипептидной цепи цитохрома P450scc в митохондриях осуществляется после отщепления адресующей препоследовательности. Наши данные и данные Wada с соавт. [Wada et al., 1991] указывают на то, что клетки бактерий, синтезирующие цитохром P450scc млекопитающих, могут служить адекватной моделью для изучения процессов, обеспечивающих формирование мембранной холо-формы белка (внедрение в липидный бислой, присоединение гема, сворачивание полипептидной цепи mP450scc в каталитически-активную конформацию).

При экспрессии в клетках Е. coli модифицированных вариантов P450scc (Ad-P и Р-Ad) была предпринята попытка выяснить роль N- и С-концевых последовательностей полипептидной цепи P450scc в процессе ее сворачивания, сопровождающегося формированием гем-связывающего центра и участков связывания субстрата и Ad. Обнаружено, что модификация концевых участков полипептидной цепи P450scc не влияет на включение белка в цитоплазматическую мембрану и на эффективность связывания гема, однако, оказывает влияние на формирование гем-связывающего центра и каталитическую активность белка.

Кроме того, в данной работе впервые показана возможность функционального сопряжения цитохрома P450scc млекопитающих с электрон-транспортной системой Е. coli и, соответственно, возможность включения P450scc в метаболические пути бактерии.

Положительные результаты, полученные при сравнении свойств нативного и рекомбинантного P450scc, экспрессируемого в клетках Е. coli, позволяли надеяться, что в клетках микроорганизмов удастся реконструировать полную ХГ/Л систему.

Совместная экспрессия трех компонентов ХГ/Л системы в клетках микроорганизмов осуществлялась в данной работе с использованием трех подходов, используемых для коэкспрессии белков. При использовании полицистронных (тандемных) плазмид впервые получены клетки, в которых одновременно синтезируются рекомбинантные цитохром P450scc, AdR и Ad, которые локализуются в клетке аналогично нативным белкам и образуют активную ферментативную систему. К сожалению, ХГ/Л система, реконструированная из индивидуальных белков в клетках Е. coli, осуществляет биотрансформацию холестерина в прегненолон с низкой эффективностью. Пока непонятно, с чем это связано, возможными причинами могут являться недостаток кофакторов, необходимых для образования активных белков данной системы, неподходящее окружение во внутреннем компартменте клетки [Black et al., 1994; Headlam, Tuckey, 2000] или присутствие значительной части молекул рекомбинантных белков в клетках в неактивной форме в составе телец включения.

С учетом имевшихся в литературе данных (см. Главу II.3.2) с целью получения более активной системы цитохрома P450scc был использован другой, как казалось, наиболее простой методический подход для реконструкции системы — экспрессия гибридных (слитых) молекул, включающих белки-компоненты ХГ/Л системы, искусственно объединенные в единую полипептидную цепь. Конструирование гибридных белков представлялось перспективным как для получения информации о каталитических свойствах белков-компонентов в составе единой полипептидной цепи и механизме функционирования слитой полиферментной системы, так и с точки зрения биотехнологии - можно было надеяться, что искусственное объединение индивидуальных компонентов ХГ/Л системы в единую полипептидную цепь позволит избежать ряда сложностей в процессе ее формирования и, возможно, получить систему, обладающую более высокой активностью по сравнению с природной.

В данной работе впервые оценена удельная активность слитой холестерингидроксилазы/лиазы и осуществлено ее сравнение с активностью системы, реконструированной из изолированных P450scc, Ad и AdR. Обнаружено, что слияние последовательностей трех компонентов системы в общую полипептидную цепь приводит к получению не более, а значительно менее активной ХГ/Л системы, чем природная.

В работе по дизайну слитой холестерингидроксилазной/лиазной системы выявлен ряд общих проблем формирования и функционирования слитых полиферментных систем. Так, конформационная гибкость новой молекулы может оказаться недостаточной для эффективного взаимодействия каталитических доменов, либо, принимая необычную конформацию, искусственный белок может быть подвержен протеолизу, кроме того, в процессе сворачивания длинной полипептидной цепи могут возникать трудности как при связывании простетических групп и формировании активных центров доменов, так и при сворачивании самих доменов. t

При экспрессии разных вариантов слитой холестерингидроксилазы/лиазы нам не удалось получить эффективно функционирующую Р450зсс-систему, что делает нерациональным использование полученных штаммов в научных и практических целях.

Стало очевидным, что для реконструкции в клетках микроорганизмов ХГ/Л системы, обладающей высокой каталитической активностью, требуются другие экспериментальные подходы. Интересным объектом в качестве организма-хозяина нам представлялись «нетрадиционные» алкан-утилизирующие дрожжи Y. lipolytica, обладающие способностью к биотрансформации гидрофобных субстратов. Мы предполагали, что использование дрожжей Y. lipolytica для экспрессии цитохрома P450scc, Ad и AdR и, следовательно, для Р450-катализируемой конверсии гидрофобных ■ стероидных субстратов, может быть чрезвычайно продуктивным. В частности, такие данные были получены при экспрессии в клетках К lipolytica стероидтрансформирующего цитохрома Р450с17 [Juretzek et al., 2000; Shkumatov et al. 2006].

При конструировании рекомбинантных штаммов Y. lipolytica разработан новый подход для введения нескольких чужеродных кДНК в геном • дрожжей, включающий на первом этапе одновременную трансформацию гаплоидного штамма дрожжей смесью разных интегративных плазмид и на втором этапе - конструирование диплоидных штаммов с использованием гаплоидных трансформантов разного полового типа. ч

Используя этот подход, мы получили рекомбинантные штаммы Y. lipolytica, способные осуществлять коэкспрессию зрелых форм белков ХГ/Л системы (mP450scc, mAd и mAdR), а также коэкспрессшо белков ХГ/Л системы и цитохрома Р450с17, что позволяет осуществить сопряжение трансформации холестерина до прегненолона (прогестерона) с синтезом их 17а-гидроксилированных производных. Показано, что, используя указанный способ конструирования, можно получать трансгенные дрожжи Y. lipolytica, способные одновременно экспрессировать до 6 гетерологических белков, что может представлять интерес в плане реконструкции в дрожжах многокомпонентных полиферментных систем. К сожалению, пока в связи с низким уровнем экспрессии белков. ХГ/Л системы> данная модель не может быть использована для изучения топогенеза'и, функциональных свойств указанных белков, однако способность трансгенных штаммов осуществлять биотрансформацию стероидных субстратов свидетельствует о том, что экспрессируемые белки находятся в клетках Y. lipolytica в функционально активном v

СОСТОЯНИИ.

Настоящая работа и работа [Szczebara ' et al., 2003] показывают, что конструирование трансгенных дрожжей, синтезирующих активные зрелые формы белков Р4508сс-системы и обладающих способностью трансформировать холестерин (или его аналоги) в прегненолон, вполне реально.

Завершая анализ результатов, полученных в настоящем исследовании, можно заключить, что наиболее подходящей модельной системой для изучения топогенеза P450scc из использованных в данной работе является система на основе клеток Е. coli. В настоящее время она, в частности, успешно используется в нашей лаборатории для изучения» характера связывания P450scc с мембраной. Анализ литературных данных и собственных экспериментальных наблюдений позволяет утверждать, что при имеющемся, в природе многообразии полиферментных систем нельзя предсказать заранее, какой вариант гетерологической коэкспрессии белков будет оптимальным. Кроме того, необходимо учитывать, что свойства гетерологической системы в целом будут «корректироваться» ферментными системами клетки-хозяина. Очевидные преимущества алкан-утилизирующих «нетрадиционных» дрожжей Y. lipolytica в плане их использования для биотрансформации гидрофобных стероидных субстратов (в частности, как показано в данной работе, способность секретировать продукты биотрансформации в культуральную жидкость) позволяют предполагать, что эти дрожжи могут эффективно применяться в биотехнологии.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Новикова, Людмила Александровна, 2009 год

1. Азева Т., Гилеп А., Лепешева Г., Струшкевич Н., Усанов С. (2001) Сайт-направленный мутагенез цитохрома P450scc. Влияние замены остатков Arg425 и Arg426 на структурные и функциональные свойства цитохрома P450scc. Биохимия, 66(5), 564-575.

2. Гилевич С.Н., Гурьев О.Л., Шкуматов В.М., Чащин В.Л., Ахрем А.А. (1987) Сравнительноый анализ С27-стероид-гидроксилирующей системы из митохондрий печени быка. Биохимия, 52, 198-213.

3. Катцунг Б.Г. (1998) Базисная и клиническая фармакология. М.-СПб.: Бином-Невский Диалект, Т. 1, с. 608.

4. Клеменс М. Транскрипция и трансляция. Под ред. Хеймса Б. и Хиггинса С.М. М: Мир, 1987, стр. 282-288.

5. Ковалева И.Е., Гривенников С.И., Лузиков В.Н. (2000) О влиянии холестерина на поведение CYP11A1, импортированного в дрожжевые митохондрии in vivo. Биохимия, 65, 1425-1431.

6. Котельникова А.В., Звягильская Р.А. (1973) Биохимия дрожжевых митохондрий. Наука, Москва.

7. Лепешева Г.И., Усанов С.А. (1998) Сравнительная структурная и иммунохимическая характеристика рекомбинантного и природного цитохромов P450scc (CYP11А1). Биохимия, 63(2), 265-276.

8. Лузиков В.Н. (2009) Принципы контроля за формированием структур, осуществляющих дыхательные функции митохондрий. Успехи биол. химии, 49, 77-106.

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984) Молекулярное клонирование. Мир, Москва.

10. Метелица Д.И. (1984) Моделирование окислительно-восстановительных ферментов, Наука и техника, Минск, с. 293.

11. Струшкевич Н.В., Азева Т.Н., Лепешева Г.И., Усанов С.А. (2005) Роль положительно заряженных остатков lys267, lys270, и arg411 цитохрома p450scc (CYP11A1) во взаимодействии с адронодоксином. Биохимия, 70, 664-671.

12. Турко И.В., Адамович Т.Б., Кириллова С.А., Усанов С.А., Чащин В.Л. (1988) Ковалентно связанный комплекс цитохрома Р450 с адренодоксином. Биохимия, 53, 18101816.

13. Чащин В.Л. (1985) Структура и функция монооксигеназных систем митохондрий коры надпочечников. Дисс. докт. хим. наук, Институт биоорганической химии АН Белоруси, Минск, с. 270.

14. Шкуматов В.М. (1991) Ферментные системы биосинтеза биологически активных веществ, содержащие цитохром Р-450. Дисс. докт. биол. наук, Институт Биохимии им. А.Н. Баха, Москва.

15. Шкуматов В.М., Усова Е.В., Фролова Н.С., Барт Г., Мауерсбергер Ш. (2006) Влияние модификаторов биосинтеза стероидов на биотрансформацию прогестерона рекомбинантными дрожжами, экспрессирующими цитохром Р450с17. Биомед. химия, 52, 298-308.

16. Шкуматов В.М., Радюк В.Г., Гапонова Г.И., Чащин BJL, Ахрем А.А., Сметан Г., Рукпауль К. (1988)' Ковалентно-сорбционная реконструкция стероидных гидроксилаз. Биохимия, 53, 1962-1971.

17. Шкуматов В.М., Усова Е.В., Радюк В.Г., Фролова Н.С., Райков А.В., Новикова Л. А., Назаров П.А., Друца B.JL, Лузиков В.Н. (2001) Новые подходы к синтезу стероидов Избранные научные труды БГУ, серия Химия, 5, 446-459.

18. Adams, D.J., Seilman, S., Amelizad, Z., Oesch, F., Wolf, C.R. (1985) Identification of human cytochromes P450 analogous to forms induced by phenobarbital and 3-methylcholanthrene in the rat. J. Biochem., 232, 869-876.

19. Agarwal, M.K. (1993) Receptors for mammalian steroid hormones in microbes and plants. FEBS Lett., 322,207-210.

20. Akhrem, A.A., Lapko, V.N., Lapko, A.G., Shkumatov, V.M., Chashchin, V.L. (1979) Isolation, structural organization and mechanism of action of mitochondrial steroid hydroxylating systems. Acta Biol. Med. Germ., 38, 257-273.

21. Akijama, S., Takahashi, S., Ishimori, K., Morishima, I. (2000) Stepwise formation of alpha-helices during cytochrome с folding. Nat. Struct. Biol. 7, 514-520.

22. Akiyoshi-Shibata, M., Sakaki, Т., Yabusaki, Y., Murakami, H., Ohkawa, H. (1991) Expression of bovine adrenodoxin and NADPH-adrenodoxin reductase cDNA in S.cerevisiae. DNA Cell Biol., 10,613-621.

23. Alberti, K.G.M.M., Bartley, W. (1969) The localization of proteolytic activity in rat liver mitochondria and its relation to mitochondrial swelling and aging. Biochem J., 11, 763-776

24. Amann, E., Ochs, В., Abel, K.-J. (1988) Tightly regulated tac promoter vectors useful for expression of unfused and fused proteins in Escherichia coli. Gene, 69, 301-315.

25. Amerik, A.Y., Petukhova, G.V., Grigorenko, V.G., Lykov, I.P., Yarovoi, S.V., Lipkin, V.M., Gorbalenya, A.E. (1994) Cloning and sequence analysis of cDNA for a human homolog of eubacterial ATP-depen-dent Lon proteases. FEBS Lett, 340, 25-28.

26. Aoki, Y. (1978) Crystallization and characterization of a new protease in mitochondria of bone marrow cells. J. Biol. Chem., 253, 2026-2032.

27. Aoyama, Y, Yoshida, Y, Kubota, S, Kumaoka, H, Furumichi, A. (1978) NADPH-cytochrome P-450 reductase of yeast microsomes. Arch. Biochem. Biophys., 185, 362-369.

28. Arlt, H., Tauer, R., Feldmann. H„ Neupert, W., Langer, T. (1996) The YTA10-12 complex, an AAA protease with chaperone-like activity in the inner membrane of mitochondria. Cell, 85, 875-885.

29. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K. (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998

30. Azhar, S., Leers-Sucheta, S., d Raven, E. (2003) Cholesterol uptake in adrenal and gonadal tissues: The SR-BI «selective» pathhway connection. Front. Biosci., 8, s998-1029.

31. Azhar, S., Reaven, E. (2002) Scavenger receptor class BI and selective cholesteryl ester uptake: partners in the regulation of steroidogenesis. Mol. Cell. Endocrinol., 195, 1-26.

32. Banecki, В., Zylicz, M. (1996) Real time kinetics of the Dna/DnaJ/GrpE molecular chaperone machine action. J. Biol. Chem., 271, 6137-6143.

33. Barros, M.H., Nobrega, F.G. (1999) YAH1 of Saccharomyces cerevisiae: a new essential gene that codes for a protein homologous to human adrenodoxin. Gene, 233, 197-203.

34. Barth, G., Gaillardin, C. (1996) Yarrowia lipolytica. In Nonconventional yeasts in biotechnology (Wolf, K., ed.), A Handbook, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp. 313-388.

35. Bauer, M.F., Sirrenberg, C., Neupert, W., Brunner, M. (1996) Role of Tim23 as voltage sensor and presequence receptor in protein import into mitochondria. Cell, 87, 33-41.

36. Bergkamp, R.J., Kool, I.M., Geerse, R.H., Planta, R.J. (1992) Multiple-copy integration of the alpha-galactosidase gene from Cyamopsis tetragonoloba into the ribosomal DNA of Kluyveromyces lactis. Curr. Genet., 21, 365-370

37. Bernhard, R. (2006) Cytochrome P450 as versatile biocatalysts. J. Biotechnol., 124, 128145.

38. Bernhardt, R. (1995). Cytochrome P450: structure, function, and generation of reactive oxygen species. Re.v Physiol. Biochem. Pharmacol., 127:137-221.

39. Birboim, H.C., Doly, J. (1979) A rapid alkaline extraction method for screening recombinant plasmid DNA. Nucl. Asids Res., 76, 1513-1522.

40. Black, S.M., Harikrishna, J.A., Szklarz, G.D., Miller, W.L. (1994) The mitochondrial environment is required for activity of the cholesterol side-chain cleavage enzyme cytochrome P450scc. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7247-7251.

41. Blobel, G. (1980) Intracellular protein topogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 496500.

42. Boeke, J.D., Xu, H., Fink, G.R. (1988) A general method for the chromosomal amplification of genes in yeast. Science, 239, 280-282.

43. Bohnert, M., Pfanner, N., van der Laan, M. (2007) A dynamic machinery for import of mitochondrial precursor proteins. FEBS Lett., 581, 2802-2810.

44. Bolliger, L., Deloche, O., Glick, B.S., Georgopoulos, C., Jeno, P., Kronidou, Horst, M., Morishima, N., Schatz, G. (1994) A mitochondrial homolog of terial GrpE interacts with mitochondrial hsp70 and is essential for viability. EMBOJ, 13, 1998-2006.

45. Boutry, M., Nagy, .F, Poulsen, C., Aoyagi, K., Chua, N.H. (1987) Targeting of bacterial chloramphenicol acetyltransferase to mitochondria in transgenic plants. Nature. 328, 340-342.

46. Brandriss, M.C., Krzywicki, K.A. (1986) Amino-terminal fragments of delta 1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase direct beta-galactosidase to the mitochondrial matrix in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol,. 6, 3502-3512.

47. Brandt, M.E., Vickery, L.E. (1992) Expression and characterization of human mitochondrial ferredoxin reductase in Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys., 294, 735-740.

48. Brueggemeier, R.W., Hackett, J.C., Diaz-Cruz, E.S. (2005) Aromatase inhibitors in the treatment of breast cancer. Endocr. Rev., 26, 331-345.

49. Brunoa, R.D., Njar., V.C.O. (2007) Targeting cytochrome P450 enzymes: a new approach in anti-cancer drug development. Bioorg. Med. Chem., 15, 5047-5060.

50. Cao, P., Bernhardt, R. (1999) Interaction of CYP11B1 (cytochrome Р-450цР) with CYP11A1 (cytochrome P-450scc) in COS-1 cells. Eur. J. Biochem., 262, 720-726.

51. Cao, P.R., Bulow, H., Dumas, В., Bernhardt, R (2000) Construction and characterization of a catalytic fusion protein system: P-450(l 1 beta)-adrenodoxin reductase-adrenodoxin. Biochim. Biophys. Acta, 1476, 253-264.

52. Cauet, G., Balbuema, D., Achstetter, Т., Dumas, B. (2001) CYP11A1 stimulates the hydroxylase activity of CYP11B1 in mitochondria of recombinant yeast in vivo and in vitro. Eur. J. Biochem., 268, 4054-4062.

53. Chacinska, A., Lind, M., Frazier, A.E., Dudek, J., Meisinger, C., Geissler, A., Sickmann,и

54. A., Meyer, H.E., Truscott, K.N., Guiard, В., Pfanner, N. Rehling, P. (2005) Mitochondrial presequence translocase: swithing between TOM tethering and motor recruitment involves Tim21 and Timl7. Cell, 120, 817-829.

55. Chashchin, V.L., Usanov, S.A., Lapko, V.N., Adamovich, T.B., Shkumatov, V.M., Akhrem, A.A. (1986) Chemistry of Peptides and Proteins (Voelter, W., Bayer, E., Ovchinnikov, Yu., Ivanov, V., eds.), Berlin -New York: Walter de Greyter and Co, pp. 177-189.

56. Chaurasia, C.S., Alterman, M.A., Lu, P., Hanzlik, R.P. (1995) Biochemical characterization of lauric acid omega-hydroxylation by а СYP4A1 /NADPH-cytochrome P450 reductase fusion protein. Arch. Biochem. Biophys., 317, 161—169.

57. Chen, C.D, Doray, В., Kemper, B. (1998) A conserved proline-rich sequence between the N-terminal signal-anchor and catalytic domains is required for assembly of functional cytochrome P450 2C2. Arch. Biochem. Biophys., 350, 233-238.

58. Cheng, M.Y., Pollock, R.A., Hendrick, J.P., Horwich, A.L. (1987) Import and processing of human ornithine transcarbamoylase precursor by mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci USA. 84(12):4063-4067.

59. Cheng, M.Y., Haiti, F.U., Horwich, A.L. (1990) The mitochondrial chaperonin hsp60 is required for its own assembly. Nature, 348, 455-458.

60. Churchill, P.F., Kimura, T. (1979) Topological studies of cytochromes P-450scc and P-45011 beta in bovine adrenocortical inner mitochonrial membranes. Effects of controlled tryptic digestion. J. Biol. Chem., 254, 10443-10448.

61. Cirigliano, M.C., Carman, G.M. (1984) Isolation of a bioemulsifier from Candida lipolytica. Appl. Environ. Microbiol., 48, 747-750.

62. Coghlan, V.M., Vickery, L.E., (1991) Site-specific mutations in human ferredoxin that affect binding to ferredoxin reductase and cytochrome P450scc. J Biol Chem., ;266, 1860618612.

63. Compagnone, N.A., Bulfone, A., Rubenstein, J.L., Mellon, S.H., (1995) Expression of the steroidogenic enzyme P450scc in the central and peripheral nervous systems during rodent embryogenesis. Endocrinology, 136,2689-2696.

64. Confalonieri, F., and Duguet, M. (1995) A 200-amino acid ATPase module in search of a basic function. BioEssays, 17, 639-650.

65. Constantino, P., Attardi, G. (1977) Metabolic properties of the products of mitochondrial protein synthesis in HeLa cells. J Biol Chem., 252,1702-1711

66. Coon, M.J., Vaz, A.D.N., McGinnity, F., Peng, H.-M. (1998) Multiple activated oxygen species in P450 catalysis. Drug Metab. Dispos., 26, 1190-1193.

67. Cullin, C., Pompon, D. (1988) Synthesis of functional mouse cytochromes P450 PI and chimeric P450 P3-1 in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Gene, 65, 203-217.

68. D'Silva, P.D., Schilke, В., Walter, W., Craig, E.A. (2005) Role of Paml6's degenerate J domain in protein import across the mitochondrial inner membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102,12419-12424.

69. De Leij, L. Witholt, B. (1977) Structural heterogeneity of the cytoplasmic and outer membranes of Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 471, 92-104.

70. Degtyarenko, K.N., Archakov, A.I. (1993) Molecular evolution of P450 superfamily and P450-containing monooxygenase systems. FEBS Lett., 332, 1-8.

71. Desautels, M. (1986) Mitochondrial proteolysis. In: Fiskum, G. (ed) Mitochondrial physiology and pathology. Van Nostrand Rein-hold, New York, pp 40-65.

72. Desautels, M. Goldberg, A.L. (1982a) Demonstration of an ATP-dependent, vanadate-sensitive endoprotease in the matrix of rat liver mitochondria. J. Biol. Chem., 257, 11673-11679.

73. Desautels, M, Goldberg, A.L. (1982b) Liver mitochondria contain an ATP-dependent, vanadate-sensitive pathway for the degradation of proteins. Proc Natl Acad Sci USA, 79, 18691873.

74. Deshavies, R.J., Schenkman, R. (1987) A yeast mutant defective at an early stage in import of secretory protein precursors into the endoplasmic reticulum. Ad. J. Cell Biol., 105(2), 633-645.

75. Dilworth, F.J., Black, S.M., Guo, Y.D., Miller, W.L. (1996) Construction of a P450c27 fusion enzyme: a useful tool for analysis of vitamin D3 25-hydroxylase activity. Biochem. J., 320, 267-271.

76. Dong, J., Porter, T.D. (1996) Coexpression of mammalian cytochrome P450 and reductase in Escherichia coli. Arch Biochem Biophys, 327(2), 254-259.

77. Dower, W.J., Mille,r J.F., Ragsdale, C.W. (1988) High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res., 16, 6127-6145

78. Dragan, C.A., Hartmann, R.W., Bureik, M. (2006) A fission yeast-based test system for the determination of IC50 values of anti-prostate tumor drugs acting on CYP21. J. Enzyme Inhib. Med. Chem., 21, 547-556.

79. Dragan, C.-A., Zearo, S., Hannemann, F., Bernhardt, R., Bureik, M. (2005) Efficient conversion of 11-deoxycortisol to Cortisol (hydrocortisone) by recombinant fission yeast Schizosaccharomacespombe. FEMS Yeast Res, 5, 621-625

80. Duport, C., Schoepp, В., Chatelain, E., Spagnoli, R., Dumas, В., Pompon, D. (2003) Critical role of the plasma membrane for expression of mammalian mitochondrial side chain cleavage activity in yeast. Eur. J. Biochem., 270(7), 1502-1514.

81. Duport, C., Spagnoli, R., Degryse, E., Pompon, D. (1998) Self-sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone in engineered yeast. Nat. Biotechnol., 16, 186-189.

82. Endo, Т., Eilers, M., Schatz, G. (1989) Binding of a tightly folded artificial mitochondrial precursor protein to the mitochondrial outer membrane involves a lipid-mediated conformational change. J. Biol. Chem., 264(5), 2951-2956.

83. Estabrook, R.W., Shet, M.S., Faulkne, K., Fisher C.W. (1996). The use of electrochemistry for the synthesis of 17 alpha-hydroxyprogesterone by a fusion protein containing P450cl7. Endocr. Res., 22, 665-671.

84. Fersht, A.R. (1997) Nucleation mechanisms in protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol., 7, 3-9.

85. Fickers, P., Benetti, P.H., Wache ,Y., Marty, A., Mauersberger, S., Smit, M.S., Nicaud, J.M. (2005) Hydrophobic substrate utilization by the yeast Yarrowia lipolytica, and its potential applications. FEMS Yeast Res, 5, 527-543.

86. Flores, C.L., Gancedo, C. (2005) Yarrowia lipolytica mutants devoid of pyruvate carboxylase activity show an unusual growth phenotype. Eukaryot Cell., 4(2), 356-364.

87. Forster A. (2001) Untersuchungen zur heterologen Expression von steroidwandelnden Cytochrom P450 Systemen in der Hefe Yarrowia lipolytica. Diploma thesis, Institute of Microbiology, Technische Universitat Dresden.

88. Forster A., Aurich A., Mauersberger S., Barth G. (2007) Citric acid production from sucrose using a recombinant strain of the yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbiol. Biotechnol., 75, 1409-1417.

89. Fujita, K., Kamataki, T. (2002) Genetically engineered bacterial cells co-expressing human cytochrome P450 with NADPH-cytochrome P450 reductase: prediction of metabolism and toxicity of drugs in humans. Drug Metab. Pharmacokinet., 17, 1-22.

90. Gambill, B.D., Voos, W., Kang, P.J., Miao, В., Langer, Т., Craig, E.A., Pfanner, N. (1993) A dual role for mitochondrial heat shock protein 70 in membrane translocation of preproteins. J. Cell Biol., 123, 109-117.

91. Gatti, D.L., Tzagoloff, A. (1990) Structure and function of the mitochondrial bcl complex. Properties of the complex in temperature-sensitive corlmutants. J. Biol. Chem., 265, 2146821475.

92. Gavel, Y., von Heijne, G. (1990) Cleavage-site motifs in mitochondrial targeting peptides. Protein Eng., 4, 33 37.

93. Gerber, J (1999) Untersuchungen zur Optimierung des Elektronentransportsystems fur die Cytochrom P450 katalysierte Biotransformation von Steroiden in Yarrowia lipolytica. Diplomarbeit, Institut fur Mikrobiologie, TU Dresden.

94. Gizard, F., Lavallee, В., DeWitte, F., Hum, D.W. (2001) A novel zinc finger protein TReP-132 interacts with CBP/рЗОО to regulate human CYP11A1 gene expression. J Biol Chem., 276(36), 33881-33892.

95. Glover, L.A., Lindsay, J.G., (1992) Targeting proteins to mitochondria: a current overview. Biochem J., 284(Pt 3), 609-620.

96. Gomez-Lechon, M.J., Donato, M.T., Castell, J.V., Jover, R. (2004) Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Curr. Drug Metab., 5, 443462.

97. Gotoh, O. (1992) Substrate recognition sites in cytochrome P450 family 2 (CYP2) proteins inferred from comparative analyses of amino acid and coding nucleotide sequences. J. Biol. Chem., 267, 83-90.

98. Graham-Lorence, S., Peterson, J.A. (1996) P450s: structural similarities and functional differences. FASEBJ., 10, 206-214.

99. Grallert, H., Rutkat, K., Buchner, J. (2000) Limits of protein folding inside GroE complexes. J. Biol. Chem., 275, 20424-20430.

100. Grinberg, A.V., Hannemann, F., Schiffler, В., Muller, J., Heinemann, U., Bernhardt, R. (2000) Adrenodoxin: structure, stability, and electron transfer properties. Proteins, 40, 590-612.

101. Grivell, L.A. (1989) Nucleo-mitochondrial interactions in yeast mitochondrial biogenesis. Eur. J. Biochem., 182, 477-493.

102. Grivell, L.A. (1995) Nucleo-mitochondrial interactions in mitochondrial gene expression. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 30, 121-164.

103. Guengerich, F.P., Gillam, E.M., Ohmori, S„ Sandhu, P., Brian, W.R., Sari, M.A., Iwasaki, M. (1993) Expression of human cytochrome P450 enzymes in yeast and bacteria and relevance to studies on catalytic specificity. Toxicology, 82, 21-37.

104. Guengerich, F.P. (2001) Uncommon P450-catalyzed reactions. Current Drug Metab., 2, 93-115.

105. Guo, I.C., Shin, M.C., Lan, H.C., Hsu, N.C., Ни, M.C., Chung, B.C. (2007) Transcriptional regulation of human CYP11A1 in gonads and adrenal. J. Biomed. Sci., 14, 509515.

106. Gupta, M.K., Guryev, O.L., Auchus, R.J. (2003) 5alpha-reduced C21 steroids are substrates for human cytochrome P450cl7. Arch. Biochem. Biophys., 418, 151-160.

107. Haas, R., Heinrich, P.C. (1978) The localization of an intracellular membrane-bound proteinase from rat liver. Eur. J. Biochem., 91, 171-178.

108. Hakki, Т., Bernhardt, R. (2006) CYP17- and CYP1 IB-dependent steroid hydroxylases as drug development targets. Pharmacol. Ther., Ill, 27-52.

109. Hall PF (1984). Cellular organization for steroidogenesis. Int. Rev. Cytol., 86, 53-95.

110. Hanukoglu, I., Suh, B.S., Himmelhoch, S., Amsterdam, A. (1990) Induction and mitochondrial localization of cytochrome P450scc system enzymes in normal and transformed ovarian granulosa cells. J Cell Biol., 111(4):1373-1381

111. Hanukoglu, I., Hanukoglu, Z. (1986) Stoichiometry of mitochondrial cytochromes P450, adrenodoxin, NADPH-cytochrome P450 reductase. Eur. J. Biochem., 157, 27-31. 1

112. Hare, J.F. (1978) A novel proteinase associated with mitochondrial membranes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 83, 1206-1215.

113. Hare, J.F., Hodges, R. (1982) Turnover of mitochondrial inner membrane proteins in hepatoma monolayer cultures. J. Biol Chem., 257, 3575-3580.

114. Hare, J.F. (1990) Mechanisms of membrane protein turnover. Biochim. Biophys. Acta, 1031, 71-90.

115. Harikrishna, J.A., Black, S.M., Szklarz, G.D., Miller, W.L. (1993) Construction and function of fusion enzymes of the human cytochrome P450scc system. DNA Cell Biol., 12, 5, 371-379.

116. Hauet Т., Liu J., Li H., Gazouli M., Culty M., Papadopoulos V. (2002) PBR, StAR, and PKA: partners in cholesterol transport in steroidogenic cells. Endocr. Res., 28, 395-401.

117. Headlam, M.J., Tuckey, R.C. (2002) The effect of glycerol on cytochrome P450scc (CYP11 Al) spin state, activity, and hydration. Arch. Biochem. Biophys., 407, 95-102.

118. Headlam, M.J., Wilce, M.C., and Tuckey, R.C. (2003) The F-G loop region of cytochrome P450scc (CYP11A1),interacts with the phospholipid membrane. Biochim. Biophys. Acta, 1617, 96-108.

119. Helvig, C., Capdevila, J.H. (2000) Biochemical characterization of rat P450 2C11 fused to rat or bacterial NADPH-P450 reductase domains. Biochemistry, 39, 5196-5205.

120. Herman С., Thevenet D., Dari R., Bouloe P. (1995) Degradation of cj32, the heat-shock regulator in Escherichia coli is governed by HflB. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 92, 3516-3520.

121. Herrmann, J.M., Folsch, H., Neupert, W., Stuart, R.A. (1994a) in Cell Biology: A Laboratory Handbook, Vol. 1 (Celis, D.E., ed) pp. 538-544, Academic Press, Inc., San Diego.

122. Higman, M.A., Christen, L.A., Niles, E.G. (1994) The mRNA (guanine-7-)methyltransferase domain of the vaccinia virus mRNA capping enzyme. J. Biol. Chem., 269(21), 14974-14981.

123. Hiwatashi, A., Ichikawa, Y. (1982) Purification and properties of tightly bound reduced NADPH-adrenodoxin reductase of bovine adrenocortical mitochondria. J. Biochem., 92, 2, 335342.

124. Hoffman, C.S„ Winston, F. (1987) A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene 57:267-272.

125. Hoogenraad, N.J., Ward, L.A., Ryan, M.T. (2002) Import and assembly of proteins into mitochondria of mammalian cells. Biochim. Biophys. Acta, 1592, 97-105.

126. Horie, S., Watanabe, T. (1975) Properties of high spin type P-450 preparation from bovine adrenal cortex mitochondria. J. Steroid Biochem., 6(3-4), 401-409.

127. Horst, M., Hilfiker-Rothenfluh, S., Oppliger, W., Schatz, G. (1995) Dynamic interaction of the protein translocation systems in the inner and outer membranes of yeast mitochondria. EMBOJ., 14, 2293-2297.

128. Ни, M.C., Hsu, N.C., Pai, C.I., Wang, C.K., Chung, B. (2001) Functions of the upstream and proximal steroidogenic factor 1 (SF-l)-binding sites in the CYP11A1 promoter in basal transcription and hormonal response. Mol. Endocrinol., 15, 812-828/

129. Huang S., Ratliff K.S., Matouschek A. (2002) Protein unfolding by the mitochondrial membrane potential. Nat. Struct. Biol., 9, 301-307.

130. Huang, M.C., Miller, W.L. (2001) Creation and activity of COS-1 cells stably expressing the F2 fusion of the human cholesterol side-chain cleavage enzyme system. Endocrinology, 142(6), 2569-2576.

131. Hurt E.C., Goldschmidt-Clermont M., Pesold-Hurt В., Rochaix J.D., Schatz G. (1986) A mitochondrial presequence can transport a chloroplast-encoded protein into yeast mitochondria. J Biol Chem, 261(25), 11440-11443.

132. Hutchinson, E.G., Tichelaar, W., Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K.R. (1989) Identification and electron microscopic analysis of a chaperonin oligomer from Neurospora crassa mitochondria. EMBOJ., 8, 1485-1490.

133. Ingelman, M., Bianchi, V., Eklund, H. (1997) The three-dimensional structure of flavodoxin reductase from Escherichia coli at 1.7 A resolution. J. Mol. Biol., 268, 147-157.

134. Ishimura, К., Fujita, H. (1997) Light and electron microscopic immunohistochemistry of the localization of adrenal steroidogenic enzymes. Microsc. Res. Tech., 36(6), 445-453.

135. Jindal; S., Dudani, A.K., Singh, В., Harley, C.B., Gupta, R.S. (1989) Primary structure of a human mitochondrial protein homologous to the bacterial and plant chaperonins and to the 65-kilodalton mycobacterial antigen. Mol. Cell. Biol., 9, 2279-2283.

136. John, M.E., John, M.C., Ashley, P., MacDonald, R.J., Simpson, E.R., Waterman, M.R. (1984) . Identification and characterization of cDNA clones specific for cholesterol side-chain cleavage cytochrome P-450. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5628-5632

137. Jordan, R., and McMacken, R. (1995) Modulation of the ATPase activity of e molecular chaperone DnaK by peptides and the DnaJ and GrpE heat shock oteins. J. Biol. Chem., 270, 4563-4569.

138. Jose, J., Bernhardt, R., Hannemann, F. (2001) Functional display of active bovine adrenodoxin on the surface of E. coli by chemical incorporation of the 2Fe-2S. cluster. Chembiochem., 2(9),695-701.

139. Joseleau-Petit, D., Kepes, A. (1975) A novel electrophoretic fractionation of Escherichia coli envelopes. Biochim. Biophys. Acta, 406, 36-49.

140. Juretzek, Т., Le Dall, M.T., Mauersberger, S., Gaillardin, C., Barth, G., Nicaud, J.M. (2001) Vectors for gene expression and amplification in the yeast Yarrowia lipolytica. Yeast, 18, 97-113.

141. Juretzek, Т., Mauersberger, S., Schunck, W-H., Nicaud, J.-M., Barth, G. (1999) Functional expression of heterologous cytochrome P450 in the yeast Yarrowia lipolytica and its use in biotransformation of steroids. Current Genetics, 35, 307-311.

142. Kakuta, Y., Horio, Т., Takahashi, Y., Fukuyama, K. (2001) Crystal structure of Escherichia coli Fdx, an adrenodoxin-type ferredoxin involved in the assembly of iron-sulfur clusters. Biochemistry, 40, 11007-11012.

143. Kamerbeek, N.M., Janssen, D.B., van Berkel, W.J.H., Fraaije, M.W. (2003) Substrate specificity and enantioselectivity of 4-hydroxyacetophenone monooxygenase. Adv. Synth. Catal., 6-7, 106-120.

144. Kamin, H., Batie, C., Lambeth, J.D., Lancaster J., Graham, L., Salerno, J.C. (1985) Paramagnetic probes of multicomponent electron-transfer systems. Biochem Soc Trans., 13(3), 615-618.

145. Kang, P.-J., Osterman, J., Shilling, J., Neupert, W., Craig, E., Pfanner, N. (1990) Requirement for hsp70 in the mitochondrial matrix for translocation and folding of precursor proteins. Nature, 348, 137-143.

146. Kayes-Wandover, K.M., White, P.C. (2000) Steroidogenic enzyme gene expression in the human heart. J. Clin. Endocrinol. Metab., 85, 2519-2525.

147. Kemper, B. (2004) Structural basis for the role in protein folding of conserved proline-rich regions in cytochromes P450. Toxicol. Appl. Pharmacol., 199, 305-319.

148. Kiebler, M., Pfaller, R., Sollner, Т., Griffiths, G., Horstmann, H., Pfanner, N., and Neupert, W. (1990) Identification of a mitochondrial receptor complex required for recognition and membrane insertion of precursor proteins. Nature, 348, 610-616.

149. Kihara, A., Akiyama, Y., Ito, K. (1995) FtsH is required for proteolytic elimination of uncomplexed forms of SecY, an essential protein translocase subunit. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 4532-4536.

150. Knoell, H.E., Knappe, J. (1974) Escherichia coli ferredoxin, an iron-sulfur protein of the adrenodoxin type. Eur. J. Biochem., 50, 245-252.

151. Kostic, M., Pochapsky, S.S., Obenauer, J., Mo, H., Pagani, G.M., Pejchal, R., Pochapsky,i

152. T.C. (2002) Comparision of functional domains in vertebrate-type ferredoxin. Biochemistry, 41, 5978-5989.

153. Kozlov, D.G., Prahl, N. Efremov, B.D., Peters, L., Wambut, R., Kaprychev, I.V.,-Eldarov, M.A., Benevolensky, S.V. (1995) Host cell properties and external pH affect proinsulin production by Saccharomyces yeast. Yeast, 11, 8, 713-724.

154. Kraemer, F.B., Shen, W.J. (2002) Hormone-sensitive lipase: control of intracellular tri-(di-)-acylglicerol and cholesteryl ester hydrolysis. J. Lipid Res., 43, 1585-1594.

155. Kruse, K., Forster, A., Juretzek T, Mauersberger, S., Barth, G. (2004) Method for the biotechnological production of citric acid by means of a genetically modified yeast Yarrowia lipolytica. W02004/009828, DE10333144.

156. Krynetski, E.Yu., Drutsa, V.L., Kovaleva, I.E., Luzikov, V.N. (1995) High yield expression of functionally active human liver CYP2D6 in yeast cells. Pharmacogenetics, 5, 103109.

157. Kusano, K., Kagawa, N., Sakaguchi, M., Waterman, M.R., Omura, T. (2001a) Microsomal p450s use specific proline-rich sequences for efficient folding, but not for maintenance of the folded structure. J. Biochem. (Tokyo), 129, 259-269.

158. Kusano, K., Kagawa, N., Sakaguchi, M., Omura, Т., Waterman, M.R. (20016) Importance of a proline-rich sequence in the amino-terminal region for correct folding of mitochondrial and soluble microbial p450s. J. Biochem. (Tokyo,) 129, 271-277.

159. Kutejova, E., Durcova,.G., Surovkova, E., Kuzela, S. (1993) Yeast mitochondrial ATP-dependent protease purification and comparison with the homologous rat enzyme and the bacterial ATP-dependent protease La. FEBSLett., 329, 47-50.

160. Kutik, S., Guiarad, В., Meyer, H., Wiedemann, N., Pfanner, N. (2007) Cooperation of translocase complexes in mitochondrial protein import. J. Cell. Biol., 179, 585-591.

161. Lacapere, J.J., Papadopoulos, V. (2003) Peripheral-type benzodiazepine receptor: structure and function of a cholesterol-bonding protein in steroid and bole acid biosynthesis. Steroids, 68, 569-585.

162. Lacour, Т., Achstetter, Т., Dumas, B. (1998) Characterization of recombinant adrenodoxin reductase homologue (Arhlp) from yeast. Implication in in vitro cytochrome p4501 lbeta monooxygenase system. J. Biol. Chem., 273,23984-23992.

163. Lacour, Т., Ohkawa, H. (1999) Engineering and biochemical characterization .of the rat microsomal cytochrome P4501A1 fused to ferredoxin and ferredoxin-NADP(+) reductase from plant chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta, 1433, 87-102.

164. Ladokhin, A.S., White, S.H. (2001) Protein chemistry at membrane interfaces: non-additivity of electrostatic and hydrophobic interactions. JMol Biol., 309(3), 543-552.

165. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural protein during the assembly of the head bacteriophage T-4. Nature, 227, 680-685.

166. Lala, D.S., Rice, D.A., Parker, K.L. (1992) Steroidogenic factor I, a key regulator of steroidogenic enzyme expression, is the mouse homolog of fushi tarazu-factor I. Mol Endocrinol., 6, 1249-1258.

167. Lambeth, D., Kamin, H. (1976) Properties of complexes of reduced enzime with NADP+ and NADPH. J. Biol. Chem., 251, 4299-4306.

168. Lambeth, D., Seybert, D., Kamin, H. (1980) Adrenodoxin reductase adrenodoxin complex rapid formation and breakdown of the complex and a slow conformational change in the flavoprotein. J. Biol Chem., 255,4667-4672.

169. Lambeth, J.D., Seybert, D.W., Kamin, H. (1979) Ionic effects on adrenal steroidogenic electron transport. The role of adrenodoxin as an electron shuttle. J. Biol Chem., 254, 72557264/

170. Langer, T. (2000) AAA proteases: cellular machines for degrading membrane proteins. Trends Biochem. Sci., 25, 247-251.

171. Langer, Т., Lu, C, Echols, H., Flanagan, J., Hayer, M.K., Haiti, F.-U. (1992) Successive action of DnaK, DnaJ and GroEL along the pathway of haperone-mediated protein folding. Nature, 356, 683-689.

172. Le Dall, M.T., Nicaud, J.M., Gaillardin, C. (1994) Multiple-copy integration in the yeast Yarrowia lipolytica. Curr Genet., 26(1), 38-44.

173. Leonhard, K., Sriegler, A., Neupert, W., Langer, T. (1999) Chaperone-like activity of the AAA domain of the yeast Ymel AAA protease. Nature, 398, 348-351.

174. Lewis, D.F., Lee-Robichaud, P. (1998) Molecular modelling of steroidogenic cytochromes P450 from families CYP11, CYP17, CYP19 and CYP21 based on the CYP102 crystal structure. J Steroid Biochem. Mol. Biol., 66\ 217-233.

175. Light, D., Walsh, C. (1980) Flavin analogs as mechanistic probes of adrenodoxin reductasedependent electron transfert of the cholesterol side chain cleveage cytochrome P-450 of the adrenal cortex. J. Biol. Chem., 255,4264-4477.

176. Lill, R., Neupert, W. (1996) Mechanisms of protein import across the mitochondrial outer membrane. Trends Cell Biol., 6, 56-61.

177. Lin, D., Shi Y., Miller, W.L. (1990) Cloning and sequence of the human adrenodoxin reductase gene. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 87, 1955-1962.

178. Lin, H.L., Kent, U.M., Hollenberg, P.F. (2002) Mechanism-based inactivation of cytochrome P450 3A4 by 17 alpha-ethynylestradiol: evidence for heme destruction and covalent binding to protein. J. Pharmacol. Exp. Ther., 301,160-167.

179. Liu J., Rone, M.B., Papadopoulos, V. (2006) Protein-protein interactions mediate mitochondrial cholesterol transport and steroid biosynthesis. J. Biol. Chem., 281, 38879-18893.

180. Liu, Z., Simpson, E.R. (1999) Molecular mechanism for cooperation between Spl and steroidogenic factor 1 (SF-1) to regulate bovine CYP11A gene expression. Mol. Cell. Endocrinol., 153, 183-196.

181. Lopes, T.S., de Wijs, I.J., Steenhauer, S.I., Verbakel, J., Planta, R.J. (1996) Factors affecting the mitotic stability of high-copy-number integration into the ribosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 12,467-477.

182. Lopes, T.S., Hakkaart, G.J., Raue, H.A., Planta, R.J. (1991) Mechanism of high-copy-number integration of pMIRY-type vectors into the ribosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae. Gene, 105, 83-90.

183. Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L., Randal, R.J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193,265-270.

184. Luciakova, K. Kuzela, S (1992) Increased steady state levels of several mitochondrial and nuclear gene transcripts in rat hepatoma with a low content of mitochondria. Eur J Biochem., 205, 1187-1193

185. Luft, F.C. (2001) Steroidogenesis and CYP enzymes. J. Mol. Med., 79, 549-550.

186. Luster, M.I., Lawson, L.D., Linko, P., Goldstein, J.A. (1983) Mitochondrial unique protein of rat steroidogenic tissues: Stoichiometry and localisation. Mol. Pharmacol., 23(1), 252257.

187. Luzikov, V.N. (1985) Mitochondrial biogenesis and breakdown. Plenum Press, New York.229; Luzikov, V.N. (1986) Proteolytic control over topogenesis of membrane proteins. FEBS Lett, 200, 259-264.

188. Maarse, A.C., Blom, J., Grivell, L.A., Meijer, M. (1992) MPI1, an essential gene encoding a mitochondrial membrane protein, is possibly involved in protein import into yeast mitochondria. EMBO J., 11, 3619-3628.

189. Maarse, A.C., Blom, J., Keil, P., Pfanner, N., Meijer, M. (1994) Identification of the essential yeast protein MIM 17, an integral mitochondrial inner membrane protein involved in protein import. FEBS Lett., 349, 215-221.

190. Mackett, M., Smith, G.L., Moss, B. (1984) General method for production and selection of infectious vaccinia virus recombinants expressing foreign genes. J. Virol., 49, 857-864.

191. Mandai, Т., Fujiwara, S., Imaoka, S. (2009) Construction and engineering of a thermostable self-sufficient cytochrome P450. Biochem. Biophys. Res. Commun., 384, 61-65.

192. Mandel, M., Higa, A. (1970) Calcium dependent bacteriophage DNA infection J. Mol. Biol., 53, 154.

193. Manna, P.R., Stocco, D. (2005) Regulation of the steroidogenic acute regulatory protein expression: functional and physiological consequences. Curr. Drug Targets Immune Endoc. Metab. Disord., 5, 93-108.

194. Manning-Krieg, U., Scherer, P.E., Schatz, G. (1991) Sequential action of mitochondrial chaperones in protein import into the matrix. EMBOJ., 10, 3273-3280.

195. Mansuy, D. (1998) The great diversity of reactions catalyzed by cytochromes P450. Сотр. Biochem. Physiol., Part C: Pharmacol., Toxicol. Endocrinol., 121, 5-14.

196. Manzella, L., Barros, M.H., Nobrega, F.G. (1998) ARH1 of Saccharomyces cerevisiae: a new essential gene that codes for a protein homologous to the human adrenodoxin reductase. Yeast, 14, 839-846.

197. Marg, A., Kuban, R.J., Behlke, J., Dettmer, R., Ruckpaul, K. (1992) Crystallization and X-ray examination of bovine adrenodoxin. J. Mol. Biol., 227, 945-947.

198. Marver, H.S., Collins, A., Tschudy, D.P., Rechcigl, M. (1966) 5-aminolevulinic acid synthetase. II. Induction in rat liver. J. Biol. Chem., 241, 4323-4329.

199. Mason, H.A. (1957) Mechanism of oxygen metabolism. Adv. Enzymol., 19, 79-223.

200. Mast, N., Andersson, U., Nakayama, K., Bjorhem, I., Pikuleva, I. (2004) Expression of human cytochrome P450 46A1 in Escherichia coli: effects of N- and C-terminal modifications. Arch. Biochem. Biophys., 428, 99-108.

201. Mathew, P.A., Mason, J.I., Trant, J.M., Waterman, M.R. (1990) Incorporation of steroidogenic pathway which produce Cortisol and aldosterone from cholesterol into nonsteroidogenic cells. Mol. Cell. Endocrinol, 73, 73-80.

202. Matocha, M.F., Waterman, M. (1986) Import and processing of P-450SCC and P-450(l 1) beta precursors by corpus luteal mitochondria: a processing pathway recognizing homologous and heterologous precursors. Arch. Biochem. Biophys., 250, 456-460.

203. Matocha, M.F., Waterman, M.,R., (1984) Discriminatory procyssing of the precursor forms of cytochrome P450scc and adrenodoxin by adrenocortical and heart mitochondria. J. Biol. Chem., 259, 8672-8678.

204. Mauersberger, S., Ohkuma, M., Schunck, W.-H., Takagi, M. (1996) Candida maltosa. In Non-conventional Yeasts in Biotechnology (Wolf, K., ed.), Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp. 411-580.

205. Mayer, A., Nargang, F.E., Neupert, W., Lill, R. (1995) MOM22 is a receptor for mitochondrial targeting sequences and cooperates with MOM 19. EMBO J., 14, 4204-4211.

206. Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. (1995) Mitochondrial protein import: leversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane Irives partial translocation and unfolding. Cell, 80, 127-137.

207. Mellon, S.H., Griffin, L.D. (2002) Neurosteroids: biochemistry and clinical significance. Trends Endocrinol. Metab., 13, 35-43

208. Miles, C.S., Ost, T.W.P., Noble, M., Munro, A.W., Chapman, S.K. (2000), Protein engineering of cytochromes P-450. Biochim. Biophis. Acta, 1543, 383 407.

209. Miller, W.L. (2007) StAR search what we know about how steroidogenic acute regulatory protein mediates cholesterol import. Mol. Endocrinol., 21, 589-601.

210. Miller, W.L. (2008) Steroidogenic enzymes. Endocr. Dev., Karger, Basel, 13, 1-18.

211. Minenko, A.N., Novikova, L.A., Luzikov, V.N., Kovaleva, I.E. (2008) Import of hybrid forms of CYP11 Al into yeast mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1780, 1121—1130.

212. Mitani, F. (1979) Cytochrome P450 in adrenocortical miochondria. Mol. Cell Biochem., 24,21-43.

213. Miura, S., Ichikawa, Y. (1994) Interaction of NADPH-adrenoferredoxin reductase with NADP and adrenoferredoxin. J. Biol. Chem., 269, 8001-8006.

214. Monte, D., De Witte, F., Hum, D.W. (1998) Regulation of the human P450scc gene by steroidogenic Factor 1 is mediated by CBP/p300. J. Biol. Chem., 273, 4535-4591.

215. Moro, F., Sirrenberg, H.C., Neuper,t W. (1999) The TIM 17-23 preprotein translocase in mitochondria: composition and function in protein transport into the matrix, EMBO J., 18, 3667 3675.

216. Morohashi, K., Honda, S., Inomata, Y., Handa, H., Omura, T. (1992) A common transacting factor, Ad4-binding protein, to the promoters of steroidogenic P-450s. J. Biol. Chem., 267, 17913-17919.

217. Morohashi, K., Sogawa, K., Omura, Т., Fujii-Kuriyama, Y., (1987) Gene structure of human cytochrome P-450(SCC), cholesterol desmolase. J Biochem. (Tokyo), 29, 879-887.

218. Muller, A., Muller, J.J., Muller, Y.A., Uhlmann, H., Bernhardt, R., Heinemann, U. (1998) New aspects of electron transfer revealed by the crystal structure of a truncated bovine adrenodoxin, Adx (4-108). Structure, 6, 269-280.

219. Muller, J.J., Lapko, A., Bourenkov, G., Ruckpaul, K., Heinemann, U. (2001) Adrenodoxin reductase-sdrenodoxin complex structure suggests electron transfer path in steroid biosynthesis. J. Biol Chem., 276, 2786-2789.

220. Murakami, H., Yabusaki, Y., Sakaki, Т., Shibata, M., Ohkawa, H. (1990) Expression of cloned yeast NADPH-cytochrome P450 reductase gene in S. cerevisiae. J.Biochem. (Tokyo), 108(5), 859-865.

221. Murakami, H., Yabusaki, Y., Sakaki, Т., Shibata, M., Ohkawa, H. (1987) A genetically engineered P450 monooxygenase: construction of the functional fused enzyme between rat cytochrome P450c and NADPH-cytochrome P450 reductase. DNA, 6, 189-197.

222. Nabi, N., Omura, T. (1983) In vitro synthesis of NADPH-adrenodoxin reductase and adrenodoxin of bovine adrenal cortex, and the existence of a large precursor of adrenodoxin. J Biochem. (Tokyo), 94(5), 1529-1538.

223. Nakai, Т., Mera, Y., Yasuhara, Т., Ohashi, A. (1994) ATP-dependent proteolysis in yeast mitochondria. J. Biochem. (Tokyo), 116, 752-758.

224. Nakayama, K., Puchkaev, A., Pikuleva, I.A. (2001) Membrane binding and substrate access merge in cytochrome P450 7A1, a key enzyme in degradation of cholesterol. J. Biol. Chem., 276,31459-31465.

225. Narhi, L.O., Fulco, A.J. (1986) Characterization of a catalytically self-sufficient 119,000-dalton cytochrome P450 monooxigenase induced by barbiturates in Bacillus megaterium. J. Biol. Chem., 261, 7160-7169.

226. Neupert, W., Herrmann, J.M. (2007) Translocation of proteins into mitochondria. Annu. Rev. Biochem., 76, 723-749.

227. Nguen, V., Argan, C., Lusty, C.J., Shore, G.C. (1986) Import and processing of hybrid proteins by mammalian mitochondria in vitro. J. Biol. Chem., 261, 800-805.

228. Nishimoto, M., Clark, J.E., Masters, B.S.S. (1993) Cytochrome P450 4A4: expression in Escherichia coli, purification, and characterization of catalytic properties. Biochemistry, 32, 8863-8870.

229. Novikova, L.A., Zubatov, A.S., Luzikov, V.N. (1981) Multiplicity of mitochondrial proteinases in yeast. FEBS Lett., 135,245-248.

230. Nunnari, J., Fox, T.D., Walter, P. (1993) A mitochondrial protease with two catalytic subunits of nonoverlapping specificities. Science, 262, 1997-2004.

231. Ogishima, Т., Okada, Y., Omura, T. (1985) Import and processing of the precursor of cytochrome P-450(SCC) by bovine adrenal cortex mitochondria. J. Biochem. (Tokyo), 98, 781791.

232. Ohashi, M., Omura, T. (1978) Presence of the NADPH-cytochrome P-450 reductase system in liver and kidney mitochondria. J.Biochem. (Tokyo), 83, 249-260.

233. Ohe, Т., Ashino, Т., Akihirobe, A. (1997) Substituent elimination from p-substituted phenols by cytochrome P450. ipso-substitution by the oxygen atom of the active species. Drug Metab. Dispos., 25, 116-122.

234. Omura Т., Sato R. (1964) The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. II. Solubilization, purification, and properties. J. Biol. Chem., 239,2379-2385.

235. Omura, Т., Ito, A. (1991) Biosynthesis and intracellular sorting of mitochondrial forms of cytochrome P450. Methods Enzymol., 206, 75-81.

236. Oonk, R.B., Parker, K.L., Gibson, J.L., Richards, J.S., (1990) Rat cholesterol side-chain cleavage cytochrome P-450 (P-450scc) gene. Structure and regulation by cAMP in vitro. J. Biol. Chem., 265, 22392-22401.

237. Orme-Johnson N.R. (1990) Distinctive properties of adrenal cortex mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1020, 213-231.

238. Osterman, J., Voss, W., Kang, P.-J., Craig, E., Neupert, W., Pfanner, N. (1990) Precursor proteins in transit through mitochondrial contact sites interact with hsp70 in the matrix. FEBS Lett., 277, 281-284.

239. Ou, W., Ito, A., Morohashi, K., Fujii-Kuriyama, Y., Omura, T. (1986) Processing-independent in vitro translocation of cytochrome P450scc precursor across mitochondrial membranes. J. Biochem. (Tokyo), 100, 1287-1296.

240. Pachecka, J., Tomaszewski, P., Kubiak-Tomaszewska, G. (2008) Cytochrome P450 polymorphis-molecular, metabolic and pharmacogenetic aspects. I. Mechanisms of activity of cytochrome P450 monooxygenases. Acta. Pol. Pharm., 65, 303-306.

241. Pacifici, R.E., Davies, K.J.A. (1990) Protein degradation as an index of oxidative stress. Methods Enzymol., 186, 485-502.

242. Page, C.C., Moser, C.C., Chen, X., Dutton, P.L. (1999) Natural engeneering principles of electron tunneling in biological oxidation-reduction. Nature, 402(6757), 47-52/

243. Pajic, A., Tauer, R., Feldmann, H., Neupert, W., Langer, T. (1994) YtalOp is required for the ATP-dependent degradation of polypeptides in the inner membrane of mitochondria. FEBS Lett., 353, 201-206.

244. Palin, M.F., Berthiaume, L., Lehoux, J.G., Waterman, M.R., Sygusch, J. (1992) Direct expression of mature bovine adrenodoxin in Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys., 295, 1, 126-131.

245. Papadopoulos, V., Guarneri, P. (1994) Regulation of C6 glioma cell steroidigenesis by adenosine 3',5'-cyclic monophosphate. Glia, 10, 75-78/

246. Parce, J.W., Spach, P.I., Cunningham, C.C. (1980) Deterioration of rat liver mitochondria under conditions of metabolite deprivation. Biochem. J., 188, 817-822.

247. Parikh, A., Guengerich, F.P. (1997). Expression, purification, and characterization of a catalytically active human cytochrome P450 lA2:rat NADPH-cytochrome P450 reductase fusion protein. Protein Expr. Purif., 9, 346-354.

248. Parikh, A., Gillam, E.M., Guengerich, F.P. (1997) Drug metabolism by Escherichia coli expressing human cytochromes P450. Nat Biotechnol., 15(8), 784-788.

249. Parker, K.L., Schimmer, B.P. (1997) Steroidogenic factor 1: a key determinant of endocrine development and function. Endocr. Rev., 18, 361-377

250. Parmar, J., Key, R.E., Rainey W.E. (2008) Development of an adrenocorticotropin-responsive human adrenocortical carcinoma cell line. J. Clin. Endocrinol. Metab., 93, 45424546.

251. Payne, A.H., Hales, D.B. (2004) Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocr. Rev., 25, 947-970.

252. Pearce, D.A., Sherman, F. (1995a) Degradation of cytochrome oxidase subunits in mutants of yeast lacking cytochrome с and suppression of the degradation by mutation of ymel. J. Biol. Chem., 270, 20879-20882.

253. Pearce, D.A., Sherman, F. (1995a) Enhanced stability of a thermody-namically stable mutant form of yeast iso-1-cytochrome c. Mol Gen Genet., 249, 155-161.

254. Pearce, D.A., Sherman, F. (19956) Diminished degradation of yeast cytochrome с by interactions with its physiological partners. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 3735-3739.

255. Pelham, H.R.B., Jackson, R.J. (1976) An efficient mRNA-dependent translation system from reticulocyte lysates. Eur. J. Biochem., 67, 247-256.

256. Pechurskaya, Т.A., Harnastai, I.N., Grabovec, I.P., Gilep, A.A., Usanov, S.A. (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun., 353, 598-604.

257. Pfanner, N., Chacinska, A. (2002) The mitochondrial import machinery: preprotein-concducting channels with binding sites for presequence. Biochim. Biophys. Acta, 1592, 15 — 24.

258. Pfanner N., Geissler A. (2001) Versality of the mitochondrial protein transport machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biology, 2, 339 349.

259. Pfanner N., Wiedemann N. (2002) Mitochondrial protein import: two membranes, three translocases. Curr. Opin. Cell Biol., 14, 400 411.

260. Pfanner, N., Rassow, J., van der Klei, I.J., Neupert, W. (1992) A dynamic model of the mitochondrial import machinery. Cell, 68, 999-1002.

261. Pikuleva, I.A. (2004) Putative F-G loop is involved in association with the membrane in P450scc (P450 11A1). Mol. Cell. Endocrinol., 215, 161-164.

262. Pikuleva, I.A., Puchkaev, A., Bjorkhem, I. (200V Putative helix F contributes to regioselectivity of hydroxylation in mitochondrial cytochrome P450 27A1. Biochemistry, 40, 7621-7629.

263. Pikuleva, I.A., Tesh, K., Waterman, M.R., Kim, Y. (2000) The tertiary structure of full-length bovine adrenodoxin suggests functional dimers. Arch. Biochem. Biophys., 373, 44-55.

264. Pompon, D. (1988) cDNA cloning and functional expression in S.cerevisiae of beta-naphthoflavine-induced rabbit liver P450 LM4 and LM6. Eur. J. Biochem., 177, 285-293.

265. Pompon, D., Truan, G., Abecassis, V. (2003), Sequence mapping of combinatorial libraries on macro- and microarrays: bioinformatic treatment of data. Methods Mol Biol., 231, 199-211.

266. Prip, B.C., Westermann, В., Schmitt, M., Langer, Т., Neupert, W., Shwarz, E. (1996) Role of the mitochondrial DnaJ homologue, Mdjlp, in the evention of heat-induced protein aggregation. FEBS Lett., 380, 142-146.

267. Pritchard, M.P., Glancey, M.J., Blak,e J.A., Gilham, D.E., Burchell, В., Wolf, C.R., Friedberg, T. (1998) Functional co-expression of CYP2D6 and human NADPH-cytochrome P450 reductase in Escherichia coli. Pharmacogenetics, 8(1), 33-42.

268. Purvis, J.L., Canick, J.A,. Mason, J.I., Estabrook, R.W., McCarthy, J.L. (1973) Lifetime of adrenal cytochrome p-450 as influenced by ACTH. Ann. NY Acad. Sci., 21B2, 319-343

269. Ravichandran, K.G., Boddupalli, S.S., Hasermann, C.A., Peterson, J.A. (1993) Crystal structure of hemoprotein domain of P450BM-3, a prototype for microsomal P450's. Science, 261,731-736.

270. Rechsteiner, M., Hoffman, L., Dubiel, W. (1993) The multi-catalytic and 26s proteases. J. Biol. Chem., 268, 6065-6068.

271. Rehling, P., Pfanner, N., Meisinger, C. (2003) Insertion of hidrophobic membrane proteins into mitochondrial membrane A guided tour. J. Mol. Biol., 326, 639-637.

272. Rep, M., Grivell, L.A. (1996) The role of protein degradation in mitochondrial function and biogenesis. Curr. Genet., 30, 367-380.

273. Rep, M., Nooy, J., Guelin, E., Grivell, L.A. (19966) Three genes for mitochondrial proteins suppress null-mutations in both Afg3 and Real when over-expressed. Curr. Genet., 30, 206-211.

274. Rep, M., van Dijl, M., Suda, K., Schatz, G., Grivell, L.A., Suzuki, C.K. (1996a) Promotion of mitochondrial membrane complex assembly by a proteolytically inactive yeast Lon. Science, 274, 103-106.

275. Reverdatto, S.V., Beilinson, V.A., Fradkov, A.F., Polushin, N.N., Efimov, V.A. (1991) Plasmid vectors for 'unclonable' DNA constructions. (1991) Nucl. Acid. Res., 24, 306-307.

276. Rhee, S.K., Icho, Т., Wickner, R.B. (1989) Structure and nuclear localization signal of the SKI3 antiviral protein of Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 5, 149-158.

277. Roise, D., Theiler, F., Horvath, S.J., Tomich, J.M., Richards, J.H., Allison, D.S., Schatz, G. (1988) Amphiphilicity is essential for mitochondrial presequence function. EMBO J., 7, 649653.

278. Rojo, E.E., Guiard, В., Neupert, W., Stuart, R.A. (1998) Sorting of D-Lactate dehydrogenase to the inner membrane of mitochondria. J. Biol. Chem., 273, 8040-8047.

279. Rojo, E.E., Guiard, В., Neupert, W., Stuart, R.A. (1999) N-terminal tail export from the mitochondrial matrix: adherence to the procaryofir 'positive inside1 rule of membrane protein topology. J. Biol. Chem., 274,19617-19722.

280. Rowley, N., Prip-Buus, C., Westermann, В., Brown, C., Schwartz, E., Barrell, В., Neupert, W. (1994) . Mdjlp, a novel chaperone of the DnaJ family, is involved in mitochondrial biogenesis and protein folding. Cell, 77,249-259.

281. Ruckpaul K., Rein H. (eds) (1989) Basis and Mechanism of Regulation of Cytochrome P450,1. Akademie-Verlag, Berlin.

282. Ryan, K.R., Menold, M.M., Garrett, S., Jensen, R.E. (1994) SMS1, a high-copy suppressor of the yeast mas6 mutant, encodes an essential inner membrane protein required for mitochondrial protein import. Mol. Biol. Cell. 5, 529-538.

283. Saberi, M.R., Shah, К., Simons," С. (2005) Benzofuran- and furan-2-yl-(phenyl)-3-pyridylmethanols: synthesis and inhibition of P450 aromatase. J. Enzyme Inhib. Med. Chem., 20, 135-141.

284. Sagara, Y., Ito, A., Omura, T. (1984) Partial purification of a metalloprotease catalyzing the processing of adrenodoxin precursor in bovine adrenal cortex mitochondria. J Biochem., 96, 1743-1752.

285. Sagara, Y., Aramaki, H. (1998) Overproduction in Escherichia coli and characterization of the precise mature form of rat adrenodoxin. Biol. Pharm. Bull., 21, 1106-1109.

286. Sagara, Y., Wada, A., Takata, Y., Waterman, M.R., Sekimizu, K., Horiuchi, T. (1993) Direct expression of adrenodoxin reductase* in Escherichia coli and the functional characterization. Biol. Pharm. Bull., 7, 627-630.

287. Sakaki, Т., Inouye, K. (2000) Practical application of mammalian cytochrome P450. J. Biosc. Bioeng., 90(6), 583-590.

288. Sakaki, Т., Kominami, S., Takemori, S., Ohkawa, H., Akiyoshi-Shibata, M., Yabusaki, M.J. (1994) Kinetic studies on a genetically engineered fused enzyme between rat cytochrome P4501Al and yeast NADPH-P450 reductase. Biochemistry, 33, 4933-4939.

289. Sakaki, Т., Sawada, N., Komai, K., Shiozawa, S., Yamada, S., Yamamoto, K., Ohyama, Y., Inouye, K. (2000) Dual metabolic pathway of 25-hydroxyvitamin D3 catalyzed by human CYP24. Eur. J. Biochem., 267, 6158-6165.

290. Sakaki, Т., Shibata, M., Yabusaki, Y., Murakami, H., Ohkawa, H. (1989) Expression of bovine cytochrome P450cl7 cDNA in Saccharomyces cerevisiae. DNA, 8, 409-418.

291. Sakaki, Т., Shibata, M., Yabusaki, Y., Murakami, H., Ohkawa, H. (1990) Expression of bovine cytochrome P450c21 and its fused enzymes with yeast NADPH-cytochrome P450' reductase in Saccharomyces cerevisiae. DNA Cell Biol., 9, 603-614.

292. Sakaki, Т., Shinkyo, R., Takita, Т., Ohta, M., Inouye, K. (2002) Biodegradation of poly chlorinated dibenzo-p-dioxins by recombinant yeast expressing rat CYP1A subfamily. Arch. Biochem. Biophys., 401, 91-98.

293. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (eds) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989

294. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, F.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467.

295. Sawada, N. Sakaki, Т., Kitanaka, S., Takeyama, K., Kato, S., Inouye, K. (1999) Enzymatic properties of human 25-hydroxyvitamin D3 la-hydroxylase. Eur. J. Biochem., 265, 950-956. s

296. Scherer, P.E., Manning, U., Jeno, P., Schatz, G., Horst, M. (1992) Identification of a 45-kDa protein at the protein import site of the yeast mitochondrial inner membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11930-11934.

297. Schiffler, В., Bureik, M., Reinle, W., Muller, E.C., Hannemann, F., Bernhardt, R. (2004) The adrenodoxin-like ferredoxin of Schizosaccharomyces pombe mitochondria. J. Inorg. Biochem., 98, 1229-1237.

298. Schiffler, В., Kiefer, M., Wilken, A., Hannemann, F., Adolph, H.W., Bernhardt, R. (2001) The interaction of bovine adrenodoxin with CYP11A1 (cytochrome P450scc) and CYP11B1 (cytochromeP450 lip). J. Biol. Chem., 276, 36225-36232.

299. Schleyer, M., Neupert, W. (1985) Transport of proteins into mitochondria: transnational intermediates spanning contact sites between outer and inner membranes. Cell, 43, 339-350.

300. Schlossmann, J., Neupert, W. (1995) Assembly of the preprotein receptor MOM72/MAS70 into the protein import complex of the outer membrane of mitochondria. J. Biol. Chem. 270, 27116-27121.

301. Schmid-Berger, N., Schmid, В., Barth, G. (1994) Yltl, a highly repetitive retrotransposon in the genome of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica. J Bacteriol., 176:2477-2482.

302. Schmidlin, J., Anner, G., Billeter, J.R., Wetterstein, A. (1955) Synthesis in aldosterone-series. I. Total synthesis of racemic aldosterone. Experientia, 11(9), 365-368.

303. Schmitt, M., Neupert, W., Langer, T. (1995) Hsp78, a Clp homologue within mitochondria, can substitute for chaperone functions of mt-hsp70. EMBOJ. 14, 3434-3444.

304. Schneider, H.C., Berthold, J., Bauer, M.F., Dietmeier, K., Guiard, В., Brunner, M., Neupert, W. (1994) Mitochondrial Hsp70/MIM44 complex facilitates protein import. Nature, 371, 768-774.

305. Schneider, H.C., Westermann, В., Neupert, W., Brunner, M. (1996) The leotide exchange factor MGE exerts a key function in the ATP-dependent le of mt-Hsp70-Tim44 interaction driving mitochondrial protein import. EMBO J., 15, 5796-5803.

306. Schuster, I., Bernhardt, R. (2007) Inhibition of cytochromes P450: existing and. new promising therapeutic targets. Drug Metabol. Rev., 39, 481-499.

307. Schwarz, D., Kisselev, P., Pfeil, W., Pisch, S., Bornscheuer, U., Schmid, R.D. (1997) Evidence that nonbilayer phase propensity is important for the side chain cleavage activity of cytochrome P450scc. Biochemistry, 36, 4262-4270.

308. Schwarz, D., Kruger, V., Chernogolov, A.A., Usanov, S.A., Stier, A. (1993) Rotation of cytochrome P450SCC (CYP11A1) in proteoliposomes studied by delayed fluorescence depolarization. Biochem. Biophys. Res. Commun., 195, 889-896.

309. Schwarz, D., Richter, W., Kruger, V., Chernogolov, A., Usanov, S., Stier, A. (1994) Direct visualization of a cardiolipin-dependent cytochrome P450scc-induced vesicle aggregation J. Struct. Biol., 113, 207-215.

310. Seaton, B.L., Vickery, L.E. (1992) Expression of human ferredoxin in Saccharomyces cerevisiae: import of the protein and assembly of the 2Fe-2S. center. Arch. Biochem. Biophys., 294, 603-608.

311. Sewer, M.B., Dammer, E.B., Jagarlapudi, S. (2007) Transcriptional regulation of adrenocortical steroidogenic gene expression. Drug Metabol. Rev., 39, 371-388.

312. Seybert, D.W., Lancaster, J.R., Jr., Lambeth, J.D., Kamin, H. (1979) Participation of the membrane in the side chain cleavage of cholesterol. Reconstitution of cytochrome P-450scc into phospholipid vesicles, J. Biol. Chem., 254, 12088-12098.

313. Shank-Retzlaff, M.L., Raner, G.M., Coon, M.J., Sligar, S.G. (1998) Membrane topology of cytochrome P450 2B4 in Langmuir-Blodgett monolayers. Arch. Biochem. Biophys., 359, 8288.

314. Sheng W.G., Cheng X.B. (2002) Using of two-step integrating technology, transducted the H and L chain gene of humanized Fab fragment of anti-HB-sAg antibody into the genome of methylotropic yeast Pichiapastoris. J. Biochem. Mol. Biol., 18, 546-550.

315. Shet, M.S., Fisher, C.W., Estabrook, R.W. (1997) The function of recombinant cytochrome P450s in intact Escherichia coli cells: the 17 alpha-hydroxylation of progesterone and pregnenolone by P450cl7. Arch. Biochem. Biophys., 339,218-225.

316. Shibata M., Sakaki, Т., Yabusaki, Y., Murakami, H., Ohkawa, H. (1990) Genetically engineered P450 monooxygenases: construction of bovine P450cl7/yeast reductase fused enzymes. DNA Cell Biol., 9, 27-36.

317. Shkumatov, V.M., Usanov, S.A., Chashchin, V.L., Akhrem, A.A. (1985) Cytochrome P-450 dependent pathways in corticosteroid hormones biosynthesis. Pharmazie, 40, 757-766.

318. Sibbesen, O., De Voss, J.J., Montellano, P.R. (1996) Putidaredoxin reductase-putidaredoxin-cytochrome p450cam triple fusion protein. Construction of a self-sufficient Escherichia coli catalytic system. J. Biol. Chem., 271, 22462-22469.

319. Sidhu, R.S., Bollon, A.P. (1987) Analysis of alpha-factor secretion signals by fusing with acid phosphatase of yeast. Gene, 54, 175-184.

320. Sikorski, R.S., Hieter, P. (1989) A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics., 122(1), 1927.

321. Singer, T. P. (1974) Determination of the activity of succinate, NADH, choline, and alpha-glycerophosphate dehydrogenases. Methods of Biochemical Analysis (Glick, D., ed.), 22, Wiley, NY, pp. 123175.

322. Sitte, N., Drung, I., Dubiel, W. (1995) Identification of a novel ATP-dependent proteolytic activity in mitochondrial intermembrane space. Biochem. Mol. Biol. Int., 36, 871-881.

323. Sivozhelezov, V., Nicolini, C. (2005) Homology modeling of cytochrome P450scc and the mutations for optimal amperometric sensor. J. Theor. Biol., 234, 479-485.

324. Smerdon, G.R., Walton, E.F., Aves, S.J. (1998) Stable production of human gastric lipase by chromosomal integration in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Appl Microbiol Biotechnol 49, 45-50.

325. Smettan, G., Shkumatov, V.M., Pommerening, K., Ruckpaul, K. (1985) Cytochrome p-450. Biochemistry, Biophysics and Induction of Cytochrome P-450 (Vereczkey, L., Mayar, K., eds.), Budapest: Akademie Kiad, pp. 207-210.

326. Smith, L.L. In: Biotechnology, Chapter 2 Steroids, 1988, pp 31-78.

327. Solish, S.B., Picado-Leonard, J., Morel, Y., Kuhn, R.W., Mohandas, Т.К., Hanukoglu, I.,

328. Miller, W.L. (1988) Human adrenodoxin reductase: Two mRNAs encoded by a single gene on chromosome i7cen-q25 are expressed in steroidogenic tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7104-7108.

329. Sollner, Т., Rassow, J., Wiedmann, M., Schlossmann, J., Keil, P.', Neupert, W., Pfanner, N. (1992) Mapping of the protein import machinery in the mitochondrial outer membrane by crosslinking of translocation intermediates. Nature, 355, 84-87.

330. Steinborn, G., Gellissen, G., Kunze, G. (2007) A novel vector element providing multicopy vector integration in Arxula adeninivorans. FEMS Yeast Res, 7,1197-1205.

331. Subramanian, M., Katyare, S.S., Fatterpaker, P., Sreenivasan, A. (1975) A protease in rat liver mitochondria: its physiological significance. Ind. J. Biochem. Biophys., 12, 307-310.

332. Suhara, K., Nakayama, K., Takikawa, O., Katagiri, M. (1982) Two forms of adrenodoxin reductase. Eur. J. Biochem., 125, 3, 659-664.

333. Suhara, K., Takemori, S., Katagiri, M., Wada, K., Kobayashi, H., Matsubara, H. (1975) Estimation of labile sulfide in iron-sulfur protein. Anal. Biochem., 68(2), 632-636.

334. Suzuki, C.K., Rep, M., van Dijl, J.M., Suda, K., Grivell, L.A., Schatz, G. (1997) ATP-dependent proteases that also chaperone protein biogenesis. Trends Biochem. Sci., 22, 118-123.

335. Suzuki, C.K., Suda, K., Wang, N., Schatz, G. (1994) Requirement for the yeast gene LON in intramitochondrial proteolysis and maintenance of respiration. Science, 264, 273-276.

336. Sz'abo, A., Langer, Т., Schroder, H., Flanagan, J., Bukau, В., and Hartl, F.U. (1994) The ATP hydrolysis-dependent reaction cycle of the Escherichia coli Hsp70 system DnaK, DnaJ, and GrpE. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10345-10349.

337. Та, D. Т., Vickery, L. E. (1992) Cloning, sequencing, and overexpression of a 2Fe-2S. ferredoxin gene from Escherichia coli. J.Biol.Chem., 267, 11120-11125

338. Takeshige, K., Baba, M., Tsuboi, S., Noda, Т., Ohsumi, Y. (1992) Auto-phagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction. J. Cell. Biol., 119, 301-311.

339. Tauer, R., Mannhaupt, G., Schnall, R., Pajic, A., Langer, Т., Feldmann, H. (1994) YtalOp, a member of a novel ATPase family in yeast, is essential for mitochondrial function. FEBS Lett., 353, 197-200.

340. The QIAexpressionist: A Laboratory Manual. (1992) DIAGEN GmbH, QIAGEN Inc., Hilden.

341. Tsujita, M., Ichikawa, Y. (1993) Substrate-binding region of cytochrome P-450SCC (P-450 XIA1). Identification and primary structure of the cholesterol binding region in cytochrome P-450SCC. Biochim. Biophys. Acta, 1161, 124-130.

342. Tuls, J., Geren, L., Lambeth, J.D., Millett, F. (1987) The use of a specific fluorescence probe to study the interaction of adrenodoxin with adrenodoxin reductase and cytochrome P-450scc. J. Biol. Chem., 262, 10020-10025.

343. Tzagoloff, A., Barrientos, A., Neupert, W., Herrmann, J.M. (2004) AtplOp assists assembly of Atp6p into the F0 unit of the yeast mitochondrial ATPase. J. Biol. Chem., 279, 19775-19780.

344. Uhlmann, H., Beckert, V., Schwarz, D., Bernhardt, R. (1992) Expression of bovine adrenodoxin and site-directed mutagenesis of 2Fe-2S. cluster ligands. Biochem. Biophys. Res. Commun., 188, 1131-1138.

345. Ullrich, V. (2006) Cytochrome P450 and biological hydroxylation reactions. Heidelberg (Springer Berlin), pp. 67-104.

346. Ungermann, C, Guiard, В., Neupert, W., and Cyr, D.M. (1996) The and Hsp70/MIM44-dependent reaction cycle driving early steps of protein import into mitochondria. EMBOJ. 15, 735-744.

347. Ungermann, C, Neupert, W., Cyr, D.M. (1994) The role of Hsp70 in conferring unidirectionality on protein translocation into mitochondria. Science. 266, 1250-1253.

348. Urban P., Truan G., Gautier J.C., Pompon D. (1993) Xenobiotic metabolism in humanized yeast: engineered yeast cells producing human NADPH-cytochrome P-450 reductase, cytochrome b5, epoxide hydrolase and P-450s. Biochem Soc Trans., 21(4), 1028-34.

349. Usanov, S.A., Chashchin, V.L., Akhrem, A.A. (1990) in Molecular Mechanisms of Adrenal Steroidogenesis and Aspects of Regulation and Application (Ruckpaul, K., Rein, H., eds.), Frontiers in Biotransformation, Vol. 3, Berlin:Akademie-Verlag, pp. 1-57.

350. Usanov, S.A., Chernogolov, A.A., Chashchin, V.L. (1990) Is cytochrome P450scc a transmembrane protein? FEBSLett., 275, 33-35.

351. Van der Laan, M., Risser, M., Rehling P. (2006) Mitochondrial preprotein translocases as dynamic molecular machines. FEMS Yeast Res., 6, 849-861.

352. Van Dyck, L., Pearce, D.A., and Sherman, F. (1994) PIM1 encodes a mitochondrial ATP-dependent protease that is required for mitochondrial function in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 269, 238-242.

353. Vickery, L.E. (1997) Molecular recognition and electron transfer in mitochondrial steroid hydroxylase systems. Steroids, 62, 124-127.

354. Vijakumar S., Salerno J. C. (1992) Mjltcular modeling of 3-D structure of cytochrome P450scc. Biochim. Biophys. Acta, 1160, 281 -286.

355. Voellmy,W.V., Goldberg,A.L. (1981) ATP-stimulated endoprotease is associated with the cell membrane of £ coli. Nature. 290, 419-421.

356. Voice, M.W., Zhang, Y., Wolf, C.R., Burchell, В., Friedberg, T. (1999) Effects of human cytochrome bs on CYP3A4 activity and stability in vivo. Arch. Biochem. Biophys., 366, 116-124.

357. Voisine, C., Craig, E.A., Zufalln von Ahsen, O., Pfanner, N., Voos, W. (1999) The protein import motor of mitochondria: unfolding and trapping of preproteins are distinct and separate functions of matrix Hsp 70. Cell, 97, 565 574.

358. Von Heijne, G. (1988) Transcending the impenetrable: how proteins come to terms with membranes. Biochim. Biophys. Acta, 947, 307-333.

359. Vonrhein, C., Schmidt, U., Ziegler, G.A., Schweiger, S., Hanukoglu, I., Schulz, G.E. (1999) Chaperone-assisted expression of authentic bovine adrenodoxin reductase in Escherichia coli. FEBS Lett., 443,167-169.

360. Vonrhein, C., Schmidt, U., Ziegler, G.A., Schweiger, S., Hanukoglu, I., Schulz, G.E. (1999) Chaperone-assisted expression of authentic bovine adrenodoxin reductase in Escherichia coli. FEBS Letters, 443, 167-169.

361. Voos, W., Gambill, B.D., Laloraya, S., Ang, D., Craig, E.A., Pfanner, N. (1994) Mitochondrial GrpE is present in a complex with hsp70 and preproteins in transit across membranes. Mol. Cell. Biol., 14, 6627-6634.

362. Wada, A., Mathew, P.A., Barnes, H.J., Sanders, D., Estabrook, R.W., Waterman, M.R. (1991) Expression of functional bovine cholesterol side-chain cleavage cytochrome P450 (P450scc) in E.coli. Arch. Biochem. Biophys., 290, 376-380.

363. Wada, A., Waterman, M.R. (1992) Identification by site-directed mutagenesis of two lysine residues in cholesterol side-chain cleavage cytochrome P450 that are essential for adrenodoxin binding. J. Biol. Chem., 267, 22877-22882.

364. Wagner, I., van Dyck, L., Savel'ev, A.S., Neupert, W., Langer, T. (1997) Autocatalitic processing of the ATP-dependent PIM1 protease: Crucial function of a pro-region for sorting to mitochondria. EMBO J., 17, 7317-7325.

365. Wagner, I., Arlt, H., van Dyck, L., Langer, Т., Neupert, W. (1994) Molecular chaperones cooperate with PIM1 protease in the degradation of misfolded proteins in mitochondria. EMBO J., 13, 5135-5145.

366. Wan, J.T., Jarrett, J. (2002) Electron acceptor specificity of ferredoxin (flavodoxin):NADP+ oxidoreductase from Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys., 406, 116126.

367. Wang, H.-P., Kimura, T. (1976) Purification and characterization of adrenal cortex mitochondrial cytochrome P-450 specific for cholesterol side-chain cleavage activity. J. Biol. Chem., 251, 6068-6074.

368. Wartmann, Т., Bellebna, C., Boer, E., Bartelsen, O., Gellissen, G., Kunze, G. (2003) The constitutive AHSB4 promoter—a novel component of the Arxula adeninivorans-based expression platform. App.l Microbiol. Biotechnol., 62, 528-535.

369. Watabe, S., Kimura, T. (1985) ATP-dependent protease in bovine adrenal cortex. Tissue specificity, subcellular localization, and partial characterization. J. Biol. Chem., 260, 5511-5517.

370. Watanabe, N., Inoue, H., Fujii-Kuriyama, Y. (1994) Regulatory mechanisms of cAMP-dependent and cell-specific expression of human steroidogenic cytochrome P450scc (CYP11A1) gene. Eur. J. Biochem., 222, 825-834.

371. Watts, K.T., Lee, P.C., Schmidt-Dannert, C. (2004) Exploring recombinant flavonoid biosynthesis in metabolically engineered Escherichia coli. Chembiochem., 5(4), 500-507.

372. Weber, H., Kurischko, C. (1989) Sexual behaviour in the alkane-utilizing yeast Yarrowia lipolytica. Yeast, 5, 279-85.

373. Werck-Reichhart, D., Feyereisen, R., (2000) Cytochrome P450: a success story. Genome Biology, 1, 3003.1-3003. .

374. Wery, J., Gutker, D., Renniers, A.C., Verdoes, J.C., van Ooyen, A.J. (1997) High copy number integration into the ribosomal DNA of the yeast Phaffia rhodozyma. Gene, 184, 89-97.

375. Westermann, В., Prip, B.C., Neupert, W., Schwarz, E. (1995) The role of the GrpE homologue, Mgelp, in mediating protein import and protein folding in mitochondria. EMBO J., 14, 3452-3460.

376. Westermann, В., Gaume, В., Herrmann, J.M., Neupert, W., Schwarz, E. (1996) Role of the mitochondrial DnaJ homolog Mdjlp as a chaperone for mitochondrially synthesized and imported proteins. Mol. Cell. Biol., 16, 7063-7071.

377. Westermann, В., Prip, B.C., Neupert, W., Schwarz, E. (1995) The role of the GrpE homologue, Mgelp, in mediating protein import and protein folding in mitochondria. EMBO J., 14, 3452-3460.

378. Wilks, A., Black, S.M., Miller, W.I., Ortiz De Montellano, P.R. (1995). Expression and characterization of truncated human heme oxygenase (hHO-1) and a fusion protein of hHO-1 with human cytochrome P450 reductase. Biochemistry, 34, 4421-4427.

379. Williams P.A., Cosme J., Sridhar V., Johnson E.F., McRee D.E. (2000) Mammalian microsomal cytochrome P450 monooxygenase: structural adaptation for membrane binding and functional diversity. Mol. Cell., 5, 121 -131.

380. Wimley, W.C., White, S.H. (1996) Experimentally determined hydrophobicity scale for proteins at membrane interfaces. Nat. Struct. Biol.,'3, 842-848.

381. Woods, S.T., Sadleir, J., Downs, Т., Triantopoulos, Т., Headlam, M.J., Tuckey, R.C. (1998) Expression of catalytically active human cytochrome P450scc in Escherichia coli and mutagenesis of isoleucine-462. Arch. Biochem. Biophys., 353, 109-115.

382. Woodward R., Sondheimer F., Taub D., Heusler K., McLamore W. (1952) J. Am. Chem. Soc., 74,4223.

383. Xia, J., Kemper, B. (2005) Structural Determinants of constitutive androstane receptor required for its glucocorticoid receptor interacting protein-1-mediated nuclear accumulation. J.Biol. Chem., 280, 7285-7293.

384. Yamamoto, R., Kallen, C.B., Babalola, G.O., Rennert, H., Billheimer, J.T., Strauss III, J.F. (1991) Cloning and expression of a cDNA encoding human sterol carrier protein 2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 463-467.

385. Yasuhara T, Mera Y, Nakai T, Ohashi A (1994) ATP-dependent proteolysis in yeast mitochondria. J Biochem., 1, 1166-1171.

386. Yoshihisa, Т., Ito, K. (1996) Pro-OmpA derivatives with a Hise tag in their N-terminal "Translocation Initiation Domains" are arrested by Ni2+ at an early post-targeting stage of translocation. J.Biol.Chem., 271, 9429-9436.

387. Youngblood GL, Nesbitt MN, Payne AH 1989 The structural genes encoding P450scc and P450arom are closely linked on mouse chromosome 9. Endocrinology. 125,2784-2786.

388. Zeghouf M, Fontecave M, Coves J. (2000) A simplifed functional version of the Escherichia coli sulfite reductase. J Biol Chem., 275, 37651-37656.

389. Zheng, X., Rosenberg, L.E., Kalousek, F., Fenton, W.A., (1993) GroEL, GroES, and ATP-dependent folding and spontaneous assembly of ornithine transcarbamylase. J. Biol. Chem., 268, 7489-7493.

390. Zollner, A., Pasquinelli, M.A., Bernhardt, R., Beratan, D.N. (2007) Protein phosphorilation and intermolecular electron transfer: a joint experimental and computational study of a hormone biosynthesis pathway. J. Am. Chem. Soc., 129, 4206-4216.

391. Zubatov, A.S., Mikhailova, A.E., Luzikov, V.N. (1984) Detection, isolation and some properties of membrane proteinases from yeast mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 787, 188195.

392. Zuber, M.X., Mason, J.I., Simpson, E.R., Waterman, M.R. (1988) Incorporation of steroidogenic pathway which produce Cortisol and aldosterone from cholesterol into nonsteroidogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 699-703.1. VIII. БЛАГОДАРНОСТИ

393. Я хочу выразить благодарность моим коллегам, которые принимали участие в этой работе. Выполнение этой работы стало возможным благодаря участию многих людей.

394. Я глубоко благодарна преподавателям кафедры биохимии Биологического факультета, благодаря труду которых у меня появился интерес к научной работе и навыки работы в лаборатории.

395. Я искренне благодарна своему учителю Валентину Николаевичу Лузикову, под руководством которого я проработала много лет. Валентин Николаевич инициировал эту работу, и без его идеологической и практической поддержки она вряд ли могла бы состояться.

396. Большое спасибо Б.Ф. Ванюшину за внимательное отношение к нашей1 работе и постоянную моральную поддержку, без которой эта работа не была бы написана.

397. Также не могу не выразить искреннюю признательность A.M. Копылову, моему первому учителю в области молекулярной биологии, и В.Л. Друца за полезные советы и большую помощь, оказанную при конструировании плазмидных конструкций.

398. Я благодарю всех членов моей семьи, которые терпеливо переносили все трудности и помогали мне на всех этапах создания этой работы.