Комплексная иммунологическая и молекулярная диагностика пацилломавирусной инфекции у больных и определение формирования злокачественной трансформации эпителиальных тканей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.11, доктор медицинских наук Кубанов, Алексей Алексеевич

• Кубанов, Алексей Алексеевич
• доктор медицинских наук
• 2005

Оглавление диссертации доктор медицинских наук Кубанов, Алексей Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Классификации папнлломавпрусов человека, вопросы эпидемиологии и особенности клинической картины.

1.1.1. Особенности структурно-функциональной организации генома н классификация папнлломавпрусов человека.

1.1.2 Эпидемиология апогепнталыюй папнлломавирусной инфекции. 23 1.1.3. Особенности клинической картины у больных аногенпталыюн наннлломавнрусной инфекцией.

1.2. Влияние папнлломавпрусов человека на развитие онкологических заболевании у человека.

1.2.1. Эпидемиологические доказательства связи аногенитальной наннлломавнрусной нпфекцпп с раком шенкн матки.

1.2.2. Факторы риска инфицировании ВПЧ и развития неопластнческпх процессов.

1.2.3. Молекулярные механизмы индукции рака шейки матки.

1.3. Характеристика иммунного статуса больных папнлломавнрусной ппфскцпсй

1.3.1. Естественный иммунитет. Прямой антивирусный п аптинролпфератнвный эффект цнтокппов.

1.3.2. Адаптивный клсточно-оносрсдоваппый иммунитет при ВПЧ - инфекции.

1.4. Современные методы идентификации вируса папилломы человека.

1.4.1.Соврсмснныс технологии детекции ВПЧ.

1.4.2. Сравнение современных методов детекции напилломавнруса человека.

1.5. Современные направлении в терапии аиогенпталыюн наннлломавнрусной инфекции.

1.5.1. Методы лечения больных наннлломавнрусной инфекцией с использованием средств для наружного применения.

1.5.2. Иммунотерапии наннлломавнрусной нпфекцпп.

1.5.3. Генотераппя наннлломавнрусной инфекции.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Клпппко-лабораторпыс исследования

2.2. Молскулярно-биологическис и иммупогспстичсскнс методы исследования.

2.2.1 Клеточные штаммы п плазмидиые векторы.

2.2.2. Синтез олнгонуклеотндных пранмеров.

2.2.3. Выделение ДНК из клеток крови.

2.2.4. Выделение ДНК из клинического материала цервпкалыюго канала и уретры.

2.2.5. Выделение РНК нз клеток крови.

2.2.6. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК.

2.2.7. Выявление ДНК папнлло.мавируеов и возбудителен урогеннтальных инфекции в клинических образцах.

2.2.8. Конструирование илазмндных векторов, содержащих полноразмерную нуклеотидную последовательность генома ВПЧ 16 п ген Е6.

2.2.9. Проведение трансформации Е. coli плазмндиой ДНК.

2.2.10. Прснаратнвное выделение плазмндиой ДНК.

2.2.12. Гснотнпированнс ВПЧ.

2.2.13. Прямая твердофазная гибридизация.

2.2.14. Определение полиморфизма гепа р53.

2.2.15. Определение Th - цнтокинового статуса в клетках цервпкалыюго капала.

2.2.16. Количественная оценка мРНК цптокинов с помощью ПЦР в реальном режиме времени.

2.2.17. Определение цнтокинового профиля в цервикалыю.м секрете.

2.3. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Результаты скринннговых исследований населения Москвы и Московской области на частоту выявления ВПЧ. Разработка системы генотннировапнн ВПЧ. Изучение частоты ассоциаций между ВПЧ и другими возбудителями инфекции урогеннталмюго тракта.

3.1.1. Разработка системы выявления н тнинровання ВПЧ в урогеннталыюм тракте.

3.1.2. Результаты скрининга населения г. Москвы и Московской области на распространенность ВПЧ и его асоциацпй с другими возбудителями инфекции урогеннталыюго тракта.

3.2. Клиническая характеристика больных аногеннталыюй ПВП.

3.3. Результаты изучения экспрессии цнтокииов: INF-y, 11-4, TNF-a п II-l2 и uiiTOKiiiiORoro профиля в цсрвикальном секрете у пациенток с наннлломавнрусной инфекцией.

3.3.1. Результаты исследования экспрессии цшокннов и цптокпиового профиля у пациенток с ПВП методом ОТ-ПЦР в режиме реального врсмспп.

3.3.2. Зависимость между экспресснеп цитокппов и характером течения ПВП.

3.3.3. Показатели измерения цнтокнпового профиля методом ИФА.

3.4. Изучение физического стату са ДНК вируса папилломы человека.

3.4.1. Определение количественного соотношения интегрированной н энисомалмюп форм ДНК вируса папилломы человека.

3.4.2. Определение физического статуса ДИК ВПЧ с использованием мультнпраимернон ПЦР.

3.4.4. Определение физического статуса ДНК ВПЧ с использованием ПЦР в режиме реального времени.

3.5. Результаты изучения изменчивости генома человека н вируса напнлломы человека у пациентов с ПВП, ассоциированной с ВПЧ 16 типа.

3.5.1. Изучение полиморфизма гена р53 у пациенток с ПВП методом конформацпопного анализа нуклеотндных последовательностей.

3.5.2. Определение вариантов аллелей гена Еб ВПЧ 16 типа н их корреляция с полиморфизмом кодоиа 72 гепа р53 пациенток с ПВП.

3.5.3. Вариации нуклеотпдиой последовательности LCR, Еб и Е7 ВПЧ 16 типа.

3.5.4. Результаты изучения нуклеотндных замен 350G/T гена Еб ВПЧ 16 типа.

3.5.5. Результаты изучения полиморфизма 72 кодоиа гена р53 у пациентов с ВПЧ методом аллельснецпфпчсскоп ПЦР.

3.5.6. Выявление корреляции между полиморфизмом 350G/T гена Еб ВПЧ 16-го типа н аллельпон изменчивостью 72 кодоиа р53 у пациентов с ПВП.

3.6. Лечение пацнептов с наннлломаоируснон инфекцией.

ГЛАВА IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комплексная иммунологическая и молекулярная диагностика пацилломавирусной инфекции у больных и определение формирования злокачественной трансформации эпителиальных тканей»

Актуальность проблемы

Апогенитальные бородавки, или аногенитальная папилломавирусная инфекция (ПВИ) человека является одним из наиболее распространенных вирусных заболеваний, передаваемых половым путем. ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) определяется у клинически здоровых женщин в 3-10% случаев, у пациентов с остроконечными кондиломами - в 50-80%, при доброкачественных поражениях шейки матки — в 12-35%, дисплазиях шейки матки - в 19-90%, внутриэпителиальных карциномах - в 58-89%, причем на ранних стадиях дисплазии ПВЧ обнаруживается чаще, чем на поздних (Franco E.L. et al., 1999; Brown D.R. et al., Ferlay J„ 2001; 2002; Sherman M.E., et al., 2003).

Вирус папилломы человека впервые был выделен в 1933 г. из биологического материала, полученного от кролика, и в последующем стал первой экспериментальной моделью вирусного канцерогенеза. Согласно данным Киселева Ф.Л.(2000); Аполихиной И.А.(2002); Хансона К.ГЦ2002), при раке шейки матки (РШМ) в опухолевом материале в 90-100% случаях обнаруживается ДНК вируса папилломы человека. Постоянное носительство ВПЧ приводит сначала к возникновению дисплазии шейки матки легкой, затем к умеренной, и, наконец, к тяжелой степени, которая заканчивается развитием инвазивного плоскоклеточного рака (Koutsky L.A, 1997).

Вывод об этиологической роли ВПЧ при раке шейки матки имеет не только важное теоретическое, но и непосредственное практическое значение.

Согласно данным ВОЗ, в настоящее время в мире ежегодно регистрируется до 500 000 новых случаев рака шейки матки, который занимает 7-е место среди всех злокачественных опухолей и 3-е место среди всех раковых заболеваний у женщин после рака молочной железы и рака толстой кишки.

Высокая контагиозность вируса и половой путь передачи способствуют его широкому распространению среди различных групп населения, в особенности сексуально активных лиц. С точки зрения эпидемиологии к факторам риска развития РШМ и состояний, ему предшествующих, относятся: раннее начало половой жизни, высокая сексуальная активность, частая смена половых партнеров, несоблюдение половой гигиеиы, наличие сопутствующих ИППП, вирусных инфекций, а также иммунодефицит, курение, использование оральных контрацептивов. Широкое распространение вариантов такого поведения среди молодежи вызывает необходимость проведения скрининговых программ, направленных па активное выявление бессимптомных носителей вируса, своевременное обнаружение и лечение больных ПВИ. В российской научной медицинской литературе до настоящего времени отсутствуют систематические данные о частоте выявления ВПЧ разных типов у пациентов с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, обращающихся в специализированные лечебно-профилактические учреждения, а также о сочетании ВПЧ с другими инфекциями, передаваемыми половым путем. Вместе с тем получение таких сведений является совершенно необходимым для понимания эпидемиологии ПВИ и взаимоотношения ВПЧ с другими возбудителями ИППП именно в Российской популяции, переживающей последствия сексуальной революции и социальные потрясения (затяжные военные конфликты, терроризм, появление беженцев, лиц, без определённого места жительства, резкое «омоложение» ИППП).

В 1989 г. была предложена концепция «инициирующего фактора» (zur Hauzen, 1991), согласно которой ВПЧ сам по себе не вызывает злокачественной трансформации, однако способствует развитию предракового состояния. При этом чрезвычайно важным является генотип ВПЧ и возможность ко-инфицирования ВПЧ разных типов (Thomas К.К., 2000).

Онкогенный потенциал ВПЧ существенно варьирует; по способности инициировать диспластические изменения и рак ВПЧ условно разделены на группы «высокого», «среднего» и «низкого» онкогенного риска опухолевой трансформации инфицированного эпителия. Типы ВПЧ 6, 11, 42, 43, 44 классифицированы как типы низкого риска развития

РШМ, типы 16, 18, 48, 56 - высокого риска. При РШМ типы 16 и 18 превалируют над другими типами вирусов. Наиболее часто встречающимся определен 16 тип вируса, который выявляется в 50 - 70% случаев РШМ (Koutsky L., 1997; Zur Hausen Н. 1999, Xi L.F. et al., 2002). В связи с вышеизложенным, в целях определения своевременного прогноза и предупреждения развития РШМ вследствие перенесенной ПВИ представляется актуальным своевременное и качественное определение генотипа вируса и разработка методов генотипирования, позволяющих проводить большие скрининговые программы с одновременным быстрым определением различных генотипов ВПЧ.

Как известно, определяющим фактором пути развития патологического процесса при взаимодействии вируса папилломы человека и макроорганизма: прогресса, персистенции или элиминации вируса из организма, - является иммунный ответ организма человека на внедрение возбудителя. Для развития этих процессов важен баланс между двумя эффекторными механизмами иммунитета - Thl (клеточно опосредованным) и Th2 (гуморальным).

На сегодняшний день уже не вызывает сомнения, что риск заражения ВПЧ связан с нарушением клеточного иммунитета (Critchlow et al, 1992; 1998; Hillemans et al, 1996; Palefsky et al, 1990; 1997; 1998), определяемого, в частности, продукцией барьерными эпителиальными клетками (включая цервикальные кератиноциты) и Т-лимфоцитами различных видов цитокинов. Существует достаточное количество доказательств, указывающих на то, что цитокины, в особенности TGF-ß, TNF, 1L-2, IFNy, могут оказывать влияние на рост ВПЧ-инфицированных клеток, ингибируя экспрессию ВПЧ -генов, включая гены Е6 и Е7, обладающих высоким проонкогенным потенциалом. (Malejczyk et al, 1992, 1994; Woodworth et al, 1990).

Работы по изучению иммунорегуляции при ПВИ фокусируются в последние годы на функциональной дихотомии цитокинов, обусловленной секретирующими их Т-хелперами и подразделяемыми па Th 1 типа, стимулирующие клеточный иммунитет (секретируют

IFNy, TNF и IL-2) и Th 2 типа, стимулирующие гуморальный иммунитет (декретируют IL-4, 5, 10 и 13) (Picker et al, 1995; Mosmann et al, 1996; Prussin, 1997; Nakagawa et al, 2000).

Существуют данные, указывающие на наличие ассоциации между Th 1 - профилем цитокинов и элиминацией ВПЧ и, напротив, данные о взаимосвязи между Th 2 — профилем и предрасположенностью к трансформации пораженных ВПЧ тканей в РШМ (Franco Е., et al., 1999). В свете изложенного, представляется необходимым проводить изучение цитокинового профиля пациентов с ПВИ в целях выявления возможных предиктивных факторов и групп риска для своевременного выявления предрасположенности больных к развитию злокачественной трансформации тканей при ПВИ. В отечественной литературе ссылки на работы подобного плана отсутствуют.

Особую роль в развитии рака шейки матки играют генетические факторы, ответственные за наличие предрасположенности к заражению ВПЧ, а также дефекты генов, ответственные за повреждения ДНК и степень клеточной пролиферации.

Одним из основных механизмов неопластической трансформации клеток является повреждение генов, контролирующих апоптоз. Известно, что ген р53 кодирует ядерный белок, модулирующий экспрессию генов, отвечающих за репарацию ДНК, деление клеток и программируемую клеточную смерть. Аминокислота аргинин, входящая в состав белка р53, во многом определяет его проонкогенные свойства. Показано, что наличие у женщин гомозиготпости по аргинину в составе белка (р53 Arg/Arg), характеризует их как относящихся к группе высокого риска развития рака шейки матки. В свою очередь, полиморфизм гена Е6 и других функционально активных областей генома ВПЧ может приводить к изменению их свойств с высокой степенью вероятности трансформации ДНК вируса в интегрированную форму с повреждением генома клетки человека и развитием РШМ. Связываясь с белком Е6 ПВЧ 16 типа, продукт гена р53 может оказывать значительное влияние па развитие ВПЧ-опосредованного рака шейки матки, приводя к запуску механизмов неконтролируемой пролиферации. Таким образом, чрезвычайно важное значение в понимании механизмов развития неопластических процессов шейки матки, развивающихся вследствие перенесенной ПВИ или на ее фоне, имеет изучение полиморфизма генов возбудителя и человека, а также процессов, лежащих в основе взаимодействия меаеду этими факторами.

В настоящее время установлено, что решающую роль в канцерогенезе при ПВИ играют продукты генов Е6 и Е7 ВПЧ «высокого» онкогенного риска (16 и 18); в их присутствии значительно возрастает вероятность прогрессии интраэпителиальной неоплазии, нередко предшествующей РШМ. Однако, в некоторых случаях вирусный геном в течение нескольких месяцев может быть спонтанно элиминирован из организма (Но в. е1 а!., 1998), что чаще всего ассоциируется с персистенцией вируса в эписомальной форме. И, напротив, интеграция вирусной ДНК ВПЧ 16 типа индуцирует нестабильность клеточного генома, нарушения в хромосомах и активирует механизм прогрессии неоплазии от дисплазии тяжелой степени к раку. В связи с вышеуказанным, чрезвычайно важным для понимания процессов злокачественной трансформации инфицированных тканей является точное определение физического статуса ДНК ВПЧ 16 типа, что напрямую связано с изучением соотношений белков Е1, Е2, Е6 и Е7 ВПЧ «высокого» онкогенного риска (16 и 18 типов), играющих определяющую роль в канцерогенезе при ПВИ.

Таким образом, многие вопросы, касающиеся распространенности, факторов риска заражения и патогенеза ПВИ в настоящее время являются в достаточной степени изученными. Вместе с тем следует констатировать, что в клинической практике до настоящего времени отсутствует четкий алгоритм обследования пациентов с папилломавирусной инфекцией и оценки факторов риска злокачественной трапформации тканей, основанный на комплексной оценке различных факторов, в первую очередь, молекулярных и иммуногенетических процессов, характеризующих папилломавирусную инфекцию и касающихся как возбудителя, так и инфицированного человека.

Существующие в настоящее время методы лечения больных ВПЧ-инфекцией не достаточно эффективны вследствие проблемы частых рецидивов, возникающих не только в связи с реинфицированием, но и с реактивацией процессов репликации вируса, выщеплением его генома из хромосомы человека и переходом в активное состояние. Это обстоятельство диктует необходимость поиска средств терапии, воздействующих как на возбудителя, так и на макрооргапизм.

В последнее время появилось много сообщений об успешном использовании для лечения папилломавирусной инфекции иммуномодулирующих препаратов из группы интерферонов, усиливающих цитотоксическую активность Т-лимфоцитов и стимулирующих их активность в отношении инфицированных клеток. Для лечения ПВИ препараты интерферонов используют местно и для системного введения. (Манухин И.Б. и др., 1998; Sherman М.Е. et al., 1998; Hengge U.R., 2001). Вместе с тем, лечение часто назначается эмпирически, без учета индивидуальных особенностей больного. Индивидуализация терапии является одним из требований современной клинической медицины и преследует цель повысить эффективность назначенного лечения, свести к минимуму риск побочных осложнений, уменьшить число рецидивов.

В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования является разработка иммунологических и молекулярных методов диагностики папилломавирусной инфекции у больных и определение формирования злокачественной трансформации эпителиальных тканей.

Задачи исследования:

1. Изучить распространенность папилломавирусной инфекции путем скрининга жителей г. Москвы и Московской области. Установить частоту регистрации генотипов вируса папилломы человека различной степени онкогенного риска.

Выявить значимые ассоциации вируса папилломы человека с другими возбудителями инфекций, передаваемых половым путем.

2. Изучить экспрессию цитокинов гамма-интерферона, фактора некроза опухоли, интерлейкинов 4 и 12 и их профиль в секрете цервикалыюго канала пациенток папилломавирусной инфекцией.

3. Разработать метод генотипирования вируса папилломы человека, основанный на твердофазной гибридизации продуктов амплификации с типоспецифическими олигонуклеотидами зондами.

4. Разработать методы оценки физического состояния вирусов папилломы человека и определить с их помощью количественные соотношения форм ДНК вирусного генома в инфицированных тканях пациенток папилломавирусной инфекцией.

5. Изучить полиморфизм основного смыслового участка - 72 кодона гена р53, ответственного за регуляцию нарушений в системе апоптоза у больных различными клиническими формами папилломавирусной инфекции, вызванной 16 типом вируса.

6. Исследовать изменчивость генома 16 типа вируса, выделенного от пациентов с различными клиническими формами инфекции, по вариациям нуклеотидных последовательностей функционально активных областей ДНК вируса - LCR, Е (гены Е6, Е7).

7. Разработать диагностические критерии риска развития злокачественной трансформации инфицированных тканей пациентов папилломавирусной инфекцией с учетом данных о физическом состояния вируса папилломы человека и изменчивости его генома, полиморфизма гена р53 и цитокинового статуса больных.

Положения, выносимые на защиту

1. Распространенность папилломавирусной инфекции среди населения Москвы и Московской области, обращавшегося в клинику для исключения инфекций, передаваемых половым путем в период с 1998 по 2003 гг. составляет 14%. В структуре генотипов преобладают типы вируса папилломы человека среднего (31, 33, 35, 52 - 38,6%) и высокого (16, 18 - 29,8%) онкогенного риска. Вирус папилломы человека часто сочетается с облигатпыми (C.trachomatis) и условнопатогенными (Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum, Gardnerella vaginalis) возбудителями инфекций, передаваемых половым путем.

2. Разработанный метод генотипирования вируса, использующий в своей основе гибридизационный подход с прямой регистрацией флуоресценции типоспецифического зонда, связанного с продуктом, отличается высокой специфичностью и чувствительностью по сравнению с методами, основанными на полимеразно цепной реакции с электрофоретической детекцией ампликонов и иммуноферментного анализа.

3. Экспрессия цитокинов: гамма-интерферона, фактора некроза опухоли, интерлейкинов 4 и 12 в секрете цервикального канала у женщин папилломавирусной инфекцией связана с ее клинико-морфологическими формами: цитокиновый профиль больных манифестными формами инфекции соответствует преобладанию клеточного (Thl) варианта иммунного ответа на инфекцию; с латентными формами преобладающий вариант цитокинового профиля не определяется. У больных папилломавирусной инфекцией цитологически определяемой интраэпителиальной неоплазией легкой степени преобладает гуморальный (Th2) вариант иммунного ответа, являющийся предиктивным фактором злокачественного перерождения тканей. Наличие цитокинов Thl профиля способствует спонтанной элиминации вируса. Присутствие цитокинов

Th2 профиля позволяет прогнозировать длительное рецидивирующее течение инфекционного процесса с вероятным развитием злокачественной трансформации тканей.

4. Метод определения физического состояния ДНК вируса папилломы человека на основе технологии ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией позволяет выявлять одновременное присутствие и количественное соотношение у пациенток с папилломавирусной инфекцией нескольких форм ДНК вируса высокого онкогенного риска: эписомальной, интегрированной и смешанной. У 14,3% пациенток (лица с интраэпителиальной неоплазией - CIN 1) определяется интегрированная, у 33,3% -смешанная и у 52,4% - эписомальная форма ДНК вируса.

5. Присутствие аллеля Арг/Арг в 72 кодоне гена р53 обеспечивает повышенную восприимчивость макроорганизма к инфицированию вируса папилломы 16 типа. Женщины с гетерозиготной формой белка р53 в значительно меньшей степени подвержены инфицированию вирусом, чем женщины, гомозиготные по аргинину (38% против 50% по результатам метода конформационного полиморфизма и 17% против 83% по данным метода аллельспецифической ПЦР).

6. Высокая частота замен нуклеотидов в нуклеотидных последовательностях функционально активных областей генома вируса папилломы человека 16 типа (LCR, Е6 и Е7) свидетельствует об изменениях их свойств, высокой степени вероятности трансформации ДНК вируса в интегрированную форму и зависит от формы заболевания. Наиболее частым вариантом являются замены Т на G в положении 350.

7. Определяющими критериями риска развития злокачественной трансформации инфицированных тканей пациентов папилломавирусной инфекцией являются: обнаружение вируса 16 типа; проонкогенный гуморальный (Th2) профиль цитокинов в цервикальном секрете; обнаружение интегрированной формы ДНК вируса; гомозиготность белка р53 по аргинину больных; наличие нуклеотидных замен в функционально активных областях (LCR, Еб, Е7) генома вируса папилломы человека.

Научная новизна.

Для изучения физического статуса ДНК ВПЧ 16 типа разработан метод real-time ПЦР, основанный на оценке количественного соотношения интегрированной и эписомальной форм ДНК вируса. Предложенный метод позволяет определять статус ДНК ВПЧ 16 типа для эписомальной, интегрированной и смешанных форм.

Впервые проведено изучение ассоциативных связей между полиморфизмом гена р53 и генома ВПЧ у пациенток с ПВИ путем исследования смыслового участка гена р53 - 72 кодона, позволившее оценить предрасположенность женщин к инфицированию ВПЧ в зависимости от состояния аллельной изменчивости 72 кодона р53.

Впервые на основании анализа полиморфизма генов Е6 ВПЧ 16 типа и исследования его корреляции с полиморфизмом кодона 72 гена р53 изучен механизм запуска неконтролируемой пролиферации клеток и супрессии апоптоза у пациентов с ПВИ.

Впервые на основании изучения вариаций геномной ДНК (сравнение нуклеотидных последовательной 3' конца LCR, Е6 и Е7 открытых рамок считывания ДНК) исследована онкогенная роль ВПЧ 16 типа, позволившая оценивать вероятность перехода ДНК вируса в интегрированную форму.

На основании данных об экспрессии генов цитокинов у пациенток с ПВИ впервые сформулированы представления о соотношениях уровня цитокинов и их матричной РНК как о показателе функционального резерва организма обследуемых пациенток, впервые охарактеризованы закономерности Thl и Th2 цитокинового ответа больных с различными клиническими формами ПВИ

Практическая значимость работы.

На основании проведенных исследований получены сведения об уровне распространенности инфицированности ВПЧ среди жителей Москвы и Московской области; определены высоко достоверные (Р <0,001) ассоциации между инфицированием ВПЧ и распространенными бактериальными возбудителями инфекций, передаваемых половым путем (Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum и Gardnerella vaginalis), что может служить основанием для разработки профилактических мероприятий, направленных на предупреждение развития РШМ.

Впервые разработан и предложен для использования в практике метод типирования папилломавирусов человека, основанный на твердофазном флуоресцентно-гибридизационном анализе продуктов амплификации.

Впервые для нужд практического здравоохранения определены диагностические критерии риска развития злокачественной трансформации инфицированной ВПЧ ткани с учетом показателей цитокинового статуса, полиморфизма генома человека, а также физического статуса ДНК и полиморфизма генома ВПЧ 16 типа. Определение корреляции между уровнем цитокинов (1 и 2 типов) в цервикальном секрете и физическим статусом ВПЧ может оказаться перспективным для прогнозирования риска развития неопластических заболеваний шейки матки.

На основании изучения подходов к лечению и тактике ведения пациентов с ПВИ с учетом индивидуальных особенностей клинической картины заболевания и иммунно-генетической характеристики выработаны критерии для индивидуализации лечения. Разработан эффективный метод терапии больных с распространенными и рецидивирующими формами ПВИ препаратами рекомбинантного интерферона (ИНТРОН А).

Апробация материалов диссертации:

Основные положения диссертации обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы вирусных инфекций, передаваемых половым путем (папилломавирусы человека, вирусные гепатиты, герпесвирусные инфекции): эпидемиология, клинико-диагностические особенности, принципы ведения больных» (Москва, 2000); VIII Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2001); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы терапии инфекций, передаваемых половым путем и хронических дерматозов» (Екатеринбург, 2002); Всероссийском совещании «По совершенствовании серологической диагностики сифилиса» (Москва, 2003); Первом Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2003); Всероссийской научно-практической конференции «Современные направления развития диагностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов» (Нижний Новгород, 2004); 8 ежегодной конференции Европейского филиала Всемирного союза против болезней передающихся половым путём (Греция, 2004); Всероссийской научно-практической конференции дерматовенерологов «Новые технологии в организации дерматовенерологической помощи населению Российской Федерации» (Москва, 2004); IX Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2005). Объём и структура работы:

Диссертационная работа состоит из: введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 208 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 рисунками, имеет 23 таблицы. Указатель литературы включает 26 отечественных и 273 иностранных источника.

Заключение диссертации по теме «Кожные и венерические болезни», Кубанов, Алексей Алексеевич

Выводы:

1. В результате скрининга на наличие вируса папилломы человека 9146 женщин Москвы и Московской области, обращавшихся в клинику для исключения инфекций, передаваемых половым путем, методом ПЦР установлена высокая степень их инфицированности - 1280 человек (14%) с преобладанием типов вируса среднего (31, 33, 35, 52 - 38,6%) и высокого (16, 18 - 29,8%) опкогенного риска и наличием достоверных (р< 0,001) сочетаний вируса папилломы с облигатными (C.trachomatis) и условнопатогепными (Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Gardnerella vaginalis) возбудителями инфекций, передаваемых половым путем.

2. Установлено, что у пациенток с отсутствием клинической симптоматики папилломавирусной инфекции зарегистрировано отсутствие преобладающего цитокинового профиля, что может быть обусловлено относительным биологическим равновесием между организмом человека и возбудителем и является показателем благоприятного течения болезни.

У больных манифестными проявлениями инфекций преобладают цитокины, продуцируемые Т хелперами первого порядка, свидетельствующие о благоприятном исходе заболевания.

У пациенток с наличием цитологически определенной интраэпителиальной неоплазией легкой степени наблюдается значительное повышение экспрессии цитокинов 2-го типа, что является предвестником вероятности развития злокачественной трансформации.

3. Разработан метод генотипировапия вируеа папилломы человека на основе твердофазной гибридизации с типоспецифическими олигонуклеотидными зондами и прямой регистрацией флюоресценции типоспецифического зонда, связанного с продуктом, имеющий более высокую специфичность в сравнении с ИФА и ПЦР при определении генотипа вируса.

4. Разработан метод определения физического состояния ДНК вируса папилломы человека на основе технологии ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией, позволивший выявлять одновременное присутствие и количественное соотношение у пациенток двух форм ДНК вируса: эписомальной и интегрированной.

В результате обследования данным методом у 14,3% пациенток (лица с интраэпителиальной неоплазией ) установлено наличие интегрированной, у 33,3% -смешанной и у 52,4% - эписомальной формы ДНК вируса.

Методами конформационного полиморфизма и аллельспецифической ПЦР установлено, что присутствие аллели Арг/Арг в 72 кодоне гена р53 обеспечивает повышенную восприимчивость макроорганизма к инфицированию вирусом папилломы 16 типа. Женщины с гетерозиготной формой белка р53 в значительно меньшей степени подвержены инфицированию ВПЧ, чем женщины, гомозиготные по аргинину (38% против 50% по результатам метода конформационного полиморфизма и 17% против 83% по данным метода аллельспецифической ПЦР). В результате анализа вариаций нуклеотидной последовательности областей генома вируса папилломы 16 типа LCR, Е6 и Е7 установлена высокая частота замен нуклеотидов в нуклеотидных последовательностях функционально активных областей генома вируса папилломы 16 типа, свидетельствующая об изменениях их свойств, высокой степени вероятности трансформации ДНК вируса в интегрированную форму и зависевшая от формы заболевания. Наиболее частым вариантом были замены Т на G в положении 350 (у всех обследованных) и G (350 G), которые регистрировались у 60% пациентов с клиническими проявлениями папилломавирусной инфекции, у 33% латентной формой у 33% - с наличием цитологически определенной интраэпителиальной неоплазией шейки матки легкой степени.

Разработаны критерии диагностики риска развития злокачественной трансформации инфицированных тканей пациентов папилломавирусной инфекцией, к которым относятся обнаружение вируса папилломы 16 типа, проонгкогенный гуморальный (Th2) профиль цитокинов в цервикальном секрете, обнаружение интегрированной формы ДНК вируса; гомозиготность белка р53 по аргинину больных; наличие нуклеотидных замен в функционально активных областях (LCR, Е6, Е7) генома вируса папилломы человека.

ГЛАВА IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В российской научной медицинской литературе до настоящего времени отсутствуют систематические данные о частоте выявления ВПЧ разных типов у пациентов с воспалительными заболеваниями урогентального тракта, обращающихся в специализированные лечебно-профилактические учреждения. Отсутствуют сведения о сочетании ВПЧ с инфекциями, передаваемыми половым путем, бактериальной и вирусной природы.

Результаты скрининга на наличие вируса папилломы человека, проведенного среди более чем девяти тысяч женщин Москвы и Московской области, обращавшихся в клинику для исключения ИППП, позволили установить высокую распространенность инфицированное™ ВПЧ (14%) с преобладанием типов ВПЧ среднего (типы: 31, 33, 35, 52 - 38,6%) и высокого (типы: 16, 18 - 29,8%) онкогенного риска, которые составили более 2/3 (68,4%) от общего числа выявленных генотипов вируса. Данное обстоятельство свидетельствует о крайне неблагоприятных тенденциях распространения ПВИ в Российской популяции, об угрозе роста онкопатологии шейки матки среди молодых, сексуально активных женщин и вызывает необходимость разработки системы мер по усилению контроля за распространением этой вирусной инфекции среди населения, ведущего активную половую жизнь, в целях предотвращения передачи вируса половым путем. Одной из таких мер может быть проведение на регулярной основе скрининговых программ по выявлению инфицированности ВПЧ среди разных групп населения, в особенности, в группах риска (несовершеннолетние правонарушители, сексуально активные подростки, работницы коммерческого секса).

Результаты настоящего исследования показали, что у пациентов, обращающихся в лечебно-профилактические учреждения, ВПЧ практически не ассоциирован с вирусами простого герпеса, но в то же время латентные бактериальные паразиты, относящиеся к группе внутриклеточных или мембранных (хламидии, микоплазмы и др.), тесно ассоциированы с ВПЧ разных генотипов. Трихомонад и нейссерий при этом следует рассматривать как случайных возбудителей, выявленных у пациентов с ПВИ.

На основании проведенных исследований можно заключить, что природа трансформации эпителиальной ткани при инфицировании ВПЧ имеет сложный механизм, сопряженный не только с персистенцией и репликацией самого вируса, но и с нарушением целостности слизистых оболочек, возможно, вследствие развития местных дисбиотических расстройств, вызываемых присутствием вышеупомянутых бактериальных патогенов.

Ассоциированные с ВПЧ мембранные и внутриклеточные паразиты, выявленные в результате наших исследований, обладают практически теми же самыми иммунобиологическими свойствами, что и ВПЧ. Хламидии и микоплазмы способны при длительном персистировании в организме человека вызывать иммуносупрессию на местном и организменном уровне, подавлять апоптоз, изменять физиологию и морфологию инфицированных клеток. С этой точки зрения обнаруженная нами тесная ассоциативная связь между ВПЧ и этими микроорганизмами представляется неслучайной.

Необходимо отметить, что выявление особенностей распространения генотипов ВПЧ среди различных групп населения, определение ассоциации ВПЧ (отдельных генотипов) с другими возбудителями ИППП следует проводить регулярно, так как возможно изменение как числа инфицированных ВПЧ, так и структуры ассоциаций вируса с другими патогенами. Кроме того, необходимо проводить дополнительные исследования по разработке эпидемиологических принципов выявления, а также методов лечения ИППП с учетом присутствия ассоциативных инфекций и других сопутствующих заболеваний. Учитывая высокую достоверность выявленных ассоциаций ВПЧ с C.trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum, Gardnerella vaginalis, следует считать оправданным рекомендовать при обследовании пациенток с урогенитальным хламидиозом, уреамикоплазмозом, бактериальным вагинозом проводить дополнительные, в том числе молекулярно-биологические и иммуногенетические исследования для выявления ВПЧ с определением степени его онкогенного риска, физического статуса ДНК, полиморфизма генома вируса, а также особенностей иммуного ответа организма человека.

Одним из главных условий успешной диагностики ПВИ и своевременного выявления угрозы злокачественной трансформации тканей является определение генотипа вируса. Использованная нами диагностическая система, позволяющая с высокой долей достоверности типировать вирус (определять генотипы), является надежным инструментом для проведения эпидемиологических и клинических исследований на предмет выявления ВПЧ и его ассоциации с другими патогенами.

До настоящего момента при типировании ВПЧ в исследуемом материале от больных использовались методы так называемой аллель-специфической ПЦР. При всей простоте их применения они имееют ряд существенных недостатков, среди которых главным является ограничение количества определяемых ВПЧ - типов. Использованная в нашей работе технология ПЛАТАН, разработанная совместно с сотрудниками НИИ физико-химической медицины Миздрава России, позволяет проводить генотипирование практически всех типов ВПЧ. Кроме того, в отличие от иных методов детекции продуктов амплификации, эта технология объективизирует учет, устраняя работу оператора на самом отвественном этапе регистрации результатов. Данные обстоятельства, а также результаты типирования, полученные в нашем исследовании, позволяют рассматривать разработанную технологию как одну из возможных для проведения массового скрининга на инфицированность ВПЧ.

Прежде чем говорить о тонких механизмах и закономерностях развития злокачественной прогрессии тканей при ПВИ и критериях ее диагностики и прогноза, следует обратить внимание на поражаемый контингент и фон, на котором эти изменения могут развиться.

Результаты клинико-лабораторного обследования находившихся под наблюдением женщин с диагностированной ПВИ, а также анализ их социального статуса и стиля половой жизни позволили отметить ряд характерных особенностей.

В абсолютном большинстве (70%) это были женщины активного сексуального возраста (18 - 30 лет), незамужние (72%), не имевшие постоянной работы (55% -домохозяйки, не работающие, работницы коммерческого секса), ведущие беспорядочную половую жизнь (у 53% - промискуитет), без должного внимания относившиеся к своему здоровью (позднее обращение в клинику - у 70,5%, неиспользование средств барьерной контрацепции и оральных контрацептивов - у 53%), часть из которых (почти 20%) в прошлом перенесла ИППП.

Таким образом, характеристика данного контингента вполне соответствовала обычному представлению о лицах, входящих в группу риска заражения ИППП, к числу которых относится аногенитальная ПВИ.

Следует заметить, что ПВИ развилась у них на фоне патологических изменений шейки матки, которые были диагностированы при клинико-микробиологическом, кольпоскопическом и цитологическом обследовании, а также (у части пациенток) на фоне нарушений гормонального статуса.

В процессе клинического осмотра у большинства пациенток регистрировались отклонения в виде цервицита (75%), псевдоэрозий (29%), ретенционных кист (23%), посткоагуляционного синдрома (14%) .

Нормальная" кольпоскопическая картина отмечена лишь в 11, 4% случаев, у остальных при кольпоскопическом обследовании были обнаружены доброкачественные изменения слизистой оболочки шейки матки (фоновые изменения), представленные: цервицитом (71%), эктопией (80%), зоной превращения (7,7%), эндометриозом (5,7%), рубцовой дистрофией (2,8%), полипами (8,5%).

Кроме этого, у 3 пациенток были выявлены изменения слизистой оболочки, подозрительные на наличие злокачественной трансформации: немые йоднегативные участки и лейкоплакия, атипичные зоны превращения (в различных сочетаниях); при их клиническом обследовании отмечалась незначительная диффузная гиперемия и «шероховатость» шейки, а при заборе материала - контактная кровоточивость.

При анализе цитологических изменений у 75% больных были выявлены отклонения от нормального эпителиального состава мазка из влагалищной части шейки матки и /или цервикального канала.

У большинства пациенток в материале из влагалищной части шейки матки были обнаружены доброкачественные изменения клеток, характерные для эктопии с зоной превращения, реактивного воспаления, воспалительной атипии.

Гистологическая картина в мазках большинства обследованных характеризовалась вакуолизацией цитоплазмы (койлоцитоз), увеличением размеров ядер клеток, наличием дискератоцитов, двух- и многоядерных клеток, существенным утолщением среднего слоя клеток поврежденного эпителия.

Почти у трети пациенток (26%) наблюдались нарушения менструальной функции в виде нерегулярных, слишком обильных или скудных менструаций, что свидетельствовало о наличии гормональных нарушений.

Отмеченные отклонения, несомненно, являлись благоприятным фоном для поражения вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска (16 типа).

Известно, что индивидуальная толерантность человека к вирусным заболеваниям определяется многочисленными наследственными и случайными функциональными признаками, среди которых наибольший вес имеют факторы, регулирующие иммунный ответ организма на первичную интервенцию вируса, либо реактивацию персистирующего процесса в случае хронизации инфекции.

Одной из задач настоящего исследования было изучение особенностей регулирования иммунных реакций, развивающихся на местном уровне (в клетках цервикального канала и цервикальном секрете) пациентов с ПВИ, связанных с эффекторным звеном (оценка концентрации цитокинов) и с индуцированными в ходе наблюдения транскрипционными профилями, отображающими активность соответствующих генов.

В результате проведенных исследований была отмечена ассоциация между наличием ТЫ - профиля цитокинов и спонтанной элиминацией ВПЧ, а также установлены свойства цитокинового статуса, позволявшие прогнозировать длительное рецидивирующее течение инфекционного процесса с вероятным развитием злокачественной трансформации тканей при наличии ТЬ2 - профиля цитокинов. Речь идет о том, что длительно текущая во времени папилломовирусноая инфекция, вероятно, сопровождается постепенной трансформацией ТЬ - 1 ответа, который постепенно редуцируется вследствие влияния многочисленных факторов, в ТЬ2 - ответ, что отражает, по нашему мнению, возможность неблагоприятного прогноза излеченности.

Безусловно, кроме определения параметров цитокинового ответа, необходимо учитывать полиморфизм генов, кодирующих цитокины. В доступной литературе существуют отдельные работы, посвященные влиянию однонуклеотидных замен в генах цитокинового семейства на развитие хронических заболеваний (например, 1Ь-2). Принимая во внимание это обстоятельство, необходимо констатировать, что предиктивная медицина строит новые диагностические модели, в которых должны учитываться не только объективные показатели эффекторного звена иммунитета (концентрация антигенов, белков и т.д.), но и конститутивные индивидуальные генетические параметры пациента, поскольку во многих случаях именно они ответственны за развитие тех или иных синдромов и заболеваний. Особую роль при этом играет состояние физического статуса ДНК вируса, определяющее его активность и глубину проникновения в организм человека.

Известно, что присутствие вирусного генома в эписомальной форме чаще всего регистрируется при спонтанной регрессии интраэпителиальной неоплазии 1 степени, интеграция же ДНК ВПЧ 16 типа в хромосому клетки-хозяина приводит к опухолевой прогрессии клеток цервикального эпителия.

Поскольку ВПЧ обладает способностью интегрироваться в геном инфицированных клеток, целесообразно было разработать лабораторный тест для оценки физического состояния ДНК ВПЧ и применить его к образцам, взятым у пациенток с ПВИ, ассоциированной с ВПЧ 16 типа.

Примененный в данном исследовании метод определения физического состояния ДНК вируса папилломы человека, разработанный на основе технологии ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией, позволил выявлять одновременное присутствие и количественное соотношение у пациенток с ПВИ двух форм ДНК вируса: эписомальной и интегрированной. В результате обследования данным методом у 14,3% пациенток (лица с интраэпителиальной неоплазией - CIN 1) установлено наличие интегрированной, у 33,3% -смешанной и у 52,4% - эписомальной формы ДНК ВПЧ.

Результаты наблюдений позволяют сделать вывод о том, что развитие дисплазий сопряжено с формированием устойчивого равновесия между вирусом и клеткой эпителия, при котором присутствуют смешанные состояния — и интегрированная, и автономная (эписомальная) форма вирусной ДНК, но в большинстве проведенных нами клинических наблюдений пациенток с CIN1 присутствовала только интегрированная форма ДНК ВПЧ, что свидетельствовало о неблагоприятном прогнозе инфекционного процесса у лиц с данной морфологической формой ПВИ.

Полученные результаты позволяют считать целесообразным рекомендовать использование теста, оценивающего форму персистирования вирусной ДНК в клетках пациентов с ПВИ и дисплазиями шейки матки разной степени, в качестве одного из показателей прогноза исхода заболевания, а обнаружение интегрированной формы ДНК ВПЧ расценивать как свидетельство неблагоприятного прогноза заболевания, требующего пристального наблюдения за пациентками с подобными находками.

Процесс трансформации эпителиальных клеток слизистой шейки матки в сторону малигнизации представляет собой сложное, растянутое во времени явление, где присутствие ВПЧ является индуктором или запускающим механизмом.

Одним из основных механизмов неопластической трансформации клеток является повреждение генов, контролирующих апоптоз. В настоящей работе мы предприняли попытку оценить присутствие значимых мутаций в одном из основных генов апоптоза человека - р53 и генома ВПЧ у пациентов с разными клиническими и морфологическими формами ПВИ.

Как показали исследования, проведенные с использованием двух методов изучения полиморфизма 72 кодона гена р53 (метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК и метода аллельспецифической ПЦР), присутствие гомозиготы Арг/Арг в 72 кодоне гена р53 обеспечивает повышенную восприимчивость макроорганизма к ВПЧ-16 типа. Пациентки, имеющие даже одну Про- аллель, демонстрировали меньшую чувствительность к ПВИ, обусловленной ВПЧ 16 типа, и при наличии гомозиготности по пролину инфицировались в 3 раза реже и, наконец, женщины с гетерозиготной формой белка р53 были в значительно меньшей степени подвержены инфицированию ВПЧ, чем женщины, гомозиготные по аргинину (38% против 50% по результатам метода конформационного полиморфизма и 17% против 83% по данным метода аллельспецифической ПЦР). Данное обстоятельство позволило расценить факт наличия гомозиготности по аргинину как один из возможных факторов риска злокачественной трансформации тканей при ПВИ, вызванной ВПЧ 16 типа.

Список литературы диссертационного исследования доктор медицинских наук Кубанов, Алексей Алексеевич, 2005 год

1. Александрова Ю.Н. Лыщев A.A., Сафронников Н.Р. и др. Папилломавирусная инфекцияу здоровых женщин Санкт-Петербурга // Вопросы онкологии. 2000. - Т. 46, № 2. -С. 75-179.

2. Аполихина И.А. Папилломавирусная инфекция гениталий у женщин / Под ред. В.И.

3. Кулакова. М.: Гэотар-мед, 2002. - 111 с.

4. Бохман Я.В., Лютра У.К. Рак шейки матки. Кишинев: Штиинца, 1991.

5. Ващенко С.Н. Частота выявления возбудителей урогенитальной инфекции методомполимеразной цепной реакции у женщин, проживающих в Приморском крае // Генодиагностика в практической медицине Дальнего Востока: Материалы конфер. -Владивосток, 2000.

6. Вишневский A.C., Сафронникова Н.Р. 2002. Дискуссионные вопросы леченияпапилломавирусной инфекции шейки матки. Практическая онкология. 3(3): 166-172.

7. Голованова В.А., Новик В.И., Гуркин Ю.А. Частота и факторы рискапапилломавирусной инфекции и дисплазии эпителия шейки матки у сексуально-активных девушек-подростков. Вопр. онкол. 1999. Т. 45, № 6. - С. 623-626.

8. Головина Л.И. Кольпоскопическая и цитологическая оценка плоских кондилом и ихсвязи с интраэпителиальной неоплазией шейки матки: Дисс. канд. мед. наук СПб. -1994.

9. Дебабов В.Г. ДНК-вакцинация и генотерапия на основе транзиентной экспрессиинуклеиновых кислот в соматическихх клетках человека и животных // Молекулярная биология. 1997. -№31.-С. 209-215.

10. Иглесиас-Кортит Л., Иглесиас Г.Д. Инфекции половых органов и неопластическиеизменения шейки матки // В сб.: Репродуктивное здоровье. Т.2. Редкие инфекции: Медицина. - 1988. - С. 390-402.

11. Катханова O.A. Клинико-эпидемиологические аспекты папилломавирусной инфекции:этиология, патогенез, клиника, диагностика: Дисс. . канд. биол. наук. М., 2003.

12. Киселев Ф.Л. Вирус-ассоциированные опухоли человека: рак шейки матки и вирусыпапиллом // Биохимия. 2000. - Т. 65, № 1. - С. 79-91.

13. Киселев Ф.Л., Павлиш O.A., Татосян А.Г. Молекулярные основы канцерогенеза учеловека.- М., 1990. с.64

14. Коломиец Л.А., Уразова Л.Н., Севастьянова Н.В., Чуруксаева О.Н. Клиникоморфологические аспекты цервикальной папилломавирусной инфекции // Вопр. онкол. 2002.-Т. 48, № 1.-С. 43-46.

15. Костава М.Н. Криодеструкция и диатермокоагуляция доброкачественных заболеванийшейки матки // Заболевания шейки матки: Клин, лекции. М., 1997. - С. 58-62.

16. Краснопольский В.И., Радзинский В.Е., Буянова С.Н., Манухин И.Б., Кондриков Н.И.

17. Патология влагалища и шейки матки. М.: Медицина, 1997. С. 28-35.

18. Манухин И.Б., Минкина Г.Н., Пинегин Б.В. Иммунотерапия папилломавируснойинфекции шейки матки // Акуш. и гин. 1998. - № 3. - С. 24-26.

19. Новик В.И. Эпидемиология рака шейки матки, факторы риска, скрининг // Практич.онкол 2002. -Т. 3,№ 3. - С. 156-164.

20. Прилепская В.Н. Возрастные особенности шейки матки. Современные методыдиагностики патологии шейки матки // Акуш. и гин. 1998. - № 6. - С. 51-4.

21. Прилепская В.Н., Кондриков Н.И., Бебнева Т.Н. Значение вируса папилломы человекав развитии диспластических процессов шейки матки // Гинекол. 2000/ - Т. 2, № 3. -С.80-82.

22. Прилепская В.Н., Роговская С.И., Межевитинова Е.А. Кольпоскопия: Практ. рук. М.,1997.- 108 с.

23. Прилепская В.Н., Рудакова Е.Б. Эрозии и псевдоэрозии шейки матки.// Заболеванияшейки матки, влагалища и вульвы/ под ред. В.Н.Прилепской. М., 1999. - С. 66-75.

24. Роговская С.И. Папилломавирусная инфекция гениталий. Клиника и лечение.

25. Заболевания шейки матки: Клин, лекции / под ред. В.Н.Прилепской. М., 1997. - С. 46-51.

26. Скрипкиин Ю.К. Опыт применения кондилина в лечении остроконечных кондилом //

27. ЗППП.- 1995.-№ 5.-С. 17-19.

28. Т.Н.Бебнева, В.Н.Прилепская. Папилломавирусная инфекция и патология шейки матки.- Гинекол. 2001. - Т. 3, № 3. - С. 2-7.

29. Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Современные представления о канцерогенезе рака шейкиматки // Практич. онкол. 2002. - Т. 3, № 3. - С. 145-155.

30. Яковлева И.А., Кукутэ Б.Г. Классификация предрака и рака шейки матки // Арх. патол.1977.-Т. 39, № 1.-С. 18-25.

31. Alani R.M., Munger К. Human papillomaviruses and asscociated malignancies // J. Clin.

32. Oncol. 1998. - № 16. - P. - 330-337.

33. Alter B. J., Grillot-Courvalin C., Bach M. L. et al. Secondary cell-mediated lympholysis:importance of H-2 LD and SD factors // J. Exp. Med. 1976. - № 143. - P. - 1005-1014.

34. Alvarez-Salas L.M., Cullinan A.E., Siwkowski A. et al. Inhibition of HPV-16 E6/E7immortalization of normal keratinocytes by hairpin ribozymes // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.- 1998.-№95. -P.- 1189-1194.

35. Arany I., Rady P., Tyring S.K. Alterations in cytokine/antioncogene expression in skin lesionscaused by "low risk" types of human papillomaviruses // Viral. Immunol. 1993. - № 16. -P. - 255-265.

36. Arany I., Goel A., Tyring S. K. Interferon response depends on viral transcription in humanpapillomavirus-containing lesions // Anticancer Res. 1995. - № 15. - P. - 2865-2869.

37. Arany 1., Rady P.,Tyring S. K. Effect of interferon therapy on human papillomavirus copynumber in patients with condyloma acumina-tum // Am. J. Med. Sci. 1995. - № 310. - P. -14-18.

38. Aynaud O., Piron D., Barrasso R., Poveda J. D. Comparison of clinical, histological, andvirological symptoms of HPV in H1V-1 infected men and immunocompetent subjects // Sex. Transm. Infect. 1998. - № 74. - P. - 32-34.

39. Baker T. S., Newcomb W. W., Olson N. H. et al. Structures of bovine and humanpapillomaviruses. Analysis by cryoelectron microscopy and three-dimensional image reconstruction // Biophys. J. 1991. - № 60. - P. - 1445-1456.

40. Barker J. N., Mitra R. S., Griffiths C. E. et al. Keratinocytes as initiators of inflammation //1.ncet. 1991. -№ 337. - p. - 211-214.

41. Barnard P., McMillan N. A. The human papillomavirus E7 oncoprotein abrogates signalingmediated by interferon-alpha//Virol. 1999. -№ 259. - P. - 305-313.

42. Beckman G., Birgander R., Sjalander A. et al. Is p53 polymorphism maintained by naturalselection? // Human Heredity. 1994. - № 44. - P. - 266-270.

43. Beer-Romero P., Glass S., Rolfe M. Antisense targeting of E6AP elevates p53 in HPVinfected cells but not in normal cells // Oncogene. 1997. - № 14. - P. - 595-602.

44. Bernard B.A., Bailly C., Lenoir M.C. et al. The human papillomavirus type 18 (HPV 18) E2gene product is a repressor of the HPV 18 regulatory region in human keratinocytes // J. Virol. 1989.-№63.-P.-4317-4324.

45. Billich A. HPV vaccine Medlmmune/GlaxoSmithKline // Curr. Opin. Investig. Drugs.2003.- №4.-P.-210-213.

46. Bontkes, H. J., de Gruijl T. D.,. Walboomers J. M. et al. Assessment of cytotoxic Tlymphocyte phenotype using the specific markers granzyme B and TIA-1 in cervical neoplastic lesions// Br. J. Cancer. 1997. -№ 76. - P. - 1353-1360.

47. Bontkes, H. J., Van Duin M., DeGruijl T. D. et al. HPV-16 infection and progression ofcervical intra-epithelial neoplasia: analysis of HLA polymorphism and HPV-16 E6 sequence variants // International Journal of Cancer. 1998. - № 78. - P. - 166-171

48. Boom R., Sol C.J., Salimans M.M. et al. Rapid and simple method for purification of nucleicacids //

49. J. Clin Microbiol. 1990. - № 28. - P. - 495-503.

50. Borg H., Medley G., Garland S. Polymerase chain reaction. A sensitive indicator of theprevalence of human papillomavirus DNA in population with sexually transmitted disease // 39. P. - 654-658

51. Bosch F.X., Lorincz A., Munoz N. et al. The casual relation between human papillomavirusand cervical cancer // J. Clin. Pathol. 2002. - № 55. - P. - 244-265.

52. Bosch F.X., Manos M.M., Munoz N. et al. Prevalence of human papillomavirus in cervicalcancer: a worldwide perspective // J. Natl. Cancer Inst. 1995. - 87. - P. - 796-802.

53. Bouvard V., Storey A., Pim D., Banks L. Characterization of the human papillomavirus E2protein: evidence of trans-activation and trans-repression in cervical keratinocytes // EMBO J. 1994.-№13.-P.-5451-5459.

54. Braun, L., Durst M., Mikumo R., Gruppuso P. Differential response of nontumorigenic andtumorigenic human papillomavirus type 16-positive epithelial cells to transforming growth factor beta 1 // Cancer Res. 1990. - №50. - P. - 7324-7332.

55. Brown D.R., Legge D., Qadadri B. Distribution of human papillomavirus types incervicovaginal washings from women evaluated in a sexually transmitted diseases clinic // Sex. Transm. Dis. 2002. - №29. - P. - 763-768.

56. Bubenik J. Therapeutic vaccines against HPV16-associated tumors // Minireview. Neoplasma.2002. №49. - P. - 285-289.

57. Burd E.M. Human papillomavirus and cervical cancer // Clin. Microbiol. Rev. 2003. - №16.-P. 1-17.

58. Burkman R.T. Oral contraceptives: an update // Drugs Today (Bare). 1999. - № 35. - P.857.866.

59. Chang Y.E., Pena L., Sen G.C. et al. Long-term effect of interferon on keratinocytes thatmaintain human papillomavirus type 31 // J. Virol. 2002. - № 76. - P. - 8864-8874.

60. Cho C.W., Poo H., Cho Y.S. et al. HPV E6 antisense induces apoptosis in CaSki cells viasuppression of E6 splicing // Exp. Mol. Med. 2002. - №34. - P. - 159-166.

61. Cho N.H., Kim Y.T., Kim J.W. Alteration of cell cycle in cervical tumor associated withhuman papillomavirus: cyclin-dependent kinase inhibitors //Yonsei Med. J. 2002. - № 43. -P. - 722-728.

62. Chua K. L., Hjerpe A. Persistence of human papillomavirus (HPV) infections precedingcervical carcinoma // Cancer. 1996. -№ 77. - P. - 121-127.

63. Claus E.B., Stowe M., Carter D. Oral contraceptives and the risk of ductal breast carcinoma insitu // Breast Cancer Res. Treat. 2003. - № 81. - P. - 129-136.

64. Clavel C., Rihet S., Masure M. et al. DNA-EIA to detect high and low risk HPV genotypes incervical lesions with T6/T7 primer mediated multiplex PCR // 1998.

65. Clerici M., Merola M., Ferrario E. et al. Cytokine production patterns in cervicalintraepithelial neoplasia: association with human papillomavirus infection // J. Natl. Cancer Inst. 1997. - №89. - P. - 245-250.

66. Cooper B., Schneider S., Bohl J. et al. Requirement of e6ap and the features of humanpapillomavirus e6 necessary to support degradation of p53 // Virology. 2003. - № 306. - P.- 87-99.

67. Cope J., Hildesheim A., Schiffman M. et al. Comprasion of the hybrid capture tube test and

68. PCR for detection of human papillomavirus DNA in cervical specimens // J. Clin Microbiol.- 1997. № 35. - P. - 2262-2265.

69. Coutlee F., Mayrand M.H., Provencher D. The future of HPV testing in clinical laboratoriesand applied virology research // J. CI & Diagn. Virol. 1997. - № 8. - P. - 123-41.

70. Cripe T.P., Alderborn A., Anderson R.D. et al. Transcriptional activation of the humanpapillomavirus-16 P97 promoter by an 88-nucleotide enhancer containing distinct cell-dependent and AP-1-responsive modules // New Biol. 1990. - № 2. - P. - 450-463.

71. Critchlow C.W., Koutsky L.A. Epidemiology of human papillomavirus infection // Genitalwarts. Human papillomavirus infection / Ed. A.Mindel. London: Edward Arnold, 1995. - P. -53-81.

72. Critchlow C.W, Koutsky L.A. Epidemiology of human papillomavirus infection // Genitalwarts. Human papillomavirus infection / Ed. A.Mindel. London: Edward Arnold, 1995. -P.-53-81.

73. Critchlow C. W., Holmes K. K., Wood R. et al. Association of human immu-nodeficiencyvirus and anal human papillomavirus infection among homo-sexual men // Arch. Intern. Med. 1992. - №152. - P. - 1673-1676.

74. Critchlow C. W., Hawes S. E., Kuypers J. M. et al. Effect of HIV infection on the naturalhistory of anal human papillomavirus infection //AIDS. 1998. - №12. - P. - 1177- 1184.

75. Cubie H. A., Norval M., Crawford L. et al. Lymphoproliferative response to fusion proteins ofhuman papillomaviruses in patients with cervical intraepithelial neoplasia // Epidemiol. Infect. 1989. - №103. - P. - 625-632.

76. Cullen A. P., Reid R., Campion M., Lorincz A. T. Analysis of the physical state of differenthuman papillomavirus DNAs in intraepithelial and invasive cervical neoplasms // J. Virol. -1991. -№ 65. P. - 606-612.

77. Cullen A.P., Reid R., Campion M., Lorincz A.T. Analysis of the physical state of differenthuman papilomavirus DNAs in intraepithelian and invasive cervical neoplasms // J.Virol. -1991.- 65.-P.-606-612.

78. Cuschieri K.S., Seagar A.L., Moore C. et al. Development of an automated extractionprocedure for detection of human papillomavirus DNA in liquid based cytology samples // J. Virol Methods. 2003. - Vol. 107, № 1. - P. - 107-13.

79. Dahl M.V. Imiquimod: a cytokine inducer // J. Am. Acad. Dermatol. 2002. - Vol. 47, № 4.1. P. 205-208.

80. Dallner J. Antibody responses to defined HPV epitopes in cervical neoplasia // Papillomavirus1. Rep. 1994.-№5.-p.-35-41.

81. Danos O., Katinka M., Yaniv M. Human papillomavirus la complete DNA sequence: a noveltype of genome organization among papovaviridae // EMBO J. 1982. - № 1. - P. - 231-236.

82. Das B. C., Sharma J. K., Gopalakrishna V., Luthra U. K. Papillomavirus type 16 DNA incervical preneoplastic and neoplastic lesions // J. Gen. Virol. 1992. - № 73. - P. - 23272336.

83. Das B.C., Sharma J.K., Gopalakrishna V., Luthra U.K. Papillomavirus type 16 DNA incervical preneoplastic and neoplastic lesions // J.Gen.Virol. 1992. - № 73. - P. - 2327-2336.

84. De Marco, F., and Marcante M. L. Cellular and molecular analyses of interferon betacytopathic effect on HPV-16 in vitro transformed human keratinocytes (HPK-IA) // J. Biol. Regul. Homeost. Agents/- 1995.-№ 9.-P. -24-30.

85. De Sanjose S., Santamaria M., Alonso de Ruiz P. et al. HPV types in women with normalcervical cytology // The epidemiology of cervical and human papillomavirus / Eds N. Munos, F.X.Bosch, K.V. Shan, A. Meheus Lyon, France: IARC, 1992. - P. - 75-84.

86. De Villiers E.M. Human pathogenic papillomavirus types: an update // Human pathogenicpapillomaviruses, Topics in Microbiology and Immunology / Eds H. zur Hausen. Berlin, 1994,- № 186.-P. - 1-13.

87. De Wolf CJM. Organization and Results of Cervical Canser Screening in Europe over the Past

88. Years //New Developments in Cervical Cancer Screening and prevention / Eds E. Franco & J. Mosonego. Oxford: Blackwell Science. - 1997. - P. - 209-19.

89. De Franco A. L. Molecular aspects of B-lymphocyte activation // Annu. Rev. Cell Biol.1987. № 3. - P. - 143-178.

90. Dolei A., Curreli S., Marongiu P. et al. Human immunodeficiency virus infection in vitroactivates naturally integrated human papillomavirus type 18 and induces synthesis of the LI capsid protein // J. Gen. Virol. 1999. - № 80. - P. - 2937-2944.

91. Duensing S., Duensing A., Crum C.P., Munger K. Human papillomavirus type 16 E7oncoprotein-induced abnormal centrosome synthesis is an early event in the evolving malignant phenotype // Cancer Res. 2001. - № 61. - P. - 2356-2360.

92. Dupuy C., Buzoni-Gatel D., Touze A. et al. Cell mediated immunity induced in mice by HPV

93. LI virus-like particles//Microb. Pathog. 1997.-№22. -P. -219-225.

94. Durst M., Kleinheinz A. Hotz M., Gissman L. The physical state of human papillomavirustype 16 DNA in benign and malignant genital tumours // J. Gen. Virol. 1985.-№66.-P. - 1515-1522.

95. Dyson N., Howley P.M., Munger K., Harlow E. The human papillomavirus 16 E7 oncoproteinis able to bind to the retinoblastoma gene product // Science. 1989. - № 243. - P. - 934-937.

96. Elfgren K., Jacobs M., Walboomers J.M. et al. Rate of human papillomavirus clearance after treatment of cervical intraepithelial neoplasia // Obstet. Gynecol. 2002. - Vol. 100 (5 Pt 1). -P.-965-971.

97. Emeny R.T., Wheeler C.M., Jansen K.U. et al. Priming of human papillomavirus type 11-specific humoral and cellular immune responses in college-aged women with a virus-like particle vaccine // J. Virol. 2002. - № 76. - P. - 7832-7842.

98. Evander M., Edlund K., Gustafsson A. et al. Human papillomavirus infection is transient in young women: a population-based cohort study //J. Infect. Dis. 1995. - 171. - P. - 10261030.

99. Evans E. M., Man S., Evans A. S., Borysiewicz L. K. Infiltration of cervical cancer tissue with human papillomavirus-specific cytotoxic T-lymphocytes // Cancer Res. 1997. - № 57. - P. -2943-2950.

100. Fausch S.C., Da Silva D.M., Eiben G.L et al. Hpv protein/peptide vaccines: from animal models to clinical trials//Front. Biosci. 2003. -№ 8. - P. - 81-91.

101. Favre N., Bordmann G., Rudin W. Comprasion of cytokine measurements using ELISA, ELISPORT and semi-quantative RT-PCR // J.Immunol. Methods. 1997. - № 204. - P. -57-66.

102. Feltkamp M. C., Smits H. L., Vierboom M. P., Minnaar R. P., de Jongh B. M., Drijfhout J. W., ter Schegget J., Melief C. J., and Kast W. M. 1993.

103. Ferenczy A., Franco E., Arseneau J. et al. Diagnostic perfomance of Hybrid Capture human papillomavirus deoxyribonucleic acid assay combined with liquid-based cytologic study // Am. J. Obstet. Gynecol. 1996. - № 175. - P. - 651.

104. Ferrera A., Velema J.P., Figueroa M. et al. Human papillomavirus infection, cervical dysplasia and invasive cervical cancer in Honduras: a case-control study // Int. J. Cancer. 1999. - № 82. - P. - 799-803.

105. Franco E. L., Duarte-Franco E., Ferenczy A. Cervical cancer: epidemiology, prevention and the role of human papillomavirus infection//CMAJ. -2001.-№ 164.-P.- 1017-1025.

106. Franco E.L., Rohan T.E., Villa L.L. Epidemiologic evidence and human papillomavirus infection as a necessary cause of cervical cancer //. J. Natl. Natl. Cancer Inst. 1999. - № 91.-P.-506-511.

107. Franco E. L., Villa L. L., Richardson H. et al. Epidemiology of Cervical Human Papillomavirus Infection // New Developments in Cervical Cancer Screening and prevention /Eds Franco E. & Mosonego J. Oxford: Blackwell Science. 1997:14-22.

108. Franco E., Villa L., Sobrinho J. et al. Epidemiology of acquisition and clearance of cervical human papillomavirus infection in women from high-risk area for cervical cancer // J. Infect. Dis. 1999.-№ 180.-P. - 1415-1423.

109. Frazer I. Vaccines for papillomavirus infection // Virus Res. 2002. - № 89. - P. - 271-274.

110. Garland S.M. Human papillomavirus update with a particular focus on cervical disease // Patology. 2002. - № 34. - P.- 213-224.

111. Gasco M., Crook T. The p53 network in head and neck cancer // Oral. Oncol. 2003. - № 39. -P.-222-231.

112. Gill D. K., Bible J. M, Biswas C. et al. Proliferative T-cell responses to human papillomavirus type E5 are decreased amongst women with high-grade neoplasia // J. Gen. Virol. 1998. -№79.-P.-1971-1976.

113. Glasebrook A. L., Fitch F. W. T-cell lines which cooperate in generation of specific cytolytic activity // Nature. 1979. - № 278. - P. - 71-173.

114. Gravitt P., Hakenewerth A., Stoerker J. A direct comprasion of methods proposed for use in widespread screening of human papillomavirus infections/ Mo.l cell, probes. 1991. - № 5. - P. - 65-72.

115. Greenberg P. D. Adoptive T cell therapy of tumors: mechanisms operative in the recognition and elimination of tumor cells // Adv. Immunol. 1991. - № 49. - P. - 281-355.

116. Gross GE. & Barrasso R. Humman Papilloma Virus Infection. A Clinical Atlas. 1997. -c.144

117. Grossman S.R., Laimins L.A. E6 protein of human papillomavirus type 18 binds zinc // Oncogene. 1989. - № 9. - P. - 1089-1093.

118. Gunter J. Genital and perianal warts: new treatment opportunities for human papillomavirus infection // Am. J. Obstet. Gynecol. 2003. - № 189(3 Suppl). - P. - 3-11.

119. Hart K., Williams O., Thelwell N. et al. Novel method for detect for detection, typing and quantitation of human papillomaviruses in clinical samples // J. Clin. Microbiol. 2001. - № 39.-P.-3204-3212

120. Hatch K.D., Schneider A., Abdel-Nour M.W. An evaluation of human papillomavirus testing for intermediate- and high-risk types as triage before colposcopy // Am. J. Obstet. Gynecol. -1995.-№ 172.-P. 1150.

121. Hawley-Nelson P., Vousden K.H., Hubbert N.L. et al. HPV16 E6 and E7 proteins cooperate to immortalize human foreskin keratinocytes // EMBO J.- 1989. №. - P. - 3905-3910.

122. Hengge U.R., Benninghoff B., Ruzicka T., Goos M. Topical immunomodulators—progress towards treating inflammation, infection, and cancer // Lancet Infect. Dis.- 2001. № 1. - P. - 189-198.

123. Herrington C.S. Human papillomaviruses and cervical neoplasia. Classification, virology, pathology and epidemiology // J. Clin. Pathol. 1994. - № 47. - P. - 1066-1072.

124. Hildesheim, A., Schiffman M. H, Gravitt P. E. et al. Persistence of type-specific human papillomavirus infection among cytologically normal women // J. Infect. Dis. 1994. - № 169.-P.-235-240.

125. Hillemanns, P., T. V. Ellerbrock, S. McPhillips, P. Dole, S. Alperstein, D.

126. HIV and human papillomavirus as independent risk factors for cervical neoplasia in women with high or low numbers of sex partners // Sex. Transm. Infect. № 75. - P. - 258-260.

127. Ho G. Y., Bierman R., Beardsley L. et al. Natural history of cervicovaginal papillomavirus infection in young women // N. Engl. J. Med. 1998. - № 338. - P. - 423^128.

128. Hodi F.S., Dranoff G. Genetically modified tumor cell vaccines // Surg. Oncol. Clin. N. Amer. 1998.-№7. -P. -471-485.

129. Hubbard R.A. Human papillomavirus testing methods // Arch. Pathol. Lab. Med. 2003. - № 127.-P.-940-945.

130. Hubbert N.L., Sedman S.A., Schiller J.T. Human papillomavirus type 16 E6 increases the degradation rate of p53 in human keratinocytes // J. Virol. 1992. - Vol. 66, № 10. - P. -6237-6241.

131. IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans // Human papillomaviruses. Lyon: IARC. - 1995. - P. - 64.

132. Jablonska S. Traditional therapies for the treatment of condylomata acuminata (genital warts) // Australas. J. Dermatol. 1998. - № 39 (Suppl 1). - P. - 2-4.

133. Jackson S., Harwood C., Thomas M. et al. Role of Bak in UV-induced apoptosis in skin cancer and abrogation by HPV E6 proteins // Genes. Dev. 2000. - № 14. - P. - 3065-3073.

134. Jenkins D. Diagnosing human papillomaviruses: recent advances // Curr. Opin. Infect. Dis. -2001.- № 14. P. - 53-62.

135. Jensen S.L. Comparison of podophyllin application with simple surgical excision in clearance of perianal condylomata acuminatum // Lancet. 1985. - № 2. - P. - 1146-1148.

136. Johnson X. W., Sun M. A., Chiasson T. C., Wright Jr. Prevalence of anal human papillomavirus infection and anal cytologic abnormalities in HIV-seropositive women // AIDS. 1996. - № 10. - P. - 1641-1647.

137. Kadish A. S., Ho G. Y., Burk R. D. et al. Lymphoproliferative responses to human papillomavirus (HPV) type 16 proteins E6 and E7: outcome of HPV infection and associated neoplasia //J. Natl. Cancer Inst. 1997. - № 89. - P. - 1285-1293.

138. Kast W. M., Brandt R. M., Sidney J. et al. Role of HLA-A motifs in identifi-cation of potential CTL epitopes in human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins // J. Immunol. -1994. № 152. - P. - 3904-3912.

139. Khan M. A., Tolleson W. H., Gangemi J. D., Pirisi L. Inhibition of growth, transformation, and expression of human papillomavirus type 16 E7 in human keratinocytes by alpha interferons // J. Virol. 1993. - № 67. - P. - 3396-3403.

140. Kitagawa K., Yoshikawa H., Onda T. et al. Genomic organization of human papillomavirus type 18 in cervical cancer specimens // Jpn. J. Cancer Res. 1996. - № 87. - P. - 263-266.

141. Klencke B., Matijevic M., Urban R.G. et. al. Encapsulated plasmid DNA treatment for human papillomavirus 16-associated anal dysplasia: a Phase I study of ZYC101 // Clin. Cancer Res. -2002.-№8.-P. 1028-1037.

142. Knebel Doeberitz M. New markers for cervical dysplasia to visualise the genomic chaos created by aberrant oncogenic papillomavirus infections//Eur. J. Cancer. 2002. - №38.-P.-2229-2242.

143. Koutsky L. Epidemiology of genital human papillomavirus infection // Am. J. Med. 1997. -№ 102. - P. - 3-8.

144. Koutsky L. A., Holmes K. K., Critchlow C. W. et al. A cohort study of the risk of cervical intraepithelial neoplasia grade 2 or 3 in relation to papillomavirus infection // N. Engl. J. Med. 1992. - № 327. - P. - 1272-1278.

145. Kyo S., Inoue M., Hayasaka N. et al. Regulation of early gene expression of human papillomavirus type 16 by inflammatory cytokines // Virology. 1994. - № 200. - P. - 130139.

146. Lambert P.F., Pan H., Pitot H.C. et al. Epidermal cancer associated with expression of human papillomavirus type 16 E6 and E7 oncogenes in the skin of transgenic mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1993. № 90. - P.- 5583-5587.

147. Lappin M. B., Kimber I., Norval M. 1996. The role of dendritic cells in cutaneous immunity. Arch. Dermatol. Res. 288:109-121.

148. Leigh I. M., Glover M. T. Skin cancer and warts in immuno-suppressed renal transplant recipients // Recent Results Cancer Res. 1995. - № 139. - P. - 69-86.

149. Li J., Sun Y., Garen A. Immunization and immunotherapy for cancers involving infection by a human papillomavirus in a mouse model // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2002. № 99. -P. - 16232-16236.

150. Liu D.Z., Jin Y.X., Hou H. et al. Preparation and identification of activity of anti-HPV-6b/l 1E1 universal ribozyme-Rzl 198 in vitro // Asian J. Androl. 1999. - № 1. - P. - 195201.

151. Liu W.J., Gao F., Zhao K.N. et al. Codon modified human papillomavirus type 16 E7 DNA vaccine enhances cytotoxic T-lymphocyte induction and anti-tumour activity // Virology. -2002. -№301.-P.-43-52.

152. Lorincz A. T., Reid R., Bennett A. et al. Human papillomavirus infection of the cervix: relative risk associations of 15 common anogenital types // Obstet. Gynecol. 1992. - № 79. - P. - 328-337.

153. Lorinez A.T., Reid R., Bennet A. et al. Human papillomavirus infection of cervix: relative risl associations of common anogenital types // Obstet.Gynecol. 1992. - 79. - P. - 328-337.

154. Luxton J. C., Rose R. C., Coletart T. et al. P. Serological and T-helper cell responses to human papillomavirus type 16 LI in women with cervical dysplasia or cervical carcinoma and in healthy controls // J. Gen. Virol. 1997. - № 78. - P. - 917-923.

155. Maehama T., Asato T., Kanazawa K. Prevalence of HPV infection in cervical cytology-normal womwn in Okinawa, Japan, as determined by polymerase chain reaction // Int. J. Gynecol. Obstet. 2000. - № 69. - P. - 175-176.

156. Malejczyk M., Jozwiak J., Osiecka A. et al. Serum levels of soluble tumor-necrosis-factor receptors in patients with benign and malignant HPV-associated anogenital lesions// Int. J. Cancer. 1997. - № 73. - P. - 16-19.

157. Matlashewski G., Schneider J., Banks L. et al. Human papillomavirus type 16 DNA cooperates with activated ras in transforming primary cells // EMBO J. 1987. - № 6. - P. -1741-1746.

158. Matsura Y., Kawagoe T., Toki N. et al. Cervical intraepithelial neoplasia (low grade) and human papillomavirus infection in cases with long-term follow-up // Acta Cytol- 1998. № 42. - P. - 625-630.

159. McCree D.H., Leichliter J.S., Hogben M., St Lawrence J.S. National survey by specialty of U.S. physicians' HPV screening practices // Prev. Med. 2003. - № 36. - P. - 159-163.

160. McMurray H.R., Nguyen D., Westbrook T.F., McAnce D.J. Biology of human papillomaviruses // Int. J. Exp. Pathol. 2001. - № 82. - P. - 15-33.

161. Mellin H., Dahlgren L., Munck-Wikland E. et al. Human papillomavirus type 16 is episomal and a high viral load may be correlated to better prognosis in tonsillar cancer // Int. J. Cancer.- 2002. Vol. 10, № 102(2). - P. - 152-8

162. Memar O. M., Arany I., Tyring S. K. Skin-associated lymphoid tissue in human immunodeficiency virus-1, human papillomavirus, and herpes simplex virus infections // J. Investig. Dermatol. 1995. - № 105. - P. - 99-104.

163. Meschede W., Zumbach K., Braspenning J., et al. Antibodies against early proteins of huma papillomaviruses as diagnostic markers for invasiv cervical canser // J. Clin. Microbiol. -1998/-№36.-P.-475-80.

164. Miller R.A. Podophyllin // Int. J. Dermatol. 1985. - № 24. - P. - 491-498.

165. Minkoff H., Feldman J., DeHovitz J. et al. A longitudinal study of human papillomavirus carriage in human immunodeficiency virus-infected and human immunodeficiency virus-uninfected women // Am. J. Obstet. Gynecol. 1998. - № 178. - P. - 982-986.

166. Morelli A. E., Belardi G., DiPaola G. et al. Cellular subsets and epithelial ICAM-1 and HLA-DR expression in human papillomavirus infection of the vulva // Acta Derm. Venereol. -1994. № 74. - P. - 45-50.

167. Morris H. H., Gatter K. C., Sykes G. et al. Langerhans' cells in human cervical epithelium: effects of wart virus infection and intraepithelial neoplasia // Br. J. Obstet. Gynaecol. 1983.- № 90. P. - 412-420.

168. Moscicki A. B., Shiboski S., Broering J. et al. The natural history of human papillomavirus infection as measured by repeated DNA testing in adolescent and young women // J. Pediatr. 1998. - № 132. - P. - 277-284.

169. Mosmann T. R., Sad S. The expanding universe of T-cell subsets: Thl, Th2 and more // Immunol Today. 1996. - № 17. - P. - 138-146.

170. Mota F., Rayment N., Chong S. et al. The antigen- presenting environment in normal and human papillomavirus (HPV)-related premalignant cervical epithelium // Clin. Exp. Immunol. 1999. - № 116. - P. - 33^10.

171. Mullokandov M. R., Kholodilov N. G., Atkin et al. Genomic alterations in cervical carcinoma: losses of chromosome heterozygosity and human papillomavirus tumor status // Cancer Research. 1996. - № 56. - P. - 197-205.

172. Munger K., Howley P.M. Human papillomavirus immortalization and transformation functions. Virus Res. 2002. - № 89. - P. - 213-228.

173. Munoz N. Human papillomavirus and cervical cancer: epidemiological evidence // New developments in cervical cancer screening and prevention / Eds E. Franco, J. Monsonego. -Oxford: Blackwell Science, 1997. P. - 3-13.

174. Munoz N., Kato I., Bosch F.X. et al. Risk factor for HPV DNA detection in middle-aged women // Sex. Transm. Dis. 1996. - № 23. - P. - 504-510.

175. Palefsky J. M., Holly E. A., Ralston M. L. et al. Anal cytological abnormalities and anal HPV infection in men with Centers for Disease Control group IV HIV disease // Genitourin. Med. 1997. -№73. -P. - 174-180.

176. Palefsky J. M., Gonzales J., Greenblatt R. M. et al. Anal intraepithelial neoplasia and anal papillomavirus infection among homosexual males with group IV HIV disease // JAMA. -1990. № 263. - P. - 2911-2916.

177. Pao C. C., Lin C. Y., Yao D. S., Tseng C. J. Differential expression of cytokine genes in cervical cancer tissues // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. - № 214. - P. - 11461151.

178. Park J. S., Hwang E. S., Park S. N. et al. Physical status and expression of HPV genes in cervical cancers // Gynecol. Oncol. 1997. - № 65. - P. - 121-129.

179. Parkin D.M., Pisani P., Ferlay J. Global cancer statistics//Can. Cancer J. Clin. 1999. -№ 49. - P. - 33-64.

180. Penn I. Cancers of the anogenital region in renal transplant recipi-ents. Analysis of 65 cases // Cancer. 1986. - № 58. - P. - 611-616.

181. Perisic Z., Popovic Lazic J., Terzic B. et al. Condylomata gigantea in anal and perianal region: surgical and CO(2) laser treatment // Arch. Gynecol. Obstet. 2003. - № 267. - P. - 263-265.

182. Peyton C., SchifFman M., Lorincz et al. Comprasion of PCR and hybrid capture-based human papillomavirus detection systems using multiple cervical specimen collection strategies // J Clin Microbiol. 1998. -№ 36. - P. - 3248-3254

183. Picker L. J., Singh M. K., Zdraveski Z. et al. Direct demonstration of cytokine synthesis heterogeneity among human memory/effector T cells by flow cytometry // Blood. 1995. -№86.-P. - 1408-1419.

184. Pranchev N., Katsarova M. The use of Solcoderm in acute condylomas of the vulva (preliminary report) //Akush Ginekol (Sofiia). 1991. - № 30. - P. - 71-72.

185. Prussin C. Cytokine flow cytometry: understanding cytokine biology at the single-cell level // J. Clin. Immunol. 1997. - № 17. - P. - 195-204.

186. Richardson H., Franco E., Pintos J. et al. Determinants of low-risk and high-risk cervical human papillomavirus infections in Montreal University students // Sex. Transm. Dis. -2000. № 27. - P. - 79-86.

187. Romanczuk H., Thierry F., Howley P.M. Mutational analysis of cis elements involved in E2 modulation of human papillomavirus type 16 P97 and type 18 P105 promoters // J.Virol. -1990.-№64.-P. 121-129

188. Sach K.V., Kessis T.D., Sach F. et al. Human papillomavirus investigation of patients with cervical intraepithelial neoplasia 3, some of whom progressed to invasive canser // Int. J. Gynecol. Pathol. 1996. - № 15. -P. - 127-30.

189. Sadovnikova E., Zhu X., Collins S. M. et al. Limitations of predictive motifs revealed by cytotoxic T lymphocyte epitope mapping of the human papilloma virus E7 protein // Int. Immunol. 1994 - № 6. - P. - 289-296.

190. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular cloning: a laboratory manyal. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989

191. Samoylova E.V., Shaikhaiev G. O., Petrov S.V. et al. HPV infection in cervical-cancer cases in Russia//Int. J. Cancer. 1995.- № 61. - P. - 337-41.

192. Sauvaigo S., Teoule R, Bernard P. et al. Fast solid support detection of human papillomavirus in vitro amplified DNA using a DNP-anti DNP monoclonal antibody couple // J. Virol. Methods.- 1994.-№46.-P.-29-38.

193. Savoca S., Nardo L.G., Rosano T.F. et al. CO (2) laser vaporization as primary therapy for human papillomavirus lesions. A prospective observational study // Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2001. - № 80. - P. - 1121-1124.

194. Scala M., Bonelli G., Gipponi M. et al. Cryosurgery plus adjuvant systemic alpha2-interferon for HPV-associated lesion //. Anticancer Res. 2002. - № 22. - P. - 1171-1176.

195. Schefifner M., Romanczuk H., Munger K. et al. Function of human papillomavirus proteins // Curr. Top. Microbiol, Immunol. 1994. - № 186. - P. - 83-96.

196. Schefifner M., Werness B.A., Huibregtse J.M. et al. The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes the degradation of p53 // Cell. 1990. - № 63. - P. - 1129-1136.

197. SchifTman M., Schatzkin A. Test reliability is critically important to molecular epidemiology.: an example from studies of human papillomavirus infection and cervical neoplasi // Cancer Res. 1994. - № 54. - P. - 1944-1947

198. Schiffman M.H. Epidemiology of cervical human papillomavirus infection // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1994. - № 186. - P. - 83-96.

199. Schneider A., Koutsky L. Natural history and epidemiology features of genital HPV infection. // The epidemyology of cervical and human papillomavirus / Eds. N. Munoz, F.X. Bosch, K.V. Shan, A. Meheus Lyon, France: IARC, 1992. - P. - 25-52.

200. Scott, M., Stites D. P., Moscicki A. B. Thl cytokine patterns in cervical human papillomavirus infection // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1999. - № 6. - P. - 751-755.

201. Shah K. V., Viscidi R. P., Alberg A. J. et al. Antibodies to human papillomavirus 16 and subsequent in situ or invasive cancer of the cervix // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. -1997. № 6. - P. - 233-237.

202. Sherman M.E., Lorincz A.T., Scott D.R. et. al. Baseline cytology, human papillomavirus testing, and risk for cervical neoplasia: a 10-year cohort analysis // J. Natl. Cancer Inst. -2003. № 95. - P. - 46-52.

203. Sherman M.E., Schiffman M.H., Strickler H., Hildeshtein A. Prospects for a prophylactic HPV vaccine: rationale and future implications for cervical cancer screening // Diagn. Cytopathol. 1998. - № is. p. . 5.9.

204. Si H.X., Tsao S.W., Poon C.S. et al. Viral load of HPV in esophageal squamous cell carcinoma // Int. J. Cancer. 2003. - Vol. 103, № 4. - P. - 496-500.

205. Sikorski M., Zrubek H. Long-term follow-up of patients treated with recombinant human interferon gamma for cervical intraepithelial neoplasia // Int. J. Gynaecol. Obstet. 2003. -№82.-P. - 179-185.

206. Sillman F., Stanek A., Sedlis A. et al. The relationship between human papillomavirus and lower genital intraepithelial neoplasia in immunosuppressed women // Am. J. Obstet. Gynecol. 1984. - № 150. - P. - 300-308.

207. Silverberg, E„ Lubera J. Cancer statistics 1987 // CA Cancer J. Clin. 1987. - № 37. - P. - 219.

208. Smahel M., Sima P., Ludvikova V. et al. Immunisation with modified HPV16 E7 genes against mouse oncogenic TC-1 cell sublines with downregulated expression of MHC class I molecules//Vaccine. 2003. - №21. - P. - 1125-1136.

209. Sotlar K., Selinka H.C., Menton M. et al. Detction of human papillomavirus type 16 E6/E7 oncogen transcripts in dysplastic and nondysplastic cervical scrapes by nested RT-PCR // Gynecol, oncol. 1998. - Vol. 69, № 2. - P. - 114-21.

210. Stadnyk A. W. Cytokine production by epithelial cells // FASEB J. 1994. - № 8. - P. - 10411047.

211. Storey A., Thomas M., Kalita A., et al. Role of a p53 polymorphism in the development of human papillomavirusassociated cancer //Nature. 1998.- № 393. - P. - 229-234.

212. Sultana H., Kigawa J., Kanamori Y. et al. Chemosensitivity and p53-Bax pathway-mediated apoptosis in patients with uterine cervical cancer // Ann. Oncol. 2003. - № 14. - P. - 214219.

213. Sun X. W., Kuhn L., Ellerbrock T. V. et al. Human papillomavirus infection in women infected with the human immunodeficiency virus // N. Engl. J. Med. 1997. - № 337. - P. -1343-1349.

214. Syrjanen S. M. Basic concepts and practical applications of recombinant DNA techniques in detection of human pap-illomavirus (HPV) infections // APMIS. 1990. - № 98. - P. - 95110.

215. Taichmain, L. B., LaPorta R. F. The expression of papillomaviruses in epithelial cells // The papova-viridae. Plenum / Eds N. P. Salzman. New York, N.Y, 1986. - P. 109-130.

216. Tarpey I., Stacey S., Hickling J. et al. Human cytotoxic T lymphocytes stimulated by endogenously processed human papillomavirus type 11 E7 recognize a peptide containing a HLA-A2 (Ap0201) motif// Immunology. 1994. - № 81. - P. - 222-227.

217. Tay S. K., Jenkins D., Maddox P. et al. Subpopulations of Langerhans' cells in cervical neoplasia // Br. J. Obstet. Gynaecol. 1987. - № 94. - P. - 10-15.

218. Thelwell N., Millington S., Solinas A. et al. Mode of action and application of scorpion primers to mutation detection //Nucleic. Acid. Res. 2000. - № 28. - P. - 3752-3761.

219. Thomas K.K., Hughes J.P., Kuypers J.M. et al. Concurrent and sequential acquisition of different genital human papillomavirus types // J. Infect. Dis. 2000. - № 182. - P. - 10971102.

220. Ting Y., Manos M.M. Detection and typing of genital human papillomaviruses // PCR protocols: a guide to methods and applications / Eds M.A Innis., D.H. Gelfand, J.J.Sninsky, T.J.White. San Diego: Academic Press, 1990. - P. - 356-67.

221. Tjalma W.A., Weyler J.J., Bogers J.J. et al. The importance of biological factors (bcl-2, bax, p53, PCNA, MI, HPV and angiogenesis) in invasive cervical cancer // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2001. - № 97. - P. - 223-230.

222. Tonon S.A., Picconi M.A., Zinovich J.B. et al. Human papillomavirus cervical infection and associated risk factors in a region of Argentina with a high incidence of cervical carcinoma // Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 1999. - № 7. - P. - 237-243.

223. Tsukui T., Hildesheim A., Schiffman M. H. et al. Interleukin 2 production in vitro by peripheral lymphocytes in response to human papillomavirus-derived peptides: correlation with cervical pathology // Cancer Res. 1996. - № 56. - P. - 3967-3974.

224. Tsutsui T., Kumakura S., Yamamoto A. et al. Association of pi6 (lNK4a) and pRb inactivation with immortalization of human cells // Carcinogenesis. 2002. - № 23. - P. -2111-2117.

225. Tyring S., Conant M., Marini M. et al. Imiquimod; an international update on therapeutic uses in dermatology // Int. J. Dermatol. 2002. - № 41. - P. - 810-816.

226. Veldman T., Horikawa I., Barrett J.C., Schlegel R. Transcriptional activation of the telomerase hTERT gene by human papillomavirus type 16 E6 oncoprotein // J. Virol. 2001. - № 75. -P. - 4467-4472.

227. Vernon S. D., Hart C. E., Reeves W. C., Icenogle J. P. The HIV-1 tat protein enhances E2-dependent human papillomavirus 16 transcription // Virus Res. 1993. - № 27. - P. - 133145.

228. Villa L. L., Vieira K. B., Pei X. F., Schlegel R. Differential effect of tumor necrosis factor on proliferation of primary human keratinocytes and cell lines containing human papillomavirus types 16 and 18 // Mol. Carcinog. 1992. - № 6. - P. - 5-9.

229. Volpers C., Sapp M., Komly C.A. et al. Development of type-specific and cross-reactive serological probes for the minor capsid protein of human papillomavirus type 33 // J. Virol. -1993.-№67.-P. 1927-35.

230. Wakabayashi M.T., Da Silva D.M., Potkul R.K., Kast W.M. Comparison of Human Papillomavirus Type 16 LI Chimeric Virus-Like Particles versus L1/L2 Chimeric VirusLike Particles in Tumor Prevention // lntervirology. 2002. - № 45. - P. - 300-307.

231. Walts A.E, Thomas P. Correlation of manual screening and automated (AutoPap 300) analysisof conventional cervicovaginal smears with HPV typing using Digene HC II assay // Diagn. Cytopathol. 2003. - № 29. - P. - 256-261.

232. Wang X.M., Jansen K.U., McClements W.L. DNA replicative functions of highly-expressed, codon-optimized human papillomavirus proteins El and E2. J Virol Methods. Vol. 108, № 1.-P.-83-90.

233. Wang B., Amerio P., Sauder D. N. Role of cytokines in epidermal Langerhans cell migration

234. J. Leukoc. Biol. 1999. - № 66. - P. - 33-39.

235. Watts D.K., Koutsky L.A., Holmes K.K. et al. Low risk of perinatal transmission of human papillomavirus: result from a prospective cohort study // Am. J. Obstet. Gynecol. 1998. -№ 178.-P.-365-373.

236. Werness B.A., Levine A.J., Howley P.M. Association of human papillomavirus types 16 and 18 E6 protein with p53 // Science. 1990. - № 248. - P. - 76-79.

237. Weston A.C., Prolla J.C. Association between esophageal squamous cell carcinoma and human papillomavirus detected by Hybrid Capture II assay // Dis Esophagus. 2003. - № 16.-P.-224-228.

238. Whitcombe D., Theaker J., Guy S.P. et al. Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence // Nat. biotechnology. 1999. - № 17. - P. - 804-807.

239. Wiest T., Schwarz E., Enders C. et al. Involvement of intact HPV 16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control // Oncogene. 2002. - № 21. - P. - 1510-1517.

240. Wiley D.J., Douglas J., Beutner K.et al. External genital warts: diagnosis, treatment, and prevention // Clin. Infect. Dis. 2002. - Vol. 35, № 2. - P. - 210-24.

241. Wohlfahrt J., Melbye M. Age at any birth is associated with breast cancer risk // Epidemiology. 2001. -№ 12. - P. - 68-73.

242. Wolf J.K., Franco E.L., Arbeit J.M. et al. Innovations in understanding the biology of cervicalcancer//Cancer.-2003. Vol. 98, № 9. - P. - 2064-2069.

243. Woodworth C. D. HPV innate immunity // Front Biosci. 2002. - № 7. - P. - 2058-2071.

244. Woodworth C. D., Simpson S. Comparative lymphokine secretion by cultured normal human cervical keratinocytes, papillomavirus-immortalized, and carcinoma cell lines // Am. J. Pathol. 1993. -№ 142. - P. - 1544-1555.

245. Wright T.C., Sun X.W., Koulos J. Comparison of management algorithms for the evaluationof women with low-grade cytologic abnormalities // Obstet. Gynecol. 1995. - № 85. - P. -202.

246. Xi L.F., Carter J.J., Galloway D.A. et al. Acquisition and natural history of human papillomavirus type 16 variant infection among a cohort of female university students // Cancer Epidemiol. Biomarkers. Prev. 2002. - № 11. - P. - 343-351.

247. Xi L. F., Koutsky L. A., Galloway D. A. et al. Genomic variation of human papillomavirus type 16 and risk for high grade cervical intraepithelial neoplasia // Journal of the National Cancer Institute. 1997. - № 89. - P. - 796-802.

248. Yamada T., Manos M. M., Peto et al. Human papillomavirus type 16 sequence variation in cervical cancers: a worldwide perspective // Journal of Virology. 1997. - № 71. - P. - 24632472.

249. Zerfass K., Schulze A., Spitkovsky D. et al. Sequential activation of cyclin E and cyclin A gene expression by human papillomavirus type 16 E7 through sequences necessary for transformation // J. Virol. 1995. - № 69. - P. - 6389-6399.

250. Zur Hausen H. Papillomavirus infection a major cause of human cancer // Biochim. Biophys. Acta. - 1996. - № 1288. - P. - 55-78.

251. Zur Hausen H. Papillomaviruses in human cancers // Proc. Assoc. Am. Physicians. 1999. -№ 111.-P.-581-587.

252. Zur Hausen H. Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application // Nature. 2002. -№ 2. - P. - 342-350.

253. Zur Hauzen H. Viruses in human cancers // Science. 1991. - № 254. - P. - 1167-1173.