Комплекс Integrator – участник транскрипции теломеразной РНК человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат наук Василькова Дарья Павловна

• Василькова Дарья Павловна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Василькова Дарья Павловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Теломеразная РНК

1. Общие сведения

2. Структура теломеразной РНК

2.1. Структура теломеразной РНК ресничных

2.2. Структура теломеразной РНК дрожжей

2.3. Структура теломеразной РНК позвоночных (человека)

3. Биогенез теломеразной РНК в различных организмах

3.1. Биогенез теломеразной РНК ресничных. Сборка теломеразного холофермента

3.2. Биогенез теломеразной РНК дрожжей

3.3. Биогенез теломеразной РНК человека

Терминация транскрипции РНК человека. Белковые комплексы - участники

терминации транскрипции

1. Комплекс Integrator

1.1. Структура комплекса Integrator

1.2. Участие Integrator в процессинге мяРНК

1.3. Участие Integrator в «паузах» РНК-полимеразы II в процессе транскрипции

1.4. «Нестандартные» функции отдельных субъединиц комплекса

Integrator

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Постановка задачи

2. Создание модельных клеточных линий

3. Определение положения старта транскрипции бицистронной

конструкции в исследуемых клеточных линиях

2

4. Зависимость количества непроцессированной формы hTR от

промотора

5. Влияние нокдауна субъединиц комплекса Integrator на процессинг малой ядерной РНК U2

6. Влияние нокдауна субъединиц комплекса Integrator на процессинг теломеразной РНК человека

7. Определение длины первичного транскрипта теломеразной РНК человека

8. Заключение

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Используемые реактивы и буферные растворы

2. Клеточные линии, штаммы и плазмиды

3. Олигонуклеотиды, зонды для Нозерн-блоттинга, малые интерферирующие РНК

4. Методики, используемые в работе

4.1. Приготовление компетентных клеток E. coli

4.2. Трансформация компетентных клеток E. coli

4.3. Выделение плазмидной ДНК

4.4. Выделение плазмидной ДНК для трансфекции эукариотических клеток

4.5. Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле

4.6. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля

4.7. Создание векторных конструкций для получения модельных клеточных линий

4.8. Секвенирование плазмид и ПЦР-продуктов

4.9. Культивирование клеток HEK293T

4.10. Выделение геномной ДНК

4.11. Трансфекция клеток кальций-фосфатным методом

4.12. Инфекция клеток вирусными частицами

4.13. Трансфекция клеток малыми интерферирующими РНК

3

4.14. Выделение суммарной РНК, обработка ДНКазой и получение

кДНК

4.15. Проведение ПЦР в реальном времени

4.16. Нозерн-блоттинг

4.17. Проведение 3'ЯАСЕ-анализа с последующим пиросеквенированием

4.18. Проведение 5'ЯАСЕ-анализа

ВЫВОДЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Проверка эффективности и специфичности праймеров, используемых в

данной работе в методе ПЦР в реальном времени

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

DMEM/F12

dNTPs FBS HEK HEPES

hTR INTS LB OD

Opti-MEM PBS RACE TdT

TEMED

TER, TR, TERC

TERT

Tris

а.о.

БСА

Да, кДа

ДНК

ДСН

ДТТ

кДНК

мРНК

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

среда Игла в модификации Дульбекко с добавлением питательных веществ (F-12) в соотношении 1:1 2' -дезоксирибонуклеозид-5' -трифосфаты фетальная бычья сыворотка клетки почки эмбриона человека ^2-гидроксиэтилпиперазин-№-2-этансульфоновая кислота теломеразная РНК человека

Integrator subunit, субъединица комплекса Integrator богатая среда Lysogeny broth оптическая плотность

оптимизированная минимальная поддерживающая среда фосфатный буферный раствор

быстрая амплификация концов комплементарной ДНК терминальная трансфераза N,N,N' ,N' -тетраметилэтилендиамид теломеразная РНК

теломеразная обратная транскриптаза трис(гидроксиметил)аминометан аминокислотный остаток бычий сывороточный альбумин дальтон, килодальтон дезоксирибонуклеиновая кислота додецилсульфат натрия 1,4-дитио-DL-треитол комплементарная ДНК матричная РНК

мяРНК малая ядерная РНК

мяоРНК малая ядрышковая РНК

н.о. нуклеотидные основания

н нуклеотид

ОТ обратная транскрипция

оцДНК одноцепочечная ДНК

ПААГ полиакриламидный гель

ПСА персульфат аммония

п.о. пара оснований

ПЦР полимеразная цепная реакция

РНК рибонуклеиновая кислота

ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комплекс Integrator – участник транскрипции теломеразной РНК человека»

Актуальность проблемы

Линейная организация геномов эукариот требует специальной клеточной системы для защиты и поддержания целостности концевых участков. Такой системой являются теломеры - сложные нуклеопротеиновые структуры. При каждом клеточном делении в результате недорепликации концы хромосом укорачиваются, а после достижения критического предела -предела Хейфлика - клетка и вовсе перестает делиться [1].

Постоянному укорочению теломер противодействует их удлинение ферментом теломеразой. В соматических клетках теломераза неактивна, как предполагается, эта репрессия служит механизмом защиты от образования опухолей. В стволовых, половых и зародышевых клетках теломераза, наоборот, эффективно работает, обеспечивая постоянное деление этих клеток

[2]. Теломераза также активна в ~90% раковых клеток, что делает исследование механизмов регуляции её экспрессии важной научной задачей

[3].

Теломеразная РНК человека - необходимый компонент теломеразного комплекса - синтезируется в клетках постоянно, в отличие от обратной транскриптазы [4]. Последние данные показывают, что процессинг и деградация теломеразной РНК являются строго координированными процессами [5]. При этом некоторые заболевания-теломеропатии, характеризующиеся укороченными теломерами и пониженной пролиферативностью клеток, ассоциированы с мутациями hTR и её низким уровнем экспрессии [6, 7]. И неудивительно, что процессинг теломеразной РНК привлекает к себе внимание многих учёных.

Степень разработанности проблемы

Несмотря на достаточно большой объем знаний о процессинге теломеразной РНК человека, полученный в последние несколько лет, механизм самой первой стадии, неразрывно связанной с терминацией транскрипции, оставался неизвестным. В то же время для дрожжевых теломеразных РНК показано участие в процессинге тех же белковых факторов Nrd1-Nab3-Sen1, что и для малых ядерных РНК [8, 9]. На основании изученных литературных данных нами выдвинута гипотеза об участии в процессинге теломеразной РНК человека комплекса Integrator, который является функциональным гомологом дрожжевых белков Nrd1-Nab3-Sen1. Данная работа посвящена экспериментальному подтверждению этой гипотезы.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение возможности участия комплекса Integrator в процессинге теломеразной РНК человека.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- создание модельных клеточных линий, экспрессирующих ген теломеразной РНК человека под контролем различных промоторов;

- анализ содержания различных форм теломеразной РНК в модельных клеточных линиях;

- получение нокдауна некоторых белковых субъединиц комплекса Integrator в клетках HEK293T для оценки влияния Integrator на процессинг предшественника hTR;

- определение длины предшественника hTR.

Объект исследования - процессинг теломеразной РНК человека.

Предмет исследования - участие комплекса Integrator в процессинге

8

теломеразной РНК человека.

Научная новизна

Впервые показана роль комплекса Integrator в регуляции транскрипции гена теломеразной РНК человека. Результаты экспериментов, полученные при использовании нескольких разных взаимодополняющих методов, свидетельствуют об участии комплекса в терминации транскрипции hTR.

Теоретическая значимость работы

В представленной работе показано, что нокдаун субъединиц комплекса Integrator - INTS1, INTS9 и INTS11 - приводит к появлению и накоплению непроцессированных трансриптов различной длины. Экспрессия теломеразной РНК под промоторами, для которых нехарактерно привлечение Integrator к РНК-полимеразе II, также приводит к нарушению правильного процессинга hTR. В результате данного исследования обнаружен и подтверждён новый участник процессинга теломеразной РНК, который вносит разрыв в её первичный транскрипт.

Практическая значимость работы

Различные исследования последних лет показывают корреляцию между нарушениями процессинга теломеразной РНК человека и различными заболеваниями, характеризующимися укороченными теломерами. Результаты данного исследования способствуют пониманию возможных механизмов нарушения процессинга и, как следствие, разработке новых методов диагностики теломеропатий у человека.

Методология диссертационного исследования

При проведении экспериментов использовали современные биохимические методы. Плазмиды нарабатывали в штаммах-продуцентах E.coli. Очистку плазмид и РНК проводили с использованием специализированных наборов реагентов от ведущих фирм-производителей. Чистоту препаратов нуклеиновых кислот проверяли методами электрофореза и спектрофотометрии. Работу с культурами эукариотических клеток проводили в специально оборудованном помещении в стерильных условиях в ламинарном шкафу. Флуоресцентный анализ клеток проводили с использованием микроскопа Evos FL Imaging System (Thermo Fisher Scientific). Сортировали клетки с помощью высокоскоростного клеточного сортера BD FACSAria III (Beckton Dickinson). Подбор праймеров для полимеразной цепной реакции осуществляли при помощи онлайн-системы Primer-Blast (NCBI). Для обработки данных ПЦР в реальном времени использовали программное обеспечение Bio-Rad CFX Manager. Статистическую обработку данных проводили в программе GraphPad Prism с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA и метода Шидака для множественных сравнений.

Положения, выносимые на защиту:

1. Процессинг теломеразной РНК зависит от промотора, который регулирует экспрессию гена hTR в клетке.

2. Нокдаун субъединиц комплекса Integrator - INTS1, INTS9 и INTS11 - приводит к накоплению непроцессированных hTR и U2 мяРНК в клетке.

3. Комплекс Integrator - необходимый участник процессинга теломеразной РНК, также как и для мяРНК.

Степень достоверности результатов

Достоверность результатов диссертационного исследования подтверждается воспроизводимостью экспериментов и статистической обработкой данных. В работе использовали современные методы исследований, соответствующие поставленным целям и задачам. Результаты получены на современном научном оборудовании и с использованием реактивов, произведенных ведущими мировыми компаниями. Результаты работы опубликованы в международных рецензируемых журналах, индексируемых в системах Web of Science и Scopus.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на заседании кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, а также на следующих научных мероприятиях и конференциях:

V Международная конференция «Постгеном'2018», Казань, Россия, 29.10- 2.11.2018; Telomere biology in health and human disease, Troia, Португалия, 1-6.05.2018; FEBS 2018, Прага, Чехия, 7-12.06.2018; Международная научная конференция «XII чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» VIII Российский симпозиум «Белки и пептиды», Москва, Россия 18.09.-22.09.2017; Long Noncoding RNAs: From Evolution to Function, Keystone Resort, США, 15-21.03.2015; The 4th International Conference on Science and Applied Research «Post-Genome Methods of Analysis in Biology and Laboratory and Clinical Medicine», Казань, Россия 29.10.-01.11.2014; 3rd Meeting of the CNRS LIA NUCPROT «Biogenesis, structure and reactivity of nucleic acids protein assemblies important for health and disease», Страсбург, Франция 16.10.-19.10.2014.

Публикация работы

Основные результаты диссертационной работы представлены в 4 публикациях в международных рецензируемых журналах, индексируемых в системах Web of Science и Scopus.

1) Rubtsova M.P., Vasilkova D.P., Moshareva M.A., Malyavko A.N., Meerson M.B., Zatsepin T.S., Naraykina Y.V., Beletsky A.V., Ravin N.V., Dontsova O.A.. Integrator is a key component of human telomerase rna biogenesis. Scientific reports, 9(1):1701, 2019. IF 4,122

2) Рубцова М.П., Василькова Д.П., Нарайкина Ю.В., Донцова О.А. Особенности процессинга теломеразных РНК дрожжей и человека. Acta Naturae (англоязычная версия), 2016, 8(4), с. 78-86. IF 2,000.

3) Vasilkova D.V., Azhibek D.M., Zatsepin T.S., Naraikina Y.V., Prassolov V.S., Prokofjeva M.M., Rubtsova M.P. Dynamics of human telomerase RNA structure revealed by antisense oligonucleotide technique. Biochimie, 2013, 95 (12), 2423-2428. IF 3,112.

4) Рубцова М.П., Василькова Д.П., Малявко А.Н., Нарайкина Ю.В., Зверева М.Э., Донцова О.А. Функции теломеразы: удлинение теломер и не только. Acta Naturae (англоязычная версия), 2012, 4(2), с. 44-61. IF 2,000.

Личный вклад автора

Личный вклад автора в проведенное исследование заключался в сборе и анализе литературных данных, постановке задач, планировании и проведении экспериментальных процедур, анализе и оформлении полученных результатов, в представлении результатов на научных мероприятиях.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: оглавление, список сокращений, введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, заключение, материалы и методы, выводы, приложение, благодарности и список литературы. Материал иллюстрирован 29 рисунками и 4 таблицами. Список литературы включает 116 процитированных работ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Теломеразная РНК

1. Общие сведения

Теломераза - специализированный РНК-белковый комплекс, служащий для поддержания длины хромосом в клетках эукариот. В состав теломеразного холофермента входят обратная транскриптаза (TERT) и теломеразная РНК (TER). В отличие от других клеточных или вирусных обратных транскриптаз теломераза использует в качестве матрицы участок теломеразной РНК. Таким образом, TERT и TER являются минимально необходимыми компонентами для работы фермента in vitro [10]. In vivo в состав теломеразы входят дополнительные белки, необходимые для стабильности и активности комплекса [11].

Теломеры - ДНК-белковые структуры, защищающие концы хромосом от слияния или деградации. Теломерная ДНК состоит из многократно повторяющихся 6-8 нуклеотидных блоков (например, TTAGGG - у человека или TTGGGG - у Tetrahymena thermophila) [12, 13]. После каждого раунда репликации теломеры укорачиваются, и этот процесс контролирует число делений клетки до наступления сенессенса. Теломераза же достраивает нуклеотидные повторы теломерной ДНК по собственной внутренней матрице, позволяя клетке продолжать деление (рис. 1) [2].

Рисунок 1. Теломераза удлиняет теломерный участок ДНК по своей РНК-матрице [14].

2. Структура теломеразной РНК

Структура теломеразных РНК у разных организмов достаточно разнообразна. Длина TER колеблется от ~150 нуклеотидов у инфузорий до ~1500 у некоторых видов дрожжей. Тем не менее, некоторые элементы вторичной структуры можно назвать общими для TER инфузорий, дрожжей и позвоночных (рис. 2). Консервативным можно назвать одноцепочечный матричный участок, длиной примерно в 1,5 теломерных повтора. Рядом с ним расположен псевдоузел, стабилизированный триплексной структурой. Основной функцией приписываемой в настоящий момент псевдоузлу является связывание TER с обратной транскриптазой и правильное позиционирование матричного участка относительно последней.

Рядом с псевдоузлом и матрицей находится длинная последовательность спаренных нуклеотидов - стебель или отдельная шпилька. Это участок, ограничивающий матрицу (template boundary element -TBE) с 5'-конца, который препятствует копированию нуклеотидов, не относящихся к теломерному повтору.

Также консервативным доменом является «stem terminus» element (STE), взаимодействующий с теломеразной обратной транскриптазой и необходимый для сборки активного комплекса [15].

различных организмов: А) ресничные; Б) человек (позвоночные); В) дрожжи. Цветом выделены общие функциональные домены, такие как: псевдоузел, матричный участок, STE и TBE [15].

Помимо перечисленных элементов TER содержат участки взаимодействия со вспомогательными белками, отвечающими за правильный процессинг РНК и её стабильность.

2.1. Структура теломеразной РНК ресничных

Теломеразная РНК известного модельного организма, T. thermophila, довольно короткая - всего 159 нуклеотидов. Тем не менее, она содержит все вышеперечисленные элементы, характерные для теломеразных РНК. В отличие от других организмов, у ресничных TER синтезирует РНК-полимераза III [16].

С помощью метода FRET (Förster resonance energy transfer, Фёрстеровский перенос энергии) показано, что белки TERT и p65 участвуют в формировании псевдоузла у TER T. thermophila. Причём правильная сборка третичной структуры псевдоузла крайне важна для активности всего комплекса. В отсутствие каталитической субъединицы этот участок РНК образует альтернативные структуры и только при взаимодействии с TERT происходит его «упаковка» в структуру псевдоузла [17].

Важным элементом структуры данной РНК является так называемый «стебель» IV или STE (рис. 2, А). При взаимодействии с белком p65 он изменяет свою конформацию, что является необходимым условием для взаимодействия РНК с обратной транскриптазой [18].

Помимо TBE - участка, ограничивающего матрицу с 5'-конца - TER ресничных содержат TRE (template recognition element) - участок, отвечающий за распознавание матрицы. Он расположен сразу после З'-конца матрицы [19]. В процессе транслокации теломеразы TBE- и TRE-последовательности поочередно то растягиваются, то снова компактизуются, работая подобно «молекулярному аккордеону», что способствует процессивности теломеразы [20].

2.2. Структура теломеразной РНК дрожжей

Эти TER дрожжей сравнительно большие (более 1000 нуклеотидов).

Схематично их вторичную структуру можно представить в виде трёх

17

больших «стеблей» и консервативного «центра», состоящего из псевдоузла и матричного участка (рис. 2, В).

Перед 5'-концом матрицы находится элемент, ограничивающий её (TBE). У дрожжей рода Saccharomyces этот же «стебель» оканчивается участком взаимодействия с гетеродимером Ku - белковым комплексом, важным для ядерной локализации и сборки теломеразы [21, 22].

Второй РНК-стебель содержит сайт связывания белка Estl у Saccharomyces или его гомолога у Schizosaccharomyces pombe. Estl важен для удлинения теломер in vivo, хотя и не оказывает прямого влияния на каталитическую активность теломеразы [23].

Третий РНК-стебель содержит STE-элемент, а также сайт связывания Sm-белков, способствующих созреванию и стабилизации РНК [24]. С STE-элементом и псевдоузлом взаимодействует каталитическая субъединица дрожжевой теломеразы (белок Est2 у S.cerevisiae или Trtl у S.pombe).

Интересно, что длинные «стебли» необязательны для функциональности теломеразной РНК. Mini-T РНК, состоящая исключительно из функциональных доменов без длительных нуклеотидных последовательностей между ними, функционально активна. Хотя у клеток, экспрессирующих ген Mini-T, теломеры были короче, чем у клеток с теломеразной РНК дикого типа [25]. Фактически, теломеразная РНК дрожжей представляет собой гибкий каркас, на котором располагаются белковые субъединицы [26]. Сайты связывания Sm-белков, Est2 и Ku-белков выполняют свои функции, даже если их переместить в другую область TER [27, 28].

Консервативный центр теломеразной РНК отделен от остальной её

части протяженным двуцепочечным участком, получившим название CEH -

core-enclosing helix [29]. Все четыре элемента коровой области TER:

псевдоузел, матричный участок, TBE, CEH - должны быть расположены в

определённом порядке. При нарушении взаимодействия между TBE и CEH-

участками активность теломеразы падает. Но и наоборот, TERT в комплексе

18

с короткой micro-T РНК (170 нуклеотидов длиной), содержащей только элементы консервативной части, достаточно для удлинения теломер-подобного праймера in vitro [30].

2.3. Структура теломеразной РНК позвоночных (человека)

Теломеразная РНК человека (hTR) имеет длину 451 нуклеотид. Для выявления её вторичной структуры был проведён филогенетический анализ. При выравнивании последовательностей TER ряда позвоночных выявлено несколько консервативных участков (conserved regions - CRs), в том числе псевдоузел [31].

Последовательность CR1 содержит в себе матрицу, по которой достраиваются теломеры, а также участок TBE. У TER грызунов этот домен укорочен, и матричный участок начинается через несколько нуклеотидов от 5'-конца РНК [31].

В структуре псевдоузла hTR присутствует тройная спираль РНК [32]. Введение мутаций в азотистые основания, участвующие в образовании триплекса, приводит к дестабилизации псевдоузла и падению активности теломеразы. Некоторые мутации, связанные с заболеваниями, также приводят к нарушению конформации псевдоузла, что подтверждает значимость этого домена в функционирование всего фермента [33, 34].

Домен CR4/5 содержит STE-элемент, который состоит из трёх шпилек, объединённых внутренней петлёй, и напоминает по форме вилку с двумя зубцами. В его структуре отдельно выделяют Р6.1 шпильку (Рис. 2, Б). Доказано, что эта шпилька непосредственно участвует в связывании с TERT и, следовательно, необходима для каталитической активности фермента [35, 36].

Структура теломеразы, полученная методом криоэлектронной микроскопии, показывает, что в составе фермента псевдоузел и домен CR4/5

сближены в пространстве и как бы окружают обратную транскриптазу, образуя каталитический центр фермента (рис. 3) [37].

Помимо перечисленных доменов, характерных для всех теломеразных РНК, hTR содержит несколько специфичных мотивов, важных для созревания РНК, сборки рибонуклеопротеидного комплекса, клеточной локализации и регуляции in vivo. Так, 5'-конец hTR содержит несколько близкорасположенных гуанозиновых последовательностей, способных образовывать внутримолекулярный G-квадруплекс, который впоследствии распознаёт и разрешает хеликаза DHX36 (также обозначаемая RHAU или G4R1). Предположительно, квадруплекс служит для защиты 5'-конца hTR на ранних стадиях биогенеза. Позднее эту функцию выполняет триметилированный гуанозин («кэп»), а 5'-область hTR формирует P1-стебель [38, 39].

А

САВ box

Р4.2

Субстрат Матрица

Б

NHP2

ТСАВ1

TERT

™N' Субстрат Матрица

Рисунок 3. А) Схематичное изображение вторичной структуры hTR, полученное методом криоэлектронной микроскопии. Б) Схематичное изображение структуры холофермента теломеразы человека, полученное методом криоэлектронной микроскопии [37].

З'-область hTR содержит Н/АСА мотив, характерный для малых ядрышковых РНК (мяоРНК). Этот участок представляет собой две шпильки, соединённые одноцепочечным участком (Н-Ьох), и небольшой одноцепочечный «хвост», содержащий последовательность АСА. У зрелой теломеразной РНК каждая из шпилек Н/АСА мотива взаимодействует с комплексом из четырёх белков: DKC1 (дискерина), КОРЮ, КНР2 и GAR1 [40]. При этом шпилька Р4 взаимодействует преимущественно только с дискерином, тогда как шпилька Р8 связывается и с КОРЮ, и с КНР2 (рис.3) [37].

Основная функция эукариотических РНК семейства Н/АСА - сайт-специфическое псведоуридинилирование, которое обеспечивается за счёт гибридизации Н/АСА мотива с участками РНК вблизи целевого уридина. Теломеразная РНК считается утратившей данную функцию, так как для неё не найдено ни одной предполагаемой мишени [40, 41]. Также следует отметить, что у теломеразной РНК одна из шпилек Н/АСА мотива не является канонической, так как она одновременно является и частью CR4/5 мотива [40]. Вероятно, этим и объясняется неодинаковое взаимодействие двух дискериновых комплексов с теломеразной РНК (рис. 4). Н/АСА мотив необходим теломеразной РНК для правильного посттрансляционного процессинга и последующей сборки теломеразного комплекса. Так, например, у пациентов с врожденным дискератозом (заболеванием, при котором наблюдается пониженный уровень активности теломеразы и укороченные теломеры) были обнаружены мутации именно в этом мотиве теломеразной РНК [6, 42].

NHP2 NHP2

Рисунок 4. Взаимодействие белков дискеринового комплекса с H/ACA-мотивом теломеразной РНК человека [37].

В состав H/ACA мотива также входят CAB-box и BIO-box. CAB последовательность (5'-UGAG-3') представляет собой сигнал локализации в тельцах Кахаля. С этой последовательностью связывается белок TCAB1 (telomerase Cajal body protein 1). Методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) показано, что hTR накапливается в тельцах Кахаля в линии раковых клеток HeLa. И, напротив, нокдаун гена TCAB1 вызывает значительное снижение количества hTR, локализованной в тельцах Кахаля

[43].

BIO-box, в отличие от CAB-box, характерен не для всех H/ACA РНК

[44]. Предполагается, что он необходим для сборки и стабильности РНК-белкового комплекса на H/ACA мотиве hTR [45]. Впрочем, по данным другой группы исследователей, BIO мотив необходим для взаимодействия с белком NHP2 и характерен для малых ядрышковых РНК с неканонической шпилькой в 5'-области H/ACA мотива [46].

3. Биогенез теломеразной РНК в различных организмах

3.1. Биогенез теломеразной РНК ресничных. Сборка теломеразного холофермента

Теломеразная РНК ресничных транскрибируется РНК-полимеразой III, её 3'-область богата уридинами. Эта полиуридиновая последовательность вместе со «стеблем» I и «стеблем» IV обеспечивает взаимодействие РНК с белком p65, которое в свою очередь приводит к образованию тройного, каталитически активного комплекса p65-TER-TERT [47]. Связывание p65 стабилизирует излом «стебля» IV, что является необходимым условием сборки комплекса (рис. 5) [18].

Т. МегторЬИа ТЕР

Транскрипция РНК-полимеразой III

Привлечение белка p65

Привлечение каталитической субъединицы TERT

>75

ЩГ

ТеЫ Р50

Рисунок 5. Биогенез рибонуклеопротеида Т. ^егторЫШ [15].

Аффинная очистка теломеразного комплекса ресничных выявила другие белки, входящие в его состав: р19, р45, р50, р75 и ТеЬ1. В 2015 году методом крио-электронной микроскопии получена более точная (с разрешением 9А) структура теломеразного комплекса, а также найдены ещё несколько белков, входящих в состав холофермента. На сегодняшний день показано, что тройной комплекс p65-TER-TERT связан с двумя другими тройными комплексами (ТеЬ1-ТеЬ2-ТеЬ3, р19-р45-р75) через белок р50. При

этом TEB белки, по аналогии с репликативным белком А (RPA), взаимодействуют с одноцепочечной ДНК теломер, а комплекс p19-p45-p75 выполняет функции CST-комплекса, например, привлечение ДНК-полимеразы а к новосинтезированной цепи теломеры [48].

3.2. Биогенез теломеразной РНК дрожжей

Основными объектами исследования в данной области являются TER дрожжей Saccharomyces cerevisiae - TLC1 и Schizosaccharomyces pombe -TER1. Обе РНК транскрибируются РНК-полимеразой II, причем в обоих случаях в состав активной теломеразы входит неполиаденилированная форма [9, 49].

TLC1 РНК очень похожа своей структурой на малые ядерные РНК: у неё имеется 2,2,7-триметилгуанозиновый (TMG) кэп на 5'-конце и сайт связывания Sm-белков в З'-области. Показано, что в процессе созревания она выходит в цитоплазму, как и мРНК, и мяРНК [50]. Но в отличие от них TLC1 присутствует в клетках одновременно в двух формах: полиаденилированной и неполиаденилированной [9]. Предполагалось, что вначале синтезируется длинный предшественник, который подвергается полиаденилированию по классическому механизму с участием поли-А полимеразы (PAP1), а затем процессируется до неполиаденилированной формы [51]. Однако поздние исследования показали, что возможен и другой путь образования более короткой, неполиаденилированной РНК - по механизму с участием Nrdl комплекса. Этот комплекс, состоящий из белков Nrdlp, Nab3p, Senlp, участвует в терминации транскрипции мя/мяоРНК дрожжей [9]. Впрочем, такой механизм процессинга считается малоэффективным для длинных РНК. И поскольку полиаденилированная форма TLC1 также присутствует в клетках, возможно процессинг осуществляется одновременно по двум механизмам (рис. 6).

Функция полиаденилированной формы теломеразной РНК дрожжей неизвестна. Можно предположить, что поли-А последовательность может обеспечивать дополнительную стабильность транскрипту или необходима для функционирования ТЬС1 в качестве мРНК [50]. Первичная структура ТЬС1 содержит открытую рамку считывания.

Транскрипция РНК-полимеразой II

Л

П.С?

1жЧ

1 |

Терминация по пути мяРНК/мяоРНК Терминация по пути полиаденилирования

]

Предшественник ^^

Укорочение посредством экзосомы

V

Зрелая TLC1 Полиаденилированная TLC1

ф ЯГГРУШЙПЬ ^ 1Р ЫПНЖВЁЭ ИЦ1111

Рисунок 6. Возможные механизмы процессинга 3'-конца РНК [9].

Итак, в случае процессинга по пути №^1-№аЬ3^еп1 происходит

фосфорилирование С-концевого участка РНК-полимеразы II, что необходимо

для взаимодействия белков N^1 и КаЬЗ со специфическими участками,

находящимися в З'-концевой части гена ТЬС1. После связывания с ТЬС1

N^1 и №Ь3 взаимодействуют с хеликазой Sen1. Каким образом происходит

терминация транскрипции, точно неизвестно, но предполагается, что

26

хеликаза расплетает РНК-ДНК дуплекс в активном сайте полимеразы. Далее комплекс TRAMP (Trf4, Air2, Mtr4) добавляет короткую поли-А последовательность на З'-конец получившегося транскрипта, что служит сигналом для процессинга РНК при помощи экзосомы. 3'-5' деградация предшественника TLC1 останавливается, когда экзосома доходит до комплекса Sm-белков (описан ниже) [8, 52, 53]. Привлечению экзосомы к 3'-концу РНК также способствует белок Nrdl [54].

В случае TER1 S.pombe длинная полиаденилированная форма является необходимой стадией созревания. Этот предшественник TER1 содержит интрон, который распознаёт сплайсосома. При этом сплайсинг идёт не до конца: зрелая теломеразная РНК содержит только первый экзон. В интроне же «ЬгапсЬьсайт и З'-сплайс-сайт заметно удалены друг от друга, что снижает эффективность второй стадии сплайсинга и отделения интрона от второго экзона не происходит [55].

Очень важную роль в формировании З'-концевого участка у TER1 и TLC1 играют Sm-белки. В эукариотах семь Sm-белков (SmB, SmD1, 2 and 3, SmE, SmF и SmG) образуют гептамерный комплекс на уридин-богатом специфическом сайте различных малых ядерных РНК. Но они также взаимодействуют и с теломеразными РНК дрожжей. Сайт связывания Sm-белков находится в нескольких нуклеотидах до окончания зрелой формы теломеразной РНК. Эти белки способствуют стабильности РНК, защищая её от деградации, а также служат своеобразной «меткой» 3'-конца зрелой формы [53]. Для TER1 связывание с ними к тому же является сигналом к дополнительному метилированию 5'-концевого «кэпа» с помощью TGS1 и началу сплайсинга [24].

Транскрипция РНК-полимеразой II, терминация по пути Nrd1-Nab3-Sen1 ^

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Василькова Дарья Павловна, 2019 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. de Lange, T., Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev, 2005. 19(18): p. 2100-10.

2. Greider, C.W. and E.H. Blackburn, Telomeres, telomerase and cancer. Sci Am, 1996. 274(2): p. 92-7.

3. Shay, J.W. and S. Bacchetti, A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer, 1997. 33(5): p. 787-91.

4. Yashima, K., et al., Expression of the RNA component of telomerase during human development and differentiation. Cell Growth Differ, 1998. 9(9): p. 805-13.

5. Tseng, C.K., et al., Human Telomerase RNA Processing and Quality Control. Cell Rep, 2015. 13(10): p. 2232-43.

6. Mitchell, J.R., E. Wood, and K. Collins, A telomerase component is defective in the human disease dyskeratosis congenita. Nature, 1999. 402(6761): p. 551-5.

7. Errington, T.M., et al., Disease-associated human telomerase RNA variants show loss of function for telomere synthesis without dominant-negative interference. Mol Cell Biol, 2008. 28(20): p. 6510-20.

8. Jamonnak, N., et al., Yeast Nrdl, Nab3, and Senl transcriptome-wide binding maps suggest multiple roles in post-transcriptional RNA processing. RNA, 2011. 17(11): p. 2011-25.

9. Noel, J.F., et al., Budding yeast telomerase RNA transcription termination is dictated by the Nrd1/Nab3 non-coding RNA termination pathway. Nucleic acids research, 2012. 40(12): p. 5625-36.

10. Weinrich, S.L., et al., Reconstitution of human telomerase with the template RNA component hTR and the catalytic protein subunit hTRT. Nat Genet, 1997. 17(4): p. 498-502.

11. Collins, K., The biogenesis and regulation of telomerase holoenzymes. Nat Rev Mol Cell Biol, 2006. 7(7): p. 484-494.

12. Moyzis, R.K., et al., A highly conserved repetitive DNA sequence, (TTAGGG)n, present at the telomeres of human chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A, 1988. 85(18): p. 6622-6.

13. Greider, C.W. and E.H. Blackburn, Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell, 1985. 43(2 Pt 1): p. 405-13.

14. Verhoeven, J.E., et al., Cellular aging in depression: Permanent imprint or reversible process?: An overview of the current evidence, mechanistic pathways, and targets for interventions. Bioessays, 2014. 36(10): p. 968-78.

15. Egan, E.D. and K. Collins, Biogenesis of telomerase ribonucleoproteins. RNA, 2012. 18(10): p. 1747-59.

16. Collins, K., Ciliate telomerase biochemistry. Annu Rev Biochem, 1999. 68: p. 187-218.

17. Mihalusova, M., J.Y. Wu, and X. Zhuang, Functional importance of telomerase pseudoknot revealed by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(51): p. 20339-44.

18. Stone, M.D., et al., Stepwise protein-mediated RNA folding directs assembly of telomerase ribonucleoprotein. Nature, 2007. 446(7134): p. 458-61.

19. Miller, M.C. and K. Collins, Telomerase recognizes its template by using an adjacent RNA motif Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(10): p. 6585-90.

20. Berman, A.J., et al., The RNA accordion model for template positioning by telomerase RNA during telomeric DNA synthesis. Nat Struct Mol Biol, 2011. 18(12): p. 1371-5.

21. Fisher, T.S., A.K. Taggart, and V.A. Zakian, Cell cycle-dependent regulation of yeast telomerase by Ku. Nat Struct Mol Biol, 2004. 11(12): p. 1198-205.

22. Gallardo, F., et al., TLC1 RNA nucleo-cytoplasmic trafficking links telomerase biogenesis to its recruitment to telomeres. EMBO J, 2008. 27(5): p. 748-57.

23. Lingner, J., et al., Three Ever Shorter Telomere (EST) genes are dispensable for in vitro yeast telomerase activity. Proc Natl Acad Sci US A, 1997. 94(21): p. 11190-5.

24. Tang, W., et al., Telomerase RNA biogenesis involves sequential binding by Sm andLsm complexes. Nature, 2012. 484(7393): p. 260-4.

25. Zappulla, D.C., K. Goodrich, and T.R. Cech, A miniature yeast telomerase RNA functions in vivo and reconstitutes activity in vitro. Nat Struct Mol Biol, 2005. 12(12): p. 1072-7.

26. Zappulla, D.C. and T.R. Cech, Yeast telomerase RNA: a flexible scaffold for protein subunits. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(27): p. 10024-9.

27. Zappulla, D.C. and T.R. Cech, RNA as a flexible scaffold for proteins: yeast telomerase and beyond. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 2006. 71: p. 217-24.

28. Zappulla, D.C., et al., Ku can contribute to telomere lengthening in yeast at multiple positions in the telomerase RNP. RNA, 2011. 17(2): p. 298-311.

29. Lin, J., et al., A universal telomerase RNA core structure includes structured motifs required for binding the telomerase reverse transcriptase protein. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(41): p. 14713-8.

30. Mefford, M.A., Q. Rafiq, and D.C. Zappulla, RNA connectivity requirements between conserved elements in the core of the yeast telomerase RNP. EMBO J, 2013. 32(22): p. 2980-93.

31. Chen, J.L., M.A. Blasco, and C.W. Greider, Secondary structure of vertebrate telomerase RNA. Cell, 2000. 100(5): p. 503-14.

32. Theimer, C.A., C.A. Blois, and J. Feigon, Structure of the human telomerase RNA pseudoknot reveals conserved tertiary interactions essential for function. Mol Cell, 2005. 17(5): p. 671-82.

33. Qiao, F. and T.R. Cech, Triple-helix structure in telomerase RNA contributes to catalysis. Nat Struct Mol Biol, 2008. 15(6): p. 634-40.

34. Theimer, C.A., L.D. Finger, and J. Feigon, YNMG tetraloop formation by a dyskeratosis congenita mutation in human telomerase RNA. RNA, 2003. 9(12): p. 1446-55.

35. Chen, J.L., K.K. Opperman, and C.W. Greider, A critical stem-loop structure in the CR4-CR5 domain of mammalian telomerase RNA. Nucleic acids research, 2002. 30(2): p. 592-7.

36. Mitchell, J.R. and K. Collins, Human telomerase activation requires two independent interactions between telomerase RNA and telomerase reverse transcriptase. Mol Cell, 2000. 6(2): p. 361-71.

37. Nguyen, T.H.D., et al., Cryo-EM structure of substrate-bound human telomerase holoenzyme. Nature, 2018. 557(7704): p. 190-195.

38. Sexton, A.N. and K. Collins, The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation. Molecular and cellular biology, 2011. 31(4): p. 736-43.

39. Lattmann, S., et al., The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme. Nucleic acids research, 2011. 39(21): p. 9390-404.

40. Egan, E.D. and K. Collins, Specificity and stoichiometry of subunit interactions in the human telomerase holoenzyme assembled in vivo. Molecular and cellular biology, 2010. 30(11): p. 2775-86.

41. Mitchell, J.R., J. Cheng, and K. Collins, A box H/ACA small nucleolar RNA-like domain at the human telomerase RNA 3' end. Molecular and cellular biology, 1999. 19(1): p. 567-76.

42. Fu, D. and K. Collins, Distinct biogenesis pathways for human telomerase RNA and H/ACA small nucleolar RNAs. Mol Cell, 2003. 11(5): p. 1361-72.

43. Venteicher, A.S., et al., A human telomerase holoenzyme protein required for Cajal body localization and telomere synthesis. Science, 2009. 323(5914): p. 644-8.

44. Jady, B.E., E. Bertrand, and T. Kiss, Human telomerase RNA and box H/ACA scaRNAs share a common Cajal body-specific localization signal. The Journal of cell biology, 2004. 164(5): p. 647-52.

45. Egan, E.D. and K. Collins, An enhanced H/ACA RNP assembly mechanism for human telomerase RNA. Molecular and cellular biology, 2012. 32(13): p. 2428-39.

46. Ketele, A., T. Kiss, and B.E. Jady, Human intron-encoded AluACA RNAs and telomerase RNA share a common element promoting RNA accumulation. RNA Biol, 2016. 13(12): p. 1274-1285.

47. O'Connor, C.M. and K. Collins, A novel RNA binding domain in tetrahymena telomerase p65 initiates hierarchical assembly of telomerase holoenzyme. Molecular and cellular biology, 2006. 26(6): p. 2029-36.

48. Jiang, J., et al., Structure of Tetrahymena telomerase reveals previously unknown subunits, functions, and interactions. Science, 2015. 350(6260): p. aab4070.

49. Leonardi, J., et al., TER1, the RNA subunit of fission yeast telomerase. Nature structural & molecular biology, 2008. 15(1): p. 26-33.

50. Teixeira, M.T., et al., Intracellular trafficking of yeast telomerase components. EMBO reports, 2002. 3(7): p. 652-9.

51. Chapon, C., T.R. Cech, and A.J. Zaug, Polyadenylation of telomerase RNA in budding yeast. RNA, 1997. 3(11): p. 1337-51.

52. Kuehner, J.N., E.L. Pearson, and C. Moore, Unravelling the means to an end: RNA polymerase II transcription termination. Nature reviews. Molecular cell biology, 2011. 12(5): p. 283-94.

53. Coy, S., et al., The Sm complex is required for the processing of non-coding RNAs by the exosome. PloS one, 2013. 8(6): p. e65606.

54. Vasiljeva, L. and S. Buratowski, Nrdl interacts with the nuclear exosome for 3'processing of RNA polymerase II transcripts. Mol Cell, 2006. 21(2): p. 239-48.

55. Box, J.A., et al., Spliceosomal cleavage generates the 3' end of telomerase RNA. Nature, 2008. 456(7224): p. 910-4.

56. Wu, H., D. Becker, and H. Krebber, Telomerase RNA TLC1 shuttling to the cytoplasm requires mRNA export factors and is important for telomere maintenance. Cell Rep, 2014. 8(6): p. 1630-1638.

57. Kannan, R., et al., Diverse mechanisms for spliceosome-mediated 3' end processing of telomerase RNA. Nat Commun, 2015. 6: p. 6104.

58. Qi, X., et al., Prevalent and distinct spliceosomal 3'-end processing mechanisms for fungal telomerase RNA. Nat Commun, 2015. 6: p. 6105.

59. Kuprys, P.V., et al., Identification of telomerase RNAs from filamentous fungi reveals conservation with vertebrates and yeasts. PLoS One, 2013. 8(3): p. e58661.

60. Gunisova, S., et al., Identification and comparative analysis of telomerase RNAs from Candida species reveal conservation of functional elements. RNA, 2009. 15(4): p. 546-59.

61. Theimer, C.A., et al., Structural and functional characterization of human telomerase RNA processing and cajal body localization signals. Mol Cell, 2007. 27(6): p. 869-81.

62. Dez, C., et al., Stable expression in yeast of the mature form of human telomerase RNA depends on its association with the box H/ACA small nucleolar RNP proteins Cbf5p, Nhp2p and Nop10p. Nucleic acids research, 2001. 29(3): p. 598-603.

63. Goldfarb, K.C. and T.R. Cech, 3' terminal diversity of MRP RNA and other human noncoding RNAs revealed by deep sequencing. BMC molecular biology, 2013. 14: p. 23.

64. Berndt, H., et al., Maturation of mammalian H/ACA box snoRNAs: PAPD5-dependent adenylation and PARN-dependent trimming. RNA, 2012. 18(5): p. 958-72.

65. Nguyen, D., et al., A Polyadenylation-Dependent 3' End Maturation Pathway Is Required for the Synthesis of the Human Telomerase RNA. Cell Rep, 2015. 13(10): p. 2244-57.

66. Shukla, S., et al., Inhibition of telomerase RNA decay rescues telomerase deficiency caused by dyskerin or PARN defects. Nat Struct Mol Biol, 2016. 23(4): p. 286-92.

67. Andersen, P.R., et al., The human cap-binding complex is functionally connected to the nuclear RNA exosome. Nat Struct Mol Biol, 2013. 20(12): p. 1367-76.

68. Lubas, M., et al., The human nuclear exosome targeting complex is loaded onto newly synthesized RNA to direct early ribonucleolysis. Cell Rep, 2015. 10(2): p. 178-92.

69. Moon, D.H., et al., Poly(A)-specific ribonuclease (PARN) mediates 3'-end maturation of the telomerase RNA component. Nat Genet, 2015. 47(12): p. 1482-8.

70. Tseng, C.K., et al., The H/ACA complex disrupts triplex in hTR precursor to permit processing by RRP6 and PARN. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 5430.

71. Roake, C.M., et al., Disruption of Telomerase RNA Maturation Kinetics Precipitates Disease. Mol Cell, 2019. 74(4): p. 688-700 e3.

72. Deng, T., et al., TOE1 acts as a 3' exonuclease for telomerase RNA and regulates telomere maintenance. Nucleic Acids Res, 2019. 47(1): p. 391405.

73. Darzacq, X., et al., Stepwise RNP assembly at the site of H/ACA RNA transcription in human cells. The Journal of cell biology, 2006. 173(2): p. 207-18.

74. Walbott, H., et al., The H/ACA RNP assembly factor SHQ1 functions as an RNA mimic. Genes & development, 2011. 25(22): p. 2398-408.

75. Boulon, S., et al., PHAX and CRM1 are required sequentially to transport U3 snoRNA to nucleoli. Molecular cell, 2004. 16(5): p. 777-87.

76. Tomlinson, R.L., et al., Cell cycle-regulated trafficking of human telomerase to telomeres. Molecular biology of the cell, 2006. 17(2): p. 955-65.

77. Stuart, B.D., et al., Exome sequencing links mutations in PARN and RTEL1 with familial pulmonary fibrosis and telomere shortening. Nat Genet, 2015. 47(5): p. 512-7.

78. Rubtsova, M., et al., Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways. Nucleic Acids Res, 2018. 46(17): p. 8966-8977.

79. Baillat, D., et al., Integrator, a multiprotein mediator of small nuclear RNA processing, associates with the C-terminal repeat of RNA polymerase II. Cell, 2005. 123(2): p. 265-76.

80. Jonkers, I. and J.T. Lis, Getting up to speed with transcription elongation by RNA polymerase II. Nature reviews. Molecular cell biology, 2015. 16(3): p. 167-77.

81. Porrua, O. and D. Libri, Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop. Nature reviews. Molecular cell biology, 2015. 16(3): p. 190-202.

82. Rosonina, E., S. Kaneko, and J.L. Manley, Terminating the transcript: breaking up is hard to do. Genes Dev, 2006. 20(9): p. 1050-6.

83. Luo, W., A.W. Johnson, and D.L. Bentley, The role of Rati in coupling mRNA 3'-end processing to transcription termination: implications for a unifiedallosteric-torpedo model. Genes Dev, 2006. 20(8): p. 954-65.

84. O'Reilly, D., et al., Human snRNA genes use polyadenylation factors to promote efficient transcription termination. Nucleic acids research, 2014. 42(1): p. 264-75.

85. Chen, J., et al., An RNAi screen identifies additional members of the Drosophila Integrator complex and a requirement for cyclin C/Cdk8 in snRNA 3'-end formation. RNA, 2012. 18(12): p. 2148-56.

86. Hernandez, N., Small nuclear RNA genes: a model system to study fundamental mechanisms of transcription. The Journal of biological chemistry, 2001. 276(29): p. 26733-6.

87. Hernandez, N., Formation of the 3' end of U1 snRNA is directed by a conserved sequence located downstream of the coding region. The EMBO journal, 1985. 4(7): p. 1827-37.

88. Hsin, J.P. and J.L. Manley, The RNA polymerase II CTD coordinates transcription and RNA processing. Genes & development, 2012. 26(19): p. 2119-37.

89. Egloff, S., Role of Ser7 phosphorylation of the CTD during transcription of snRNA genes. RNA biology, 2012. 9(8): p. 1033-8.

90. Hsin, J.P., K. Xiang, and J.L. Manley, Function and control of RNA polymerase II C-terminal domain phosphorylation in vertebrate transcription and RNA processing. Molecular and cellular biology, 2014. 34(13): p. 2488-98.

91. Baillat, D. and E.J. Wagner, Integrator: surprisingly diverse functions in gene expression. Trends Biochem Sci, 2015. 40(5): p. 257-64.

92. Albrecht, T.R. and E.J. Wagner, snRNA 3' end formation requires heterodimeric association of integrator subunits. Molecular and cellular biology, 2012. 32(6): p. 1112-23.

93. Chen, J. and E.J. Wagner, snRNA 3' end formation: the dawn of the Integrator complex. Biochemical Society transactions, 2010. 38(4): p. 10827.

94. Zhang, Z., J. Fu, and D.S. Gilmour, CTD-dependent dismantling of the RNA polymerase II elongation complex by the pre-mRNA 3'-end processing factor, Pcf11. Genes Dev, 2005. 19(13): p. 1572-80.

95. Ezzeddine, N., et al., A subset of Drosophila integrator proteins is essential for efficient U7 snRNA and spliceosomal snRNA 3'-end formation. Molecular and cellular biology, 2011. 31(2): p. 328-41.

96. Guiro, J. and S. Murphy, Regulation of expression of human RNA polymerase II-transcribedsnRNA genes. Open Biol, 2017. 7(6).

97. Mayer, A., H.M. Landry, and L.S. Churchman, Pause & go: from the discovery of RNA polymerase pausing to its functional implications. Current opinion in cell biology, 2017. 46: p. 72-80.

98. Rienzo, M. and A. Casamassimi, Integrator complex and transcription regulation: Recent findings and pathophysiology. Biochim Biophys Acta, 2016. 1859(10): p. 1269-80.

99. Gardini, A., et al., Integrator regulates transcriptional initiation and pause release following activation. Molecular cell, 2014. 56(1): p. 128-139.

100. Yamamoto, J., et al., DSIF and NELF interact with Integrator to specify the correct post-transcriptional fate of snRNA genes. Nature communications, 2014. 5: p. 4263.

101. Skaar, J.R., et al., The Integrator complex controls the termination of transcription at diverse classes of gene targets. Cell research, 2015. 25(3): p. 288-305.

102. Huang, J., et al., SOSS complexes participate in the maintenance of genomic stability. Molecular cell, 2009. 35(3): p. 384-93.

103. Zhang, F., J. Wu, and X. Yu, Integrator3, a partner of single-stranded DNA-binding protein 1, participates in the DNA damage response. The Journal of biological chemistry, 2009. 284(44): p. 30408-15.

104. Li, Y., et al., HSSB1 and hSSB2 form similar multiprotein complexes that participate in DNA damage response. The Journal of biological chemistry, 2009. 284(35): p. 23525-31.

105. Zhang, F., T. Ma, and X. Yu, A core hSSB1-INTS complex participates in the DNA damage response. Journal of cell science, 2013. 126(Pt 21): p. 4850-5.

106. Hata, T. and M. Nakayama, Targeted disruption of the murine large nuclear KIAA1440/Ints1 protein causes growth arrest in early blastocyst stage embryos and eventual apoptotic cell death. Biochimica et biophysica acta, 2007. 1773(7): p. 1039-51.

107. Han, S.M., et al., Deleted in cancer 1 (DICE1) is an essential protein controlling the topology of the inner mitochondrial membrane in C. elegans. Development, 2006. 133(18): p. 3597-606.

108. Weber, K., et al., A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther, 2008. 16(4): p. 698706.

109. Gray, S.J., et al., Optimizing promoters for recombinant adeno-associated virus-mediated gene expression in the peripheral and central nervous system using self-complementary vectors. Hum Gene Ther, 2011. 22(9): p. 1143-53.

110. Vandesompele, J., et al., Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol, 2002. 3(7): p. RESEARCH0034.

111. Xi, L. and T.R. Cech, Inventory of telomerase components in human cells reveals multiple subpopulations of hTR and hTERT. Nucleic Acids Res, 2014. 42(13): p. 8565-77.

112. Soboleski, M.R., J. Oaks, and W.P. Halford, Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J, 2005. 19(3): p. 440-2.

113. Prudencio, M., et al., Kinome-wide RNAi screen implicates at least 5 host hepatocyte kinases in Plasmodium sporozoite infection. PLoS Pathog, 2008. 4(11): p. e1000201.

114. Jodoin, J.N., et al., The snRNA-processing complex, Integrator, is required for ciliogenesis and dynein recruitment to the nuclear envelope via distinct mechanisms. Biol Open, 2013. 2(12): p. 1390-6.

115. Ran, F.A., et al., Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols, 2013. 8(11): p. 2281-2308.

116. Cristofari, G., et al., Human telomerase RNA accumulation in Cajal bodies facilitates telomerase recruitment to telomeres and telomere elongation. Mol Cell, 2007. 27(6): p. 882-9.