Конструирование и функционирование рекомбинантных белков, составленных из компонентов холестеринмонооксигеназной/лиазной системы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Назаров, Павел Александрович

• Назаров, Павел Александрович
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Назаров, Павел Александрович

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Холестеринмонооксигеназная/лиазная система. Общая характеристика адренодоксина. Общая характеристика адренодоксинредуктазы. Общая характеристика цитохрома Р450зсс. Механизм действия холестеринмонооксигеназной/лиазной системы.

Перенос электронов от КАБРН к адренодоксину. Возможные механизмы превращения холестерина в прегненолон.

Взаимодействие адренодоксина с адренодоксинредуктазой и цитохромом Р450зсс.

Топология и стехиометрия компонентов холестеринмоно-оксигеназной/лиазной системы.

Регуляция активности холестеринмонооксигеназной/лиазной системы.

Гетерологическая экспрессия компонентов холестерин-монооксигеназной/лиазной системы в различных модельных объектах.

Системы экспрессии индивидуальных белков-компонентов холестеринмонооксигеназной/лиазной системы. Экспрессия гибридных (слитых) молекул, включающих компоненты Р450-монооксигеназных систем. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы.

III. 1. Реактивы и ферменты.

П.1.2. Использованные клеточные штаммы и плазмиды.

П.П. Методы.

П.П. 1. Методы работы с ДНК.

ПЛ. 1.1. Выделение ДНК.

ПЛ. 1.2. Рестриктный анализ.

П.П. 1.3. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

ПЛ. 1.4. Дефосфорилирование ДНК.

ПЛ. 1.5. Модификация концевых участков ДНК.

ПЛ. 1.6. Цитирование.

П.П. 1.7. Полимеразная цепная реакция (ПНР).

П .П. 1.8. Секвенирование.

П.П.2. Экспрессия рекомбинантных белков в клетках Е. coli и

S. cerevisiae.

П.П.2.1 Условия роста штаммов S. cerevisiae.

Н.П.2.2. Условия роста штаммов Е. coli. П.П.2.3. Трансформация клеток S. cerevisiae. II.H.2.4. Трансформация клеток Е. coli. П.П.З. Фракционирование клеток Е. coli и S. cerevisiae. ПЛ. 3.1. Выделение митохондрий из дрожжевых клеток. П.П.З.2. Получение гомогената клеток E.coli. IIЛ. 3.3. Получение вывернутых мембранных частиц клеток Е. coli. П.П.4. Анализ образцов.

П.П.4.1. Определение содержания бежа по Лоури. П.П.4.2. Электрофорез по Лэммли. ПЛАЗ. Иммуноблоттинг.

П.П.4.4. Экстракция вывернутых мембранных частиц Тритоном Х-100. П.П.4.5. Карбонатная экстракция вывернутых мембранных частиц. П.П.4.6. Обработка митохондрий трипсином и протеиназой К. П.П.4.7. Оценка содержания рекомбинантных белков.

П.П.5. Получение спектров рекомбинантных бежов. 76 П.П.6. Определение ферментативной активности рекомбинантных бежов.

Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ш. I. Результаты. 80 Ш.11. Гетерологическая экспрессия гибридных бежов в клетках

Saccharomyces cerevisiae.

IILI.1.1 Экспрессия гибридного бежа F2. 82 П1.1.1.2 Холестеринмонооксигеназная/лиазная активность изолированных митохондрий, содержащих гибридный белок

F2. 86 Ш.1.1.3 Совместная экспрессия цитохрома P450scc и гибридного бежа AdR-Ad в дрожжах. Определение холестеринмоно-оксигеназной/лиазной активности при совместной экспрессии. 87 Ш.П. Гетерологическая экспрессия гибридных бежов в клетках

Escherichia coli.

Ш.П. 1 Экспрессия гибридного бежа PAA(b-h).

Ш.П. 1.1 Конструирование pTrc99A/PAA(b-h).

Ш.П. 1.2 Идентификация гибридного бежа PAA(b-h). 93 Ш.П. 1.3 Холестеринмонооксигеназная/лиазная активность клеточных гомогенатов, содержащих гибридный белок

PAA(b-h).

П1.П. 2 Экспрессия гомологических тройных гибридных белков.

Ш.П. 2.1 Конструирование pTrc99A/PAA(h).

Ш.П. 2.2 Конструирование рТгс99АУААР (h).

Ш.П.2.2.1.Конструирование pTrc99A/AAlong(h).

Ш.Н.2.2.2. Конструирование pTrc99A/AAP(h). 102 1П.Н. 2.3 Идентификация продуктов экспрессии кДНК, кодирующих гибридные белки PAA(h) и AAP(h).

Ш.П. 2.4 Холестеринмонооксигеназная/лиазная активность тройных гомологических гибридных белков.

Ш.П. 3 Экспрессия гомологических двойных гибридных белков.

Ш.П. 1.4 Конструирование pTrc99A/AA(h).

Ш.П. 1.5 Конструирование pTrc99A/P-Ad(h).

Ш.П. 1.6 Конструирование pTrc99A/Ad-P(h). 110 Ш.П. 3 Идентификация продуктов экспрессии кДНК, кодирующих двойные гибридные белки. 111 Ш.П.5 Холестеринмонооксигеназная/лиазная активность клеточных гомогенатов, содержащих гибридные белки.

Ш. II. 6 Клеточная локализация гибридных белков.

Ш.П.7 Спектральные свойства гибридных белков.

Ш. Ш. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конструирование и функционирование рекомбинантных белков, составленных из компонентов холестеринмонооксигеназной/лиазной системы»

Формирование мультиферментных комплексов - сложный, многостадийный процесс, регулируемый на каждой стадии, начиная с синтеза мРНК и заканчивая образованием мультиферментного комплекса с оптимальной стехиометрией компонентов. К сожалению, не все стадии этого процесса в настоящее время детально изучены, и многие факторы, влияюпще на формирование мультиферментных комплексов, еще не определены.За последние пятнадцать лет обнаружены белки, в которых домены, выполняющие последовательно каскад реакций, объединены в единую полипептидную цепь, что позволяет им проявлять исключительно высокую каталитическую активность (до 1500 оборотов в минуту). В связи с этим можно было предполагать, что объединение в единую полипептидную цепь индивидуальных компонентов мультиферментных комплексов позволит избежать ряда сложностей в щ)оцессе их формирования. Действительно, конструирование гибридных (слитых) молекул значительно упрощает приемы трансформации и молекулярного клонирования, что существенно для решения ряда биотехнологических проблем. Указанный подход снимает также проблемы синхронизации процессов синтеза, транспорта и внутриклеточной компартментализации компонентов мультиферментных систем.В ряде работ показана принцшшальная возможность конструирования активных каталитических систем на основе микросомальных цитохромов Р450. Такие слитые молекулы содержат различные цитохромы Р450 и НАВРН: цитохром Р450-редуктазы. Получены экспериментальные данные, позволяющие утверждать, что, по крайней мере, в некоторых случаях слитые монооксигеназы обладают большей каталитической активностью. чем соответствующие реконструированные системы, что указывает на более эффективный внутримолекулярный перенос электронов в сравнении с межмолекулярным переносом.Аналогичные исследованоия были выполнены лишь для немногих трехкомпонентных цигохром Р450-содержапщх систем. Эти данные носят предварительный характер и не проливают в достаточной мере свет на механизмы взаимодействия активных центров в трехкомпонентных системах.Цель настоящей работы состояла в том, чтобы исследовать эту проблему на примере холестеринмонооксигеназной/лиазной системы митохондрий коры надпочечников, включающей цигохром P450scc, адренодоксин и NADPH: адренодоксинредуктазу. С этой целью было осуществлено конструирование гибридов с различными комбинациями указанных белков, синтез гибридов в клетках Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli и изучение их каталитических свойств.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Назаров, Павел Александрович

1. Сконструированы кДНК, кодирующие гибридные (слитые) белки, составленные из компонентов холестеринмонооксигеназной/лиазной системы из митохондрий коры надпочечников млекопитающих.Осуществлена экспрессия кДНК для P450scc-AdR-Ad в клетках S.cerevisiae и кДНК для P450scc-AdR-Ad, AdR-Ad-P450scc, P450scc-Ad, Ad-

P450scc и AdR-Ad в клетках E. coli.2. Измерена удельная холестеринмонооксигеназная/лиазная активность тройных гибридных белков в клеточных гомогенатах Е. coli. Удельная каталитическая активность гибридов значительно меньше активности системы, реконструированной из трех индивидуальных белков.3. Активность гибридных белков увеличивается при добавлении в среду реакции избытка одного из составляющих их компонентов (P450scc, AdR или Ad).4. Низкая активность, высокая чувствительность к эндогенным протеиназам и возможность активации трехкомпонентных гибридных белков добавленными извне партнерами свидетельствует о плохом «сочленении» каталитических доменов и конформационной неустойчивости гибридных молекул.5. Эксперименты с двухкомпонентными гибридами из P450scc, Ad и AdR показали, что формирование активного центра одного из каталитических доменов зависит от природы и расположения другого домена (см., например, данные для Ad-P и P-Ad).6. При формировании каталитических доменов в двухкомпонентных гибридах продемонстрирована экранировка активных центров отдельных доменов их белковыми партнерами (см. данные для АА, а также для Ad-P БЛАГОДАРНОСТИ Особенно хочется поблагодарить моих научных руководителей Валентина Николаевича Лузикова и Людмилу Александровну Новикову за формулировку темы и предоставление возможности проведения данной работы.Автор благодарит Друцу Валерия Львовича за проведение сайт направленного мутагенеза и множество чрезвычайно полезных советов по молекулярному клонированию и сайт-направленному мутагенезу; Богачева Александра за разрушение клеток на Franch Pressure Cell прессе; Бетина Василия за предоставление планшеточного спектрофотометра Victor 1420; Комолова Константина за предоставление центрифуги Airfuge.Работа была выполнена при финансовой поддержке РФФИ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Назаров, Павел Александрович, 2002 год

1. Miles C S . , Ost T.W.B., Noble M . , Munro A.W., Chapman S.K. Protein engineering ofcytochromes P-450. (2000) Biochim. Biophis. Acta., 1543, 383-407.

2. Munro A.W., Lindsay J.G. Bacterial cytochromes P450. (1996) Mol . Microbiol. 20,1115-1125.

3. Suhara К., Takemori S., Katagiri M . , Wada K. , Kobayashi H., Matsubara H. Estimationof labile sulfide in iron-sulfur protein. (1975) Anal. Biochem., 68(2), 632-636.

4. Grinberg A .V . , Hannemann F., Schiffler В., Muller J., Heinemann U. , Bernhardt R.Adrenodoxin: Structure, Stability, and Electron Transfer Properties. (2000) Proteins, 40, 590-612.

5. Uhlmann H. , Beckert V. , Schwarz D., Bernhardt R. Expression of bovine adrenodoxinand site-directed mutagenesis of 2Fe-2S. cluster ligands. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun., 188, 1131-1138.

6. Huang J.J., Kimura T. Studies on adrenal steroid hydroxylases. Oxidation-reductionproperties of adrenal iron-sulfur protein (adrenodoxin). (1973) Biochemistry, 12, 406409.

7. Kostic M . , Pochapsky S.S., Obenauer J., Mo H. , Pagani G.M. , Pejchal R., PochapskyТ.е. Comparision of functional domains in vertebrate-type ferredoxin. (2002) Biochemistry, 41, 19, 5978-5989.

8. Чащин B.JI. Структура и функция монооксигеназных систем митохондрий корынадпочечников. (1985) Дисс. докт. хим. наук, Институт биоорганической химии АН Белоруси, Минск.

9. Muller А., Muller J.J., Muller Y .A . , Uhlmann Н., Bernhardt R., Heinemann U . Newaspects of electron transfer revealed by the crystal structure of a truncated bovine adrenodoxin, Adx (4-108). (1998) Structure, 6, 269-280.

10. Pikuleva I.A., Tesh K. , Waterman M.R., Kim Y . The tetriary structure of full-lengthbovine adrenodoxin suggests functional dimmers. (2000) Arch. Biochem. Biophys., 373, 44-55.

11. Uhlmann H. , Kxaft R., Bernhardt R. C-terminal region of agrenodoxin affects itsstructural integrity and determines differences units electron transfer function to cytochrome P-450. (1994) J. Biol. Chem., 269, 22557-22564.

12. Grinberg A. , Bernhardt R. Effects of replacing a conserved proline residue on thefunction and stability of bovine adrenodoxin. (1998) Protein Eng., 11,1057-1064.

13. Huang J.J., Kimura T. Specific role of reduced adrenodoxin in adrenal mitochondrialsteroid hydroxylases. (1971) Biochim. Biophis. Res. Commun., 45, 1065-1070.

14. Sugiama T., Yamano T. Purification and crystalysation of NADPH-adrenodoxinreductase from bovine adrenocortical mitochondria. (1975) FEBS Lett., 52, 1, 45-48.

15. Ziegler G.A., Vonrhein C , Hanukoglu I., Schulz G.E. The structure of adrenodoxinreductase of mitochondrial P450 systems: electron transfer for steroid biosynthesis. (1999) J. Mol . Biol. , 289, 981-990.

16. Ziegler G.A., Schulz G.E. Crystal structures of adrenodoxin reductase in complex withNADP'^ and N A D P H suggesting a mechanism for the electron transfer of an enzyme family. (2000) Biochemistry, 39, 10986-10995.

17. Hiwatashi A. , Ichikawa Y. Purification and properties of tightly bound reduced NADPHadrenodoxin reductase of bovine adrenocortical mitochondria. (1982) J. Biochem., 92, 2, 335-342.

18. Suhara K. , Nakayama K. , Takikawa O., Katagiri M . Two fonns of adrenodoxinreductase (1982) Eur. J. Biochem., 125, 3, 659-664.

19. Watanabe T., Horie S. Studies on P-450. X . On The Coordination structure ofHemoprotein P-450. (1976) J. Biochem., 79,4, 829-840.

20. White R.E., Coon M.J . Heme ligand replacement reaction of cytochrome P-450.Characterization of the binding site of the axial ligand trans to thiolate as oxygen. (1982) J. Biol. Chem., 257, 6, 3073-3083.

21. Horie S., Watanabe T. Properties of high spin type P-450 preparation from bovineadrenal cortex mitochondria. (1975) J. Steroid Biochem., 6,3-4, 401-409.

22. Wang H.-P., Kimura T. Purification and characterization of adrenal cortex mitochondrialcytochrome P-450 specific for cholesterol side-shain cleavage activity. (1976) J. Biol. Chem., 251, 19, 6068-6074.

23. Omura Т., Sato R. (1964) J. Biol. Chem., 239, 2370-2378. Omura T, Sato R, Cooper DY,Rosenthal O, Estabrook RW. Function of cytochrome P-450 of microsomes. (1965) Fed Proc. 24,5, 1181-1189.

24. Williams P.A., Cosme J., Sridhar V. , Johnson E.F., McRee D.E. Mammalian microsomalcytochrome P450 monooxygenase: structural adaptation for membrane binding and functional diversity. (2000) Mol . Cell, 5,121-131.

25. Poulos T.L., Finzel B.C., Howard A.J. Crystal structure of substrate-free Pseudomonaspufida cytochrome P450. (1986) Biochemistry, 25, 5314-5322.

26. Park S.Y., Yamane K. , Adachi S., Shiro Y . , Weiss K.E. , SUgar S.G. Crystallization andpreliminary X-ray diffraction analysis of a cytochrome P450 (CYP119) from Sulfolobus solfataricus. (2000) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 56, 1173-1175.

28. Hasemann C A . , Ravichandran K.G. , Peterson J.A., Deisenhofer J. Crystal structure andrefinement of cytochrome P450terp at 2.3 A resolution. (1994) J. Mol . Biol., 236, 11691185.

29. Cupp-Vickery J.R., Poulos T.L. Structure of cytochrome P450eryF involved inerytromycin biosynthesis. (1995) Nat. Struct. B i o l , 195, 144-153.

30. Woods S.T., Sadleir J., Downs Т., Triantopoulos Т., Headlam M.J., Tuckey R.C.Expression of catalytically active human cytochrome P450scc in Escherichia coli and mutagenesis of isoleucine-462. (1998) Arch. Biochem. Biophis., 353, 1, 109-115.

31. Vijakumar S., Salerno J.C. Molecular modeling of the 3-D structure of cytochromeP450SCC. (1992) Biochim. Biophis. Acta, 1160, 281-286.

32. Usanov S.A., Chemogolov А.А., Chashchin V . L . Is cytochrome P-450scc atransmembrane protein? (1990) FEBS Lett., 275, 1-2, 33-35.

34. Hechter O., Pincus G. Genesis of the adrenocortical secretion. (1954) Physiol. Rev., 34,459-496.

35. Orme-Johnson N.R. Distinctive properties of adrenal cortex mitochondria. (1990)Biochim. Biophis. Acta, 1020, 213-231.

36. Mason H.A. Mechanism of oxygen metabolism. (1957) Adv. Enzymol., 19, 79-223.

37. Solomon S., Levitan P., Lieberman S. Possible intermediates between cholesterol andpregnenolone in corticosteroidogenesis. (1956) Rev. Can. Biol., 15, 282.

38. Shimizu К., Dorfman R.I., Gut M . Isocapric acid, a metabolite of 20ahydroxycholesterol. (1960) J. Biol. Chem., 235,1, 25.

39. Shimizu K. , Hayano M . , Gut M . , Dorfman R.I. The transformation of 20ahydroxycholesterol to isocapric acid and C21 steroids. (1961) J. Biol. Chem., 236, 3, 695-699.

40. Shimizu K. , Hayano M . , Gut M . , Dorfman R.I. 20a,22s-dehydroxycholesterol, anintermediate in the biosynthesis of pregnenolone (3p-hydroxypregn-5-en-20 one) from cholesterol. (1962) 237, 2, 699-702.

41. Constantopoulos G., Tchen T.T. Cleavage of cholesterol side-chain by adrenal cortex.(1961) J. Biol . Chem., 263,1, 65-67.

42. Constantopoulos G., Tchen T.T. Conversion of 20a-hydroxycholesterol to pregnenolone.(1961) Biochem. Biophis. Res. Communs., 4, 6, 460-463.

43. Constantopoulos G., Satoh P.S., Tchen T.T. Cleavage of cholesterol side-chain byadrenal cortex. III. Identification of 20a, 22E-hydroxycholesterol as an intermediate. (1962) Biochem. Biophis. Res. Communs., 8, 1, 50-55.

44. Hall P.P., Koritz S.B. Inhibition of the biosynthesis of pregnenolone by 20hydroxycholesterol. (1964) Biochim. Biophis. Acta, 93, 2, 441-444.

45. Burstein S., Gut M . Biosynthesis of pregnenolone. (1971) Rec. Prog. Hormone Res., 27,303-349.

46. Burstein S., Gut M . A preliminary report on the intermediates in the conversion in vitroof cholesterol to pregnenolone in adrenal preparations. (1969) Steroids, 14, 2, 207-217.

47. Burstein S., Kimball H.L., Gut M . Transformation of labeled cholesterol, 20ahydroxycholesterol, (22R)-22-hydroxycholesterol by adrenal acetone-dried preparations from guinea pigs, cattle and man: II Kinetic studies. (1970) Steroids, 15, 809-857.

48. Van Lier J.E., Rousseau J. Mechanism of cholesterol side-chain cleavage: enzymicrearrangement of 20a-hydroperidoxy-20-isocholesterol to 20a,21-dihydroxy-20isocholesterol. (1976) FEBS Lett., 70, 1, 23-27.

49. Kimura T. A C T H stimulation on cholesterol side chain cleavage activity ofadrenocortical mitochondria. Transfer of the stimulus from plasma membrane to mitochondria. (1981) Mol . Cell Biochem., 36, 105-122.

51. Ivanov Y.D. , Usanov S.A., Archakov A.I. Optical biosensor studies on the productivecomplex formation beween the components of cytochrome P450scc dependent monooxygenase system. (1999) Biochem. Mol. Biol. Int., 47, 327-336.

52. Lambeth J.D., Seybert D.W., Lancaster J.R. Jr., Salerno J.C., Kamin H. Steroidogenicelectron transport in adrenal cortex mitochondria. (1982) Mol. Cell Biochem., 45, 13-31.

53. Tuls J., Geren L. , Lambeth J.D., Millet F. The use of specific fluorescence probe to studythe interaction of adrenodoxin with adrenodoxin reductase and cytochrome P-450scc. (1987) J. Biol. Chem., 262, 21, 10020-10025.

54. Coghlan V . M . , Vickery L.E. Side-specific mutation in human ferredoxin that affectbinding to ferredoxinreductase and cytochrome P450scc. (1991) J.BioI.Chem., 266, 28, 18606-18612.

55. Vickery L .E . Molecular recognition and electron transfer in mitochondrial steroidhydroxylase systems. (1997) Steroids, 62, 124-127.

56. Matocha M.F., Waterman M.R. Discriminatory processing of the precursor forms ofcytochrome P-450scc and adrenodoxin by adrenocortical and heart mitochondria. (1984) J. Biol. Chem., 259, 8672-8678.

57. Luster M.I., Lawson L.D., Linko P., Goldstein J.A. Mitochondrial unique protein of ratsteroidogenic tissues: Stoicheometry and localisation. (1983) Mol. Pharmacol, 23, 1, 252-257.

58. Hanukoglu I., Hanukoglu Z. Stoichiometry of mitochondrial cytocromes P450,adrenodoxin, NADPH-cytochrome P450 reductase. (1986) Eur. J. Biochem., 157, 2731.

59. Monte D., DeWitte F., Hum D.W. Regulation of the human P450scc gene bySteroidogenic Factor 1 is mediated by CBP/p300. (1998) J. Biol . Chem., 273, 8, 45354591.

60. Picado-Leonard J., Voutilainen R., Kao L . - C , Chung В., Strauss III J.F., Miller W.L.Human adrenodoxin: Cloning of three cDNAs and cycloheximide enhancement in JEG-3 cells. (1988) J. Biol. Chem., 263, 3240-3244; corrected 11016.

61. Lin D., Shi Y . , Miller W.L. Cloning and sequence of the human adrenodoxin reductasegene. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87, 1955-1962.

62. Mathew P.A., Mason J.I., Trant J.M., Waterman M.R. Incorporation of steroidogenicpathway which produce Cortisol and aldosterone from cholesterol into nonsteroidogenic cells. (1990) Mol. Cell. Endocrinol, 73, 73-80.

63. Minowa O., Sogawa K. , Higashi Y . , Fujii-Kuriyama Y . Functional expression ofmicrosomal and mitochondrial cytochrome P-450 (d and SCC) in COS-7 cells from cloned cDNA. (1990) Cell Struct. Funct., 15, 21-30.

64. Hu M.C. , Quo I.e., Lin J.H., Chung B.C. Regulation expression of cytochrome P-450scc(cholesterol-side-chain cleavage enzyme) in cultured cell lines detected by antibody against bacterially expressed human protein. (1991) Biochem. J., 274, 813-817.

65. Савельев A.C. , Новикова Л.А., Друца В.Л., Исаева Л.В., Черноголов A . A . ,Усанов А., Лузиков В.Н. Синтез инекоторые аспекты топогенеза цитохрома P450SCC быка в дрожжах. (1997) Биохимия, 62, 3-11.

66. Wada A. , Mathew P.A., Barnes H.J., Sanders D., Estabrook R.W., Waterman M.R.Expression of functional bovine cholesterol side-chain cleavage cytochrome P450 (P450SCC) in E.coU. (1991) Arch. Biochem. Biophys., 290, 376-380.

67. Лепешева Г.И., Усанов C A . Сравнительная структурная и иммунохимическаяхарактеристика рекомбинантного и природного цитохромов P450scc (CYP11A1). (1998) Биохимия, 63, 2, 265-276.

68. Seaton B.L. , Vickery L.E. , Expression of human ferredoxin in Saccharomycescerevisiae: import of the protein and assembly of the 2Fe-2S. center. (1992) Arch. Biochem. Biophys., 294, 603-608.

69. Brandt M.E. , Vickery L.E. Expression and characterization of human mitochondrealferedoxin reductase in E.coli.(1992) Arch. Biochem. Biophys., 294, 2, 735-740.

72. Jose J., Bernhardt R., Hannemann F. Functional display of active bovine adrenodoxin onthe surface of E. coli by chemical incorporation of the 2Fe-2S. cluster. (2001) Chembiochem., 2,9,695-701.

74. Palin M.F., Berthiaume L. , Lehoux J . G , Waterman M.R., Sygusch J. Direct expressionof mature bovine adrenodoxin in Escherichia coli. (1992) Arch. Biochem. Biophis., 295, 1, 126-131.

75. Akiyoshi-Shibata М., Sakaki Т., Yabusaki У., Murakami Н., Ohkawa Н. Expression ofbovine adrenodoxin and NADPH-adrenodoxin reductase cDNA in S.cerevisiae. (1991) D N A Cell B i o l , 10,613-621.

76. Harikrishna J.A., Black S.M., Szklarz G.D., Miller W.L. Construction and function offusion enzymes of the human cytochrome P450scc system. (1993) DNA Cell B i o l , 12, 5, 371-379.

77. Проблема белка. II. Пространственное строение белка. (1996) Наука, Москва.

78. Проблема белка. IV. Структура и функция белка. (2000) Наука, Москва.

79. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии. (1981) Мир,Москва.

80. Narhi L.O., Fulco A.J . Identification and characterization of tv^o functional domain incytochrome P450 BM3, a catalytically self-sufficient monooxigenase induced by barbiturates in Bacillus megaterium. (1987) J. B i o l Chem., 262, 6683-6690.

81. Govindaraj S., Poulos T.L. The domain architecture of cytochrome P450 BM3. (1997)J. B i o l Chem., 272, 7915-7921.

83. Murakami H., Yabusaki Y. , Sakaki Т., Shibata M . , Ohkawa H. A genetically engineeredP450 monooxygenase: Construction of the functional fused enzyme between rat cytochrome P450c and NADPH- cytochrome P450 reductase. (1987) DNA, 6, 3, 189197.

86. Helvig C , Capdevila J.H. Biochemical characterization of rat P450 2C11 fused to rat orbacterial NADPH-P450 reductase domain. (2000) Biochemistry, 2, 39,17, 5196-5205.

87. Shet M . , Fisher C.W., Holmans P.L., Estabrook R.W. The omega-hydroxilation of lauricacid to dodecanedioic acid by a purified recombinant fusion protein containing P450 4A1 andNADPH-P450 reductase. (1996) Arch. Biochem. Biophis., 330, 1, 199-208.

88. Chaurasia C.S., Alterman M.A. , Lu P., Hanzlik R.P. Biochemical characterization oflauric acid omega-hydroxilation by a CYP4Al/NADPH-cytochrome P450 reductase fusion protein. (1995) Arch. Bioche. Biophis., 317, 1,161-169.

89. Shet M.S., Fisher C.W., Holmans P.L., Estabrook R.W. Human cytochrome P450 3A4:enzymatic properties of a purified recombinant fusion protein containing NADPH-P450 reductase. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90, 11748-11752.

90. Guengerich P.P. Human cytochrome P450 enzymes. (1995) Cytochrome P450:Structure, Meshanism and Biochemistry. New York: Plenum Press, 14, 473-535.

91. Guengerich P.P. Cytochrome-P450 enzymes. (1993) Am. Sci., 81, 440-447.

92. Shiota N . , Kodama S., Inui H. , Okhawa H. Expression of cytochrome P450 l A l andP450 1A2 as fused enzymes with yeast NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase in transgenic tobacco plants. (2000) Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 10, 2025-2033.

93. Wilks A. , Black S.M., Miller W.L., Ortiz de Montellano P.R. Expression andcharacterization of trancated human heme oxygenase (hHO-1) and a fusion protein of hHO-1 with human cytochrome P450 reductase. (1995) Biochemistry 34,4421-4427.

94. Morohashi К., Nonaka Y . , Kirita S., Hatano О., Takakusu A. , Okamoto M . , Omura T.Enzymatic activités of P450(llß)s expressed by two cDNA in COS-7 cells. (1990) J. Biochem., 107, 635-640.

95. Lacour T., Ohkawa H. Engineering and biochemical characterization of the ratmicrosomal cytochrome P4501A1 fused to ferredoxin and ferredoxin-NADP"^ reductase from plant chloroplasts. (1998) Biochim. Biophis. Acta, 1433, 87-102.

96. Dilworth F.J., Black S.M., Guo Y.-D. , Miller W.L., Jones G Construction of a P450c27fusion enzyme: a useful tool for analysis of vitamin D3 25 hydroxylase activity. (1996) Biochem. J., 320, 267-271.

97. Cao P.-r., Bulow H. , Dumas В., Bernhardt R. Construction and characterization of acatalytic fusion protein system: P450iip-adrenodoxinreductase-adrenodoxin. (2000) Biochim. Biophis. Acta, 1476, 253-264.

98. Sibbesen 0., De Voss J.J., Ortiz de Montellano P.R. Putidoredoxin reductaseputidoredoxin-cytochrome P450cam triple fusion protein. (1996) J. Biol. Chem., 271, 13, 22462-22469.

99. Vonrhein С , Schmidt U . , ZieglerG.A., Schweiger S., Hanukoglu I., Schulz G.E.Chaperone-assisted expression of authentic bovine adrenodoxin reductase in Escherichia coli. (1999) FEBS Lett., 443, 167-169.

100. Kozlov D.G., Prahl N . , Efremov B.D., Peters L., Wambut R., Kaprychev I.V., EldarovM.A. , Benevolensky S.V. Host cell properties and external pH affect proinsulin production by Saccharomyces yeast. (1995) Yeast, 11, 8, 713-724.

101. Pompon D. cDNA cloning and functional expression in S. cerevisiae of betanaphthoflavine-induced rabbit liver P450 LM4 and LM6. (1998) Eur. J. Biochem., 177, 285-293.

102. Krynetski E.Yu. , Drutsa V .L . , Kovaleva I.E., Luzikov V .N . High yield expression offunctional active human liver CYP2D6 in yeast cells. (1995) Pharmacogenetics, 5, 103109.

103. Amann E., Ochs В., Abel K.-J . Tightly regulated tac promoter vectors for the expressionof unfused and fused proteins in Escerichia coli. (1988) Gene, 69, 301-315.

104. Маниатис T., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. (1984) Мир,Москва.

105. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. (1990) Наука, Новосибирск.

106. Fermentas Catalogue&Product Application Guide.

107. Birboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction method for screening recombinantplasmid DNA. (1979) Nucl. Asids Res., 7, 6, 1513-1522.

108. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. (1999) Мир. Москва.

109. Herrmann J.M., Folsch H. , Neupert W., Stuart R.A. (1994) in Cell Biology: A1.boratory Handbook, V o l l , 538-544.

110. Yoshihisa T., Ito К. Pro-OmpA derivatives with a HiSô tag in their N-terminal"Translocation Initiation Domains" are arrested by Ni^"^ at an early post-targeting stage of translocation. (1996) L Biol. Chem., 271, 16, 9429-9436.

111. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L . , Randal R.J. Protein measurement with theFolin phenol reagent. (1951) J. Biol. Chem., 193, 265-270.

112. Laemmli U .K. Cleavage of structural protein during the assembly of the headbacteriophage T-4. (1970) Nature, 227, 680-685.

113. Adams D.J., Seilman S., Amelizad Z., Oesch P., Wolf C.R. Identification of humancytochromes P450 analogous to forms induced by phénobarbital and 3methylcholanthrene in the rat. (1985) J. Biochem., 232, 869-876.

114. Bollag D .M. , Edelstein S.T. Protein metods. (1991) Wiley-Liss Inc, New York, 72-73.

115. Черноголов A . A . , Шварц Д., Усанов А. Селиктивная химическаямодификацияцитохрома P450scc(CYPl 1А1) дииодофлуоресцеиниодацетамидом в исследовании роли и топологии междоменного участка молекулы гемопротеина. (1996) Биохимия, 61,2103-2115.

117. X u Z., Horwich A .L . , Sigler P.B. The crystal stmcture of the asymmetric GroEL-GroES(ADP)7 chaperonin complex. (1997) Nature, 388, 741-750.

119. Kusmierczyk A.R., Martin J. Chaperonins - keeping a lid on folding proteins. (2001)FEBS Lett.,505, 343-347.

120. SavePev A.S., Novikova L .A. , Kovaleva I.E., Luzikov V .N . , Neupert W., Langer T.(1998) J. Biol. Chem., 273, 20596-20602.