Консервация и гарантированное сохранение родококков EX SITV тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Каменских, Татьяна Никодимовна

• Каменских, Татьяна Никодимовна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Каменских, Татьяна Никодимовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ

Обзор литературы

Глава 1. ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS

1.1. Распространение в природе

1.2. Приуроченность отдельных видов родококков к определенным условиям существования и пищевым субстратам

Глава 2. АДАПТИВНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТЫ КАК СПОСОБ ВЫЖИВАНИЯ РОДОКОККОВ IN SITU

2.1. Механизмы адаптации родококков к различным экологическим условиям

2.1.1. Клеточная стенка

2.1.2. Синтез протекторных и запасных соединений

2.1.3. Плеоморфизм. Цикл развития

2.1.4. Олиго- и диауксотрофность

2.1.5. Естественная колониально-морфологическая изменчивость

2.1.6. Адгезия и колонизация поверхности

2.2. Экологическая стратегия

Глава 3. КОНСЕРВАЦИЯ И ДЛИТЕЛЬНОЕ ХРАНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР EX SITU

3.1. Современные представления об анабиозе микроорганизмов

3.2. Общая характеристика и особенности приемов хранения коллекционных культур

3.3. Практический опыт хранения родококков в мировых и отечественных коллекциях чистых культур

Экспериментальная часть

Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Рабочая коллекция

4.2. Условия культивирования

4.3. Консервация чистых культур

4.4. Контроль чистоты и жизнеспособности

4.5. Проверка сохранения исходных физиолого-биохимических

свойств

4.6. Определение клеточного жирно-кислотного профиля

4.7. Исследование интенсивности эндогенного дыхания

4.8. Статистическая обработка экспериментальных данных

Глава 5. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОВ ХРАНЕНИЯ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ ВЫЖИВАЕМОСТЬ И СТАБИЛЬНОСТЬ ИСХОДНЫХ СВОЙСТВ RHODOCOCCUS SPP

5.1. Испытание традиционных методов краткосрочного

хранения бактериальных культур

5.1.1. Высушивание с иммобилизацией на твердых

носителях

5.1.2. Применение "голодных" сред

5.1.3. Хранение под вазелиновым маслом

5.2. Низкотемпературное замораживание

5.3. Лиофилизация как основной метод длительного поддержания коллекционного фонда чистых культур

5.3.1. Влияние условий лиофилизации и последующего хранения на жизнеспособность. Перспективы долгосрочной консервации

5.3.2. Изучение стабильности исходных свойств лиофилизированных культур

Глава 6. ПОИСК СПЕЦИФИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ КОНСЕРВАЦИИ АЛКАНОТРОФНЫХ РОДОКОККОВ

6.1. Влияние среды предварительного культивирования на устойчивость родококков к естественному высушиванию

6.2. Криоконсервация алканотрофных родококков

6.3. Сравнительное изучение выживаемости лиофилизированных родококков в зависимости от условий предварительного выращивания

6.4. Обобщение информации о методах консервации и

хранения коллекционных культур

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Консервация и гарантированное сохранение родококков EX SITV»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В преддверие XXI столетия, когда экологические проблемы приобретают все более угрожающий характер, в центре внимания мировой науки и национальных правительственных органов становится разработка Всемирной стратегии защиты и сохранения разнообразия жизни на Земле на уровне генов, видов, экосистем (Ившина, 1992). Как обозначено в Международной программе "Diversitas", особое внимание должно быть уделено «группам микроорганизмов, имеющим функциональное значение для биосферы и экосистем», а также «созданию специализированных региональных центров и информационных сетевых сообщений» (Haksworth, Aguirre-Hudson, 1994). Поэтому не случайно, все больший удельный вес приобретают коллекции живых культур, как «механизм, гарантирующий сохранение микробного разнообразия ex situ и делающий микроорганизмы доступными для использования и изучения человеком» (Microbial Diversity..., 1991).

В результате многолетней исследовательской работы в Институте

экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН (ИЭГМ

/

УрО РАН) создана первая на Урале профилированная коллекция микробных ресурсов, специализирующаяся на поддержании и изучении практически ценных для биотехнологии и охраны окружающей среды культур (Ившина, 1992; Ivshina, 1996, 1997). Большую часть коллекции составляют нокардио-формные эубактерии, объединенные в род Rhodococcus (Zopf 1891) Good-fellow and Alderson 1977 сем. Nocardiaceae Castellani and Chalmers 1919 nop. Actinomycetales Buchanan 1917, выделенные из контрастных эколого-географических зон, характеризующиеся высокой устойчивостью к экстремальным условиям и обладающие значительным биохимическим потенциа-

/

лом. Основная биологическая функция родококков - окисление природных и антропогенных газообразных (С3-С4), жидких w-алканов и ароматических

углеводородов. Они - постоянные и доминирующие компоненты естественного биоценоза нефтяных загрязнений (Ившина и др., 1981, 1987) и сапрофитного бактериального комплекса городских почв (Лысак, Сидоренко, 1997). Экологическая значимость родококков обусловлена широким диапазоном их толерантности к экстремальным абиотическим факторам, таким как температура, влажность, рН среды; способностью к олиготрофному и алканотрофному образу жизни; высокой сопротивляемостью конкурентам; диауксотрофными свойствами; реализацией адаптивных механизмов в условиях действия экологических стрессоров. В настоящее время в центре внимания многих исследователей находятся вопросы изучения биологии алка-нотрофных родококков и их адаптации к изменяющимся условиям внешней среды (Коронелли и др., 1990, 1994, 1997). Несомненный интерес представляет выяснение биохимических адаптационных механизмов при переключении с одного источника углеродного питания на другой.

Многие представители родококков имеют важное значение как продуценты ценных веществ: аминокислот, витаминов, ферментов, биополимеров, антибиотиков, биоПАВ (Нестеренко, 1985; Ившина и др., 1987; Ivshina et al., 1996, 1998; Finnerty, 1992). Синтезируемая ими ферментная система обладает широкой специфичностью и катализирует реакции биотрансформации практически всех классов органических соединений-загрязнителей (анилина, фенолов, эфиров фталевых кислот, стероидов и т.д.). Перспектива использования алканотрофных родококков в различных областях защиты окружающей среды и биотехнологии - от биоиндикации углеводородных залежей до интенсификации процессов биодеградации нефтяных загрязнений, от синтеза микробного белка на природном газе и до биокатализа в тонком органическом синтезе - требует надежных методов долгосрочного хранения производственно-ценных культур без потери их исходных свойств. Природная изменчивость родококков, обеспечивающая приспособляемость к неблагоприятным условиям in situ, одновременно создает проблему их

хранения ex situ, так как использование микроорганизмов в биотехнологии основано на стандартизации и исключении появления нежелательных вариантов. Поэтому выяснение условий поддержания культур без утраты или снижения их практически важных свойств особенно актуально.

В литературе описаны различные способы консервации большого разнообразия физиологических групп микроорганизмов (Сидякина, 1990; Lel-liott, 1965; Lapage, Redway, 1973; Heckly, 1978; Kirsop, 1991). В последнее время предлагается много новых и эффективных методов длительного сохранения коллекционных и производственных культур (Ротмистров и др., 1990; Доронина и др., 1992; Фельдман, Маханева, 1994; Henry, Kirsop, 1989; Malik, 1990, 1996; Gherna, 1994), однако большинство работ проведено с патогенными бактериями, а в отношении алканотрофных родококков подобные сведения весьма немногочисленны (Ившина и др., 1994; Wellington, Williams, 1978).

Традиционно в микробиологии испытывали и применяли для хранения организмы, предварительно выращенные на богатых органических средах. Однако использование богатой питательной среды для родококков, активно осуществляющих синтез на основе углеводородных субстратов трудноусвояемых для других микроорганизмов, представляется не совсем корректным. Так, культивирование на мясопептонном агаре приводит к повышению антибиотикочувствительности, а, следовательно, к снижению конкурентноспособности (Ившина и др., 1990), снижению содержания липидных компонентов клеточных оболочек, облегчающих потребление гидрофобного углеводородного субстрата (Милько, Егоров, 1991; Коронелли и др., 1993, 1994), уменьшению биохимической активности в отношении ряда ксенобиотиков (Ротмистров и др., 1990). В связи с этим актуален поиск способов хранения родококков, реализующих биохимические возможности при росте их на углеводородном субстрате, с учетом активного функционирования окси-геназного ферментного комплекса.

Обычно подбор методов хранения микроорганизмов идет в направлении изучения влияния внешних факторов (состава защитных сред, глубины замораживания, режима высушивания и т.п.) на выживаемость клеток после консервации. Это важно и актуально по сей день, однако специальная подготовка бактериальной биомассы с осознанием биохимических процессов, происходящих в клетке при изменении условий существования, реализация «самоконсервации» на основе механизмов адаптации микроорганизмов к неблагоприятным условиям среды может позволить добиться максимального результата в получении жизнеспособной культуры.

у

По свидетельству некоторых научных публикаций (Endangered ..., 1992) в настоящее время реально существует опасность потери отдельных ценных микробных коллекций из-за ряда внешних (ассигнования, штаты, оборудование) и внутренних (научные стандарты работы персонала) факторов. Как показывает практика (Сидякина, 1990), одновременное использование нескольких методов хранения для поддержания микроорганизмов конкретной таксономической группы позволяет избежать возможной потери коллекционных фондов под влиянием вероятности заражения культуры посторонней микрофлорой или потери исходной биохимической активности

у

при хранении. В связи с этим очевидна необходимость создания дублирующей коллекции сохраняемого генофонда.

В соответствии с современными требованиями решение проблем получения и обмена научной информацией осуществляется путем развития глобально разветвленных компьютеризированных баз данных (БД) о микроорганизмах и их характеристиках (Kalakoutskii, Mazanov, 1997), в том числе и специализированных компьютерных БД по методам хранения микроорганизмов (Melkozernov et al., 1993). Создание поискового каталога коллекции алканотрофных микроорганизмов в виде компьютеризированной БД, используемой в каналах Всемирной системы Internet, представляет возможность расширить поиск, сравнение и анализ информации о средах культиви-

рования и рекомендуемых методах консервации родококков для широкого круга исследователей.

В этой связи, цель настоящего исследования - разработка оптимальных методов сохранения жизнеспособности и стабилизации потенциально биотехнологически ценных свойств Шгойососсиз Брр. с учетом биологических особенностей их клеток. Формирование дублирующей коллекции культур родококков и автоматизированной базы данных по методам их хранения.

Конкретные задачи:

1. Испытание традиционных методов консервации микроорганизмов с целью подбора эффективных способов сохранения чистых культур Вкойосос-шэ рр.

у

2. Изучение влияния условий предварительного культивирования клеток родококков на их жизнеспособность и биохимическую активность при хранении различными способами.

3. Разработка новых методов и рекомендаций по консервации и последующему хранению коллекционных культур родококков с учетом их структурных и физиолого-биохимических особенностей.

4. Оценка рациональной продолжительности хранения Шойососст эрр.

5. Формирование автоматизированной базы данных по методам консервации и условиям хранения штаммов, поддерживаемых в Региональной

У

профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ.

Научная новизна работы. Апробирован широкий спектр методов для сохранения чистых культур Шюйососсш ърр. Показано, что наиболее оптимальный и надежный метод долгосрочной консервации родококков -высушивание их под вакуумом из замороженного состояния (лиофилиза-ция).

Впервые исследована зависимость жизнеспособности сохраняемых клеток от источника углеродного питания в среде предварительного культивирования родококков. Установлено, что клетки с углеводородным питанием, обладающие определенными структурными и физиолого-биохимическими особенностями, более устойчивы к действию неблагоприятных внешних факторов - замораживанию и высушиванию. Показано влияние уровня десатурации клеточных жирных кислот -йа жизнеспособность и длительность хранения лиофилизированных клеток алканотрофных родококков.

Практическое значение. Подобраны оптимальные методы консервации культур Rhodococcus spp., гарантирующие сохранение их жизнеспособности и исходных свойств. Предложен новый способ высушивания клеток на мембранных фильтрах. К практическому использованию для длительного хранения родококков рекомендован метод лиофилизации. Создана дублирующая коллекция сублимирован-ных чистых культур Rhodococcus spp.,

/

Gor dona spp., Dietzia spp. Рекомендовано поддержание штаммов-деструкторов и продуцентов практически ценных веществ по оптимизированным схемам хранения. На основе пакета программы СУБД Paradox (версия 4.5.) сформирована компьютеризированная база данных по методам консервации и хранения штаммов родококков в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Международной научной конференции "Environmental Pollution (ICEP'95)", Санкт-Петербург, 1995; Международной конференции "Перспективы развития естественных наук на Западном Урале", Пермь, 1996; Международной конференции "Microbial Diversity: current situation, conservation strategy, and ecological aspects (ICOMTO'96)", Пермь, 1996.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей и 14 рисунками; состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальной части, обсуждения и выводов. Список литературы включает 228 наименований работ, в том числе 137 отечественных и 91 зарубежных авторов.

Диссертационная работа выполнена на базе лаборатории алканотроф-ных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН и является частью исследований, проводимых в ней, по биологии и систематике бактерий рода Rhodococcus.

у

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

/

Глава 1. ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS

1.1. Распространение в природе

Еще до недавнего времени сапрофитным бактериям рода Rhodococcus не уделялось достаточно большого внимания. Между тем они имеют чрезвычайно широкий ареал распространения и встречаются практически во всех типах почв различных почвенно-климатических зон, а также в разнообразных водных экосистемах - пресных и морских, полярных и тропических, т.е. являются космополитами (Нестеренко и др., 1985; Ившина и др., 1987; Аристархова, 1989; Коронелли и др., 1994; Goodfellow, 1983, 1989). Широкие экологические возможности родококков обусловлены их высокой устойчивостью к эктремальными условиями существования.

Значительный температурный диапазон роста многих родококков позволяет им размножаться в снегу (Могилевский и др., 1979) и водах Антарктики (Коронелли и др., 1994), в почвах пустынь и сухих тропиков, испытывая недостаток влаги (Добровольская и др., 1986, 1997; Cross et al. 1976). У многих исследованных родококков рост наблюдается при температуре от 10° до 40°С (Goodfellow, Alderson, 1977). Пропан и //-бутанусваивающие ро-дококки обнаруживаются в водах родников, питающихся из районов нефтяных месторождений, при температуре 6° - 8°С (Ившина и др. 1981).

Выдерживая высокие концентрации минеральных солей, они успешно развиваются в пластовых водах нефтяных месторождений с содержанием соли до 267 г/л (Бердичевская, 1989), в воде и илах соленых лиманов и солевых промыслов, засоленных почвах и морских экосистемах (Нестеренко, 1982; Коронелли и др., 1994).

Родококки в природе проявляют жизнедеятельность в широком диапазоне реакции среды, хотя оптимум рН для их роста 7,0-7,4 (Теппер, 1976; Goodfellow, 1983).

Будучи аэробными организмами, родококки развиваются и при незначительных концентрациях кислорода (1 мг/л среды), обитают в углеводородном слое при низком парциальном давлении кислорода в газовой фазе (в 10-25 раз ниже атмосферного давления кислорода воздуха) (Бердичевская, 1983).

Выживаемость родококков под действием повреждающего и мутагенного ультрафиолета значительно выше, чем у других бактерий, использующих углеводороды. Клетки G. (R.) rubropertinctus сохраняют жизнеспособ-

л

ность даже при дозе облучения 7,5 тыс. эрг/мм (Лысенко, Демина, 1981; Егоров и др., 1986).

Широкое расселение этой группы бактерий обусловлено и чрезвычайным разнообразием трофических возможностей. Представители разных видов родококков занимают разные пищевые ниши в экосистемах. Подавляющее большинство родококков использует в качестве единственных источников питания алифатические углеводороды - газообразные и жидкие //-алканы, низкомолекулярные органические кислоты, ароматические и фе-нольные соединения (Нестеренко и др., 1985; Ившина, 1987; Paje et al., 1997). Они усваивают многие труднодоступные для других бактерий соединения - гумусовые вещества, лигнин и его производные, развиваются на средах с широким диапазоном концентраций органических веществ - от очень низких до очень высоких (Квасников, Клюшникова, 1981; Аристархо-ва, 1989). В богатом органическом субстрате нуждаются отдельные представители Rhodococcus (R. equi, R. rhodnií), вызывая опасные заболевания человека и животных. При этом следует подчеркнуть, что по результатам генетического анализа они занимают обособленное место в системе филогенетического родства в пределах рода (Rainey et al., 1995). Интересно отметить,

что этот факт был недавно подтвержден с помощью иммунохимического анализа (Ившина, 1997), а также метода антибиотикотипирования родокок-ков (Куюкина, 1997).

1.2. Приуроченность отдельных видов родококков к определенным условиям существования и пищевым субстратам

Большинство видов Rhodococcus выделяется из естественных и техногенных субстратов: R. erythropolis, R. rhodochrous, R. ruber, R. fascians, R. "longus", R. opacus и др. (Нестеренко и др., 1985; Ившина и др., 1981; 1995; Лысак, Сидоренко, 1997). Родококки являются наиболее стабильным и значительным компонентом биоценозов, если последние несут антропогенную нагрузку или природное углеводородное насыщение. Их количество тем выше, чем более загрязнена нефтью экосистема, - от полного отсутствия в чистой территории до почти 100 %-ного в сильно загрязненной (Ившина, 1982; Коронелли и др., 1994).

По результатам исследований О.А.Нестеренко с сотр. (1985) первое место по частоте встречаемости в почвах Украины принадлежит виду R. erythropolis (56 %). Представители этого вида, а также вида R. luteus (R. fascians) выделены Л.В.Лысак и Н.Н.Сидоренко (1997) из всех без исключения почвенных образцов с разными типами антропогенной нагрузки (ди-хлорфенол, углеводороды нефти, цементная пыль, костная мука), отобранных в Московской обл. Родококки доминируют в нижних слоях лесной подстилки, где идут активные процессы разложения растительного опада (Лысак и др., 1992). На столь значительное и повсеместное распространение родококков указанных видов влияет, очевидно, их способность к утилизации самого широкого спектра органических веществ. Это было подтверждено результатами исследований И.Б.Ившиной с сотр. (1995) на штаммах R. erythropolis и R. luteus (R. fascians), выделенных из разнообразных мест оби-

тания сопредельных и географически удаленных районов бывшего Советского Союза. у

При исследовании видового состава микроорганизмов, населяющих подземные воды и подпочвенные отложения в районе нефтеносных площадей, обнаружено численное преобладание двух видов доминантов - R. rho-dochrous и R. ruber. Они отличаются высокой биохимической активностью и широкими деструктивными возможностями. В результате многолетних исследований по изучению закономерности распространения алканотрофных родококков, ассимилирующих газообразные гомологи метана (пропан и н-бутан), в грунтовых водах и почвах нефтеносных и непродуктивных районов Пермского Предуралья, Удмуртии, Ульяновского Поволжья и Белоруссии подтверждена приуроченность данной группы к контуру нефтеносных структур (Ившина, 1982). Средний уровень численности пропан- и н-бутанокисляющих родококков достигает 105-106 клеток/мл в нефтезагряз-ненных почвенных образцах и 103-104 клеток/мл в подземных и поверхностных водах, что в несколько раз больше, чем гетеротрофных микроорганизмов, учитываемых высевом на мясопептонном агаре, разведенном в 10 раз (Ившина и др., 1981). Данные виды Rhodococcus служат специфическими индикаторами при поиске нефти и газа, а также используются в системе мониторинга углеводородного загрязнения и для очистки нефтезагрязненных территорий.

Вид R. coprophilus, численность которого в навозе травоядных животных составляет 105-106 клеток/г, требует для роста веществ, образуемых анаэробными бактериями рубца жвачных - жирных кислот и тиамина. Представители R. coprophilus высеваются из субстратов и стоков, прилегающих к молочным фермам. Данный вид предлагается в качестве индикаторного на фекальное загрязнение водоемов (Al-Diwany, Cross, 1987).

Некоторые виды родококков, в отличие от свободноживущих, выделены из биологического материала: R. corallinus — из кишечйого тракта тара-

канов с острова Пасхи; R. rhodnii - от кровососущего клопа Rhodnius prolixus\ G. (R.) bronchialis - из мокроты больных, страдающих туберкулезом легочной полости; R. equi - от животных, больных гнойным лимфаденитом и из крови больных СПИД (The Prokaryotes, 1981; Prescott, 1991).

В последнее время появляется значительное количество сообщений, описывающих инфекционные поражения, вызываемые родококками, ранее считавшимися непатогенными для человека. Так, вид G. (R.) bronchialis вызывает легочные заболевания у человека, R. equi - пневмонию, саркоидозы и остеомиелит (Goodfellow et al., 1993; Hall, 1994). В течение последнего десятилетия считается, что вид R. equi является важным патогеном животных, вызывая бронхопневмонию, энтерит, лимфаденит, выкидыши и другие заболевания (Finnerty, 1992). Среди родококков известны и фитопатогенные формы. Бактерии вида R. fascians вызывают образование пучков у двудольных и однодольных растений, что характеризуется потерей доминирования верхушки и нарастания боковых почек. Эти бактерии эпифитны, живут на поверхности ткани хозяина, где они и продуцируют цитокинины. Штаммы R. fascians очень отличаются по степени их патогенности. Вирулентные штаммы выделяют больше цитокининов, чем слабые и не вирулентные (Sabartefa/., 1986).

Более углубленное изучение экологии родококков позволило подойти к решению вопроса об эконишах на видовом уровне. По мнению Р.Х.Уиттекера (1980) в нишах с ограниченными ресурсами конкуренция приводит вымиранию одного из двух видов, тогда как в условиях большого обилия и разнообразия пищевых ресурсов конкурирующие виды, имеющие выраженное экологическое сходство, могут встречаться совместно и не являются в почве сильными конкурентами. Вероятно, этим объясняется большое видовое разнообразие родококков, обнаруживаемое в естественных субстратах разной степени загрязнения нефтью и нефтепродуктами. Характерные и преобладающие представители подобных экосистем - родококки с

широкими деструктивными возможностями: R. erythropolis, R. fascians (R. Intens), R: opacus, R. "longus" (Коронелли, 1994; Ившина и др., 1995). Обнаружение нескольких видов газоокисляющих родококков (R. rhodochrous, R. ruber) в почве нефтеносных районов и существование, как правило, одного вида в подземных водах над нефтяным месторождением, очевидно, обусловлено действием углеводородных газов. Это указывает на строгую приуроченность отдельных видов к определенным условиям существования и способность усваивать те или иные пищевые субстраты (Ившина, 1982; Ившина и др., 1995).

Таким образом, бактерии рода Rhodococcus обладают широким спектром возможных сред обитания - от богатых питательными веществами (организм человека и животных, растения) до олиготрофных (грунтовые воды, снег, воздух) мест и необъятным географическим ареалом распространения. Это вряд ли было бы возможно без наличия внутренних регуляторных механизмов, обеспечивающих приспособление к изменяющимся условиям существования. Рассмотрению некоторых адаптивных изменений, обеспечивающих разнообразные способы существования микроорганизмов и, в частности, родококков в природе, посвящены следующие главы литературного обзора.

Глава 2. АДАПТИВНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТЫ КАК СПОСОБ ВЫЖИВАНИЯ РОДОКОККОВ IN SITU

Многие микроорганизмы сохраняются в природе, несмотря на сравнительно частое наступление неблагоприятных условий существования (Калакуцкий, Сидякина, 1987). Как известно (Дин, Хиншельвуд, 1956), приспособления микроорганизмов к изменившимся условиям идут, в основном, за

i

счет реорганизации внутри структуры отдельных клеток и путем отбора соотношений между различными типами микробов, содержавшихся в популяции. На практике оба механизма могут действовать совместно. Способность организмов видоизменяться в направлении, увеличивающем его шансы на выживание и размножение в условиях данной среды, называют адаптацией (Hochschka, Somero, 1973). Это понятие - биологическая аксиома.

2.1. Механизмы адаптации родококков к различным экологическим условиям

Изучение морфологии и биохимии клеток Rhodococcus позволило выявить наличие целого ряда особенностей строения и функционирования, обусловливающих экологическую пластичность представителей не только на уровне рода, но и отдельного вида. Это уникальность строения клеточных оболочек, естественная колониально-морфологическая изменчивость (диссоциация) и связанная с ней изменчивость многих физиолого-биохимических свойств, адгезия и колонизация поверхности, плеоморфизм

и цикл развития, синтез протекторных и запасных соединений, олиго- и диа-

/

уксотрофность и др. (Ившина, 1997). 2.1.1. Клеточная стенка

Известно, что клеточная поверхность является посредником при взаимодействии клетки с окружающей средой, принимая участие в обмене веществ и защищая от вредных факторов среды. Родококки, как установлено

(Ившина и др., 1982; Глазачева и др., 1990; Милько, Егоров, 1991), образуют снаружи клеточной стенки капсулоподобные структуры.

Капсула представляет собой внешний слой клеточной стенки, образующийся в определенных условиях культивирования микроорганизмов (Ка81х^1, е1 а1., 1986). Легко теряя связь с клеточной стенкой, она переходит в культуральную среду в виде слизи. Капсула и/или свободная слизь родо-кокков являются внеклеточными полисахаридами нейтральной или кислой

природы. Масса суммарной фракции капсульных и внеклеточных полисаха/

ридов может не только приближаться к массе бактериальной клеточной биомассы, но и превышать ее. Так, выход экзополисахаридов Я. етуЖгороШ и Я. Шет {Я. /азЫат) достигает 5-10 г/л используемой среды (Лысак и др., 1992).

Судя по количеству и функциональной значимости (защита от действия высоких и низких значений рН, повышенной температуры, детергентов, биоцидов, высушивания и замораживания, повреждающего действия ультрафиолета и т.д.), экзополисахариды играют немаловажную роль, обеспечивая экологическое преимущество и позволяя выжить в неблагоприятные периоды жизнедеятельности (Пирог и др., 1997; ZQ■vQnhшzQn, 1966). В пользу этого утверждения свидетельствует и тот факт, что большинство представителей рода Якойососсш выделяются из почвы в слизистом состоянии, теряя его при поддержании на богатых лабораторных средах (Лысак и др., 1992). Следует все же заметить, что до конца биологическая роль экзополисахаридов у родококков еще не изучена.

Клеточная стенка родококков представляют собой особую структуру, химический и композиционный состав которой довольно хорошо исследован (Нестеренко и др., 1985; Мшшкш, 1982; ЬесЬеуаНег ер а1., 1985; 1агНег, №кшск), 1994). Главное место среди структурных и функциональных компонентов клеточных оболочек родококков принадлежит липидам, которые составляют до 25 % от сухой биомассы клеток. Липиды родококков своеоб-

разны по химическому составу. Они содержат, помимо обычных, в значительных количествах группы соединений, свойственные только этим бактериям и отсутствующие у других организмов, например, некоторые фосфо-липиды, необычные гликолипиды, пептидолипиды и пептидогликолипиды, миколовые кислоты (Коронелли, 1977, 1980, 1984; Нестеренко и др., 1980а; Alvarez et al., 1997).

Своеобразный состав клеточных оболочек обусловлен важнейшей биологической особенностью алканотрофных родококков - аккумуляцией углеводородных газов (пропана и я-бутана) и углеводородов, входящих в состав нефтей и нефтепродуктов с транформацией их в биомассу (Ившина и др., 1987). Установлено, что общее содержание липидов в клетках R.

У

rhodochrous, выращенных на w-додекане было почти вчетверо больше, чем в клетках, выращенных на глюкозе (Sorkhoh et al., 1990). По данным Дж.Весталл и Дж.Перри (Vestal, Perry, 1971) клетки штамма Mycobacterium vaccae (Rhodococcus sp.), выращенного на пропане или н-бутане, содержали приблизительно в 2 раза больше липидов, чем клетки, выращенные на ацетате, изопропаноле или пропионате.

Для родококков и родственных им организмов родов Mycobacterium, Corynebacterium, Nocardia характерны гликолипиды, представленные в основном моно- и димиколатами трегалозы, тетраэфиром трегалозы, а также другими ацилпроизводными трегалозы (Kretschmer et al., 1982; Minnikin, 1982; Kim et al., 1990; Singer et al., 1990). Указанные соединения, а также некоторые другие комплексы полисахаридов и липидов обладают сурфактант-ной активностью - эмульгируют углеводороды и улучшают смачивание клеточной поверхности углеводородами, обеспечивая диффузию их через клеточную мембрану (Kretschmer et al., 1982; Wagner et al., 1983).

Наиболее лабильными компонентами клеточных липидов, играющими важную роль в адаптивных приспособлениях родококков к экстремальным условиям существования, являются жирные кислоты (Смирнов и др., 1987).

Последние входят в состав различных классов сложных липидов: фосфо-, глико-, пептидолипидов, липополисахаридов, локализованных в поверхностных структурах и контролирующих внутреннюю среду клеток. Содержание свободных жирных кислот в клетках родококков невелико (Нестеренко и др., 1980а).

Состав жирных кислот в значительной степени подвержен влиянию внешних факторов (наличие специфического углеводородного питания, фазы роста, колебания температуры, влажности, pH, солености), а, следовательно, зависит от места обитания или среды культивирования. Это связано с адаптацией микроорганизмов к неблагоприятным внешним условиям и способствует сохранению их метаболической активности за счет структурных перестроек, изменяющих проницаемость и текучесть мембран, а также модификаций ферментных систем (Говорун и др., 1993; Хочачко, Сомеро, 1981). Наиболее изученным механизмом модификаций в составе липидов являются изменения в степени десатурации жирных кислой при температурном стрессе (Byrne, Chapman, 1964; MacLeod, Calcott, 1976; Thammavongs et al., 1996; FlorinCristensen et al., 1997; Sakamoto et al., 1998). При понижении температуры происходит компенсаторное повышение степени ненасыщенности жирных кислот мембранных липидов, что уменьшает вязкость мембран и обеспечивает поддержание необходимого для нормального функционирования клетки жидкого состояния липидов (Russell, 1984). Для многих микроорганизмов установлен и другой способ адаптации: высокое содержание кислот с короткой (Сю) углеродной цепью (Фунтикова и др., 1992; Волков, 1994; Canillac et al., 1982; Hilliger et al., 1984; Annous, et al., 1997).

Известная способность родококков существовать в экстремальных температурных условиях, по-видимому, определяется успешно реализуемым механизмом адаптации за счет изменения проницаемости и текучести мембран при модификациях уровня десатурации. Т.В.Коронелли с сотр. (1994) установили, что содержание ненасыщенных жирных кислот и кислот с не-

/

четным числом атомов углерода в клетках у свежевыделенных арктических родококков составляет более 80 %, а количество короткоцепочечных у некоторых штаммов — почти 50 %. Однако при хранении в лаборатории эти черты сглаживаются: вдвое уменьшается количество ненасыщенных кислот и многократно количество нечетных. Наличие миколовых кислот - характерный признак для бактерий рода Rhodococcus. Его представители, обитающие в арктической зоне, содержат большое количество моно- и диеновых соединений в составе миколовых кислот, что обеспечивает достаточную «жидко-стность» липофильных слоев клеточной стенки (Коронелли и др., 1993, 1994).

Специфичность углеводородного питания значительно влияет на состав жирных кислот родококков. Так, клетки микобактерий {Rhodococcus spp.), выращенные на среде с нормальными углеводородами С13 - Qg, в максимальном количестве содержат кислоты, соответствующие по длине цепи исходному углеводороду или содержащие на два атома углерода меньше (Красильников и др., 1972). При использовании низкомолекулярных субстратов (С2 - С4) длинноцепочечные жирные кислоты образуются из двууг-леродных фрагментов и здесь влияние субстрата не выражено так резко, как при выращивании культур на высокомолекулярных н-алканах. В жирнокис-лотных спектрах родококков, исследованных Т.В.Коронелли с соавт. (1994) и выращенных на среде с я-гексадеканом, преобладали насыщенные кислоты с четным числом С-атомов.

2.1.2. Синтез протекторных и запасных соединений

Многочисленные факты указывают на то, что определенные продукты метаболизма микроорганизмов являются средством биохимической адаптации к неблагоприятным условиям среды (Феофилова, 1994; Ившина, 1997; Postgate, 1967; Ausborneía/., 1994).

Как показал анализ литературных данных (Ившина, 1982; Ившина и др., 1995), основное биологическое свойство родококков - способность их к аккумуляции газообразных и жидких н-алканов и трансформации их в биомассу - определяет многие уникальные, специфические особенности метаболической организации данной группы эубактерий. Так, следствием их жизнедеятельности на среде с углеводородами в качестве единственного источника углерода является не только изменение их клеточной структуры -от гиперсинтеза внутри цитоплазматических мембран и клеточной стенки (Ившина и др., 1982; Глазачева и др., 1990) до появления новых функциональных трофических антигенов (Ившина и др., 1985), но и появление новых физиологических черт - от сверхсинтеза экстрацеллюлярных аминокислот (Ившина, 1982; Ившина, Безматерных, 1987) и биосурфактантов (Iv-shina et al,, 1996, 1998; Wagner et al., 1983) до повышения резистентности к антимикробным агентам (Ившина и др., Г990) и т.д.

Пигменты. Среди родококков широко распространены пигментированные формы, которые дают желтые, оранжевые, красные, розовые, оранжево-красные, палевые колонии (Нестеренко и др., 1985), большинство из них являются каротиноидами. Благодаря своему строению молекулы каро-тиноидов принимают участие в важных физиологических процессах живой клетки: в размножении и образовании переживающих форм, играют роль защитной "буферной системы" и посредника электронов Уу ряда бактерий (Феофилова, 1974). Широко известные защитные функции этих пигментов от действия видимого и ближнего ультрафиолетового света, а также ионизирующего облучения обусловливают широкое распространение на открытом загрязненном воздухе и в высокогорьях с повышенной радиацией (Жизнь микробов ..., 1981).

Известна биологическая функция каротиноидов как природных анти-оксидантов, предотвращающих клеточные липиды от процессов перекисно-го окисления (Владимиров, Арчаков, 1972). В этой связи, каротиноидные

пигменты газоокисляющих R. ruber играют, очевидно, особую роль. Окисление алкановых субстратов катализируется индуцируемыми системами ок-сигеназ или оксидаз (Ившина и др., 1987), для которых характерна двойная функция: гидроксилирование и пероксидация. Поэтому, нарастание интенсивности перекисного окисления липидов в бактериальных клетках при периодическом культивировании может быть вязано с активацией оксигеназ-

/

ных ферментных систем, осуществляющих гидроксилирование компонентов среды (Берия и др., 1991; Исмаилов, 1994). Наличие у родококков пигментного каротиноидного комплекса, а также ферментной системы высокой ка-талазной активности (Ившина и др., 1987), которые представляют собой 2-х ступенчатую систему антиоксидантной защиты, можно рассматривать как адаптационный механизм, защищающий клетку от накопления продуктов окисления при использовании алканотрофными родококками предельно восстановленных углеводородных субстратов.

Не исключена возможность участия каротиноидных пигментов в про/

цессе дыхания родококков. В силу своеобразного химического строения эти соединения, содержащие ненасыщенные двойные связи, рассматриваются как потенциальные оксигеназы (Феофилова, 1974).

По структуре пигменты родококков весьма разнообразны и специфичны. Так, у всех исследуемых С.Такайчи с сотр. (Takaichi et al., 1997) штаммов R. rhodochrous, выявлены производные каротиноидов, не обнаруженные у других организмов и представляющие собой эфиры миколовых кислот каротиноидных глюкозидов. Установлено, что эти остатки миколовых кислот

подобны клеточным миколовым кислотам. Бактерии рода Rhodococcus, ус/

ваивающие углеводородные газы (С3-С4), представлены исключительно пигментированными (красными и красно-оранжевыми) формами (Ившина и др., 1985,1995).

Аминокислоты. К особенностям метаболизма газоокисляющих родококков относится и сверхсинтез экстрацеллюлярных аминокислот в услови-

ях выращивания клеток на газообразных н-алканах: аргинйна, валина, гис-тидина, лизина, фенилаланина (Ившина, 1982). В присутствии пропана ро-дококки синтезируют более широкий спектр аминокислот, чем при выращивании их на минеральной среде с глюкозой (Ившина и др., 1987). В последние годы широко обсуждается вопрос о роли аминокислот в процессах экологической адаптации как протекторов, защищающих основные клеточные биополимеры и липиды от повреждений за счет стабилизации структуры липидного бислоя и встроенных белковых доменов (Волков, 1994; Феофи-лова, 1994; Popova, 1997). В этой связи может быть высказано предположение, что за счет структурной стабилизации и повышения осмотического давления путем накопления внутри клеток «совместимых» веществ, компенсирующих повышенное осмотическое давление среды, вероятно, возрастает метаболическая сопротивляемость клеток алканотрофных родококков к действию неблагоприятных факторов внешней среды, в частности высоких концентраций солей. Так, Н.И.Матвеева с соавт. (1997) установили 5-20-кратное увеличение внутриклеточной концентрации аминокислот у нефтео-кисляющих штаммов Corynebacterium sp. и D. (R.) maris.

В научных публикациях обсуждается и взгляд на сверхсинтез отдельных метаболитов как на шунтовый механизм, направленный на выживание клеток при неблагоприятных внешних условиях (реакция на истощение субстрата) и невозможность размножаться далее с максимальной скоростью (Акименко, 1989; Ившина, 1997; Рощина, Петров, 1997). Реакция на стресс осуществляется путем обратимого снижения интенсивности клеточного метаболизма и выходом из клеток различных метаболитов, в том числе аминокислот.

Биосурфактанты. Синтез и выделение в среду родококками экстра-целлюлярных гликолипидов, действующих как поверхностно-активное вещество, осуществляется, как правило, при росте на углеводородах (Коронелли и др., 1994; Ivshina et al., 1996, 1998). Эмульгирующий эффект исследовате-

ли связывают с наличием в стенках этих бактерий моно- и димиколатов тре-галозы, а также другими её ацилпроизводными. Что касается роли гидрофильного компонента гликолипида родококков - трегалозы, то к настоящему времени этот вопрос недостаточно изучен. Однако, следует отметить, что трегалоза, входящая в состав клеточных липидов родококков, является широко известным природным протектором в мире микробов, играющим роль в выработке устойчивости к повреждающим факторам и стабилизирующим мембранные системы клеток, тем самым, способствуя более высокой жизнеспособности (Зикманис, 1987). Роль трегалозы полифункциональна. Помимо функции стабилизации мембран она используется как источник резервного углерода в период онтогенетического анабиоза путем быстрого разложения трегалозы до глюкозы. Влияет и на процесс свободнорадикального окисления, так как между активностью ее синтеза и наличием АО/(5-метил-2-этил-3-оксипиридин) существует положительная корреляция (Терешина и др., 1991).

Запасные вещества. Возможность длительного сохранения жизнеспособности в физиологических интервалах значений температуры и влажности может быть обусловлена значительным количеством в клетке резервных энергетических веществ, а также тех биополимеров, которые могут быть использованы в энергетических целях без потери клеткой жизнеспособности (Торможение ..., 1987). Для родококков характерно присутствие в клетках запасных веществ, которые накапливаются при избытке экзогенных субстратов и используются клеткой при недостатке подобных веществ. Причем бактерии этой группы - полизапасающие организмы: в их клетках одновременно присутствуют и полисахариды, и жировые включения, и гранулы волютина (Ившина и др., 1982, 1987). Цитологические исследования клеток Rhodococcus spp. позволили выявить большое число округлых структур, соответствующих включениям поли-р-оксибутирата (Ившина и др., 1987). Известно, что клетки, обладающие запасом поли-р-оксимасляной кислоты

(ПОМК), обеспечивают себя источником углерода и энергии, благодаря чему способны существовать в олиготрофных условиях, сохраняя метаболическую активность (Слабова и др., 1990; Бонарцева и др., 1994). ПОМК - вещество довольно метаболически инертное, но вместе с тем легко гидроли-зуемое, а его мономеры быстро вовлекаются в основной энергетический цикл клетки. При значительном накоплении ПОМК клетки могут изменять свою морфологию, что выражается, например, у пропанокисляющих родо-кокков в появлении деформированных клеток (Ившина и др., 1987).

Исследованиями И.Б.Ившиной с соавт. (1982) установлено, что в цитоплазме R. ruber и R. rhodochrous, выращенных на пропане, отмечается увеличение числа и размеров гранул волютина по сравнению с таковым при культивировании на мясопептонном агаре. Активное накопление макроэргов свидетельствует о высокой интенсивности процессов метаболизма (Са-ралов и др., 1995) и значительном биологическом потенциале вида, поскольку полифосфаты выполняют функцию фосфатных депо и источников энергии, необходимой для фосфорилирования АДФ до АТФ, а также для участия в регулировании роста микроорганизмов, посредством связывания поливалентных ионов или ферментов (Громов, 1985).

2.1.3. Плеоморфизм. Цикл развития

Родококки отличаются наличием клеточного плеоморфизма и трехступенчатого цикла развития, включающего образование рудиментарного и хорошо развитого первичного мицелия, который фрагментируется на палочки и кокковидные клетки. Жизненный цикл представителей рода Rhodococcus осуществляется за 24-48 часов, реже за несколько суток. Продолжительность морфологического цикла и степень плеоморфизма зависит от состава среды, условий культивирования, видовой и штаммовой принадлежности (Нестеренко и др., 19806; Ившина и др., 1987). При культивировании R. ruber на минеральной среде в атмосфере пропана или //-бутана суще-

ственно увеличивается продолжительность жизненного цикла родококков по сравнению с культурами, выращенными на богатой органической среде. Распад мицелия на кокковидные и овально-сферические формы наблюдается на 4-5 сутки роста.

Наличие мицелиальной фазы роста у родококков некоторых видов определяет преимущества, которыми обладают мицелиальные организмы (проникновение через поверхности раздела фаз, колонизация нового пространства, транспорт питательных веществ на расстояния и др.) (Калакуцкий, Арге, 1977) и подтверждает особую приспособленность данной группы к условиям существования.

Фрагментация ветвящегося мицелия на клетки меньших размеров является эффективным процессом клеточного деления, причем жизнеспособными обычно остаются свыше 98 % укороченных элементов (Аристархова, 1989). Бесспорно, при большом числе клеток вероятность сохранить жизнеспособность популяции выше. Кроме того, при уменьшении клеток в размерах увеличивается отношение клеточной поверхности к объему и повышается способность к утилизации субстратов, находящихся в следовых количествах. Поэтому, по мнению В.И.Аристарховой (1989), соответствующие изменения организации вегетативных клеток родококков определяют их способность к замедленному росту в особых микронишах.

2.1.4. Олиго-и диауксотрофность

Способность родококков использовать крайне низкие концентрации субстрата позволяет отнести их к олиготрофиой микрофлоре (Yanagita et.al., 1978). Ярко выраженным характером олиготрофности обладают родококки, ассимилирующие газообразные углеводороды. Слабая растворимость углеводородных газов, в силу их физической особенности, приводит к быстрому формированию газовой фазы, находящейся в равновесии с растворенным газом, так что организмы оказываются в условиях постоянно^ низкой концен-

трации питательного субстрата (Заварзин, 1979). Высокая интенсивность развития газоокисляющих эубактерий в районах миграционных потоков углеводородных газов служит доказательством окисления последних при непосредственном участии алканотрофных родококков (Ившина и др., 1987). Полагают (Климова и др., 1993), что специфические особенности олиго-трофных бактерий обусловлены особенностями строения их мембран. В частности, эти бактерии обладают более широким спектром мембранассоции-рованных белков, по сравнению с евтрофными, что может отражать большое разнообразие транспортных систем у олиготрофов.

Для алканотрофных родококков характерна олиготрофная кинетика роста: низкие скорости роста (Коронелли, Нестерова, 1990); низкие затраты энергии на нужды поддержания (Аминов, 1987); высокое сродство к субстрату которое способствует увеличению поглощения питательных веществ даже без изменения площади поверхности клетки (Коронелли, Юферова, 1990); способность к увеличению отношения площади поверхности к объему за счет дробления и наличии выростов клеток, усваивающих углеводородный субстрат (Нестеренко и др.,1985; Ившина и др., 1987).

Диауксотрофностъ родококков выражается в способности представителей одного вида переключаться с углеводного типа питания на углеводородный с индукцией монооксигеназного ферментного комплекса, то есть усваивать субстраты, требующие для их утилизации синтеза разнообразных наборов ферментов. Комбинация углеводного и углеводородного субстрата влияет на характер его утилизации родококками. ^Исследованиями В.С.Гузева с сотр. (1997) установлено, что глюкоза в концентрации до 1 мг/г почвы может на порядок увеличить плотность популяции углеводородокис-ляющих бактерий в почве и тем самым ускорить процесс разложения дизельного топлива. По мере увеличения количества глюкозы скорость утилизации снижается и плотность популяции снижается до значений, свойствен-

ных незагрязненной почве. Таким образом, легко метаболизируемые углеводы могут действовать как регулятор процесса утилизации углеводородов.

2.1.5. Естественная колониально-морфологическая изменчивость

Адаптация родококков к меняющимся условиям обитания может происходить за счет изменения состава популяции, обусловленного процессом диссоциации - расщеплением однородной популяции эубактерий на варианты. В зависимости от морфологии колоний различают следующие основные диссоцианты родококков: R (routh) имеет шероховатый тип колоний, S (smooth) - гладкий, М (mucoud) - слизистый. Исследованиями Р.А.Степановой с соавт. (1987) и Е.С.Милько с соавт. (1980, 1991) обнаружено, что диссоцианты различаются по морфологии и ультраструктуре клеток, а также по химическому составу клеточных оболочек - капсулы и клеточной стенки. Установлено, что размер капсулы G. (R.) rubropertinctus максимален у М-варианта (1,9 ± 0,2 мкм), у /¿-варианта - он в 2 раза меньше (0,9 ± 0,1 мкм). Экзополисахарид S- и М-клеток представляет собой кислый полимер, содержащий три сахара - галактозу, глюкозу и маннЪзу, у Я-клеток -нейтральный экзогликан, содержащий дополнительно арабинозу. Это приводит к изменению биологических свойств диссоциантов, то есть характеру их взаимодействия с фагом, макроорганизмом и твердым гидрофобным материалом (почвенными частицами). Толщина клеточной стенки максимальна у jR-клеток родококков (40 нм), у М-варианта она в 2 раза меньше (20 нм). Обнаружены различия у диссоциантов родококков по количеству липидов и насыщенности входящих в их состав жирных кислот. Наибольшее количество ненасыщенных жирных кислот содержат М-клетки (25 %), наименьшее -Я-клетки (11 %) (Милько, Егоров, 1991). у

Расщепление родококков на варианты, в основе которых лежат значительные различия в размере и строении клеточных оболочек, сопровождает-

ся изменением их физиологических и биохимических признаков: скорости выделения веществ из клетки; устойчивости клеток к внешнему воздействию; скорости роста; активности ряда мембранозависимых7 ферментов из-за отличий в текучести мембран и др.

Таким образом, при ограниченном росте клеток (отсутствии постоянных условий среды) главными факторами популяционной изменчивости становится селективный рост и выживание диссоциантов, которые лучше приспособлены к существующим условиям среды. Установлено (Милько, Егоров, 1991), что .ft-вариант имеет селективные преимущества при интенсивной аэрации, высокой температуре культивирования, УФ-облучении, в процессе высыхания, при действии антибиотиков или лизоцима; 5-вариант -при понижении активной кислотности среды; М-вариант -Упри низкой температуре культивирования, высоком значении pH и повышении концентрации NaCl. Гетерогенность популяции помогает выжить данному виду. Диссоциация увеличивает границы выживаемости вида при неблагоприятных внешних условиях. В экстремальных условиях вид, в целом, может выжить в форме одного из вариантов. Диссоциация - это дифференциация на уровне популяции и в этом, видимо, биологический смысл процесса расщепления популяции бактерий на варианты.

В тоже время процесс диссоциации у бактерий, имеющих практическое применение (производство химических препаратов, получение полимеров, повышение нефтеотдачи пластов, удаление отходов и веществ, загрязняющих среду и т.д.), может приводить к высокой выживаемости менее активного диссоцианта, что изменяет состав популяции и снижает эффективность микробиологического производства (Милько, Егоров, 1991). Так, исследования выживаемости углеводородокисляющего штамма Pseudomonas aeruginosa при хранении на скошенном мясопептонном агаре под минеральным маслом показали появление после 18 мес в исходной популяции ¿'-диссоцианта, наиболее интенсивно окисляющего углеводород, мало-

активных, но более устойчивых Л-клеток, что может привести к снижению способности к деструкции углеводородов (Милько, 1998).

Интересны результаты интродукции родококков в тундровую почву, проведенной Т.В.Коронелли с сотр. (1997). В районе севера России (Архангельская обл.) вид Я егуЖгороШ является доминирующим и его клетки представлены З-диссоциантами, приспособленными к условиям низких температур. Интродукция более активного углевод ородокисляющего Я-варианта позволила существенно повысить эффективность процесса биодеградации, по сравнению с контролем, где очистка нефтяного загрязнения осуществлялась аборигенными формами. Приведенные примеры свидетельствуют о том, что знание биологических особенностей микроорганизмов, связанные с диссоциацией клеток, позволяют регулировать процессы сохранения стабильности полезных свойств, а также интенсифицировать различные биотехнологические мероприятия, в том числе, связанные с деструкцией углеводородных загрязнений. /

2.1.6. Адгезия и колонизация поверхности

Адаптация к факторам внешней среды обеспечивается и механизмами, гарантирующими стабильность микробного консорциума. К таким механизмам относятся когезия и адгезия. Способность родококков к адгезии (прочному прикреплению) на твердых поверхностях, в том числе на углеводородном субстрате, обусловлена гидрофобностью клеточной поверхности - одной из важных биологических характеристик Шойососсш врр. Это способствует формированию биопленок и ускоряет процесс утилизации углеводородов. Немаловажное экологическое значение имеет и такое свойство родококков как когезия - образование достаточно прочных взаимосвязей особей. В результате электронно-микроскопических исследований И.Б.Ившиной с сотр. (1982) на поверхности клеток ЯНойососсих эрр. выявлены шишковидные выросты диаметром от 40 нм и более. Известно, что они определяют

у

сцепление, буквально склеивание отдельных особей. При этом клетки оказываются объединенными в единую многоклеточную систему с возможностью упорядоченного деления и агрегацией ферментных систем (Новик, Высоцкий, 1995). Мицелиальный характер роста родококков способствует колонизации субстрата (подобно мицелиальным актиномицетным организмам) за счет врастания клеток в субстрат и формирования мицелиеподобных структур. Образование клеточных агрегатов и колоний происходит практически одновременно с прикреплением их к субстрату, что предопределяет коллективную функцию взаимодействующих между собой клеток.

2.2. Экологическая стратегия

Изучение таксономического состава Шюс1ососсш Брр., выделенных из разнообразных природных образцов, динамика их численности и экологических характеристик дает представление о родококках как об уникальной эколого-трофической группе, проявляющей характерный комплекс стратегических приемов выживания (Ившина и др., 1995; Ившина, 1997).

Проведенные экспериментальные исследования показали, что при культивировании в лабораторных условиях алканотрофные родококки способны использовать разнообразные пищевые субстраты - -от богатых органическими веществами, проявляя свойства копиотрофов, до содержащих низкие концентрации источника углерода, выступая в роли олиготрофов. Однако, учитывая в дополнение к концентрации субстрата особенности кинетики роста - высокое сродство к субстрату (Паников и др., 1988), большинство родококков, очевидно, следует относить к группе олиготрофов, точнее факультативных олиготрофов. Последние, в отличие от облигатных, по мнению Д.И.Никитина (1985), можно поддерживать в чистых культурах при достаточно высоких концентрациях органического углерода. Понятие «олиготрофная микрофлора» во многом совпадает с характеристикой «микрофлоры рассеяния» (Заварзин, 1970), которую позднее Л.В.Васильевой и

Г.А.Заварзиным (1995) было предложено назвать группой «диссипотрофов».

Для диссипотрофов в микробном сообществе характерны высокое сродство

к субстрату, способность использовать его в низкой концентрации, относи/

тельно высокие скорости роста в этой области концентраций, чтобы конкурировать с «банальными» копиотрофами, при этом низкие удельные максимальные скорости роста (Васильева, Заварзин, 1995).

Специфика физиологической активности и кинетика роста микроорганизмов в современной экологической литературе адекватно описываются терминами экологического отбора, тактики, стратегии (Pianka, 1970; Уитте-кер, 1980; Звягинцев и др, 1981). Принято выделять три типа: г- , К- и L-. Все они взаимосвязаны и в природе практически не обнаруживается четкого разделения организмов на г-, K-типы или L-виды (Уиттекер, 1980). Согласно утверждению Е.Л.Г'оловлева (1980), отдельные представители родококков реализуют различные варианты экологической тактики и их сочетания: К- и L-тактики; элементы г- на фоне K-тактики. Реализация элементов разной экологической тактики алканотрофных родококков в сильной степени зависит от типа субстрата. Это подтверждают исследования Т.В.Коронелли и Е.Д.Нестеровой (1990). При использовании в качестве субстрата глюкозы удельная скорость роста D. (R.) maris вполне соответствует его характеристике как K-стратега. Однако, с точки зрения экологической стратегии на среде с н-гексадеканом родококки не вписываются в эти ]эамки - удельная скорость роста резко возрастает и превышает константу скорости роста (р) Р. aeruginosa в 2,5 раза. При этом сохраняется низкий уровень эндогенного дыхания. Исследование Р.И.Аминовым (1987) родококков двух видов R. minimus и R. luteus (R. fascians) показало, что по параметрам активного роста они характеризуются как K-тактики. Однако, в условиях голодания R. luteus обнаруживает характерную особенность г-тактика - низкую жизнеспособность (за 4 суток титр жизнеспособных клеток снизился на порядок), в то время как R. minimus сохраняет высокую жизнеспособность. Это свидетель-

ствует о том, что даже таксономически близкие организмы могут реализовать элементы разной экологической тактики, что, вероятно, является результатом отбора в конкретной экологической нише.

Чаще всего популяции Rhodococcus spp. обладают более выраженными L-свойствами К-стратегов (Ившина и др., 1987; Паников и др., 1988). Для

них характерны: изменчивая морфология и своеобразные кинетические

/

свойства; доминирование на поздних стадиях сукцессии, склонность к ассоциации с гидролитиками; способность функционировать в роли диссипо-трофов; устойчивость к голоданию, высушиванию, высоким концентрациям солей, токсическим агентам и антисептикам.

Осуществляя К-стратегию и обладая широкими адаптационными возможностями, алканотрофные родококки реализуют главное экологическое преимущество - способность к непрерывному осуществлению обмена веществ in situ, активному и длительному существованию в олиготрофных условиях, даже при действии экстремальных абиотических факторов. В случае

/

наступления условий, не совместимых с активным метаболизмом, родококки не образуют спор или цист для переживания стресса, а, переходя в состояние энантиостаза, сохраняют функциональную активность клеток, благодаря адаптивным изменениям химического состава клеточных структур (изменения в липидном и белковом составе, синтез протекторных соединений и др.). Вслед за энантиостазом наступает либо переход к гомеостазу, либо переход в состояние покоя (Ураков и др., 1988; Феофилова, 1994). Если имеет место питательный стресс, то в первом случае через несколько генераций значительно возрастает удельная скорость роста на новом субстрате

/

(осуществляется адаптация к новому субстрату). Исследования Т.Н.Коронелли и Е.Д.Нестеровой (1990)-продемонстрировали это на примере R. erythropolis при использовании гидрофобного субстрата. Если имеет место второе, осуществляется адаптация к голоду: постепенно снижается ферментативная активность, происходит накопление резервных веществ,

уменьшение размеров клеток за счет фрагментации, уплотняется клеточная оболочка. При этом образуются мелкие, с толстой липофильной стенкой клетки, обладающие низким уровнем эндогенного дыхания в сочетаний с внутриклеточным резервом липидов и углеводородов. Такая клетка напоминает покоящуюся форму и способна выжить по исчерпанию ресурсов длительное время (Goodfellow, 1983). Своеобразие цистоподобной формы покоящегося состояния клеток родококков - отражение специфической для актиномицетов филогенетической ветви экзоспорообразования, которая, возможно, является результатом ускоренной эволюции и значительно менее сложным процессом, чем образование эндоспор. Однако/подобная форма покоящегося состояния имеет свой биологический смысл, так как обладает лабильностью - более быстрым включением в активное состояние при появлении субстрата в отличие от эндоспоры (Калакуцкий, Агре 1977; Бекер, 1987).

Алкано- и олиготрофный образ жизни, широкая норма реакции в сочетании с толерантностью к экстремальным абиотическим факторам, способность к синтезу и аккумуляции большого количества эндогенных резервных веществ в качестве запасного источника энергии, разнообразный «репертуар» поведения в зависимости от параметров занимаемых ими экологических ниш и флуктуаций окружающей среды - все это обеспечивает повсеместное распространение родококков, способных формировать устойчивые локальные популяции относительно высокой плотности (Ившина, 1997).

Таким образом, анализ литературных данных свидетельствует о высокой эффективности природных механизмов сохранения жизнеспособности родококков in situ. Очевидно, следует непременно учитывать сведения об этих процессах и, разрабатывая экспериментальные подходы к обратимому погружению микробных клеток в состояние анабиоза, добиваться эффективной лабораторной консервации. У

Глава 3. КОНСЕРВАЦИЯ И ДЛИТЕЛЬНОЕ ХРАНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР EX SITU

У

Необходимость в разработке методов длительного хранения микроорганизмов с определенными свойствами возникла уже на первых этапах развития микробиологии и все возрастала по мере усложнения стоящих перед ней задач и выделения из нее новых отраслей. Основными целями хранения являются поддержание жизнеспособности клеток и чистоты культуры, а также предупреждение изменений и мутаций, т.е. сохранение микроорганизма в состоянии максимально близком к исходно выделенному штамму. Существует множество методов консервации, однако ни один из них не является универсальным. Все способы хранения сводятся к погружению клеток в состояние обратимого торможения метаболизма (прекращения жизнедеятельности), т.е. переводу культур в анабиотическое состояние (Сидякина, 1990).

3.1. Современные представления об анабиозе микроорганизмов

Анабиоз всегда был великой загадкой в биологии, которую пытались разгадать в XVIII веке А.Левенгук и Л.Спалланцани, в XIX - и В.Прейер и К.Эренберг, в XX - Г.Рам, А.И.Опарин и др. (Шмидт, 1955). По мнению Б.В.Кедровского (1935), "для человеческого ума трудно понять такое состояние, которое не было бы ни жизнью, ни смертью".

Явление угнетения жизни и невозможность постоянного пребывания в активном жизнедеятельном состоянии чрезвычайно широко распространено в природе и является неотъемлемым общебиологическим свойством живого (Шмидт, 1955). Но самое замечательное то, что явление прекращения жизнедеятельности может быть обратимо. При благоприятных условиях организм способен выходить из состояния угнетения с продолжением активной жизнедеятельности.

Так уж сложилось, что под названием широкого угнетения жизни взамен употреблявшихся ранее терминов "скрытая жизнь", "латентная жизнь", "мнимая смерть" укоренился термин "а н а б и о з", предложенный В.Прейером в 1873 году (Шмидт, 1955), хотя первоначальный смысл его заключался не в существовании в промежуточном состоянии между жизнью и смертью, а в "оживании", "воскрешении". '

По мнению П.Ю.Шмидта (1955), более правильно употреблять выражение "абиотическое состояние", "абиос", как отражение нежизнедеятельного состояния организма, если понимать под "биос" не жизнь вообще, а только процесс жизни - жизнедеятельность. Кроме того, использование этого термина позволило бы более или менее четко обозначить разные состояния организмов от анабиоза до жизнедеятельности разной интенсивности.

Воспользовавшись этим предложением, А.М.Голдовский (1981, 1986) разработал классификацию состояний организмов, основным критерием которых принято наличие или отсутствие сочетания ассимиляции и диссимиляции, лежащего в основе жизнедеятельности. В связи с этим, разграничиваются состояния жизнедеятельности (гепербиоз, биоз, гипобиоз) и нежизнедеятельности (мезабиоз и анабиоз). Согласно представлениям, развиваемым в теории явления анабиоза, для сохранения потенциальной жизнеспособности при остановке жизнедеятельности организма необходимо сохранить его структуру (Голдовский, 1981). Остановка метаболических процессов сама по себе еще'не означает смерти. Смерть заключается в таком нарушении структуры организма, при котором невозможно возобновить его функционирование.

Развитием современных представлений о состояниях организма применительно к микробиологическим объектам явились работы (Ураков и др., 1988; Волков, 1994), в которых отмечается соответствие "биоза" как нормальной жизнедеятельности, нормального функционального состояния -экспоненциальной фазе роста в оптимальных условиях; "гипобиоза" как по-

/

ниженной функциональной активности - стационарной фазе развития; "ме-забиоза,г - промежуточному состоянию, когда влажность уже недостаточна для нормального и даже сниженного функционирования и не настолько низка, чтобы прекратить процессы инактивации; и, наконец, полный "анабиоз", как отсутствие функциональной активности. В состоянии полного анабиоза биохимические процессы прекращаются, но жизнеспособность сохраняется. Жизнеспособные структуры находятся при этом в нефункциональном состоянии, но могут снова возобновить деятельность в благоприятных условиях. Полный анабиоз обычно достигается в условиях опыта/путем глубокого высушивания при умеренных температурах или охлаждения до низких температур или сочетания высушивания и охлаждения с применением вакуума и без него. В природе полный анабиоз встречается при определенном сочетании многих условий среды, например, споры бактерий в глубоких слоях почвы, обедненной кислородом или без него (Шмидт, 1955).

Однако, поскольку в атмосфере в природных условиях всегда содержится некоторое количество влаги, глубокое высыхание организмов с переходом к полному анабиозу чаще всего при высокой влажности воздуха оказывается невозможным. Большинство примеров для природных условий относится к неполному анабиозу (мезабиозу).

С учетом современных биологических представлений (Шмидт, 1955; Бекер, 1981, 1987; Голдовский 1986) анабиоз можно определить как существование организмов в состоянии временного обратимого прекращения жизнедеятельности (когда метаболизм предельно заторможен или приостановлен), из которого организм может перейти к активной жизнедеятельности при благоприятных условиях.

Известно, что в состоянии анабиоза жизнеспособные объекты приобретают особую устойчивость к внешним экстремальным факторам: относительно высоким положительным температурам, глубокому охлаждению и действию ионизирующих и неионизирующих излучений (Лозина-

Лозинский, 1973; Голдовский, 1981, 1986; Жизнь микробов ..., 1981). В тоже время, при анабиозе могут проходить процессы, приводящие к постепенной потере жизнеспособности. При высушивании это, в первую очередь, окислительные (Stark, Herrington, 1931; Heckly, 1978) и медленно протекающие твердофазные реакции, с образованием связей между реакционноспособны-ми группами на поверхности биополимеров (Scott, 1960; Ураков и др., 1988). Для запуска окислительных процессов в сухих биопрепаратах достаточно следовых количеств кислорода (Сох, Heckly, 1973). Методом электронного парамагнитного резонанса в спектре лиофилизированных клеток при их контакте с кислородом М.Лионом в 1961 г (цит. по Ураков и др., 1988) обнаружено появление сигнала свободных радикалов, губительное действие которых обусловлено непосредственным окислением ненасыщенных связей остатков жирных кислот, сульфгидрильных и тиоэфирных групп остатков аминокислот в белках и др. (Хекли, 1979).

Как показывают многочисленные наблюдения, при переходе биологических объектов к анабиозу происходит изменение химического состава клеток и образуются вещества, препятствующие возникающим при этом неблагоприятным явлениям. Так, увеличивается содержание трегалозы в клетках грибов и дрожжей, что способствует повышению устойчивости мембран этих организмов к высушиванию (Волков и др. 1992; Феофилова, 1992), повышается содержание в эндоспорах бацилл дипиколиновод кислоты, которой отводят роль протектора (Сидякина, 1990), синтезируются природные антиоксиданты (метилированные токоферолы), защищающие липиды от окисления (Феофилова, 1994), образуются ингибиторы, мешающие преждевременному прорастанию спор (производные бензойной или абсцизовой кислоты) (Голдовский, 1981) и т.д.

Полученные сведения о процессах, способствующих сохранению микроорганизмов в естественной среде, по-видимому, полезно и необходимо учитывать, разрабатывая вопросы поддержания жизнеспособности микроб-

ных культур при хранении их ex situ. По мнению Л.В.Калакуцкого и Т.М.Сидякиной (1987) «успешность программ консервации будет еще выше, если использовать популяции клеток, реализующих свойственные им процессы «самоконсервации».

И все же приходится констатировать, что проблеме анабиоза не уделяется должного внимания. Актуальным остается высказывание Л.К.Лозина-Лозинского (1955) о том, что раскрытие биологической загадки анабиоза «нуждается в накоплении дальнейших фактов, но основанных на тонких методах исследования и связано с некоторыми изменениями обычных определений понятия жизни, ее сущности». Однако, можно быть уверенным, что проблема анабиоза займет подобающее место как общебиологическая, имеющая фундаментальное значение для теоретической биологии в целом.

3.2. Общая характеристика и особенности приемов хранения коллекционных культур

Существующая практика консервации микробных культур выработала

/

разнообразные экспериментальные подходы к погружению клеток в состояние обратимого торможения обмена. Среди краткосрочных методов хранения микробных культур традиционными являются: субкультивирование, хранение на «голодном» агаре, под вазелиновым маслом, в дистиллированной воде и растворе хлорида натрия (NaCl) разной концентрации, в им-мобилизированном состоянии на твердых носителях.

Субкультивирование. Этот наиболее общий способ поддержания бактериальных культур, который осуществляется путем периодических пересевов на свежую питательную среду с разными интервалами, в зависимости от вида микроорганизма, используемой среды и внешних условий. К положительным сторонам этого метода хранения следует отнести простоту, постоянную доступность культур для работы, возможность контроля за их чистотой и свойствами. Среди недостатков, во-первых, достаточно высокий

fbeviiÂPQiBEMH^

уровень обмена культур, связанный с генетическими изменениями (селекцией фенотипов, утратой и возникновением новых генотипов). Во-вторых, вероятность заражения культур посторонней микрофлорой при пересеве, что может быть причиной потери штамма. В-третьих, значительные трудовые затраты (Фатеева, 1983; Heckly, 1978).

В качестве сред предпочтительнее минимальные среды, так как в них процессы метаболизма идут с пониженной скоростью и поэтому промежутки между пересевами удлиняются. Уменьшается и вероятность селекции мутантов. Простейшее условие поддержания таких культур - хранение при комнатной температуре. Однако при понижении температур сроки консервации чаще всего увеличиваются (Методы общей ..., 1983). Согласно исследованиям М.Бергер и Д.Урбан (Berger, Urban, 1996), сочетание низкой температуры хранения (0°С) с лимитированием питания по углероду и добавкой хлорамфеникола, позволяет добиться высокой и длительной выживаемости грамотрицательных бактерий. Для постоянного обеспечения инокулятом в рутинной работе микробиолога предлагается удобный метод длительного поддержания жидкой культуры Chloroflexus в стабильном состоянии (Malik, 1996). Анаэробные условия, добавки сульфида и дрожжевого экстракта, присутствие активированного угля для адсорбции вредных метаболитов снижают скорость роста клеток и пролонгируют жизнеспособность.

Хранение в дистиллированной и водопроводной воде, растворе NaCI. По имеющимся литературным данным многие микроорганизмы быстро погибают, будучи суспендированы в дистиллированной воде (Heckly, 1978; Tsukamura, Mizuno, 1982). Однако, при хранении клеток Serratia таг-cescens в дистиллированной и водопроводной воде популяция остается генетически однородной и жизнеспособной после семи лет хранения (Аркадьева и др., 1987). Хотя авторами отмечается значительное (в 3-4 раза) снижение максимальной биомассы после двух лет хранения, исходные свойства культуры не изменяются. Влияние 1 %-ного раствора NaCI оказалось более нега-

тивным: через три года клетки погибли. Жизнеспособность культуры гриба Paecilomyces variotii, сохраняемого в дистиллированной воде, спустя 1 год составляет по результатам А.Рыбникара и В.Хладика (Rybnikar, Hladik, 1986) 20 % от исходной. Максимальный срок хранения Pseudomonas aeruginosa, Р. ßuorescens, Escherichia coli, Staphylococcus aureus в дистиллированной воде и физиологическом растворе составляет 1 год, a Rhodococcus spp. -2 года (Куплетская, Аркадьева, 1997).

Хранение под минеральным маслом. Фактором, уменьшающим скорость гибели мшфоорганизмов в гипобиотическом состоянии, являются анаэробные условия, в частности использование наслоения на поверхности культуры или суспензии минерального масла или других веществ, препятствующих диффузии в среду кислорода и высыханию (Методы хранения ..., 1967). Метод особенно пригоден для культур, чувствительных к лиофилиза-ции. Его эффективность повышается, если использовать антиокислители. Недостатки метода заключаются в следующем: возможность заражения культур из-за недостаточной стерильности минерального масла; вероятность инфицирования лаборатории из-за разбрызгивания масла при обжиге петли; использование минерального масла группой углеводородокисляющих организмов в качестве ростового субстрата.

Хотя, как утверждается в публикации Р.Хекли (Heckly, 1978), не все организмы можно успешно сохранять под маслом, морфологические и куль-туральные характеристики Pseudomonas, Bacillus и Escherithia в течение 3-х лет не изменяются. В то же время, даже в пределах видов одни представители Corynebacterium и Pseudomonas проявляют хорошую жизнеспособность в течение 5 лет, а другие - так и не восстанавливаются уже на первом году консервации (Lelliott, 1965). По наблюдению М.Б.Куплетской и З.А.Аркадьевой (1997) некоторые культуры микроорганизмов сохраняют жизнеспособность под вазелиновым маслом без пересевов в течение 10-12 лет. Это бактерии родов Azotobacter (7-10 лет), Bacillus (8-12 лет), МусоЪас-

terium (7-10 лет). Другие формы, напротив, требуют частых пересевов. Так, сроки консервации молочнокислых бактерий под вазелиновым маслом по данным З.А.Аркадьевой с сотр. (1986) составляют от 6 до 24 месяцев. Метод хранения под минеральным маслом - один из трех основных методов поддержания грибов и актиномицетов в коллекции "CBS Fungus Collection" (Нидерланды). После 10 лет хранения культуры пересевают на свежую питательную среду. При этом около 85 % всех штаммов сохраняют свою жиз-

/

неспособность (von Arx, Schipper, 1978). Данные об изменчивости микроорганизмов, хранящихся под минеральным маслом, также противоречивы. З.А.Аркадьева с сотр. (1986) не обнаружили изменения исходных свойств исследуемых бактерий, а по данным С.Хардзелла (Методы хранения ..., 1967) 4 штамма бацилл спустя 8 лет хранения утратили способность сбраживать сахарозу, а Е. coli после 14 лет хранения потеряла способность к образованию индола.

Высушивание. Многие микроорганизмы обладают ксерорезйстентно-стью и, будучи высушенными на воздухе при комнатной температуре, в стерильной почве, в кварцевом песке, на гранулированной пемзе, тальке, активированном угле, зернах злаков, дисках агар-агара, бумаге, силикагеле, целлюлозе и многих других носителях, могут храниться в течение долгих лет в жизнеспособном состоянии (Сидякина, 1990; Доронина, Троценко, 1992; Heckly, 1978; Leben, Sleesman, 1982).

Хранение на бумажных фильтрах. Это сравнительно простой метод, доступный для любой бактериологической лаборатории. Испытан для многих бактериальных культур (Билько и др., 1979; Доронина, Троценко, 1992; Фельдман, Маханева, 1994) в том числе Mycobacterium и Corynebacterium. Жизнеспособность микобактерий через 12-14 мес составляет 90 %. При этом полностью сохраняются присущие им морфологические, тинкториальные, биохимические свойства и чувствительность к антибиотикам (Билько, 1988). В течение одного года хранения все изучаемые штаммы коринебактерий

дают видимый рост и сохраняют свои исходные качества (Фельдман, Маха-нева, 1994). Указано, что добавление в питательную среду'при культивировании глюкозы и других богатых органических веществ увеличивает сроки хранения микробов, так как эти соединения помимо повышения ростовых качеств являются термопротекторами. Метод широко предлагается и как удобная форма для пересылки культур бактерий пользователям.

Хранение на целлофановых дисках. По литературным сведениям данный метод применяется для хранения микобактерий. При этом через 12 мес жизнеспособность отмечается у 90 % клеток. Биологические свойства бактерий не изменяются (Билько, 1985).

Хранение на природном материале-носителе (зерне, в кварцевом песке, в стерильной почве). Методы применяются в основном для хранения спорообразующих бактерий и спор грибов, однако широко известны многие случаи длительного сохранения вегетативных клеток в почве (Методы хранения ..., 1967; Звягинцев, 1973; Lelliott, 1964; Lowendorf, 1980).

Хранение на искусственных и синтетических материалах. Наиболее часто употребляют для этих целей фарфоровые бусы, желатиновые капли, ионообменные смолы и т.п. (Рубан, 1989; Козуб, 1997; Gherna, 1994). Метод позволяет заложить на хранение большой объем однородного материала и

у

легко изъять часть инокулированного носителя в случае необходимости. Способ удобен для хранения и транспортировки микроорганизмов.

Наиболее перспективными методами сохранения коллекционных культур в настоящее время являются методы долгосрочного хранения - лиофилизация и криоконсервация.

Лиофилизация (ЛФ) или высушивание из замороженного состояния под вакуумом. Метод является одним из самых экономичных, эффективных и широко применяемых для длительного хранения бактерий и других организмов (Сидякина, 1990; Lelliott, 1965; von Arx, Schipper, 1978; Heckly, 1978; Rybnikar, Hladik, 1986; Janda, Opekarova, 1989; Malik, 1990b). При его ис-

пользовании многие физиологически разнородные виды микроорганизмов удается сохранить в жизнеспособном состоянии 30 лет и более. Штаммы, хранящиеся в коллекции культур микроорганизмов кафедры микробиологии МГУ, в течение 36 лет сохраняют высокое число жизнеспособных клеток -

4 7

порядка 1х 10н- 1 х10 клеток в ампуле (Куплетская, Аркадьева, 1997). Материал хранят небольшими порциями в запаянных ампулах обычно при пониженных температурах. Процедура лиофилизации заключается в удалении воды из замороженных бактериальных суспензий путем сублимации при низком давлении. Вакуум необходим для быстрого отвода водяного пара.

Успех лиофилизации зависит от природы, физиологического состояния и концентрации используемых клеток, условий выращивания, состава защитной среды и, наконец, от режима дегидратации и условий хранения (Емцева и др., 1991; Неск1у, 1978). Грамположительные бактерии более устойчивы к действию низких температур и ЛФ, чем грамотрицательные. Устойчивость к высушиванию некоторых прокариот связывают с наличием полисахаридной капсулы и специфического состава липидов (Аркадьева, 1983). По данным М.Б.Куплетской (1987), для крупных клеток выживаемость ниже, но в ампулах, где содержание жизнеспособных клеток после ЛФ было больше, осталось значительное количество живых клеток через 25 лет хранения. В связи с этим обычно используют высокую плотность исходных взвесей. В коллекции микроорганизмов МГУ начальная плотность со-8 10

ставляет 10-10 клеток/мл (Куплетская, Аркадьева, 1997). А.Н.Выпыяч и С.И.Маркелова (1995) сублимировали люминесцентные бактерии с начальной концентрацией 8x10ю - 1x10й клеток/мл. Клетки в экспоненциальной фазе развития более чувствительны к действию ЛФ, чем в стационарной (Ротмистров и др., 1990; Волков, 1994; Неск1у, 1978).

В ходе процедуры ЛФ значительная часть микробной популяции погибает. Гибель клеток можно уменьшить, используя защитные среды. В качестве криопротекторов используют снятое коровье молоко, стерильную

у

бычью сыворотку, нормальную лошадиную сыворотку, пептон, мононатрий-глутамат, альбумин, смесь сахарозы и 1 %-ного раствора желатины, сахаро-зо-желатиновый агар, глицерин и другие вещества (Файбич, 1947; Ротмистров и др, 1990; Сафронова и др., 1991; Heckly, 1978). Механизм защитного действия протекторов связывают, главным образом, с их гидрофильными свойствами - способностью образовывать три и более водородных связей, замещая воду, а не удерживая ее, как считалось ранее. (Волков, 1994; Strange, Сох, 1976).

У

Одним из важных вопросов ЛФ является создание щадящей технологии консервирования. Разрабатываются и широко обсуждаются в литературе скорость и глубина замораживания биомассы, режим высушивания, остаточная влажность препарата (Бекер, 1967). Рассматриваются вопросы формирования и локализации кристаллов льда, концентрирование растворенных веществ, фазовые переходы липидов в мембранах, свободнорадикальные процессы в сухом биоматериале и другие, которые в конечном итоге влияют на выживаемость после сушки (Пучков, Говорунов, 1983; Ураков и др., 1988; Russell, 1984). Все больше интересуют исследователей адаптационные перестройки и физиология бактерий в зависимости от условий и среды предварительного культивирования, так как накопление резервных веществ и синтез внутриклеточных протекторов способствует повышению устойчивости в процессе сублимационного высушивания (Ураков и др., 1988; Емце-ва и др., 1991; Postgate, 1967; Ausborn et al., 1994).

Микроорганизмы, чувствительные к свету, кислороду, поверхностному натяжению и другим факторам и не переносящие обычные режимы лио-филизации из жидкой суспензии, могут быть успешно сублимированы, если густая суспензия (108-Ю10 клеток/мл) в подходящей защитной среде осаждается на предварительно лиофилизированные таблетки высушенного снятого молока с различными добавками (Malik, 1990а). Метод может быть рекомендован для сложных культур актиномицетов. Во Всероссийской коллек-

ции микроорганизмов (ВКМ) успешно лиофилизируются этим методом некоторые фототрофные бактерии, галобактерии и другие (Сидякина, 1990).

L-высушиваНие. Высушивание под вакуумом непосредственно из жидкого состояния используется для чувствительных к замораживанию или лиофилизации культур (Сидякина, 1990; Mikata, Banno, 1989; Malik, 1990b). Применение различных носителей (полоски фильтровальной бумаги, гранулы силикагеля, активированный древесный уголь и др.) при использовании этого метода предлагается как полезный прием.

Криоконсервация. Низкотемпературная консервация (при температурах от -20°С до -196°С) обеспечивает хранение биологического объекта в жизнеспособном состоянии и в последние годы все шире используется в практике коллекционной работы.

Данные последних лет свидетельствуют об успешном хранении микроорганизмов при сверхнизких температурах жидкого азота (-196°С) и жидкого воздуха (Пучков, Говорунов, 1983; Moore, Carlson, 1975; Heckly, 1978; Malik, 1989). Технически эта задача реализуется в программных замо-раживателях, где препарат в ампуле помещают в емкость, продуваемую струей паров жидкого азота. Количество паров определяет скорость охлаждения и, в свою очередь, зависит от температуры нагрева испарителя, помещенного в емкость с жидким азотом. Замороженные препараты переносят в

У

емкость с жидким азотом, где и хранят (Методы культивирования ..., 1988). Методика введения микроорганизмов в -анабиоз с помощью жидкого азота наиболее полно описана в книге "Методы общей микробиологии" под ред. Ф.Герхардта (1983). Несмотря на высокую стоимость, использование метода рентабельно, так как криоконсервация имеет существенные преимущества перед лифилизацией и высушиванием, которые заключаются в неограниченном времени хранения культур, высокой жизнеспособности, сохранении биохимической активности и генетической стабильности (Сидякина, 1990).

У

Исследования показали, что через 8 месяцев хранения культуры Е. coli содержат 74 % живых клеток и обеспечивают накопление 9-11 млрд. клеток/мл через 7,5 часов культивирования (Автушенко, 1988). Имеются сообщения о том, что жизнеспособность культур-продуцентов антибиотиков, сохраняемых при температуре жидкого азота, составляет более 90 %. При этом продуктивность продуцента гентамицина после хранения в замороженном состоянии выше, чем после хранения обычным способом - вакуумной сушкой спор на песке (Lin, 1988).

Многие микроорганизмы могут успешно храниться и в коммерческих механических морозильных камерах при температуре от -60°С до -130°С (Henry, Kirsop, 1989; Feltham et al., 1978). В публикации Р.Хекли (Heckly, 1978) указывается о практически 100 %-ной жизнеспособности культуры Mycobacterium tuberculosis через 25 месяцев хранения при -70°С.

Использование для консервации более высоких температур (-20°С), легко получаемых в условиях бытовых морозильных камеру имеет свое преимущество и довольно широко используется для непродолжительного хранения (Heckly, 1978). М.Тсукамура и С.Мизуно (Tsukamura, Mizuno, 1982), суспендируя микобактериальные штаммы в 1 %-ном растворе глицерина и в дистиллированной воде, а затем замораживая при -20°С, эффективно поддерживали культуры от 1 года до 2-х лет. Сравнительные исследования жизнеспособности Paecilomyces variotii показали, что количество колоние-образующих единиц после одного года хранения менее всего снижается в замороженных при -28°С образцах^ чем в лиофилизированном состоянии (Rybnikar, Hladik, 1985). Аналогичные результаты получены Е.Веллингтоном и С.Вильямсом (Wellington, Williams, 1978) для R. rhodo-chrous в 20 %-ном глицерине при -20°С. Безусловно, имеются заметные различия в чувствительности различных групп и видов микроорганизмов к низкотемпературному воздействию. Так, если 90 % клеток Streptococcus pyoge-

/

nés переживают хранение при -196°С в течение года, то ни одна из них не пережила и 6-ти месяцев при -20°С (Heckly, 1978).

Криочувствительность одной и той же культуры существенно зависит от режима замораживания - оттаивания. Так, по имеющимся литературным сведениям (Иванов, Пучков, 1988), применение двухэтапного замораживания позволяет уменьшить долю поврежденных клеток в 1,5-3 раза. Предварительное замораживание до температуры -25°С приводит к замерзанию внеклеточной воды и снижению вероятности внутриклеточного льдообразования. При изучении влияния скорости охлаждения на жизнеспособность клеток установлено, что 69,1 % клеток P. putida остаются жизнеспособными при оптимальной скорости замораживания 30-40 град/мин (Высеканцев и др., 1992).

Для успешной консервации и удобства извлечения микроорганизмов, сохраняемых методом низкотемпературного воздействия, широко используют различные носители - обезвоженный силикагель, стеклянные гранулы, полипропиленовые соломки и т.п. (Сидякина, 1990; Feltham et al., 1978; Henry, Kirsop, 1989).

3.3. Практический опыт хранения родококков в мировых и отечественных коллекциях чистых культур

Усилия коллекций микробных ресурсов в направлении широкого обмена информацией о фондах хранящихся культур и методах их консервации позволяют значительно сократить затраты времени и средств на поиск необходимых штаммов и обеспечение полной информацией о них. Выпуск каталогов культур микроорганизмов, а также создание информационных банков данных о сохраняемых штаммах с широкий доступом к ним через компьютерную систему Internet способствует решению этой задачи. Согласно опубликованным и компьютерным данным, многие известные йировые и отечественные коллекции микробных ресурсов имеют в своих фондах чистые

культуры эубактерий рода Rhodococcus. В табл. 1 представлено число штаммов родококков всех валидных видов (R. coprophillis, R. equi, R. erythropolis, R. fascians, R. globerulus, R. opacus, R. rhodnii, R. rhodochrous, R. ruber, R. zopfîi), сохраняемых в известных коллекциях мигфобных культур. Наибольшее количество поддерживаемых штаммов - представители трех видов: R. erythropolis, R. ruber и R. rhodochrous, однако общее число культур чаще всего весьма ограничено. Так, всемирно известная и крупнейшая коллекция мира - Американская коллекция типовых культур (АТСС), насчитывающая свыше 45 тыс. штаммов водорослей, вирусов, бактерий, вирусов клеточных линий грибов, фрагментов ДНК человека, фагов, плазмид, культур тканей растений, простейших (WWW.atcc.org), имеет в своих фондах лишь 20 штаммов культур рода Rhodococcus, большинство которых не определено до вида. Главная коллекция микробных ресурсов России (ВКМ) поддерживает только 35 штаммов родококков. Весьма значительное количество из числа сохраняемых культур данного рода имеют индекс "species", что свидетельствует о трудностях видовой диагностики.

В последнее время важную роль приобретают профилированные коллекции, поддерживающие в большом количестве родококки определенных видов с потенциально ценными для биотехнологии свойствами. Так, коллекция Национальной Академии Наук Белоруссии (НАНБ) сохраняет в своем фонде представителей только 4-х видов, большинство из которых (416 штаммов) принадлежит виду R. erythropolis. Культуры поддерживаются путем периодических пересевов на минеральных средах, содержащих углеводороды и приоритетные загрязнители природной среды - отходы промышленных предприятий (Каталог культур ..., 1997).

Однако согласно литературным данным (Каталог культур ..., 1992; National Collection ..., 1990; Atlas, 1993; The National Collections ..., 1994; List of cultures, 1996; Catalogue of cultures (BCCM™/LMG), 1998), для хранения родококков чаще всего используется субкультивирование на триптозном и

Таблица 1. Количество штаммов валидных видов Ююйососсиь, поддерживаемых в известных коллекциях микробных ресурсов

ЪП IS on Co S .Ъ a a Co a ■ So' a ? § a a

Коллекция Rhodococc coprophilu О о о J a § S1 Rhodococc erythropolx Rhodococc fascians L Rhodococc globerulus Rhodococc opacus Rhodococc rodnii 8'g P -s л ^ Rhodococc ruber Rhodococc\ zopfii о •§ о

ВКМ (35) 2 5 5 1 5 2 15

ИЭГМ (421) 1 10 123 35 1 23 1 13 185 29

НАНБ (453) 416 11 1 5 17 3

УНКМ (171) 1 1 83 40 7 1 8 23 7

АТСС (20) 2 1 1 3 13

AFRC (5) , 1 2 1 2

ВССМ (57) 2 2 2 38 2 5 1 5

DSMZ(188) 6 8 27 7 3 18 4 20 26 2 67

IFO (24) 2 6 3 1 3 1 8

NCIMB (68) 1 3 10 1 2 1 11 1 38

\ V V ■ V . V \

Примечание. ВКМ - Всероссийская коллекция микроорганизмов. Москва - Пущино, Россия; ИЭГМ - Региональная профилированная коллекция алканотрофных микроорганизмов, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. Пермь, Россия; УНКМ -Украинская Национальная Коллекция Микроорганизмов, Институт микробиологии и вирусологии им. акад. Д.К.Заболотного НАН Украины. Киев, Украина; НАНБ - Национальная академия Наук Беларуси. Минск, Беларусь; АТСС - American Type Culture Collection. Rockville, Maryland, USA.; AFRC - National Collection of Food Bacteria, Agricultural and Food Research Council, Institute of Food Research. Shinfield, U.K.; BCCM - Belgian Coordinated Collections of Microorganisms. Gent, Belgium; DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cells Cultures. Braunschweig, Germany; IFO - Institute for Fermentation. Osaka, Japan; NCIMB - The National Collections of Industrial and Marine Bacteria LTD. Aberdeen, Scotland, U.K.

пептонно-дрожжевом агаре, лиофилизация в сепарированном молоке и

/

криоконсервация при -196°С в глицерине. Таким образом, в большинстве случаев алканотрофные родококки культивируют и поддерживают на богатых питательных средах, не учитывая их основную природную функцию -аккумуляцию разнообразных углеводородов и трансформацию их в биомассу.

Одной из наиболее полных коллекций чистых культур родококков по видовому спектру и количеству представленных штаммов Rhodococcus spp. является Региональная профилированная коллекция алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

/

Общее число поддерживаемых в этой коллекции чистых культур родококков, принадлежащих 9-ти валидным видам, составляет 421 штамм. Значительное количество сохраняемых штаммов (185) принадлежит к виду R. ruber (Kruse 1896) Goodfellow and Alderson 1977, важнейшей биологической особенностью которых, является способность ассимилировать в качестве единственного источника углеродного питания наряду с жидкими газообразные я-алканы (пропан, я-бутан).

В Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ родококки успешно культивируют и сохраняют не толь/

ко на богатых органических субстратах, но и на средах с углеводородами (Каталог штаммов ..., 1994). Дополнительно используют прием высушивания с иммобилизацией на твердых носителях. Наиболее практичным и надежным методом долгосрочного хранения определена лиофилизация родококков в сахаро-желатиновом агаре (Ившина и др., 1995). Как дополнительный способ используется простой и эффективный метод хранения алканотрофных родококков путем криоконсервации бактериальной суспензии при -20°С.

Таким образом, богатый эмпирический опыт свидетельствует о том, что ряд современных методов консервации оказывается относительно эффективным при поддержании лабораторных культур микроорганизмов. Важно не просто поддерживать жизнеспособность и чистоту культуры, а обеспечить сохранение объявленных специфических свойств. Целесообразно до предела сократить сроки пребывания микроорганизмов в активном вегетативном состоянии, имея, однако, четкие представления об обратимом погружении в покоящееся и анабиотическое состояние. Следует отметить, что, разрабатывая экспериментальные подходы к эффективной консервации, необходимо учитывать сведения о процессах, способствующих сохранению микроорганизмов в естественной среде.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Каменских, Татьяна Никодимовна

ВЫВОДЫ

1. Апробирован широкий спектр традиционных методов консервации и последующего хранения чистых культур бактерий рода Шюйососст, как то: субкультивирование, хранение в дистиллированной воде, 0,5 %-ном растворе хлорида натрия, под вазелиновым маслом, на твердых носителях, криоконсервация, лиофилизация.

2. Среди испытанных традиционных методов краткосрочного хранения родококков наиболее приемлемы способы их поддержания на "голодном" агаре и в 0,5 %-ном растворе хлорида натрия, обеспечивающие сохранение жизнеспособности у 40 - 83 % популяции клеток в течение одного года.

3. Для более продолжительного хранения родококков рекомендуется метод поддержания на миллипоровых мембранных фильтрах. Гарантироу ванная длительность сохранения жизнеспособности иммобилизированных неразмножающихся клеток родококков достигает пяти лет.

4. Наиболее надежный способ долгосрочного хранения Шюс1ососсш зрр. - лиофилизация с исходным титром клеточной популяции порядка 108 -109 клеток/мл в присутствии сахарозо-желатинового агара и ее регидратация 0,5 %-ным раствором хлорида натрия. Прогнозируемая длительность сохранения жизнеспособности родококков в лиофилизированном состоянии составляет 5,9 - 43,9 лет.

5. Клетки родококков с предварительно индуцируемым алканотроф-ным метаболизмом более устойчивы к процессам криоконсервации и лио-филизации. Для обеспечения высокого уровня выживаемости и стабильности биологических характеристик клеток целесообразно предварительное выращивание КНойососсж 8рр. на жидких н-алканах. Сублимацию газоокис-ляющих родококков рекомендуется проводить в защитной среде с использованием 1 мМ а-токоферол-ацетата в качестве антиокиданта. у

6. Повышенная устойчивость клеток родококков с алканотрофным обменом к замораживанию и обезвоживанию - регидратации коррелирует с наличием в них каротиноидных пигментов, а также относительным содержанием ненасыщенных клеточных жирных кислот.

Создана дублирующая коллекция лиофилизированных культур Шюйососст эрр. с учетом подобранных условий сублимации - регидратации. Сформирована автоматизированная база данных по методам консервации и условиям гарантированного хранения чистых идентифицированных культур, поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Каменских, Татьяна Никодимовна, 1998 год

ЛИТЕРАТУРА

у

1. Автушенко С.С. Бабкин Е.И., Александренкова О.Г., Балмасов В.А., Батарин В.И., Яременко Т.Г. Хранение посевных культур микроорганизмов при низких температурах // Микробиология. - 1988. - Т. 57, № 2. - С. 333-337.

2. Акименко В.К. Альтернативные оксидазы микроорганизмов. - М.: Наука, 1989.-263 с.

3. Аминов Р.И. Кинетика роста микроорганизмов с разными экологическими характеристиками / Дис.... канд. биол. наук. - Пущино, 1987. - 180 с.

4. АристарховаВ.И. Нокардиоподобные микроорганизмы. - М.: Наука, 1989. -248 с.

5. Аркадьева З.А. Факторы, влияющие на жизнеспособность и свойства микроорганизмов при различных методах хранения // Биол. науки. - 1983. -№4.-С. 93-105.

6. Аркадьева З.А., Выборных С.Н., Лория Ж.К. Жизнеспособность клеток Serratia marcescens при длительном хранении в дистиллированной воде .// Биол. науки. - 1987. - № 2. - С. 85-87.

7. Аркадьева З А. Методы хранения культур микроорганизмов // Метаболизм микроорганизмов / Под ред. Н.С.Егорова. - М.: Изд-во МГУ, 1986. - С. 57-64.

8. Барбан П.С., Пшеничнов P.A., Пантюхина А Н., Ившина И.Б. Иммунофлуоресцентный анализ. - Свердловск: УрО АН СССР, 1988. - 175 с.

9. Бекер М.Е. Обезвоживание микробной биомассы. - Рига: Зинатне, 1967. -361 с.

10. Бекер М.Е. Современные представления об анабиозе микроорганизмов // Торможение жизнедеятельности клеток / Под ред. М.Е.Бекера. - Рига: Зинатне, 1987. - С. 9-19.

11. Бердичевская М.В. Экология углеводородокисляющих бактерий нефтяных пластов Пермского Прикамья / Афтореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 1982. -24 с.

12. Бердичевская М.В. Особенности физиологии родококков разрабатываемых нефтяных залежей // Микробиология. - 1989. - Т. 58, вып. 1. - С. 60-65.

13. Берия Л.В., Исмаилов А.Д., Данилов B.C. Перекисное окисление липидов в процессе роста и развития биолюминесценции у бактерий Vibrio harvey II Микробиология. -1991. - Т. 60, вып. 1. - С. 77-83.

14. Билько И.П. Метод хранения микобактерий в лабораторных условиях. - М., 1985. - Деп. в ВИНИТИ 12.12.1985. - УДК 59(098) 576.8. - № 8606-В 85. - 8 с.

15. Билько И.П. Хранение микобактерий на бумажных дисках в лабораторных условиях // Микробиол. журн. - 1988. - Т. 50, № 1. - С. 96-97.

16. Билько И.П., Гашинский В.И., Фурман А.Н. Способы хранения бактериальных культур в лабораторных условиях // Микробиол. журн. -1979. - Т. 41, № 5. - С. 557-559.

17. Бонарцева Г.А., Мышкина В.Л., Загреба Е.Д. Содержание поли-ß-оксибутирата в клетках разных видов Rhizobium в зависимости от

источников углерода и азота в среде // Микробиология. - 1994. - Т. 63, вып. 1,-С. 78-85.

18. Васильева Л.В., Заварзин Г.А. Диссипотрофы в микробном сообществе // Микробиология. - 1995. - Т. 64, № 2. - С. 239-244.

19. Веслополова Е.Ф. Микрометод определения численности колониеобразующих микроорганизмов // Микробиология, - 1995. - Том. 64, № 2. - С. 279-284.

20. Владимиров Ю.А. Биологические мембраны и патология клетки - М.: Знание, 1979. - 47 с.

21. Владимиров Ю.А,, Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М.: Наука, 1972. - 252 с.

22. Волков В.Я. К вопросу о физиологических и физико-химических механизмах устойчивости микроорганизмов к замораживанию и высушиванию //Микробиология. - 1994. - Т. 63, вып. 2. - С. 5-16.

23. Волков В.Я., Сахаров Б.В., Щепкин В.Д., Федюкина Г.Н., Кашуба A.A. О природе устойчивости клеток дрожжей к высушиванию // Микробиология. -1992. - Т. 61, вып. 2. - С. 214-222.

24. Выпыяч А.Н., Маркелова С.И. Жизнеспособность и биолюминисценция у лиофильно высушенных клеток морской бактерии во время хранения // Вестник Моск. ун-та. - Сер. 16. Биология. - 1995. - № 3. - С. 33-37.

25. Высеканцев И.П., Крашенинникова Т.К., Олехнович Е.В., Степанюк JI.B. Консервирование бактерий Pseudomonas putida при низких температурах // Микробиология. - 1992. - Т. 61, вып. 6. - С. 1098-1099.

26. Вяхирев Д.А., Шушунова А.Ф. Руководство по газовой хроматографии. -М.: Высш. шк., 1987. - 335 с.

27. Глазачева JI.E., Ившина И.Б., Оборин A.A. Клеточные приспособления Rhodococcus rhodochrous и Rhodococcus ruber, усваивающих пропан и н-бутан // Микробиология. - 1990. - Т. 59, вып. 2. - С. 301-306.

28. Говорун В.М., Бондарева Е.В., Кулакова С.Н., Капитанов А.Б. Изменение липидного состава клеток Acholeplasma laidlawii под действием толуола // Микробиология. - 1993. - Т. 62, вып. 1. - С. 70-75.

29. Голдовский A.M. Анабиоз. - Л.: Наука, 1981. - 136 с.

30. Голдовский A.M. Анабиоз и его практическое значением- Л.: Наука, 1986. -169 с.

31. Головлев E.JI. Биология сапрофитных микобактерий / Афтореф. дис. ... докт. биол. наук. - Пущино: ИБФМ РАН, 1983. - 35 с.

32. Головлев Е.Л. Биохимическая активность родококков // Генетика, таксономия и физиологическая активность актиномицетов / Сб. докл. сов,-американск. конф. - Ялта, 1980. - С. 46-53.

33. Громов Б.В. Строение бактерий. - Л.: Изд-во ЛГУ, 1985. - 192 с.

34. Гузев B.C., Халимов Э.М., Волде М.И., Куличевская И.С. Регуляторное действие глюкозы на активность углеводородокисляющих микроорганизмов в почве // Микробиология. - 1997. - Т. 66, № 2. - С. 154-159.

у

35. Дин А., Хиншельвуд С. Наблюдения над адаптацией бактерий // Адаптация у микроорганизмов. - М: Изд-во иностр. лит-ры, 1956. - С. 42-69.

36. Добровольская Т.Г., Лысак JI.B. Коринеподобные бактерии в бактериальных ценозах ряда почв сухих тропиков // Почвоведение. - 1986. -№2.-С. 81-85.

37. Добровольская Т Г., Чернов И.Ю., Звягинцев Д.Г. О показателях структуры бактериальных сообществ // Микробиология. - 1997. - Т. 66, вып. 3. - С. 408414.

38. Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Способ хранения метилотрофных и гетеротрофных микроорганизмов // Прикл. биохимия и микробиол. - 1992. -Т. 28, №4. -С. 631-635.

39. Егоров Н.С., Милько Е.С., Степанова Р.А., Шибенска А. Влияние факторов внешней среды на рост и изменчивость R-, S- и М-вариантов Mycobacterium lacticolum // Биол. науки. - 1986. - № 8. - С. 87-92.

40. Емцева Т.В., Лаврова Л.Н., Константинова Н.Д. Влияние условий предварительного культивирования бактерий на их устойчивость и структуру клетки при замораживании и лиофилизации // Микробиология. -

1991. - Т. 60, вып. 5. - С. 879-888.

41. Жизнь микробов в экстремальных условиях / Под ред. Д.Кашнера. - М.: Мир, 1981.-519 с.

42. Заварзин Г.А. К понятию микрофлоры рассеяния в круговороте углерода // Журн. общ. биол. - 1970. - Т. 31, № 4. - 386-393.

43. Заварзин Г.А. Микроорганизмы и состав атмосферы // Роль микроорганизмов в круговороте газов в природе. - М.: Наука, 1979. - С. 5-34.

44. Звягинцев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями. - М.: МГУ, 1973. - 175 с.

45. Звягинцев Д.Г., Кожевин П.А., Кочкина Г.А., Полянская Л.М. Микробная сукцессия в почве и определение экологических стратегий конкретных популяций // Микробиология. -1981. - Т. 50, вып. 2. - С. 353-359.

46. Зикманис П.Б. Системный подход в исследовании анабиоза // Торможение жизнедеятельности клеток / Под ред. М.Е.Бекера. - Рига: Зинатне, 1987. - С. 180-189.

47. Иванов С.А., Пучков Е.О. Двухэтапное замораживание бактерий до - 96°С //Микробиология. - 1988. - Т. 57, вып. 4. - С. 699-701.

48. Ившина И.Б. Биология бактерий рода Rhodococcus, усваивающих пропан и н-бутан / Дис. ... канд. биол. наук. - Киев, 1982. - 215 с.

49. Ившина И.Б. Создание сети взаимодействующих коллекций микробных культур и компьютеризированных банков данных как основы изучения и сохранения биоразнообразия микробиологических ресурсов // Экология. -

1992.-№ 6,- С. 12-17.

50. Ившина И.Б. Бактерии рода Rhodococcus (иммунология, детекция, биоразнообразие) / Дис. ... докт. биол. наук. - Пермь, 1997. - 98 с.

51. Ившина И.Б., Безматерных Г. И. Биосинтез свободных аминокислот родококками // Биосинтез вторичных метаболитов: Тезисы докл. Всесоюз. конф. - Пущино, 1987. - С. 33-34. у

52. Ившина И.Б., Бердичевская М.В., Зверева Л.В., Рыбалка Л.В., Еловикова Е. А. Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из разных экосистем // Микробиология. - 1995 - Т. 64, № 4. - С. 507-513.

53. Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Козырева Г.И. Антибиотикочувствительность родококков, культивируемых на разных средах // Факторы и механизмы регуляции развития бактериальных популяций: Сб. научн. трудов. - Свердловск: УрО АН СССР, 1990. - С. 9298.

54. Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Куюкина М.С., Рычкова М.И., Шадрин O.A., Чумаков О.Б. Методы консервации культур Rhodococcus spp. и их применение в практике поддержания специализированного фонда алканотрофных родококков // Микробиология. - 1995. - Т. 64, вып. 1. - С. 118-128.

55. Ившина И.Б., Оборин A.A., Нестеренко O.A., Касумова С.А. Бактерии рода Rhodococcus грунтовых вод района нефтяных месторождений Пермского Предуралья // Микробиология. -1981. - Т. 50, вып. 4. - С. 709-717.

56. Ившина И.Б., Оборин A.A., Нестеренко O.A., Шеховцов В.П. Электронномикроскопическое изучение факультативных газоиспользующих Rhodococcus rhodochrous //Микробиология. - 1982. - Т. 51, вып. 3. - С. 477481.

57. Ившина И.Б., Пшеничнов P.A., Кеворков H.H. Особенности антигенной структуры родококков, культивируемых на разных средах // Микробиология. - 1985. - Т. 54, вып. 2. - С. 290-292.

58. Ившина И.Б., Пшеничнов P.A., Оборин A.A. Пропанокисляющие родококки. - Свердловск: УНЦ АН СССР, 1987. - 125 с.

59. Исмаилов А. Д., Берия Л.В., Данилов B.C. Ферментативный и неферментативный процессы перекисного окисления липидов в бесклеточном экстракте Vibrio harveyi II Микробиология. - 1994 - Т. 63, вып. 3.-С. 466-472.

60. Калакуцкий Л.В., Агре Н.С. Развитие актиномицетов. - М.: Наука, 1977. -287 с.

61. Калакуцкий Л.В., Сидякина Т.М. Сохранение жизнеспособности микроорганизмами в природе и основные подходы к консервации лабораторных культур // Торможение жизнедеятельности клеток / Под ред. М.Е.Бекера. - Рига: Зинатне, 1987. - С. 19-31.

62. Каталог культур микроорганизмов / Под общ. ред. Л.В.Калакуцкого и М.В.Фатеевой. Ин-т биохимии и физиологии микроорганизмов РАН. ВКМ. -Пущино - Москва, 1992. - 362 с.

63. Каталог культур микроорганизмов / Под ред. А.Г.Лобанка и Н.И.Астапович. Ин-т микробиологии. Национальная Академия Наук Беларуси. - Минск, 1997. - 214 с.

64. Каталог штаммов региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / Под ред. И.Б.Ившиной. Ин-т экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. - М.: Наука, 1994. - 163 с.

65. Квасников Е.И., Юпошникова Т.М. Микроорганизмы - деструкторы нефти. - Киев: Наук, думка, 1981. -131 с.

66. Кедровский Б.В. Проблемы единства строения и функции в протоплазме // Усп. совр. биол. - 1935. -Т. 4, № 6. - С. 486-512.

67. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов. - М.: Мир, 1975. - 324 с.

68. Климова Н.Е., Златкин И.В., Никитин-Д.И. Таксономическая характеристика олиготрофных бактерий на основании изучения белкового компонента мембран // Микробиология. - 1993. - Т. 62, вып. 2. - С. 276-282.

69. Козуб С.Н. Использование метода контактно-сорбционного обезвоживания для получения сухих музейных культур возбудителя дифтерии / Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Челябинск, 1997. - 24 с.

70. Комарова Т.И., Поршнева О.В., Коронелли Т В. Образование трегалозы клетками R- и ^-вариантов Rhodococcus erythropolis II Микробиология. -1998. -Т. 67, №3,- С. 428-431.

71. Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов // Успехи микробиологии. - М.: Наука, 1977. - Вып. 12. - С. 164-189.

72. Коронелли Т.В. Поступление углеводородов в клетки микроорганизмов // Успехи микробиологии. - М.: Наука, 1980. - Вып. 15. - С. 99-111.

73. Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов. -М.: Изд-во МГУ, 1984. - 158 с.

74. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Ильинский В.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон // Микробиология. - 1994. - Т. 63, вып. 5. - С. 917- 922.

75. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Коротаева Е.В. Выживаемость углеводородокисляюгцих бактерий в условиях полного голодания // Микробиология. - 1988а. - Т. 57, вып. 2. - С. 298-304.

76. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Семененко М.Н. Определение активности углеводородокисляюгцих бактерий с использованием и-алканов, меченных тритием // Приют, биохимия и микробиология. - 19886. - Т. 24, вып. 2. - С. 203-206.

77. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Ильинский В.В., Кузьмин Ю.И., Кирсанов Н.Б., Яненко A.C. Интродукция бактерий рода Rhodococcus в тундровую почву, загрязненную нефтью // Прикл. биохимия и микробиология - 1997. -Т. 33, №2. -С. 198-201.

78. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Юферева С.Г., Ильинский В.В., Чивкунова О.Б., Розынов Б.В. Полярные липиды углеводородокисляющих бактерий среды // Микробиология. - 1993. - Т. 62, вып. 2. - С. 231-237.

/

79. Коронелли Т.В., Нестерова Е.Д. Экологическая стратегия бактерий, использующих гидрофобный субстрат // Микробиология. - 1990. - Т. 59, вып. 6, -С. 993-997.

80. Коронелли Т.В., Юферова С.Г. Повехностно-активные свойства некоторых штаммов углеводородокисляющих бактерий // Вестник Моск. ун-та. Серия 16. Биология. - 1990. - № 1. - С. 14-18.

81. Кошелев А.В., Нестеров А.И. Ускоренный тест прогнозирования выживаемости лиофилизированных культур метанотрофных бактерий // Микробиология. - 1987. - Т. 56, вып. 3. - С. 492-496.

82. Красильников Н.А., Коронелли Т В., Розынов Б.В. Алифатические и миколовые кислоты Mycobacterium paraffinicum //Микробиология. - 1972. -Т. 41, вып. 5. - С. 808-812.

83. Кузнецов В.Д., Бушуева О.А., Рууге Э.К. Влияние способов лиофилизации на образование свободных радикалов, выживаемость и состав популяции продуцента линкомицина // Антибиотики. - 1975. - Вып. 12. - С. 1065-1068.

84. Куплетская М.Б. Результаты хранения лиофилизированных культур микроорганизмов в течение 25 лет // Микробиология. - 1987. - Т. 56, вып. 3. -С. 488-491.

85. Куплетская М.Б., Аркадьева З.А. Методы длительного хранения коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии Московского государственного университета // Микробиология. - 1997. - Т. 66, № 2. - С. 283- 288.

86. Куюкина М.С. Антибиотикочувствительность алканотрофных родококков и возможные пути формирования их неспецифической антибиотикорезистентности / Дис. ... канд. биол. наук. - Пермь, 1997. - 175 с.

87. Лозина-Лозинский Л.К. Анабиоз и устойчивость живых систем // Журн. общ. биол. - 1973-, Т. 34,№2.-С. 253-263. ✓

88. Лозина-Лозинский Л.К. Жизнеспособность и анабиоз при низких температурах у животных // В кн.: П.Ю.Шмидта "Анабиоз". - М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1955. - С. 381-433.

89. Лысак Л.В., Горин С.Е., Вустина Т.Ф. Экзогликаны почвенных бактерий родов Artrobacter и Rhodococcus II Микробиология. - 1992. - Т. 61, вып. 4. -С. 622-627.

90. Лысак Л.В., Сидоренко Н.Н. О видовом разнообразии родококков в городских почвах // Микробиология. - 1997. - Т. 66, № 4. - С. 574-575.

91. Лысенко С.В., Демина Н.С. Механизмы защиты организмов от действия ультрафиолетовых лучей // Изв. АН СССР. Сер. биол. -1981. - №. 6. - С. 845853.

92. Матвеева Н.И., Воронина Н.А., Борзенков И.А., Плакунов В.К., Беляев С.С. Состав и количественное содержание осмопротекторов в клетках нефтеокисляющих бактерий при разных условиях культивирования// Микробиология. - 1997. - Т. 66, № 1. - С. 32-37.

93. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков. - М.: Мин. здрав. СССР, 1983. - 16 с.

94. Методы культивирования клеток / Под ред. Г.П.Пинаева. - JL: Наука, 1988. -319 с.

95. Методы общей бактериологии / Под ред. Ф.Герхардта и др. - М.: Мир, 1983.-Т. 1,2. у

96. Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов / Под ред. Н.А.Красильникова. - М.: Наука, 1967. - 150 с.

97. Милько Е.С. Выживаемость диссоциантов углеводородокисляющего штамма Pseudomonas aeruginosa при хранении // Микробиология. 1998. - Т. 67, № 1.-С. 102-105.

98. Милько Е С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1991. - 142 с.

99. Милько Е.С., Егоров Н.С., Обухова Н.А. Естественная изменчивость микобактерий и родственных им организмов // Биологические науки. - 1980. -№3.-С. 5-19.

100. Могилевский Г, А., Стадник Е.В., Оборин А.А., Богданова В.М., Телегина З.П., Тон М.С. Газобактериальная съемка по снежному покрову - новый вид поисковых работ на нефть и газ // Геомикробиология поиска и разведки нефтяных месторождений. - Свердловск: УрО АН СССР/1979. - С. 21-29.

101. Нестеренко О.А. Систематика нокардиоподобных и коринеподобных бактерий / Афтореф. дис. ... докт. бжиъ наук. - Киев. 1982. - 49 с.

102. Нестеренко О.А., Андреев JI.B., Ногина Т.М., Шкаруба В.В. Жирнокислотный состав некоторых корине- и нокардиоподобных бактерий // Микробиол. журн. - 1980а. - Т. 42, № 3. - С. 288-293.

103. Нестеренко О.А., Квасников Е.И., Ногина Т.М. Нокардиоподобные и коринеподобные. - Киев: Наук, думка, 1985. - 336 с.

104. Нестеренко О.А., Ногина Т.М., Квасников Е.И. Циклы развития некоторых коринеподобных и нокардиоподобных бактерий // Микробиология. - 19806. - Т. 49, вып. 6. - С. 952-960.

105. Нестеров А.И., Кошелев А.В., Гальченко В.Ф., Иванов М.В. Выживаемость облигатных метанотрофных бактерий при лиофилизации и последующем хранении // Микробиология. - 1986. - Т. 55/вып. 2. - С. 271277.

106. Никитин Д.И. Биология олиготрофных бактерий / Афтореф. дис. ... докт. биол. наук. - М.: ИНМИ РАН, 1985. - 35 с.

107. Новик Г.И., Высоцкий В.В. Архитектоника популяций бифидобактерий: субмикроскопический аспект когезии клеток Bifidobacterium adolescentis и Bifidobacterium bifidumll Микробиология. - 1995. - Т. 64, № 2. - С. 222-227.

108. Паников Н.С., Добровольская Т.Г., Лысак Л.В. Экология коринеподобных бактерий// Успехи микробиологии. - 1988. - Т. 23. - С. 51-91.

109. Пирог Т.П., Гринберг Т.А., Малашенко Ю.Р. Защитные функции экзополисахаридов, синтезируемых бактериями Acinetobacter sp. // Микробиология. - 1997. - Т. 66, № 5. - С. 335-340.

110. Пучков Е.О., Говорунов И.Г. Проблемы криоконсервации бактериальных культур. Серия "Консервация генетических ресурсов". - Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1983. - 23 с.

111. Рапопорт А.И., Вентыня ЭТО. Структурно-функциональные перестройки в клетках при обезвоживании - регидратации // Торможение жизнедеятельности клеток / Под ред. М.Е.Бекера. - Рига: Зинатне, 1987. - С. 55-71.

112. Ротмистров М.Н., Ставская С.С., Татанова Л.А., Григорьева Т.Ю., Тренина Г. А., Ключева М.В., Емцева Т.В. Хранение псевДомонад, разлагающих поверхностно-активные вещества // Микробиология. - 1990. -Т. 59, вып. 1.-С. 156-161.

113. Рощина Е.К., Петров Л.Н. Выделение белка во внеклеточное пространство как неспецифическая реакция Escherichia coli на стресс // Микробиология. -1997.-Т. 66, № 2.-С. 179-184.

114. Рубан Е.Л. Хранение культур микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. - 1989. - Т. 25, № 3. - С. 291-301.

115. Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом. - М.: Наука, 1973. - 221 с.

116. Саралов А.И., Бердичевская М.В., Банникова О.М., Чикин С.М. Накопление полифосфатов в начальной фазе роста Acinetobacter calcoaceticus и Rhodococcus maris // Микробиология. - 1995. - Т. 64, № 4. - С. 446-452.

117. Сафронова В.И., Новикова Н.И., Сидякина Т.М., Божьева Л.Т. Сравнение методов криоконсервации и лиофилизации как способов длительного хранения клубеньковых бактерий // Микробиология. -1991. - Т. 60, вып. 2. -С. 368-376.

118. Сидякина Т.М. Консервация микроорганизмов в коллекциях культур. Сер. "Консервация генетических ресурсов". - Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1990.-С. 81-159.

119. Слабова О.И., Никитин Д.И., Загреба Е.Д. Использования поли-р-оксимасляной кислоты в процессе окисления газовых субстратов и их смесей клеткамиMethylobacterium organophilum //Микробиология. - 1990. -Т. 59, вып. 6. - С. 938-941. ;

120. Смирнов В.В., Васюренко З.П., Чуркина Н.Л. Структурно-функциональная роль жирно-кислотного компонента бактериальных липидов и связанные с ней аспекты чувствительности и устойчивости бактерий к антибиотикам // Антибиотики и мед. биотехнология. - 1987. - Т. 32, №5.-С. 265-371.

121. Степанова Р.А., Милько Е.С., Егоров Н.С., Мартынкина Л.П. Состав клеточных стенок R-, S- иМ-вариантов Rhodococcus rubropertinctus II Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. - 1987. - № 1. - С. 56-60.

122. Теппер Е.З. Микроорганизмы рода Nocardia и разложение гумуса. - М.: Наука, 1976. - 196 с.

123. Терешина В.М., Михайлова M.B., Феофилова Е.П. Физиологическая роль трегалозы и антиоксиданта у Cunninghamella japónica при высокотемпературном стрессе // Микробиология. -1991. - Т. 60, вып. 5. - С. 781-788.

124. Торможение жизнедеятельности клеток / Под общ. ред. М.Е.Бекера. -Рига: Зинатне, 1987. - 239 с.

125. Уиттекер Р.Х. Сообщества и экосистемы. - М.: Прогресс, 1980. - 327 с.

126. Ураков H.H., Волков В.Я., Боровик Р.В. Функциональное состояние и механизмы повреждения микроорганизмов в процессе приготовления бактериальных препаратов // Биотехнология. - 1988. - Том 4, № 4. - С. 420432.

127. Файбич М.М. Лиофильные сухие препараты живых вакцин и музейных культур // Бюллетень по обмену опытом института им. Пастера. - 1947. - № 4.-С. 1-17.

128. Фатеева М.В. Коллекции микроорганизмов и методы длительного хранения коллекционных культур // Успехи микробиологии. - 1983. - Вып. 18.-С. 193-215.

129. Фельдман Ю.М., Маханева Л.Г. Способ хранения и пересылки культур бактерий с использованием бумажных дисков // Клиническая лабораторная диагностика - 1994. - № 5. - С. 45-46.

130. Феофилова Е.П. Трегалоза, стресс и анабиоз // Микробиология. - 1992. - Т. 61, вып. 5.-С. 741-755.

131. Феофилова Е.П. Биохимическая адаптация грибов к температурному стрессу // Микробиология. - 1994. - Т. 63, вып. 5. - С. 757- 776.

132. Феофилова Е.П. Биохимические особенности покоящихся стадий в цикле развития мукоровых грибов // Торможение жизнедеятельности клеток / Под ред. М.Е.Бекера. - Рига: Зинатне, 1987. - С. 172-179. у

133. Феофилова Е.П. Пигменты микроорганизмов. - М.: Наука, 1974. - 218 с.

134. Фунтикова Н.С., Катомина A.A., Мысякина Л.С. Состав фосфолипидов и степень ненасыщенности гриба Мисог при низких температурах // Микробиология. - 1992. - Т. 61, вып. 5. - С. 793-797.

135. Хекли Р. Свободные радикалы в биологии / Под ред. У.Прайора. - М.: Мир, 1979.-Т. 2.-С. 151-177.

136. Хочачко П., Сомеро Д. Биохимическая адаптация. - М.: Мир, 1981. - 576 с.

137. Шмидт П.Ю. Анабиоз. - М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1955. - 436 с.

138. Al-Diwany, L.J., Cross, Т. Ecological studies on nocardioform and other actinomycetes in aquatic habitats // Zentralblatt fur Bactériologie, Parasintenkunde, Infektionskrankheiten und Hygiene. - 1987. - N. 6. - P. 153-160.

139. Alvarez, H.M., Pucci, O.H., Steinbüchel, A. Lipid storage compounds in marine bacteria// Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1997. - Уо1у47, N. 2. - P. 132139.

140. Annous, B.A., Becker, L.A., Bayles, D.O., Wilkinson, B.J. Critical role of anteiso-C-15: 0 fatty acids in the growth of Listeria monocytogenes at low temperatures // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - Vol. 63, N. 10. - P. 3887-3894.

141. Atlas, R. M. Handbook of microbiological media / Edit.: L.C.Parks. - CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo, 1993. - 1079 p.

142. Ausborn, M., Schreier, H., Brezesinski, G., Fabian, H., Meyer, H.W. The protective effect of free and membrane-bound cryoprotectants during freezing and freeze-drying of liposomes // Journal of Controller Release. -/1994. -Vol. 30, N. 2. -P. 105-116.

143. Benschoter, A.S., Ingam, 1.0. // Appl. Environ. Microbiol. - 1986. - Vol. 51, N. 6.-P. 1278-1282.

144. Berger, M., Urban, J.E. Methods for increasing survivability during storage exponentially growing bacteria // Current Microbiol. -1996. - Vol. 33, N. 5. - P. 312-316.

145. Byrne, P., Chapman, D. Liquid crystalline nature of phospholipids // Nature, Lond. - 1964. - Vol. 202. - P. 987-988.

146. Calcott P.H. Freezing and thawing microbes / Edit.: J.G.Cook. - Bushey.: Meadowfield Press Ltd., 1978.

147. Canillac, N., Pommier, M.T., Gounot, A.M. Effect de la temperature d'incubation sur la compisition lipidique de Corynbacteriacees du genre Arthrobacter II Canad. J. Microbiol. - 1982. - Vol. 28, N. 3. - P. 284-290.

~ y

148. Catalogue of cultures BCCM™/LMG. Bacteria. - Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (BCCM). - Belgium, 1998. - 633 p.

149.Chemical methods in prokaryotic systematics / Edit.: M.Goodfellow, A.G.O'Donnell. - John Wiley and Sons Ltd, England, 1994. - 576 p.

150. Cox, C.S., Heckly, R.I. Effect of oxygen freeze-dried and freeze-thawed bacteria: viability and free radical studies // Canad. J. Microbiol. - 1973. - Vol. 19, N2-P. 189-194.

151. Cross, T., Rowbotham, T.J., Mishustin, E.N. The ecology of nocardioform actinomycetes // The biology of the nocardiae. - London, 1976. - P. 337-371.

152. Endangered culture collections // First and Second Inter. Symposia / Edit.: R.R.Colwell. - Maryland, 1992. - 82 p.

153. Feltham, R.K.A., Power, A.K., Pell, P.A., Sneath, P.H.A. A simple method for storage of bacteria at -76°C // J. Appl. Bacterid. - 1978. - Vol. 44. - P. 313-316.

154. Finnerty, W. The biology and genetics of genus Rhodoccodus 11 Ann. Rev. Microbiol. -1992. - Vol. 46. - P. 193-218.

155. FlorinCristensen, M., FlorinCristensen, J., Delsola, E.D., Lammel, E., Meinardi, E., Brenner, R.R., Rasmusser, L. Temperature acclimation of Trypanosoma cruzi epimastigote and metacyclic lipids // Molecul. Biochemic. Parasitol. - 1997. - Vol. 88, N. 1-2. - P. 25-33.

156. Gherna, R.L. Culture preservation // Methods for general and molecular bacteriology / Editor-in-chief.: Ph.Gerhardt, Edit.: R.G.E.Murray, W.A.Wood, N.R.Krieg. - Washington.: American Society for Microbiology, 1994. - P. 278292.

157. Goodfellow, M. Ecology of actinomycetes // Ann. Rev. Microbiol. - 1983. -Vol. 37.-P. 189-216.

158. Goodfellow, M. Genus Rhodococcus II Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Edit.: J.G. Holt. - Baltimore etc.: Williams and Wilkins Company, 1989.-Vol. 4. -P. 2362-2371.

159. Goodfellow, M., Alderson, G. The actinomycete-genus Rhodococcus: a home for the "rhodochrous" complex // J. Gen. Microbiol. - 1977. - Vol. 100, N. 1. - P. 99-122.

160. Goodfellow, M., Schaal, K.R., Zlotnik, H., Sandoval, H., Brown, J.M., Carlotti, A., Faibra, D.T., Guerin, V., Gvozdiak, O.R., Kamne-Fotso, M.V., Kim, S.B., Panteix, G., Tarnok, I.I., Trujillo, M.E. Identification of some clinically significant actinomycetes // Res. Microbiol. - 1993. - Vol. 144. - P. 647-651.

161. Gordon, R.E., Mihm, J.M. Comparative study of some strains received as Nocardia II J. Bacteriol. - 1957. - Vol. 73, N. 1. - P. 15-27.

162. Gordon, R.E., Smith, M.M. Rapidly growing, acid fast bacteria. Species descriptions of Mycobacterium phlei Lehmann and Neumann and Mycobacterium, smegmatis (Trevisan) Lehmann and Neumann // J. Bacteriol. - 1953. - N. 1. - P. 41-47.

163. Gould, J.C., Bowie, J.H. The determination of bacteria sensitivity to antibiotics // Edinburgh Medical Journal. - 1952. - Vol. 59. - P. 178-199.

164. Haksworth, D.L., Aguirre-Hudson, B. International initiatives in microbial diversity // The biodiversity of microorganisms and the role of microbial resource centres / Edit.: B.Kirsop and D.L.Haksworth. - WFCC. UNEP. - 1994. - P. 65-72.

165. Hall, G.S. Emerging pathogens: Afipia ana Rhodococcus species // Rapid methods and automation in microbiology and immunology / Edit.: R.C.Spenser, E.P.Wrigth, S.W.B.Newson. - Intersep Ltd, 1994. - P. 305-31}.

166. Heckly, R.J. Preservation of microorganisms // Advanc. Appl. Microbiol. / Edit.: D.Perlman. - N.-Y et at Acad. Press, 1978. - Vol. 24. - P. 1-53.

167. Henry, J., Kirsop, B. Cryopreservation of yeasts in polypropylene straws // UNESCO/WFCC Technical Information Sheet (TIS). - NCYC, 1989. -Publication N. 3.

168. Hilliger, M., Hanel, F., Menz, J. Temperatureinflu auf wachstum und lisin-bildung von Corynebacterium glutamicum IIZ. Allg. Microbiol. - 1984. - Vol. 24, N. 7.-P. 437-441.

169. Hochschka, P.W., Somero, G.N. Strategies of biochemical adaptation / Edit.: W.B.Sannclers. - Philadelfia, 1973. - 276 p.

170. Ivshina, I.B. New Russian specialised collection of microbial resources // Culture collection to improve the quality of life / Edit.: R.A.Samson, J.A.Stalpers, D.van der Nei, A.H.Stouthamer. - UK, 1996. - P. 435-536.

171. Ivshina, I.B. Regional specialized collection as a source fof preservation of alkanotrophic microorganisms diversity // Environmental pollution: assessment and treatment / Edit.: P.Read and J.Kinross. - Edinburgh, UK, 1997. - P. 77-84.

172. Ivshina, I.B., Kuyukina, M.S., Philp, J.C., Christofi, N. Oil desorption from mineral and organic materials using biosurfactant complexes produced by Rhodococcus species // World J. Microbiol. Biotechnol. - 1998. - Vol. 14. - P. 1-7.

173. Ivshina, I.B., Philp, J.C., Kuyukina, M.S., Christofi, N. Novel and ecologically safe biosurfactants from Rhodococcus II Bayev Memorial Cojif.: Abstr. -Cobiotech. - Russia, Moscow, 1996. - P. 350.

174. Janda, I., Opekarova, M. Long-term preservation of active luminous bacteria by lyophilization// J. bioluminesc. chemiluminesc. - 1989. - Vol. 3. - P. 27-29.

175. Jarlier, V., Nikaido, H. Mycobacterial cell wall: Structure and role in natural resistance to antibiotics // FEMS Microbiol. Lett. -1994. - Vol. 123. - P. 11-18.

176. Kalakoutskii, L.V., Mazanov, A.L. Towards construction of object-oriented databases on microorganisms // Proceedings of the first East-European symposium on advances in databases and information systems (ADBIS'1997). St.-Petersburg, 1997. - St.-Pt.: St.-Petersburg University, 1997. - P. 85-87.

177. Kim, J.S., Powala, M., Lang, S., Wagner, F., Luensdorf, H., Wray, V. Microbial glycolipid production under nitrogen limitation and resting cell condition // J. Biotechnol. - 1990. - Vol. 13. - P. 257-266.

178. Kirsop, B.E. Service collections: their functions // Maintenance of microorganisms and culture cells / Edit.: B.E Kirsop, A.Doule. - London ets.: Acad. Press, 1991. - P. 5-20.

179. Kretschmer, A., Bock, H., Wagner, F. Chemical and physical characterization of interfacial-active lipids from Rhodococcus erythropolis grown on «-alkanes // Appl. Environ. Microbiol. - 1982. - Vol. 44, N 4. - P. 864-870.

180. Lapage, S.P., Redway, K.F. Preservation of microorganisms // CRC Handbook on microbiology. - Cleveland, Ohio: CRC Press, 1973. - P. 713-724.

181. Leben, C., Sleesman, J.P. Preservation of plant-pathogenic bacteria on silica gel // Plant Disease Rept. - 1982. - Vol. 66, N. 4. - P. 327-332.

182. Lechevalier, M.P., Lechevalier, H. Biology of actinomycetes not belonging to genus Streptomyces II Biology of Industrial Microorganisms / Edit.: A.L.Demain, N.A.Solomon. - Menlo Park, CA.: Benjamin/Cummings, 1985. - P. 315-358.

183. Lelliott, R.A. The preservation of plant pathogenic bacteria // J. Appl. Bacteriol. - 1965.-Vol. 28.-P. 181-193. /

184. Lin, Z. Low temperature preservation for producing strains of streptomycin and gentamycin // Cryoletters. - 1988. - Vol. 9, N. 3. - P. 144-151.

185. List of cultures. Microorganisms. 10th edition. / Institute for Fermentation (IFO). - Osaka, 1996. - 690 p.

186. Lowendorf, H. Factors affecting survival of Rhizobium in soil // Adv. Microbial Ecol. - 1980. - Vol. 4. - P. 87-124.

187. MacLeod, R.A., Calcott, P.H. Colg shock and freezing damage to microbes // The survival of vegetative microbes / 26th Symp. Soc. Gen. Microbiol. Univ. Cambridge, 1976. - Cambridge e.a., 1976. - P. 81-109.

188. Malik, K.A. Cryopreservation of bacteria with special reference to anaerobes // UNESCO/WFCC Technical Information Sheet (TIS). - DSM, Braunschweig, 1989.-PublicationN. 4.

189. Malik, K.A. Freeze-drying of microorganisms using a simple apparatus // UNESCO/WFCC Technical Information Sheet (TIS). - DSM, Braunschweig, 1990a.-PublicationN. 7.

190. Malik, K.A. Liquid-drying of microorganisms using a simple apparatus // UNESCO/WFCC Technical Information Sheet (TIS). - DSM, Braunschweig, 1990b.- Publication N. 8.

191. Malik, K.A. A convenient method for maintaining Chloroflexus for long time periods as slow growing liquid cultures // J. Microbiol. Methods. - 1996. - Vol. 27, N. 2-3.-P. 151-155.

192. Melkozernov, A.N., Puchkov, N.A., Bulashova, N.A., Lysakov, S.V. Computer database on methods of preservation of microorganisms // Binary. - 1993. - Vol. 5.-P. 62-65.

193. Microbial Diversity 21. IUMS/UBS Action Statemen. WFCC Newsletter. -1991.-Vol. 17.-P. 18-20.

194. Mikata, K., Banno, I. Preservation of yeast cultures by L-drying viability after 5 years of storage at 5°C // IFO Research Communications. - 1989. - N. 14. - P. 80103.

195. Minnikin, D.E. Lipids: complex lipids, their chemistry, biosynthesis and roles // The biology of the Mycobacteria / Edit. : Ratledge, Stanford, 1982. - Vol. 1. - P. 95-184.

196. Moore, L.W., Carlson, R.V. Liquid nitrogen storage of phytopathogenic bacteria // Phytopathology. - 1975. - Vol. 65, N. 3. - P. 246-250.

197. Mulder, E.G., Antheunisse, j. Morphologie, physiologie et^ecologie des Arthrobacter // Ann. Inst. Pasteur. -1963. - Vol. 105, N. 1. - P. 46-74.

198. National Collection of Food Bacterial Catalog of Cultures 1990 / Agricultural and Food Research Council. Institute of Food Research, 1990. - 158 p.

199. Paje, M.L.F., Neilan, B.A., Couperwhite, I. A. Rhodococcus species that thrives on medium saturated with liquid benzene // Microbiology. - 1997. - Vol. 143, N. 9.-P. 2975-2981.

200. Pianka, E.R. On r- and k-selection // Amer. Nat. - 1970. - Vol. 104. - P. 592597.

201. Popova, A.V. Determination of colligative and specific action of serine on thylakoid membranes during freezing // Cryo - Letters. - 1997. - Vol. 18, N. 1. - P. 27-32.

202. Postgate, J.R. Viability measurements and survival of microbes under minimum stress // Advances in microbial physiology / Edit.: A.H.Rose, J.E.Wilkugon. -London ets.: Acad. Press, 1967. - Vol. 1. - P. 1-23.

203. Prescott, J.F. Rhodococcus equi: an animal and human pathogen // Clin. Microbiol. Rev.-1991.-N. 4. - P: 20-34.

204. Rainey, F.A., Burghardt, J., Kroppenstedt, R., Klatte, S., Stackebrandt, E. Phylogenetic analysis of the genera Rhodococcus and Nocardia and evidence for the evolutionary origin of the genus Nocardia from within the radiation of Rhodococcus species // Microbiology. - 1995. - Vol. 141. - P. 523-528.

205. Rastogi, N., Frehel, C., David, H.L. Triplelayered structure of mycobacterial cell wall: evidence for the existence of polisaccaride-rich over layer in 18 mycobacterial species // Curr. Microbiol. - 1986. - Vol. 13, N. 5. - P. 237-242.

/

206. Russell, N. J. Mechanism of thermal adaptation in bacteria: blueprints for survival // Trends Biochem. Sci. - 1984. - Vol. 5, N. 3. - P. 108-112.

207. Rybnikar, A., Hladik,V. Maintenance of a Paecilomyces variotii culture in the frozen and freeze-dried state and in distilled water // Folia Microbiologica. - 1986. -Vol. 31.-P. 229-334.

208. Sabart, P.R., Gakovich, D., Hanson, R.S. Avirulent isolates of Corynebacterium fascians that are unable to utilize agmatine and proline // Appl. Environ. Microbiol. - 1986. - N. 5. - P. 33-36.

209. Sakamoto, T., Shen, G.Z., Higashi, S., Murata, N., Bryant, D.A. Alteration of low-temperature susceptibility of the cyanobacterium Synechococcus sp. Pcc 7002 by genetic manipulation of membrane lipid unsaturation // Archives of Microbiology. - 1998. - Vol. 169, N. 1. - P. 20-29. y

210. Scott, W.G. Recent research in freezing and drying / Edit.: Parkes and Smith. -Oxford, 1960. - P. 188-205.

211. Singer, M.E., Finnerty, W.R. Physiology of biosurfactant synthesis by Rhodococcus species H13-A// Can. J. Microbiol. - 1990. - Vol. 36. - P. 741-745.

212. Sorkhoh, N.A., Ghannoum, M.A., Ibrahim, A.S., Stretton, R.J. Sterols and diacylglycerophosphocholines in the lipids of the hydrocarbon-utilizing prokaryote Rhodococcus rhodochrous II J. Appl. Bacteriol. - 1990. - Vol. 69. - P. 856-863.

213. Stark, C.N., Herrington, B.L. The drying of bacteria and the viability of dry bacterial cells III. Bacteriol. -1931. - Vol. 21, N. 1. - P. 13-14.

214. Steim, J.M., Tourtelotte, M.E., Reinert, J.C., McElhaney, R.N., Rader, R.L. Calorimetric evidence for the liquid crystalline state of lipids in a biomembrane / Proceedings of the National Academy of Sciences. - USA, 1969. - N. 63. - P. 104-109.

215. Strange, R.E., Cox, C.S. The survival of vegetative microbes / Edit.: Gray and Postgate. - Univ. of Cambrige, 1976. - P. 111 -154.

216. Takaichi, S., Tamura, Y., Azegami, K., Yamamoto, Y., Ishidsu, J. Carotenoid glucoside mycolic acid esters from the nocardioform actinomycetes, Rhodococcus rhodochrous II Phytochemistry. - 1997. - Vol. 45, N. 3. - P. 505-508.

217. Thammavongs B., Corroler, D., Panoff, J.M., Auffray, Y., Boutibonnes, P. Physiological response of Enterococcus faecalis JH2-2 to cold shock: growth at low temperatures and freezing/thawing challenge // Lett. Appl. Microbiol. - 1996. -Vol. 23, N. 6. -P. 398-402.

218. The National Collections of Industrial and Marine Bacteria LTD. Catalogue of strains / Edit.: E.P.Young, G. McFarlane. The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB). - Aberdeen, 1994. - 304 p.

219. The Prokaryotes. 2-nd Edition. A handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, identification, application / Edit.: A., Balows, H.G., Truper, M., Dworkin, W., Harder, K.H. -Berlin, Heidelderg: Springer-Verlag, New York, 1981.- Vol. 1-4.

220. Tsukamura, M. Identification of Mycobacteria II Tubercle. - 1967. - Vol. 48. -P. 311-338.

221. Tsukamura, M. Numerical taxonomy of the genus Nocardia II J. Gen. Microbiol. - 1969. - Vol. 56, N. 2. - P. 265- 287.

222. Tsukamura, M., Mizuno, S. Preservation of mycobacterial strains // Kekkaku. -1982. - Vol. 57, N. 9. - P. 467-470.

223. Ukrainian national collection of microorganisms // Мшробюлопчний журнал. - 1995.-Т. 57,N. 6.-P. 3-11.

224. Vestal, J.R., Perry, J J. Effect of substrate on the lipids of the Jiydrocarbon utilizing Mycobacterium vaccae II Can. J. Microbiol. -1971. - Vol. 17, N. 1. - P. 445-449.

225. Von Arx, J.A., Schipper, M.A.A. The CBS Fungus Collection // Adv. Appl. Microbiol. - 1978. - Vol. 24. - P. 215-236.

226. Wagner, F., Benrendt, U., Bock, H., Kretschmer, A., Lang, S., Syldatk, C. Production and chemical characterization of surfactants from Rhodococcus erythropolis and Pseudomonas sp. MUB grown on hydrocarbons // Microbial Enhanced Oil Recovery. - 1983. - P. 55-60.

ТОТ "сл/гхт ллт:и:___ от т-»________-г -----------^ • i

t . »» Viuugiuij, ij.ivjL.ii., vv llliailia, kj. 1 . 11CSC1 VitUUll UX auiiiiuiliyUCLC I11UCU1U.I1 J Ш

frozen glycerol // Microbiol. Lett. - 1978. - Vol. 6. - P. 151-157. 228. Yanagita, Т., Ichikawa, Т., Tsuji, T. Two groups of bacteria, oligotrophs and eutrophs: Their distribution in fresh and sea water areas in the Central Northern Japan // J.Gen. Appl. Microbiol. - 1978. - Vol. 24. - P. 59-88.

у

у