Клинико-генетическая характеристика пациентов с недифференцированными формами интеллектуальных расстройств и хромосомными микродупликациями тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат наук Беляева Елена Олеговна

• Беляева Елена Олеговна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Беляева Елена Олеговна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Интеллектуальные расстройства

1.2. Причины интеллектуальных расстройств

1.3. Вариации числа копий участков ДНК

1.4. Механизмы возникновения микроструктурных хромосомных аберраций

1.5. Классификация вариаций числа копий участков ДНК

1.6. Гено-фенотипические корреляции при реципрокных микроделециях

и микродупликациях

1.7. Проблема недооценки значимости микродупликаций в реализации

38

патологического фенотипа ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Дизайн исследования

2.2. Характеристика исследуемых групп

2.3 Молекулярно-цитогенетические и молекулярно-генетические

методы исследования

2.3.1. Выделение ДНК фенол-хлоро формным методом

2.3.2. Матричная сравнительная геномная гибридизация

2.3.3. Количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

2.4. Биоинформационные ресурсы

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Вариации числа копий ДНК у пациентов с недифференцированными

формами интеллектуальных расстройств

3.2. Частота и спектр хромосомных микродупликаций в исследуемой выборке

3.3. Происхождение микродупликаций в группе пациентов с недифференцированными формами интеллектуальных расстройств

3.4. Распространённость впервые выявленных хромосомных микродупликаций в контрольной выборке

3.5. Клинические особенности пациентов с хромосомными микродупликациями

3.5.1. Пациенты с известными микродупликационными синдромами

3.5.2. Пациенты с микродупликациями, локализованными в регионах известных микроделеций с доказанным патогенным значением

3.5.3. Пациенты с уникальными микродупликациями, не описанными ранее в литературе

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВД - вероятно доброкачественное значение вариации числа копий участков ДНК

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЗПР - задержка психического развития

ИР - интеллектуальное расстройство

млн.п.н. - миллион пар нуклеотидов

ММС - микроделеционные и микродупликационные синдромы МРТ - магнитно-резонансная томография

НЗ - неизвестное значение вариации числа копий участков ДНК НСГ - нейросонография

ПП - потенциально патогенное значение вариации числа копий участков ДНК

ППЦНС - перинатальное поражение центральной нервной системы

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РАС - расстройство аутистического спектра

СДВГ - синдром дефицита внимания с гиперактивностью

УЗИ - ультразвуковое исследование

УО - умственная отсталость

ЭДТА - этилендаминтетрауксусная кислота

ЭКГ - электрокардиография

ЭхоКГ - эхокардиография

ЭхоЭГ - эхоэнцефалография

ЭЭГ - электроэнцефалография

aCGH (array CGH) - array Comparative Genomic Hybridization - матричная

сравнительная геномная гибридизация на микрочипах

CNV - Copy Number Variation - вариация числа копий участков ДНК

FISH - Fluorescence In Situ Hybridization - флуоресцентная in situ гибридизация

FoSTeS - Fork Stalling and Template Switching - остановка вилки репликации и

переключение матрицы

IQ - Intelligence Quotient - коэффициент интеллекта

MPS - Massive Parallel Sequencing - массовое параллельное секвенирование NAHR - Nonallelic Homologous Recombination - неаллельная гомологичная рекомбинация

NHEJ - Non-homologous End-Joining - негомологичное соединение концов qPCR (qRT-PCR) - quantitative Real-Time PCR - количественная ПЦР в режиме реального времени

SDS - Sodium Dodecyl Sulfate - додецилсульфата натрия SSC - Solution of Sodium Citrate - раствор цитрата натрия

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клинико-генетическая характеристика пациентов с недифференцированными формами интеллектуальных расстройств и хромосомными микродупликациями»

Актуальность темы исследования

Интеллектуальные расстройства (ИР) представляют большой груз для каждой отдельной семьи, где есть больной ребёнок, и общества в целом и являются серьезной проблемой в практической медицине. Частота интеллектуальных нарушений в популяции составляет 2-3% [McKenzie K. et al.,

2016]; 1-3% детей имеют задержку психомоторного развития в сочетании с дисморфиями и врожденными аномалиями [Shaffer L.G., 2005]; 0,7-3% детей страдают аутизмом [Elsabbagh M. et al., 2012; Baxter A.J. et al., 2015; Lyall K. et al.,

2017] и т.д. Известно, что доля детей-инвалидов вследствие психических расстройств и расстройств поведения в России достигает 25% [Федеральная служба статистики, 2018]. Большинство пациентов с заболеваниями данной группы нуждаются в медицинской и социальной поддержке в течение всей жизни. Высокая распространенность и медико-социальная значимость ИР определяют актуальность их научных исследований, в том числе, с точки зрения выявления этиологических факторов, среди которых особая роль отводится генетическим причинам. Своевременное выявление причин развития ИР важно для научно-обоснованной коррекции психологических и поведенческих нарушений. Все эти факты поддерживают постоянный практический и научный интерес к изучению проблемы нарушений интеллектуального развития.

Интеллектуальные расстройства - это обширное понятие, включающее разнородные клинические и патогенетические варианты возникшего в раннем возрасте интеллектуального дефекта. ИР может проявляться как состояние задержанного или неполного умственного развития, которое характеризуется, прежде всего, снижением навыков, возникающих в процессе развития, и навыков, которые определяют общий уровень интеллекта (т.е. познавательных способностей, языка, моторики, социальной дееспособности). Нарушения интеллекта в детском возрасте разделяют на количественные (задержка психического развития, умственная отсталость) и качественные,

обнаруживающиеся при раннем детском аутизме, нарушениях развития речи, заболеваниях органов восприятия и других.

С клинических позиций ИР принято разделять на синдромальные и несиндромальные. При синдромальных формах снижение интеллекта сопровождается аномалиями развития, дисморфическими признаками, неврологическими нарушениями и специфическими поведенческими расстройствами, также могут отмечаться метаболические и эндокринные нарушения. При несиндромальных формах эти признаки не регистрируются и наблюдаются изолированные нарушения когнитивных функций.

ИР c точки зрения причин и механизмов развития изучены не в полной мере, однако их этиологическая гетерогенность очевидна, и в качестве причинных факторов могут выступать как наследственные, так и средовые. По данным некоторых исследователей, от 19 до 45 % случаев интеллектуальной недостаточности обусловлены экзогенными влияниями, а на долю генетических факторов приходится 17-47 % [Moeschler J.B., Shevell M., 2006]. Существуют и другие оценки, согласно которым причину ИР в 30-50% случаев установить не удаётся [Willemsen M.H., Kleefstra T., 2014], т.е. значительный процент приходится на долю неизвестных этиологических компонентов, и, соответственно, недифференцированных форм интеллектуальных расстройств.

В качестве генетических причин ИР могут выступать моногенные мутации, числовые, а также крупные (более 5 млн.п.н.) хромосомные аномалии и субмикроскопические вариации числа копий участков ДНК. Некоторый процент данных патологий может иметь многофакторную природу. Анеуплоидии, крупные делеции и дупликации, несбалансированные хромосомные транслокации встречаются у 30-35 % пациентов с ИР [Willemsen M.H., Kleefstra T., 2014] и, как правило, лежат в основе синдромальных форм. Моногенные мутации выявляются в 5% случаев [González G. et al., 2013] и, в частности, сопряжены с такими заболеваниями, как синдром Нунан, Корнелии де Ланге, Сотоса, Секкеля, туберозным склерозом, фенилкетонурией и другими [Назаренко Л.П., Назаренко М.С., 2009].

Активное выявление в последние годы новых, ранее не описанных генетических причин ИР обусловлено существенными достижениями медико-биологических наук и активным внедрением в научно-исследовательскую работу и практическое здравоохранение высокоразрешающих молекулярно-цитогенетических технологий, таких как матричная сравнительная геномная гибридизация (array CGH) и массовое параллельное секвенирование (MPS). Использование этих технологий позволило установить большой спектр субмикроскопических вариаций числа копий участков ДНК (copy number variation, CNV), которые занимают особое место среди генетических причин развития данной патологии. Под CNV понимается фрагмент ДНК размером более одной тысячи пар нуклеотидов, по числу копий отличающийся от референсного генома [Stankiewicz P., Lupski J.R., 2002; Redon et al., 2006; Feuk L. et al., 2006; Kearney H.M. et al., 2011 a].

Исследованиями последних лет показано, что в среднем 15-25% пациентов с интеллектуальными нарушениями имеют патогенетически значимые изменения числа копий участков ДНК [Iyer J., Girirajan S., 2015]. У пациентов с нарушениями развития и умственной отсталостью идентифицировано более 230 микроделеционных и 80 микродупликационных синдромов, и этот список постоянно пополняется [Кашеварова А.А., Лебедев И.Н., 2016]. В связи с обнаружением полярных изменений копийности генов в одном и том же хромосомном регионе (реципрокные CNV) сформировался новый класс хромосомной патологии - «сестринские геномные болезни» (genomic sister-disorders) [Crespi B. et al., 2009]. На настоящий момент хромосомных регионов, обусловливающих «сестринские геномные болезни», известно около 60 [Кашеварова А.А., Лебедев И.Н., 2016]. Основным механизмом образования реципрокных CNV является неаллельная гомологичная рекомбинация (nonallelic homologous recombination, NAHR), которая в равной степени обусловливает образование как микроделеций, так и микродупликаций. Однако описанных патогенных микродупликаций примерно в три раза меньше, чем микроделеций, в связи с чем возникает вопрос о недооценке их значения в формировании

патологии. Причин гиподиагностики микродупликационных синдромов может быть несколько.

Дупликации принято считать менее патогенными, по сравнению с делециями, возможно, в виду особенностей их клинического проявления, которое является более мягким и вариабельным, в результате чего некоторые признаки могут остаться незамеченными врачом. Гено-фенотипические корреляции при дупликациях неоднозначнее таковых при делециях. И если очевидно, что делеции приводят к гаплонедостаточности, то дупликации в зависимости от точек разрыва гена, могут быть как нейтральными, так и приводить к реализации патологического фенотипа через усиление функции или снижение/потерю функции гена [Newman S. et al., 2015]. Кроме того, известно, что при локализации точкек разрывов в генах могут возникать новые химерные последовательности [Lifton R.P. et al., 1992].

Микродупликации часто наследуются от кого-либо из условно здоровых родителей, поэтому считаются не патогенными и принимаются за случайные находки, не являющиеся причиной заболевания. Однако сами родители могут быть в недостаточной степени обследованы, в результате чего считаются условно здоровыми, имея при этом менее выраженные признаки заболевания. Также ассоциированные с ИР локусы, в том числе и дуплицированные участки хромосом, могут находиться в импринтированном состоянии. В таком случае мутация будет проявляться у ребёнка, если она локализована на активной хромосоме, и не проявляться у родителя, у которого хромосома с мутацией инактивирована.

Таким образом, принимая во внимание перечисленные выше причины недооценки частоты патогенных микродупликаций, а также наиболее распространенный механизм возникновения CNV - неаллельную гомологичную рекомбинацию (NAHR), важное значение имеет поиск реципрокных микродупликаций в регионах хромосом, соответствующих известным микроделеционным синдромам. Подробная клинико-генетическая характеристика пациентов с выявленными патогенными микродупликациями может привести в

дальнейшем к выделению новых синдромов, ассоциированных с интеллектуальными расстройствами.

Степень научной разработанности темы исследования

К настоящему времени вариации числа копий участков ДНК являются объектом интенсивного изучения как в общей популяции, так и среди контингента пациентов с широким рядом патологических состояний. Изучение микроструктурной вариабельности генома в последние десятилетия стало более доступным, благодаря развитию высокоразрешающих молекулярно-цитогенетических технологий и их внедрению в клиническую практику. Многочисленные исследования проведены зарубежными коллегами, считающими необходимостью применение микроматричного анализа в качестве теста первой линии у лиц с врождёнными пороками / дисморфическими особенностями, задержанным и нарушенным развитием [Ahn J.W. et al., 2013; Battaglia A. et al., 2013; Reiff M. et al., 2014; Peters G.B., Pertile M.D., 2014; Ho K.S. et al., 2016а; Ho K.S. et al., 2016; Hollenbeck D. et al., 2017]. Такие методы появляются и в отечественных лабораториях, однако, в силу их высокой стоимости возможности широкогеномного обследования большого количества пациентов остаются ограниченными. Коллективом ФГНБУ «Научного центра психического здоровья» (г. Москва), до недавнего времени возглавляемым доктором биологических наук, профессором Юровым Ю.Б., внесён значительный вклад в развитие такого направления в современной биологической и медицинской науке, как психиатрическая генетика. Сотрудниками лаборатории молекулярной генетики мозга, руководителем которой является доктор биологических наук, профессор кафедры медицинской генетики РМАНПО МЗ РФ Юров И.Ю., совместно с доктором биологических наук, профессором Ворсановой С.Г. (Научно-исследовательский клинический институт педиатрии им. академика Вельтищева Ю.Е., лаборатория молекулярной цитогенетики нервно-психических заболеваний) опубликованы результаты работ по исследованию генетических механизмов нарушений психики, включая умственную отсталость, аутизм, шизофрению, с

помощью высокоразрешающих молекулярно-цитогенетических методов [Юров И.Ю. и др., 2012; Колотий А.Д. и др., 2013; Ворсанова С.Г. и др., 2013; Iourov I.Y. et al., 2015; Куринная О.С., и др., 2018; Юров Ю.Б. и др., 2018].

Особенности микроструктурной организации генома, приводящие к формированию новых классов наследственной патологии, активно изучаются специалистами НИИ медицинской генетики ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН» (г. Томск). Внедрение в диагностическую практику Генетической клиники НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ РАН микроматричного анализа, подходов к интерпретации и верификации его результатов стало возможным, благодаря участию врачей-генетиков и научных сотрудников в международном научно-исследовательском проекте 7 Рамочной программы Европейского союза «Улучшение диагностики умственной отсталости у детей из стран Центральной и Восточной Европы и Центральной Азии через генетическую характеристику, биоинформатику и статистику» (CHERISH, № 223692, 2009-2012 гг) [Лебедев и др., 2013]. Коллективом лаборатории цитогенетики под руководством доктора биологических наук, профессора РАН Лебедева И.Н. опубликован ряд работ, в которых рассматриваются случаи патологии, проявляющиеся нарушениями интеллектуального развития и обусловленные микроструктурными аберрациями хромосом (CNV) [Кашеварова А.А. и др., 2013; Скрябин Н.А. и др., 2014; Кашеварова А.А. и др., 2014; Кашеварова А.А. и др., 2016; Лебедев И.Н., 2017; Kashevarova A.A. et al., 2014; Lebedev I.N. et al., 2016; Kashevarova A.A. et al., 2018]. В частности, описаны синдромы реципрокных хромосомных микроделеций и микродупликаций, число которых на данный момент превысило несколько десятков и продолжает возрастать [Кашеварова А.А. и др., 2014; Кашеварова А.А., Лебедев И.Н., 2016]. Также сотрудниками лаборатории наследственной патологии под руководством доктора медицинских наук, профессора, заслуженного врача Назаренко Л.П. с клинических и генетических позиций активно обсуждаются в литературе аспекты недифференцированных форм

умственной отсталости и задержки развития [Назаренко Л.П., Назаренко М.С., 2009; Назаренко Л.П. и др., 2016; Назаренко Л.П. и др., 2017].

Цель исследования

Провести поиск патогенетически значимых хромосомных микродупликаций у пациентов с недифференцированными формами интеллектуальных расстройств и охарактеризовать их клинические проявления.

Задачи исследования

1. Определить частоту и спектр CNV в группе пациентов с недифференцированными формами интеллектуальных расстройств.

2. Описать спектр хромосомных микродупликаций у пациентов с недифференцированными формами интеллектуальных расстройств.

3. Оценить соотношение возникших de novo и унаследованных частичных трисомий.

4. Оценить распространённость впервые выявленных хромосомных микродупликаций в контрольной выборке.

5. Описать клинические особенности пациентов с микродупликациями, в том числе в сравнении с фенотипами пациентов, имеющих микроделеции в соответствующих хромосомных регионах.

Научная новизна исследования

Впервые установлены гено-фенотипические корреляции при реципрокных хромосомных микроперестройках у пациентов с недифференцированными формами интеллектуальных расстройств. Впервые проведено подробное сравнение клинических особенностей пациентов с микродупликациями и микроделециями в соответствующих хромосомных регионах. Представлены неописанные ранее в научной литературе 7 случаев уникальных потенциально патогенных микродупликаций. Очерчены особенности клинического проявления у пациентов с известными частичными трисомиями и расширены границы их

клинического полиморфизма. Впервые в России оценена распространённость двух впервые выявленных хромосомных микродупликаций в популяционной выборке: для локуса 12q24.12 частота составила 1%, а для региона 5q33.1 микродупликации в группе контроля не выявлены.

Теоретическая и практическая значимость работы

Обследована обширная группа пациентов (445 детей с 1 года до 18 лет) с недифференцированными формами интеллектуальных расстройств с помощью высокоразрешающего метода генетического анализа (aCGH). 137 больным (31%) из исследуемой выборки выставлен молекулярный диагноз. Установлен спектр идентифицированных вариаций числа копий участков ДНК в соответствии с клинической значимостью: патогенные - 5%, неопределённого значения - 20%, сочетания CNV с патогенной и вероятно патогенетической значимостью - 6%, доброкачественные - 31% от общей выборки. Получены новые данные о спектре хромосомных микродупликаций, встречающихся с частотой 14% в исследованной группе индивидов с нарушениями интеллекта. Определена частота патогенных и потенциально патогенных сегментных трисомий, подтвержденных альтернативными методами молекулярно-генетического анализа, составившая 6% в данной группе больных. Установлено происхождение хромосомных микродупликаций: 46% были унаследованы от матери, 27% имели отцовское происхождение, а 27% микродупликаций возникли de novo. Проведена оценка распространённости двух впервые выявленных хромосомных микродупликаций (регионов 5q33.1 и 12q24.12) в популяционной выборке Сибирского региона. Представлено детальное описание клинико-генетических особенностей 18 пациентов - носителей хромосомных микродупликаций с вероятно патогенным значением.

На основании результатов научного исследования разработаны 3 медицинские технологии, которые внедрены в диагностическую практику и предназначены для использования врачами различных специальностей: генетиками, психиатрами, неврологами, педиатрами.

Полученные данные о субмикроскопических цитогенетических нарушениях у пациентов с интеллектуальными расстройствами могут быть использованы в образовательном процессе при подготовке студентов, интернов и клинических ординаторов, аспирантов медицинских вузов и слушателей курсов повышения квалификации по специальности «медицинская генетика».

Методология и методы исследования

Методологической основой научной работы явилось применение современного молекулярно-цитогенетического метода исследования кариотипа в группе пациентов с нарушениями интеллектуального развития: с помощью матричной сравнительной геномной гибридизации на микрочипах (array CGH) у больных был проведён поиск микроструктурных вариаций копийности ДНК. Высокая разрешающая способность использованной технологии позволила обнаружить субмикроскопические хромосомные аберрации, не выявленные при стандартном кариотипировании. Инструментом для интерпретации полученных в ходе микрочиповой диагностики результатов и определения клинической значимости идентифицированных CNV явилась работа с биоинформационными ресурсами (базами данных DGV, OMIM, DECIPHER). С целью подтверждения обнаруженных вариаций числа копий у пациентов и установления их происхождения был использован метод ПЦР в режиме реального времени с подбором праймеров для исследуемых локусов. Для больных, имеющих верифицированные патогенные и вероятно патогенные микродупликации, проведён детальный анализ клинических признаков с привлечением литературных данных.

Положения, выносимые на защиту

1. Среди пациентов с недифференцированными формами интеллектуальных расстройств частота патогенетически значимых вариаций в числе копий хромосомных регионов составляет 31%, в том числе на долю хромосомных микродупликаций приходится 14%.

2. Хромосомные микродупликации, возникающие de novo, имеют более протяжённый размер, по сравнению с унаследованными сегментными трисомиями.

3. Хромосомные микродупликации характеризуются широким спектром клинических проявлений, включая идентичные, уникальные и зеркальные признаки в сравнении с фенотипом пациентов, имеющих микроделеции в соответствующих хромосомных регионах.

Степень достоверности полученных результатов

Достоверность полученных результатов научной работы обеспечивается достаточным объёмом исследуемых выборок (группа больных с недифференцированными формами расстройств интеллектуального развития, включающая 445 пациентов, и контрольная популяционная группа в количестве 190 русских жителей Сибирского региона). Исследование выполнено на высоком методическом уровне с использованием современных высокоразрешающих молекулярно-цитогенетических технологий анализа генома.

Апробация материалов научно-квалификационной работы

Результаты научно-исследовательской работы были представлены в виде устных и стендовых докладов на Международной научной конференции молодых учёных "Актуальные проблемы медицинской генетики" (Томск, 29-30 сентября 2016 г.); на Межрегиональной научно-практической конференции «Современные молекулярно-биологические и генетические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 25-26 апреля 2017 г.); на 50 Ежегодной конференции Европейского общества генетиков человека (Copenhagen, May 27-30, 2017); на Всероссийской конференции с международным участием «Биотехнология - медицине будущего» (Новосибирск, 24-26 июля 2017 г.); на Конференции молодых учёных «День открытых дверей Томского НИМЦ: встреча у кардиологов» (Томск, 28-29 сентября 2017 г.); на XI научной конференции «Генетика человека и патология», посвящённой 35-летию Научно-исследовательского института медицинской

генетики (Томск, 27-30 ноября 2017 г.); на XXV Межрегиональной научно-практической конференции «Современные молекулярно-биологические и генетические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 19-20 апреля 2018 г.); на конгрессе молодых учёных «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической медицины» (Томск, 24-25 мая 2018 г.); на 3 Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии диагностики наследственных заболеваний» (Москва, 26-27 октября 2018 г.); на Международном Конгрессе «VII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 100-летию кафедры генетики СПбГУ, и ассоциированные симпозиумы» (Санкт-Петербург, 18-22 июня 2019 г).

Публикации

По теме выполненного исследования опубликовано 18 научных трудов, в том числе 6 статей в периодических изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации материалов научно-квалификационной работы на соискание учёной степени кандидата наук, из них 1 - в зарубежном журнале «Molecular Cytogenetics», входящем в базы Web of Science и Scopus, 5 статей в журнале «Медицинская генетика», 3 статьи в сборниках трудов научных конференций, методические рекомендации по 3 медицинским технологиям, а также 6 тезисов докладов в материалах отечественных и международных конференций.

Личный вклад автора

Личный вклад автора заключается в изучении отечественной и зарубежной литературы по теме научно-исследовательской работы, участии во всех этапах её выполнения (планировании, проведении молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических исследований, клиническом обследовании пациентов и членов их семей, анализе и обобщении полученных данных, обсуждении

результатов и их публикации), в написании и оформлении диссертационной работы.

Объем и структура диссертации

Научно-исследовательская работа изложена на 229 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 таблицами, 42 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы с изложением результатов собственных исследований с 5 подглавами, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложений. Библиографический указатель включает 289 источников литературы, из них 20 -отечественных и 269 - иностранных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Интеллектуальные расстройства

Интеллектуальные расстройства - это обширное понятие, охватывающее широкий спектр патологических фенотипов и степени тяжести их проявления [Munir K.M. et al., 2015]. Новая терминология, введённая Диагностическим и статистическим руководством Американской психиатрической ассоциации, 5-е издание, относит интеллектуальное расстройство к категории нервных расстройств, характеризующееся дефицитом в интеллектуальном и адаптивном функционировании с точки зрения концептуальных, социальных и практических областей, происходящих в период развития [American Psychiatric Association, 2013]. Кульминацией обширных международных усилий, предпринятых для достижения согласия в отношении нового названия, позиционирования, определения и диагностических принципов умственной неполноценности является концептуализация умственной отсталости как «расстройства интеллектуального развития» [Carulla L.S. et al., 2011; Bertelli M.O. et al., 2014; Bertelli M.O. et al., 2016; Munir K.M., 2016; Salvador-Carulla L. et al., 2017]. Таким образом, понятие «интеллектуальное расстройство» подразумевает разнородные клинические и патогенетические варианты возникшего в раннем возрасте интеллектуального дефекта и включает в себя умственную отсталость и нарушения психологического развития.

ИР оптимально диагностируются в школьные годы с началом периода обучения, однако, стоит учитывать, что патология может проявляться в раннем детстве как задержка развития. Дефиниция «задержка психического развития» (ЗПР) появилась в качестве «функционального» диагноза в тех случаях, когда предполагается компенсация имеющегося интеллектуального несоответствия возрасту в процессе постнатального развития. Если не происходит достижение нижней границы возрастной нормы или несколько выше, то к 13-14 годам выставляется диагноз умственной отсталости [Макаров И.В., 2015].

Помимо количественных нарушений интеллекта, к которым относятся УО и ЗПР, существуют расстройства психологического развития, обусловленные неравномерностью развития психических, психофизиологических, эмоционально-волевых функций. О расстройстве психологического развития речь идет в случаях, когда своеобразие интеллекта препятствует адаптации ребёнка в окружающей среде на уровне бытового самообслуживания, социальных взаимодействий, освоения учебных навыков. В большинстве случаев страдают речь, зрительно-пространственные навыки и двигательная координация, также может проявляться ограниченный, стереотипный, повторяющийся комплекс интересов и действий. Качественные отклонения обнаруживаются при раннем детском аутизме, нарушениях речевого развития, речевых патологиях, заболеваниях органов восприятия и других. Задержки развития функций, тесно связанных с биологическим созреванием центральной нервной системы и проявившиеся во младенчестве или раннем детстве, могут как уменьшаться по мере взросления ребёнка, так и сохраняться в зрелом возрасте. Кроме того, зачастую у одного ребёнка можно встретить сочетание разных типов нарушений интеллектуального развития, то есть умственная отсталость нередко сочетается с аутизмом, а также с другой неврологической патологией, например, эпилепсией.

В зависимости от уровня интеллекта (IQ), социальных навыков и способности адаптироваться в обществе выделяют четыре степени интеллектуальной недостаточности (таблица 1) [American Psychiatric Association, 2000].

Распространённость умеренной и тяжёлой умственной отсталости (IQ менее 50) в популяции составляет 0,3-0,5 %, а при учёте лёгких форм (IQ равен от 50 до 70) она возрастает до 1-3 % [Leonard H., Wen X., 2002; Maulik P.K. et al., 2011; Bellinger D.C. et al., 2016; McKenzie K. et al., 2016]. В Российской Федерации доля детей-инвалидов вследствие нервно-психических расстройств достигает 25% [Федеральная служба статистики, 2018].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Беляева Елена Олеговна, 2019 год

в литературе

В настоящем научном исследовании впервые выявлено 7 неописанных ранее в мировой литературе микродупликаций, обладающих потенциально патогенным значением. К ним относятся микродупликации регионов 3p21.31, 5q33.1, 6p22.2, 7q21.3, 12q24.12, 22q13.32, Xp22.33, выявленные в кариотипах 10 пациентов (№ П85, П88, П89, П90, П97, П98, П99, П71, П105 и П106). Две семьи не были доступны для повторного клинического исследования.

О микродупликации хромосомного сегмента 3p21.31 не зафисикрованы упоминания в доступных биоинформационных ресурсах. Молекулярный кариотип arr[GRCh38] 3p21.31(47240922_47960523)x3 (микродупликация размером 0,72 млн.п.н., унаследована от матери) установлен для пробанда 5 лет (№ П85), страдающего задержкой психо-речевого развития, отсутствием речи, эхолалией и избирательностью в еде. Из фенотипических особенностей отмечены: долихоцефалия, готическое нёбо, гипертелоризм сосков, клинодактилия 5-го пальца, сандалевидная щель, плоскостопие, избыточная масса тела.

У сибсов № П105, П106 выявлены идентичные микродупликации arr[GRCh38] Xp22.33(1636849_2475506)x3, протяжённостью 0,69 млн.п.н., материнского происхождения. Два мальчика 10 и 6 лет страдали задержкой

психомоторного развития, отсутствием речи, отсутствием навыков самообслуживания, нарушением поведения, признаками аутизма. Особенности фенотипа старшего ребёнка: гидроцефалия, антимонголоидный разрез глаз, чёрные густые ресницы, высокое нёбо, вальгусное искривление нижних конечностей. У второго ребёнка отмечались: долихоцефалия, оттопыренные уши, открытые вперёд ноздри, кариес, тремы зубов, готическое нёбо, воронкообразное вдавление грудины, гипермобильность суставов, клинодактилия 5-го пальца, плоско-вальгусные стопы, водянка яичек.

В составе дуплицированного региона содержится 2 гена: DHRSX и ASMT, отвечающий за синтез мелатонина. По данным литературы и последних исследований, аномальный синтез мелатонина зарегистрирован при расстройствах аутистического спектра [Jonsson L. et al., 2014; Talarowska M. et al., 2014]. Мелатонин участвует в поведенческих процессах и познавательных способностях человека. Возможно, нарушения синтеза мелатонина играют роль в развитии клинической картины с проявлением аутистического спектра.

Клинический случай 12: пациент (№ П88) с микродупликацией региона

5д33.1

Семья обратилась за консультацией с жалобами на плохую речь ребёнка (речь односложная, с нарушенным звукопроизношением, фразы короткие), отставание в развитии, трудности в обучении, рассеянное внимание, неусидчивость, резкие перемены настроения (периодические истерики), беспокойный сон.

При составлении родословной удалось уточнить, что у дедушек по материнской и отцовской линиям, у бабушки со стороны матери отмечалась задержка речи (поздно начали говорить).

Ребёнок от первой беременности, протекавшей на фоне анемии. Роды в 38 недель, стремительные. Вес при рождении 3150 г, рост 52 см, оценка по Апгар 8/9 баллов. На первом году жизни наблюдался неврологом с диагнозом: последствия

перинатального поражения центральной нервной системы, гипертензионный синдром, пирамидная недостаточность; ортопедом: деформация черепа и грудной клетки, нейрогенная кривошея. Моторное развитие соответственно возрасту.

Первые признаки заболевания появились в возрасте 1,5 года, когда после судорог с потерей сознания на фоне высокой температуры, у пациента пропала речь. Судороги были однократно, других эпизодов не отмечалось. В 3 года родители отмечали, что ребенок «сам в себе», не реагирует на обращенную речь. Впервые осмотрен психиатром в 4 года, заключение: расстройство психического развития, расстройство развития речи и языка, нарушение активности и внимания (синдром гиперактивности с дефицитом внимания); осмотрен логопедом: системное недоразвитие речи 1 уровня. Регулярно проходит госпитализацию в логопедическом отделении с диагнозом: задержка речевого развития, сочетающаяся с задержкой интеллектуального развития и специфическими расстройствами учебных навыков. Была оформлена инвалидность по основному заболеванию: смешанные специфические расстройства психологического развития; расстройство экспрессивной речи (системное недоразвитие речи 2 уровня); дизартрия, стойкие, умеренно выраженные нарушения психо-речевых функций; и сопутствующему заболеванию: энцефалопатия неуточненная. Получает курсы медикаментозного лечения, реабилитационных мероприятий, проводится коррекционная работа с логопедами и педагогами.

Обучается в общеобразовательной школе, в 5 классе. Успеваемость на «слабую» 3. На фоне проводимой терапии испытывает сложности в обучении: привыкает к определённому распорядку, очень трудно переключается на изменения (истерики - кричит, плачет, требует делать, как ему привычно). Трудно заучивает наизусть, словарный запас ограничен, с техникой чтения не справляется - часто задумывается, «уходит» в свои мысли, медлителен, быстро утомляется, слабо развита мелкая моторика рук, навыки самообслуживания развиты слабо. Психический статус характеризуется недоразвитием интеллектуально -мнестической функции, эмоционально-волевой незрелостью с аффективными нарушениями, системным недоразвитием речи 2 уровня, дизартрией.

На момент текущего осмотра ребёнку 11 лет. Физическое развитие с опережением: рост - 154,5 см (90 процентиль), вес - 54 кг (>97 процентиля). Телосложение гиперстеничное, повышенного питания, ожирение 1 степени. Кожные покровы бледные, на наружных поверхностях плечей множественные мелкие бугорки белого цвета, слегка возвышающиеся над поверхностью кожи, напоминающие кератозис пилярис, подкожно-жировой слой мягкий рыхлый. Из фенотипических особенностей отмечаются макроцефалия (окружность головы 58 см, >97 процентиля), неправильный рост волос, жёсткие густые волосы, деформация черепа (двойная макушка), прямые кустистые брови, густые длинные ресницы, низко посаженные округлые уши, приросшие мясистые мочки ушей, завиток и противозавиток хорошо развиты, широкая переносица, широкий нос, длинный фильтр, тонкая верхняя губа, неправильный рост зубов, микрогнатия, сколиоз, разное положение плеч (левое выше), гипермобильность суставов, гинекомастия, конусовидные пальцы кистей, увеличенные ногтевые валики пальцев кистей, синдактилия П-Ш пальцев обеих стоп (рисунок 31).

Клинические анализы крови и мочи, биохимический анализ крови в пределах нормальных показателей. МРТ - картина без особенностей. На ЭЭГ зарегистрирована выраженная диффузная ирритация коры головного мозга. На ЭХО-ЭГ визуализирована гидроцефалия.

Рисунок 31 - Пациент с микродупликацией региона 5q33.1, 11 лет, собственное наблюдение. Фенотипические особенности: макроцефалия, неправильный рост

волос, жёсткие густые волосы, прямые кустистые брови, густые длинные ресницы, низко посаженные округлые уши, широкая переносица, широкий нос, длинный фильтр, тонкая верхняя губа, неправильный рост зубов, микрогнатия, сколиоз, разное положение плеч (левое выше), гинекомастия; конусовидная форма пальцев кистей, увеличенные ногтевые валики пальцев кистей, синдактилия П-Ш пальцев обеих стоп.

У пациента идентифицирована микродупликация региона 5q33.1 размером 0,11 млн.п.н. ^11-^^38] 5q33Л(149260244_149375244)x3), унаследованная от условно здоровой матери (рисунок 32 А, Б).

А)

Б)

Рисунок 32 - А) Гибридизационный профиль aCGH хромосомы 5. Б) Анализ родительского происхождения микродупликации региона 5q33.1 с помощью qPCR.

В установленной области содержится 5 генов: ABLIM3, AFAP1L1, GRPEL2, PCYOX1L, IL17B. Точки разрыва проходят по генам ABLIM3 и IL17B.

ABLIM является членом семейства актин-связывающих LIM (abLIM) белков. Было продемонстрировано, что белки домена LIM играют ключевую роль в

различных биологических процессах, таких как эмбриональное развитие, детерминация клеточных линий и дифференцировка раковых клеток. ABLIM3 преимущественно экспрессируется в сердце, лёгких, печени, а также в мозге (мозжечке). Кроме того - в печени плода, ЦНС и спинном мозге. Самый высокий уровень экспрессии наблюдается в мышечной и нервной тканях. [Krupp M. et al., 2006]. Показано, что в дополнение к регуляции подвижности клеток, сократимости и цитокинеза, актиновый цитоскелет играет критическую роль в регуляции транскрипции и экспрессии генов [Rando O.J. et al., 2000]. Эти данные свидетельствуют о том, что ABLIM3, как белок домена LIM, может модулировать транскрипцию [Barrientos T. et al., 2007].

AFAP1L1 экспрессируется в определённых структурах головного мозга: на уровне белка локализуется в мозжечке вокруг нейронов Пуркинье и гранулярных клеток гранулированного слоя, вне коры мозжечка - в глиальных клетках, а также внутри зубчатого ядра. AFAP1L1 находится не в телах нейрональных клеток, а в терминальных их частях (аксонов афферентных нейронов или дендритных шипиках эфферентных нейронов). Это позволило предположить, что AFAP1L1 может играть роль в ассоциации белков, включающих передачу сигналов в или от зубчатого ядра [Snyder B.N. et al., 2011]. Известно, что зубчатое ядро участвует в регуляции двигательной координации, отвечая за непроизвольные движения конечностей [Squire L. et al., 2012], а изменения в составе нейронов передачи сигналов в и от зубчатого ядра связаны с заболеваниями с двигательной дисфункцией, такими как болезнь Альцгеймера, расстройства аутистического спектра (у нашего пациента отмечаются аутистические черты) и болезнь Пика. Кроме этого, была определена способность AFAP1L1, взаимодействуя с кортактином, образовывать подосомы (элементы клеточной адгезии, миграции, инвазии), тем самым способствуя распространению раковых клеток при саркомах, раке молочной железы, колоректальном раке [Tie S.R. et al., 2016]. Примечательно, что подосомы участвуют в созревании нервно-мышечного соединения, и подобный механизм может быть вовлечен в нейрон-нейронные взаимодействия [Proszynski T.J. et al., 2009].

Также вызывает интерес однонуклеотидная замена [C/G] в интроне гена AFAP1L1, идентифицированная в результате SNP - генотипирования, в рамках работы по поиску новых генетических локусов, связанных с патофизиологией и биологическими процессами, лежащими в основе развития ожирения у латиноамериканских детей [Comuzzie A.G. et al., 2012].

IL17B участвует в местной воспалительной реакции, высоко экспрессируется в центральной и периферической нервной системе [Moore E.E. et al., 2012], места его локализации (преимущественно в телах нейрональных клеток) предполагают возможность определённых трансляционных процессов. Показано, что IL17B может играть роль в местной воспалительной реакции в центральной нервной системе путем модуляции активности микроглии или других клеток-мишеней. С другой стороны, IL17B может быть частью хорошо налаженной связи между центральной нервной системой и периферическими иммунными и воспалительными событиями. Также рассматривается возможность того, что IL17B играет роль в миелинизации, он экспрессируется на очень высоком уровне в спинном мозге и рассматривается в качестве гена-кандидата для редкой аутосомной формы мото-сенсорной нейропатии Шарко-Мари-Тута, приводящей к периферической демиелинизации различной степени. Кроме того, недавно описано влияние IL17B при аллергических заболеваниях кожи, вероятно, он играл роль в патогенезе дерматита, который проявлялся у пациента. Помимо модуляции локального иммунного ответа, IL17B связывают с различными гранулематозными поражениями кожи. Таким образом, возможна причастность гена к кожным проявлениям у нашего пациента. Предполагается участие IL17B в воспалительных процессах при кератоконусе (истончение роговицы, приводящее к нарушению зрительной функции). Ген экспрессируется в роговице, а в слёзной жидкости наблюдается повышенный уровень кодируемого им интерлейкина. Вклад IL17B в воспалительные и аутоиммунные заболевания был хорошо установлен, другие функциональные роли гена требуют подтверждения в дальнейших исследованиях.

Сообщается, что область 5q33 связана с шизофренией и расстройствами поведения, что говорит о том, что она может содержать локус,

предрасполагающий к тяжёлым психическим заболеваниям [Jasinska A.J. et al., 2009].

В литературе не встречается опубликованных случаев хромосомных аберраций данного региона. В базу данных DECIPHER занесены два пациента, имеющие комбинации микроструктурных перестроек с участием интересующего нас локуса. У пациента с общей задержкой развития (№ 351988) зарегистрировано сочетание расположенных друг за другом двух дупликаций хромосомы 5 (размером 1,51 и 0,86 млн.п.н. соответственно) и делеции хромосомы 10 (0,14 млн.п.н.). Носитель (№ 322253) двух последовательных делеций длинного плеча хромосомы 5 (2 и 2,66 млн.п.н.) продемонстрировал задержку развития и речи, неврологические нарушения, гипермобильность суставов, которые отмечены и у нашего больного, и пероральную экзему.

Клинический случай 13: пациент (№ П89) с микродупликацией региона

6p22.2

Ребёнок от 3 беременности, 3 родов (1 - естественные роды, мальчик, погиб в возрасте 10 лет; 2 беременность закончилась мертворождением плода вследствие внутриутробной инфекции). Беременность протекала на фоне угрозы прерывания, гестоза, гипертонии. Роды в сроке 37 недель путём кесарева сечения. Вес при рождении составил 2700 г, рост 52 см, окружность головы 32 см, оценка по шкале Апгар 5-6 баллов. Выписан из роддома с диагнозом: перинатальное поражение ЦНС, миотонический синдром.

При составлении родословной удалось уточнить, что у дяди по материнской линии отмечалась задержка развития, мальчик начал говорить после 8 лет, не обследован. Отец пробанда состоит во втором браке, дети здоровы. Других особенностей в родословной выяснить не удалось.

Развивался соответственно возрасту, начал сидеть в 6 месяцев, ходить в 13 месяцев, в 1 год произносил отдельные слова, рос спокойным ребенком. После года мать стала отмечать у мальчика ухудшение речи (практически перестал

говорить) и обратилась за консультацией к специалистам и проведением дополнительного обследования. По результатам эхо-энцефалографии зарегистрированы признаки гидроцефалии. На МРТ головного мозга визуализирована картина распространённой (умеренной) минимальной кортикальной нейродистрофии по типу перенесённой системной гипоксии в сочетании с минимальной ликворной гипертензии по открытому типу без выраженной вентрикулодилатации. По данным офтальмологического обследования выявлена ангиопатия сетчатки. Пациент находится под наблюдением невролога с диагнозом: энцефалопатия перинатально обусловленная с рассеянной микро неврологической симптоматикой.

На момент осмотра врачом-генетиком пробанду 6 лет. Пациент не говорит, произносит только слоги, отдельные звуки, проявляет признаки аутизма: отсутствие контакта с окружающими, моторные стереотипии, вокализации, избирательность в еде. Ребёнок замкнут, «сам в себе», чрезмерно любит смотреть телевизор, не просится на горшок. Объективно: рост - 119 см (95 процентиль), вес - 21кг (25 процентиль), окружность головы - 50 см. У пациента отмечены следующие фенотипические особенности: деформация черепа, неправильный рост волос, гипертрихоз, голубые склеры, большие оттопыренные уши, гипертелоризм сосков, гипермобильность суставов.

Проведённое молекулярно-цитогенетическое исследование позволило идентифицировать у пробанда микродупликацию 6p22.2 (arr[GRCh38] 6р22.2(25568793_26284793)х3) размером 0,71 млн.п.н. (рисунок 33). Происхождение данной аберрации установить не удалось, поскольку биологический материал родителей не был доступен для исследования.

Рисунок 33 - Гибридизационный профиль aCGH хромосомы 6.

Данный регион является частью обширной области комплекса гистосовместимости, содержащий большой кластер генов, кодирующих гистоновые белки разных классов (семейств), являющиеся основными ядерными белками, ответственными за структуру нуклеосом при компактизации хроматина [Volz A. et al., 1997].

В области перестройки находятся гены, кодирующие семейство белков SLC17 (А1-А4), опосредующих трансмембранный транспорт широкого спектра субстратов, в частности урата и парааминогидрата, а также лекарственных средств, играя роль в очистке печени и почек от органических анионов. Полиморфизмы в генах SLC17A1 и SLC17A3 были связаны с риском подагры [Kolz M. et al., 2009]. Транспортёры, главным образом, присутствуют в просветной мембране мочевых каналов мочевого пузыря, в то время как другое исследование показало, что SLC17A1 экспрессируется в головном мозге [Inden M. et al., 2016]. Shi J. и коллеги сообщают, что полиморфизмы в области SLC17A1-4 связаны с шизофренией, но их значение неясно [Shi J. et al., 2009].

Ген CARMIL1 считается ключевым регулятором подвижности клеток, участвует в развитии тканей, а также аномальной миграции метастатических раковых клеток [Cooper J.A., Sept D., 2008]. Экспрессия CARMIL1 показана в развивающейся нервной системе, начинающаяся на ранних стадиях эмбрионального развития и достигающая пика интенсивности к 3-кратной стадии, проявляясь в нейронах головных и хвостовых ганглиях и в аксонах, которые образуют нервное кольцо, вентральный и дорсальный нервные шнуры. Хотя экспрессия ослабевает на более поздних стадиях эмбриогенеза, она сохраняется в некоторых нейронах у взрослых. Формирование нервной системы происходит с помощью интеграции движущимися нейронами и аксональными конусами роста положительных и отрицательных сигналов. CARMIL1 идентифицирован как отрицательный регулятор миграции нейронных клеток и аксонов, при этом являющийся промотором миграции клеток глиобластомы.

Ген TPIM38 выполняет важные регуляторные роли в различных врожденных иммунных и воспалительных путях.

Экспрессия гена SCGN начинается во время нейрогенеза при развитии эмбриона и сохраняется в дифференцированных клетках в центральной и периферической нервных и нейроэндокринной системах у взрослого [Alpar A. et al., 2012]. Также экспрессируется в неопластических опухолях мозга и эндокринной системы и модулирует клеточную пролиферацию in vitro. Поскольку SCGN регулирует везикулярный экзоцитоз нейротрансмиттеров, нейропептидов и гормонов, его патологические изменения могут встречаться при нейропсихиатрических и неврологических заболеваниях, включая мигрень, атаксию, болезнь Альцгеймера, инсульт или эпилепсию. Кроме того, появились предположения, что SCGN может быть вовлечен в патогенез расстройств аутистического спектра, обусловленное снижением уровня секретагогина в плазме у детей с аутизмом, однако к настоящему времени недостаточно исследований, проведённых на более крупных выборках. Недавние научные работы показали, что секретагогин участвует в секреции инсулина и кортикотропин-высвобождающего гормона в панкреатических Р-клетках и

гипоталамусе регулирует потребление пищи и поддерживает энергетический гомеостаз [Selvanayagam T. et al., 2018]. В исследовании Selvanayagam T. ген SCGN рассматривается как новый ген-кандидат для ожирения. Коллеги идентифицировали два случая микродупликации региона 6p22.2, охватывающей SCGN: моногенная частичная трисомия у девочки, страдающей идиопатическим ожирением, и дупликация неизвестного происхождения и протяженностью 0,62 млн.п.н. у мальчика. Примечательно, что аберрация у второго пробанда сопоставима с обнаруженной у нашего пациента по размеру, но имеет только три общих гена: SCGN, SLC17A, HIST1H2. Нарушения, отмеченные у данного больного (множественные связанные с ожирением сопутствующие заболевания, включая диабет 2 типа, гипертонию, жировой гепатоз и дислипидемию, астму, обструктивное апноэ во сне) не зарегистрированы у нашего пациента.

HFE играет ключевую роль в регуляции обмена железа в организме. Железо имеет важное значение для ряда клеточных процессов: это необходимый кофактор для ряда ферментов, участвующих в клеточных функциях, таких как производство энергии, синтез и восстановление ДНК, биогенез рибосом, синтез нейротрансмиттеров, синтез миелина, липидный метаболизм и регуляция клеточного цикла. Дефект этого гена приводит к аутосомно-рецессивному расстройству метаболизма железа, наследственному гемохроматозу (OMIM 235200).

При обращении к литературным данным не обнаруживаются документированные случаи хромосомных аберраций данного региона. В базе данных DECIPHER зарегистрированы единичные перестройки короткого плеча хромосомы 6, пересекающиеся с нашей областью: для одной делеции размером 0,11 млн.п.н. (№370593) и двух дупликаций (0,25 млн.п.н. (№305866), 0,48 млн.п.н. (№283242) не указана симптоматика, а для третьей дупликации 0,36 млн.п.н. (№359456) зарегистрированы задержка речи и нарушение социальных взаимодействий, которые наблюдаются и у нашего пациента.

Клинический случай 14: пациент (№ П90) с микродупликацией региона

7q21.3

Данный представляемый случай микродупликации сегмента 7q21.3 также ранее не был описан в литературе. Трисомия верифицирована у мальчика, родившегося в семье здоровых родителей. Особенностей при составлении и анализе родословной выявить не удалось. Из анамнеза известно, что ребенок от 6 беременности, 3 родов. Родился в 40 недель весом 3280 г. Оценка по шкале Апгар составила 8 баллов. Из роддома выписан с диагнозом: пренатальная гипотрофия 2 степени; перинатальное поражение ЦНС смешанного генеза. Моторное развитие ребёнка происходило соответственно возрасту: начал сидеть в 6 месяцев, ходить в 12 месяцев. Речевое развитие с задержкой: первые слова стал произносить в 1 год 6 месяцев. Реккурентными инфекциями не страдал. На момент осмотра врачом-генетиком мальчику 10 лет. Уровень IQ - 68. Рост 140 см, вес 42 кг, окружность головы - 50 см. У пациента проявляются единичные дисморфические признаки, среди которых гидроцефальная форма черепа и короткий фильтр. Также отмечаются ожирение по абдоминальному типу и гипогонадизм. Больной наблюдается у невролога с диагнозом: симптоматическая фокальная эпилепсия; общее недоразвитие речи 2 уровня.

Частичная трисомия arr[GRCh38] 7q21.3(95301752_95433752)x3 протяжённостью 0,13 млн.п.н. (рисунок 34), наследование которой ввиду отсутствия отцовского материала исключено только по материнской линии, затрагивает кластер трех членов семейства генов параоксоназы, расположенных рядом друг с другом: PON1, PON2 и PON3. Параоксаназы являются мощными антиоксидантными и противовоспалительными ферментами, они способны гидролизировать органофосфатные соединения и фактор активации тромбоцитов, препятствовать окислению липопротеинов, ингибировать биосинтез холестерина макрофагов, стимулировать отток холестерина из макрофагов и предотвращать развитие атеросклероза [Costa L.G. et al., 2017]. Значение окислительного стресса хорошо установлено в этиопатогенезе многочисленных расстройств, таких как

рак, сердечно-сосудистая патология, нейродегенеративные заболевания и диабет [Thanan R. et al., 2015].

7

Рисунок 34 - Гибридизационный профиль aCGH хромосомы 7.

Дефицит PON1 предрасполагает к системному окислительному стрессу и повышенному риску сердечно-сосудистых заболеваний, диабета 2 типа и инсульта [Levy D., 2019]. Однако PON1 не пересекает гематоэнцефалический барьер, и предполагается, что параоксоназа либо экспрессируется в мозге, либо вовлечена в пути, которые нарушают целостность нервных клеток.

Что касается нейродегенеративных процессов, исследования показывают взаимосвязь однонуклеотидных полиморфизмов в PON1, PON2 и PON3 с риском развития болезни Альцгеймера, поскольку гены, участвующие в гомеостазе холестерина головного мозга, считаются потенциальными генами-кандидатами для заболевания [Erlich P.M. et al., 2012]. PON2 уникален среди остальных членов, так как он экспрессируется в тканях головного мозга, мРНК PON2 была обнаружена в клетках ЦНС мыши и человека. Причем наблюдаются гендерные

отличия в экспрессии гена: у женского пола уровень выше, чем у мужского [Wirdefeldt K. et al., 2011]. Это может объяснить поло-зависимую дифференциацию различных патологий, включая нейродеструктивные, неврологические и нейродегенеративные заболевания. Например, при более высоких уровнях PON2 в дофаминергических нейронах женщин, болезнью Паркинсона страдают на 90% больше мужчин, также у мужчин повышена восприимчивость к окислительному стрессу в сердце, атеросклерозу и инфекциям [Garrick J.M. et al., 2016].

Недавние исследования наименее охарактеризованного гена PON3 продемонстрировали его потенциальную антиоксидантную и противовоспалительную роль, которую он играет в различных заболеваниях человека: атеросклерозе, метаболическом синдроме, ВИЧ-инфекции, хронических заболеваниях печени и нарушениях врождённого иммунитета. PON3 был связан с иммуно-опосредованными энтеропатиями, такими как синдром раздражённого кишечника и целиакия. Кроме того, наличие у нашего пациента ожирения по абдоминальному типу может быть связано с этим геном, поскольку его роль недавно доказана в развитии данной патологии. Отсутствие экспрессии PON3 у мышей привело к изменениям метаболизма желчных кислот, увеличению массы тела и атеросклеротическим поражениям сосудов [Costa L.G. et al., 2017].

Обратившись к Базе данных хромосомного дисбаланса и фенотипов у человека (DECIPHER) можно обнаружить только один случай микродупликации (№ 315070), более сопоставимый в отношении размера аберрации и генного контента (0,78 млн.п.н., 7 генов, включая PON1, PON2, PON3) с идентифицированным нами случаем. У мальчика также зарегистрирована задержка речевого развития, как и у нашего больного.

Клинические случаи 15,16,17: пациенты с микродупликациями региона

12q24.12

Микродупликация региона 12q24.12 зарегистрирована у 3 обследованных нами неродственных пробандов (№ П97, П98, П99), имеет аналогичные размеры

(0,12, 0,14 и 0,12 млн.п.н.), у 2 пациентов отмечается совпадение координат перестройки (№ П97и П99).

Клинический случай 15 (пациент № П97)

Первый пациент, у которого была обнаружена микродупликация 12q24.12, (агг[аЯСЬ38] Щ24Л2(111746317_111871125)х3) (рисунок 35), унаследованная от здоровой матери, страдал фармакорезистентной эпилепсией и грубой задержкой развития. Мать ребёнка предъявляла жалобы на задержку физического и психического развития (головку не держит, не переворачивается, не сидит), выраженную мышечную слабость, гипервозбудимость, периодически возникающие приступы судорог, плач ребёнка при прикосновении, постоянное слюнотечение, скопление мокроты с невозможностью её самостоятельного отхождения, отказ от пищи, плохой сон.

А)

ACAD10

1,5

0,5

11

I

Б)

Контроль Отец Мать Пробанд Сибс

Рисунок 35 - А) Гибридизационный профиль aCGH хромосомы 12. Б) Анализ родительского происхождения микродупликации региона 12д24.12 с помощью дРСК

2

1

0

Генеалогический анамнез без особенностей, в нескольких поколениях у ближайших родственников нет ни одного случая наблюдения судорожного синдрома. Родословная родителей ребёнка отягощена: первая беременность закончилась замершим плодом на сроке 9-10 недель; вторая беременность -рождением мальчика, в настоящее время мальчику 9 лет, здоров, посещает школу, учится хорошо, из заболеваний: имеет аллергию на сладкое; третья беременность закончилась рождением девочки, умершей в 1 год 2 мес., у которой в 3 мес. диагностирована врождённая катаракта, гипотония, утрата сосательного рефлекса, развёрнутый судорожный синдром, не отвечающий на противосудорожную терапию.

Беременность четвёртая (настоящая) протекала на фоне субклинического гипотиреоза, ожирения 2 степени. Роды в 40 нед. путём операции кесарево сечение. Закричал сразу, вес при рождении 3120 г, рост 52 см. Оценка по шкале Апгар 7/8 баллов. В первые сутки отмечена вялость ребёнка. При выписке выставлен диагноз: перинатальная энцефалопатия. До 3 мес. развивался без особенностей. На грудном вскармливании, хорошо прибавлял в весе.

Первые признаки заболевания появились в возрасте 3 месяцев, когда мать стала замечать у ребёнка задержку развития, двигательную возбудимость, гиперчувствительность при прикосновении, дрожание глаз, скопление слизи, отказ от пищи. В это же время возникли первые тонико-клонические судороги, апноэ, усилилось слюнотечение. Назначена противосудорожная терапия, подключен кортексин, массаж. Дополнительно проведённое исследование выявило врождённую катаракту обоих глаз, атрофию зрительных нервов. По поводу катаракты прооперирован в 4 месяца. Ребёнок неоднократно обследован и регулярно наблюдается специалистами: неврологом, эпилептологом с диагнозом: эпилепсия, фармакорезистентная, с грубой задержкой психомоторного развития; офтальмологом (врождённая оперированная катаракта обоих глаз, двухсторонняя артифакия), гастроэнтерологом (гастроинтестинальная аллергия), педиатром (врождённый стридор).

Данные объективного исследования. Возраст - 2 года, вес - 4900 г, рост -71см. При осмотре общее состояние ребенка тяжёлое, самочувствие страдает за счёт генерализованных тонико-клонических судорог, которые сохраняются ежедневно, несмотря на противосудорожную терапию. Ребёнок лежит на спине, самостоятельно не переворачивается, голову не удерживает, спонтанная двигательная активность минимальна. Мышечная гипотония, гипотрофия II степени. Зрительного и слухового сосредоточения нет. В состоянии бодрствования дыхание шумное, стридорозное. Из фенотипических особенностей: долихоцефалия, нарушение роста волос, высокий лоб, гипертелоризм, монголоидный разрез глаз, эпикант, густые длинные ресницы, широкая плоская переносица, низко посаженные уши, микроретрогения, врожденное пигментное пятно на крестце (рисунок 36).

Рисунок 36 - Пациент № П97 с микродупликацией региона 12q24.12, 2 года, собственное наблюдение. Фенотипические особенности: долихоцефалия, нарушение роста волос, высокий лоб, гипертелоризм, монголоидный разрез глаз, эпикант, густые длинные ресницы, широкая плоская переносица, низко посаженные уши, микроретрогения.

Клинические анализы крови и мочи, биохимические анализы крови были в пределах нормальных показателей. На МРТ головного мозга визуализирована картина нарушения наружной ликвородинамики. На ЭЭГ зарегистрирована эпилептиформная активность в виде единичных острых волн справа в височно-затылочной области. На НСГ признаки лейкомаляции. На ЭхоКГ патологии не обнаружено. УЗИ внутренних органов: печень, поджелудочная железа, селезёнка, почки и щитовидной железы патологических изменений не отмечено.

Клинический случай 16 (пациент № П98)

У пациента верифицирована микродупликация 12q24.12q24.13 (агг[ОКСЬ38] Щ24Л2(111746317_111888992)х3) немного большей протяженностью 0,14 млн.п.н., но также материнского происхождения и также затрагивающей те же самые 3 гена (рисунок 37). Больной страдал задержкой моторного и психического развития, моторными стереотипиями, гидроцефальным синдромом, системным недоразвитием речи и врождённым пороком развития головного мозга (атрофия коры задне-теменных и затылочных отделов) [КавИеуагоуа А. е! а1., 2014].

А)

Рисунок 37

Б)

ACAD10 2

III Контроль Отец Ма II гь Пробанд

А) Гибридизационный профиль aCGH хромосомы 12. Б) Анализ родительского происхождения микродупликации региона 12д24.12 с помощью дРСЯ.

Из фенотипических особенностей были отмечены небольшая асимметрия лица, птоз, расходящееся косоглазие, горизонтальный нистагм, большие, диспластичные ушные раковины, большой нос, открытый рот, клинодактилия V пальца, сколиоз (рисунок 38).

Рисунок 38 - Пациент № П98 с микродупликацией региона 12q24.12, 16 лет, собственное наблюдение. Фенотипические особенности: небольшая асимметрия лица, птоз, расходящееся косоглазие, большие диспластичные ушные раковины, большой нос.

У двух пациентов отмечаются и перекрывающиеся признаки, такие как долихоцефалия, частичная атрофия зрительного нерва. Таким образом, два пациента с идентичной микродупликацией имеют как общие, так и различающиеся клинические признаки.

Клинический случай 17 (пациент № П99)

Родители третьего пациента-носителя микродупликации 12q24.12 предъявляли жалобы на задержку речевого развития у ребёнка, отсутствие потребности в общении, беспокойный сон.

Девочка от 1 беременности, протекающей на фоне дисфункции плаценты, 1 родов, на сроке 39 недель. Оценка по шкале Апгар 8/9 баллов, масса тела при рождении составила 3715 г, длина тела 55 см, окружность головы 36 см. С раннего возраста находится под регулярным наблюдением невролога, в медицинской документации в 2 месяца фигурировал диагноз: последствия перинатального поражения центральной нервной системы гипоксического генеза; в 7 месяцев: последствия ПП ЦНС, поздний восстановительный период, статико-моторная недостаточность на фоне умеренного миатонического синдрома. В 4 года 7 месяцев ребёнку выставлен диагноз: детский аутизм; несформированность всех средств языка; задержка психо-речевого развития; аллергический дерматит. Из анамнеза известно, что мать пробанда страдает атопическим дерматитом. В возрасте 6 лет пациентка была направлена на лечение в неврологическое отделение с диагнозом: резидуально-органическое поражение центральной нервной системы; гипертензионно-гидроцефальный синдром,

субкомпенсированная форма; задержка психо-речевого развития с аутистическими проявлениями; синдром дефицита внимания и гиперактивности; навязчивые поведенческие проявления; энурез; аллергодерматит.

В 6 лет 8 месяцев ребёнок находился на обследовании и стационарном лечении в генетической клинике НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ, в которой пробанду была проведена молекулярно-цитогенетическая диагностика, установившая наличие частичной трисомии 12q24.12q24.13 (агг[ОЯСИ38] 12q24.12(111746317_111871125)^3) размером 0,12 млн.п.н., наследование которой исключено по отцовской линии, биологический материал матери не доступен (рисунок 39).

Осмотр пациента был затруднён в виду её расторможенности, отсутствия зрительного и разговорного контакта, отсутствия реакции на обращённую речь. Активная игровая деятельность у девочки отсутствует, снижена концентрация внимания. Речь в форме отдельных звуковых комплексов. Предметы не называет. Наблюдается моторная неловкость, нарушение походки (ходит на носочках), склонность к стереотипным действиям. Объективно: рост 116 см, вес 20,4 кг,

окружность головы 50 см. Физическое развитие гармоничное, пропорциональное, конституция нормостеническая. Волосы светлые тонкие длинные. Лицо без грубых дисморфических признаков, из особенностей - тонкие губы, высокое нёбо. Грубая задержка речевого, умственного развития.

А)

ACAD10

1,5

0,5

Б)

Контроль

Отец

Пробанд

Рисунок 39 - А) Гибридизационный профиль aCGH хромосомы 12. Б) Анализ родительского происхождения микродупликации региона 12д24.12 с помощью дРСЯ.

1

0

Дуплицированный регион 12q24.12 содержит только три гена: ACAD10, который экспрессируется в головном мозге плода, задействован в метаболизме жирных кислот [He M. et al., 2011; Cheng B. et al., 2019], уникальных для развития мозга, MAPKAPK5, участвующий в процессах нейрогенеза [Gerits N. et al., 2007; Park B. et al., 2012], и ALDH2, мутации в котором ассоциированы с процессами нейродегенерации [Ohta S. et al., 2004; D'Souza Y. et al., 2015]. Точки разрыва проходят по гену ACAD10 и приводят к образованию химерного белка MAPKAPK5-ACAD10, которому, возможно, и принадлежит ведущая роль в формировании патологического фенотипа.

Микродупликация 12q24.12 вызывает дискуссию среди исследователей, поскольку мнения о её патогенетической значимости разнятся с диаметральной

противоположностью. Малая протяжённость абберации, частое родительское наследование, присутствие у условно здоровых индивидов говорят в пользу нейтральности частичной трисомии. Кроме того, в исследовании Holt R. [Holt R. et al., 2012] ставится под сомнение распространённый механизм восприимчивости к расстройствам аутистического спектра, заключающийся в образовании химерного гена посредством слияния двух других при дупликации хромосомного сегмента. Поскольку микродупликация 12q24.12, в результате которой возникает гибридный транскрипт MAPKAPK5-ACAD10, регистрируется как у пациентов, страдающих РАС, так и у здоровых индивидов.

Учитывая вышеизложенные обстоятельства для исключения доброкачественного характера идентифицированной аберрации впервые в России нами был осуществлён поиск данной CNV в контрольной выборке сибирской популяции. Проведённый с использованием ПЦР в реальном времени анализ показал, что микродупликация региона 12q24.12 встречается в группе условно здоровых индивидов с частотой 1% (у 2 человек из 190), что не позволяет исключить возможный популяционный полиморфизм по числу копий участков ДНК локуса 12q24.12.

Однако для более точной оценки роли изменений копийности региона 12q24.12 в реализации патологического фенотипа необходимо привлечение большего объёма данных. Так, информация о важных функциях затронутых генов, ассоциированных с неврологическими процессами, клиническая картина и сходные фенотипические признаки у пациентов, в частности, задержка и нарушения интеллектуального развития, должны рассматриваться в будущих исследованиях дисбаланса генома. Таким образом, 3 продемонстрированных случая подчёркивают клиническую роль неописанной ранее уникальной микродупликации субсегмента 12q24.12 для пациентов с задержкой психомоторного и речевого развития.

Клинический случай 18: пациент (№ П71) с комбинацией разных типов CNV: микродупликации 22д13.32 и микроделеций 3д13.31 и 22q13.32q13.33

Девочка впервые проконсультирована генетиком в 1 год 8 месяцев. Мать ребёнка предъявляет жалобы на задержку физического и психического развития (самостоятельно не ходит, голова не увеличивается в объёме, из речевых проявлений только гуление), гипервозбудимость, резкие перемены настроения, нарушение режима сна.

При составлении родословной удалось уточнить, что у племянника отца отмечается задержка интеллектуального развития, мальчик находится на домашнем обучении, не обследован. Других особенностей в родословной выяснить не удалось.

Беременность первая (настоящая) протекала на фоне невроза и угрозы прерывания. Роды в 34 нед. путём операции кесарева сечения. Вес при рождении 1422 г (<3 процентиля), рост 48 см (25 процентиль). В первые 2 месяца отмечались судороги, назначена противосудорожная терапия, в 3 месяца препараты были отменены, так как судороги прекратились. Выписана в 3 месяца с диагнозом: последствия перинатального поражения центральной нервной системы. На искусственном вскармливании, плохо прибавляла в весе. До 6 месяцев развивалась соответственно возрасту.

Первые признаки заболевания появились в возрасте 7-8 месяцев, когда мать стала замечать у ребёнка задержку развития - девочка не начала садиться. В 10-11 месяцев, когда ребёнок не начал ползать, неврологом был выставлен диагноз ДЦП, спастическая диплегия, акцент справа в ногах. После проведённых реабилитационных мероприятий (ЛФК, массаж) самостоятельно пошла в 2 года. Ребёнок регулярно наблюдается неврологом с диагнозом детский церебральный паралич (атонически-астатическая форма, задержка психомоторного развития, задержка речевого развития); психиатром (психические расстройства, обусловленные резидуально-органическим заболеванием головного мозга сложного генеза со снижением интеллекта до уровня дефекта (в степени

выраженной дебильности), синдром психомоторной расторможенности, несформированные функции контроля за физиологическими отправлениями.

На момент текущего осмотра ребёнку 4 года. Вес - 14,5 кг (25 процентиль), рост - 108 см (95 процентиль). Телосложение астеничное, узкое туловище. Из фенотипических особенностей отмечаются: микроцефалия (окружность головы 45,5 см, <2 процентиля), выступающие лобные бугры, скошенный затылок, прямые брови, монголоидный разрез глаз, эпикант, телекант, широкая, запавшая переносица, мясистый кончик носа, сглаженный фильтр, тонкая верхняя губа, короткая шея, широкое пупочное кольцо, брахидактилия I и V пальцев кистей рук и всех пальцев ног, утолщенная дистальная фаланга больших пальцев кистей и стоп, плоско-вальгусная стопа, крестцовокопчиковая ямка (рисунок 40). Обследование затруднено из-за беспокойства и выраженной активности девочки.

Рисунок 40 - Пациент № П71с комбинацией разных типов CNV: микроделеции 3д13.31 и 22q13.32q13.33 и микродупликации 22q13.32, собственное наблюдение. Фенотипические особенности: выступающие лобные бугры, скошенный затылок, прямые брови, монголоидный разрез глаз, эпикант, телекант, широкая, запавшая переносица, мясистый кончик носа, сглаженный фильтр, тонкая верхняя губа, короткая шея.

При проведении нейросоноскопии выявлена незначительная вентрикуломегалия. На МРТ головного мозга визуализирована картина варианта Денди-Уолкера. На ЭЭГ зарегистрировано общее замедление корковой ритмики; задержка формирования биоэлектрической активности мозга. На ЭхоКГ обнаружены малые аномалии сердца: открытое овальное окно с минимальным лево-правым сбросом; расширенный коронарный синус; диагональная ложная хорда левого желудочка.

В результате стандартного цитогенетического исследования, проведенного в цитогенетической лаборатории медико-генетической консультации г. Барнаула, у пациентки была выявлена кольцевая хромосома 22 (кариотип 46,XX,r(22)). Известно, что кольцо возникает в результате делеции терминальных участков хромосомы, однако стандартный метафазный анализ не даёт четкого представления о размере делетированного участка, особенно в случае такой небольшой хромосомы, как 22. Для уточнения диагноза пациентка была направлена в НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ РАН, где был проведён aCGH-анализ, и идентифицирована микроделеция 22q13.32, закономерная при образовании кольцевой хромосомы 22, наличие которой было подтверждено с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с зондами на центромеру хромосомы 22 и на ген TBC1D22A, локализованный вблизи микроделеции. Микроделеция (arr[GRCh38] 22q13.32q13.33

(48719772_50739836)х1) (рисунок 41 Б), протяжённостью 2,02 млн.п.н., возникшая de novo, затрагивает критический регион синдрома Фелана-МакДермида (OMIM 606232). Клиническим признакам данного синдрома у пробанда соответствовали такие симптомы как задержка психомоторного и речевого развития, признаки аутизма, агрессия, высокий рост, микроцефалия, выраженные лобные бугры, эпикант, аномалии ушной раковины, мясистый кончик носа, крестцовокопчиковая ямка, аномалии развития ЦНС, судороги, нарушение сна, пороки сердца (Приложение 4) [Kolevzon A. et al., 2014; Luciani J.J. et al., 2003].

Остальные признаки, наблюдаемые у пациента, не укладывались в клиническую картину данного синдрома. Возможным объяснением является наличие в кариотипе дополнительной унаследованной от матери микроделеции 3q13.31 (arr[GRCh38] 3q13.31(116514317_116896653)x1 (рисунок 41 А), размером 0,38 млн.п.н., затрагивающей регион синдрома микроделеции 3q13.31 (OMIM 615433). У девочки отмечены такие признаки, характерные для данного синдрома, как: задержка психомоторного развития и речи, признаки аутизма, синдром дефицита внимания и гиперактивности, выраженные лобные бугры, эпикант, аномалии ушной раковины, короткий, сглаженный фильтр, тонкая верхняя губа, вентрикуломегалия (Приложение 4) [Vuillaume M.L. et al., 2013; Molin A.M. et al., 2012]. Как видно, некоторые из отмеченных симптомов оказались общими для двух синдромов.

А)

Б)

Рисунок 41 - Гибридизационные профили aCGH хромосом 3 (А) и 22 (Б).

Кроме того, в кариотипе девочки идентифицирована третья микроструктурная перестройка: arr[GRCh38] 22q13.32(48491000_48663203)x3 (рисунок 41 Б). Микродупликация имела размер 0,18 млн.п.н. и произошла de

novo. Содержащийся в области дупликации 22q13.32 единственный ген FAM19A5 оказался разорван таким образом, что первые два экзона дуплицированы, а четвертый удален (рисунок 42 А, Б).

2 1,5 1

0,5 0

FAM19A5ex4

А)

Контроль Отец Мать Пробанд

Б)

Рисунок 42 - А) Подтверждение делеции гена ЕАМ19А (экзон 4) с помощью дРСЯ. Б) Подтверждение дупликации гена ЕАМ19А (экзон 2) с помощью qPCR.

В литературе встречаются две недавно опубликованных статьи относительно гена, структура которого нарушена точками разрыва. Первая статья демонстрирует, что ген является важнейшим кандидатом для модуляции образования остеокластов и костных расстройств [Park M.Y. et al., 2017], т.е. можно предположить, что скелетные аномалии обусловлены дефицитом белка FAM19A5. Кроме того, обе статьи показывают, что FAM19A5 высоко экспрессируется в жировой ткани и секретируется адипоцитами [Wang Y. et al., 2018]. Следовательно, его дефицит может быть связан с малым весом и астеническим телосложением пробанда. Кроме того, FAM19A5 также экспрессируется в мозге и действует как модулятор иммунного ответа в нервных клетках [Tang Y.T. et al., 2004].

В то же время, такие аномалии как прямые брови, монголоидный разрез глаз, телекант, широкая, запавшая переносица, широкое пупочное кольцо, ранее не были описаны ни при одном из синдромов. Формирование этих признаков может быть обусловлено клиническим полиморфизмом заболеваний, вариабельностью генного состава в областях аберраций у разных пациентов, а также сочетанным эффектом зарегистрированных микроделеций.

Таким образом, в описанном наблюдении комбинации нескольких CNV у одного пациента для каждой хромосомной микроперестройки приведена генетическая и клиническая характеристика. Также отмечены признаки, не укладывающиеся в установленные гено-фенотипические корреляции, что указывает на другие возможные механизмы формирования клинического полиморфизма и реализации патологического фенотипа при сочетаниях у носителя разных типов CNV.

В заключение стоит отметить, что зачастую оценка патогенетической значимости выявляемых СМУ остаётся сложной задачей, поскольку большая их часть является редкими и представлена единичными наблюдениями. Широкий класс СМУ с неопределённым клиническим значением требует дальнейшего изучения на крупных выборках больных для идентификации общих субмикроскопических перестроек, характеристика клинических симптомов которых необходима для улучшения диагностики и ведения пациентов. Именно такой вклад вносит данное научное исследование, в котором впервые в России обследована обширная группа пациентов Сибирского региона (445 детей) с недифференцированными формами интеллектуальных расстройств. В ходе научно-практической работы продемонстрированы и детально рассмотрены 18 клинических случаев пациентов - носителей хромосомных микродупликаций, осуществлено установление связи генетических наблюдений и соответствующей клинической информации в структурированном виде. Неописанные ранее в мировой литературе 7 уникальных случаев могут помочь в более точной интерпретации при выявлении субмикроскопических перестроек, клиническая значимость которых до настоящего времени не ясна. В работе приведены данные о микродупликациях 8 регионов, попадающих в области известных делеций с доказанной патогенетической значимостью, подробная клинико-генетическая характеристика которых, доступная для более широкой аудитории, может привести в дальнейшем к описанию новых синдромов, ассоциированных с интеллектуальными расстройствами, обеспечив новое понимание геномной архитектуры, лежащей в основе этих заболеваний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интеллектуальные расстройства являются одной из самых распространённых причин инвалидности в мире. Встречаясь у 1-3% населения, они представляют социально-значимую проблему. Эти нарушения могут возникать как вследствие неблагоприятных экзогенных влияний, так и обусловливаться генетическими факторами, которые, к сожалению, нередко остаются недифференцированными. Исследования генетической компоненты становятся более доступными в связи с развитием геномных технологий, внедрение в клиническую практику которых привело к появлению новых синдромов, связанных с микроструктурными хромосомными аберрациями (синдромы микроделеций и микродупликаций). Микроделеции и микродупликации - это вариации числа копий участков ДНК, имеющие размер до 5 млн.п.н. и не выявляемые при стандартном цитогенетическом исследовании (кариотипировании). Несмотря на то, что для многих хромосомных микроперестроек показана связь с известными синдромами, большая их часть является редкими и представлены единичными наблюдениями. В настоящее время вариации числа копий участков ДНК рассматриваются как одна из ведущих причин нарушений интеллектуального развития. Однако у пациентов с данной патологией описано более 230 микроделеционных, но только порядка 80 микродупликационных синдромов. Обращает на себя внимание тот факт, что патогенных микродупликаций примерно в три раза меньше, чем микроделеций, в связи с чем возникает вопрос о недооценке их значения в формировании патологических состояний.

Полученные в диссертационном исследовании данные основаны на результатах современного высокоразрешающего метода молекулярно-цитогенетического анализа, проведенного в обширной группе больных с недифференцированными формами ИР и/или врождёнными аномалиями. Установленная структура вариаций числа копий ДНК (СКУ), ассоциированных с расстройствами интеллектуального развития, указывает на то, что значимое место

в ней занимают хромосомные микродупликации. В отличие от микроделеций, вклад микродупликаций в наследственную и врождённую патологию человека до сих пор остается недооценённым в научной литературе, вероятно, в связи с более мягкими и вариабельными фенотипическими проявлениями, частым наследованием от условно здоровых родителей, что не позволяет однозначно интерпретировать их как патогенные.

В настоящей научно-исследовательской работе установлено, что хромосомные микродупликации встречаются в выборке пациентов с недифференцированными формами ИР (445 больных) с частотой 14 % (у 60 пациентов): в 1 % случаев зарегистрированы микродупликации, локализующиеся в регионах известных микродупликационных синдромов (3 пациента), в 13 % -микродупликации, относящиеся к классу СМУ с неопределённым клиническим значением (57 пациентов). В то время как среди идентифицированных микроделеций на долю патогенных приходится 4 % (у 19 детей), и 7 % от общей выборки составляют 33 микроделеции неясной клинической значимости.

Актуальный вопрос интерпретации широкого класса хромосомных микродупликаций неопределённого значения решается в настоящем исследовании на основе генетической характеристики пациентов-носителей частичных трисомий, базированной на анализах размера, наследования, количества и функций затронутых генов, и сопоставления её с клиническими особенностями у пациентов, страдающих недифференцированными формами нарушений интеллектуального развития.

Так, показано, что размер частичных трисомий, обнаруженных у пациентов, варьировал от 0,08 млн.п.н. до 7,8 млн.п.н. Анализ распределения 26 микродупликаций по размеру зафиксировал преобладание микроаберраций протяжённостью до 1 млн.п.н. (19 микродупликаций, что составляет 73% от их общего числа). Однако продемонстрировано, что размер перестройки не всегда имеет значение в проявлении клинической картины заболевания.

Детальное внимание уделено анализу генного состава хромосомных перестроек. В областях потенциально значимых микродупликаций находятся

гены, увеличение копий которых может иметь отношение к патогенезу интеллектуальных нарушений и других клинических признаков, наблюдаемых у больных. Анализ функционального обогащения затронутых генов с помощью ресурса WebGestalt показал, что чаще встречаются гены, имеющие отношение к таким патологическим состояниям, как: экстрапирамидальные расстройства и нарушения двигательных функций; миоклонические судороги; ангиодисплазии; дивертикулёз; расстройства минерального метаболизма, в частности, железа.

Установлено происхождение вероятно патогенных частичных трисомий: в 6 случаях они возникли de novo (27%), а в 16 случаях (73%) были унаследованы от фенотипически здоровых родителей: 46% микродупликаций имели материнское происхождение (10 CNV), 27% - отцовское (6 CNV). При этом нами показано, что хромосомные микродупликации размером до 1,5 млн.п.н. статистически значимо чаще являются унаследованными, по сравнению с хромосомными перестройками большей протяжённости (p = 0,03). Обосновано предположение, что наследуемые делеции и дупликации могут иметь неполную пенетрантность, вариабельную экспрессивность или затрагивать импринтированные локусы, ассоциированные с интеллектуальными нарушениями.

В случаях впервые выявленных микродупликаций двух регионов (5q33.1 и 12q24.12) для исключения доброкачественного характера проведена оценка распространённости вариаций в выборке условно здоровых индивидов. Отсутствие CNV в локусе 5q33.1 является свидетельством в пользу вероятной патогенетической значимости микродупликации. В то же время, обнаружение микроперестроек в сегменте 12q24.12 с частотой 2% не позволяет исключить возможный популяционный полиморфизм по числу копий участков ДНК и говорит о необходимости дальнейших исследований данной области и установления гено-фенотипических корреляций.

Основным и самым объемным решением задачи явилась клиническая характеристика пациентов с недифференцированными ИР и хромосомными микродупликациями, в ходе которой удалось установить гено-фенотипические корреляции, в том числе общие (идентичные), зеркальные и уникальные

фенотипы при реципрокных хромосомных микроперестройках. Очерчены особенности клинического проявления у пациентов с известными частичными трисомиями и расширены границы их клинического полиморфизма. Кроме того, в работе приведены данные о микродупликациях, попадающих в области известных делеций с доказанной патогенетической значимостью, подробная клинико-генетическая характеристика которых, доступная для более широкой аудитории, может привести в дальнейшем к описанию новых синдромов, ассоциированных с интеллектуальными расстройствами. Наконец, описан и детально охарактеризован ряд новых для мировой практики хромосомных микродупликаций, которые могут помочь для их более точной клинической интерпретации.

Таким образом, настоящая научная работа, посвещенная описанию наиболее неоднозначному и малоизученному типу изменений копийности участков ДНК - хромосомным микродупликациям, вносит весомый вклад в расширение знаний и устоявшихся представлений в понимании геномной архитектуры, лежащей в основе широко распространённой и социально значимой проблемы нарушений интеллектуального развития. Представленные результаты отражают и практическую важность молекулярно-цитогенетической диагностики и идентификации причины заболевания, которые обеспечивают качественное медико-генетическое консультирование семей и эффективную помощь больным детям.

ВЫВОДЫ

1. У 62% пациентов с недифференцированными формами интеллектуальных расстройств зарегистрированы вариации числа копий участков ДНК, в том числе носителями полиморфных вариантов явились 31%; патогенных - 5%; потенциально патогенных - 20%; сочетаний разных типов CNV (с патогенной и вероятно патогенетической значимостью) 6% индивидов.

2. У 14% пациентов с недифференцированными формами интеллектуальных расстройств выявлены клинически значимые хромосомные микродупликации, локализованные в регионах: 1p34.1, 1p36.32, 1 q21.1, 1q25.1q25.2, 1 q31.1, 2p12p11.2, 2p25.3, 2p25.3p25.2, 2q12.2q12.3, 2q21.1, 2q23.1, 3p21.31, 3p26.3, 3q12.2, 4q21.21q21.22, 4q31.21, 4q31.23, 5q13.3, 5q33.1, 6p22.2, 7q21.3, 7q34, 7q36.3, 8q11.1q11.21, 8q24.12, 9p24.2, 10p13, 10q11.22, 10q26.3, 11q25, 12p13.31, 12q24.12, 13q13.1, 13q31.3, 14q11.2, 14q31.1, 14q31.2q31.3, 15q22.2, 16p11.2, 16q21, 16q23.1, 20q13.12, Xp11.4, Xp11.22, Xp22.31, Xp22.33, Xq13.1, Xq13.3q21.1

3. Большая часть хромосомных микродупликаций наследуется от условно здоровых родителей: 46% микродупликаций локализованы на хромосомах материнского происхождения, а 27% унаследованы от отца. На долю de novo возникших микродупликаций приходится 27% верифицированных хромосомных вариантов.

4. Хромосомные микродупликации, имеющие размер до 1,5 млн.п.н., статистически значимо чаще являются унаследованными, по сравнению с хромосомными перестройками большей протяжённости (p = 0,03).

5. Впервые описанные уникальные микродупликации, имеющие потенциально патогенное значение, затрагивают хромосомные локусы: 3p21.31, 5q33.1, 6p22.2, 7q21.3, 12q24.12, 22q13.32, Xp22.33. Для региона 12q24.12 показаны изменения копийности хромосомного сегмента с частотой 2% в популяционной выборке, а для региона 5q33.1 изменений в числе копий не зарегистрировано.

6. Клинические особенности пациентов, являющихся носителями патогенетически значимых хромосомных микродупликаций, характеризуются

широким спектром клинических проявлений, включая идентичные, уникальные и зеркальные признаки, по сравнению с фенотипом пациентов, имеющих микроделеции в соответствующих хромосомных регионах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Одним из ключевых результатов исследовательской работы является установление того факта, что хромосомные микродупликации практически равновероятно могут возникать de novo, либо быть унаследованы от клинически здоровых родителей, бессимптомных носителей той же самой хромосомной аберрации. В связи с этим, особую значимость приобретают разработанные новые медицинские технологии диагностики хромосомных микродупликаций. Эти технологии внедрены в диагностическую практику Медико-генетического центра (Генетической клиники) НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ:

1. Акт внедрения в диагностический процесс разработанной медицинской технологии: «Разработка комплексного обследования и лечения детей с несиндромальными аутистическими расстройствами», авторы разработки: Назаренко Л.П., Лебедев И.Н., Беляева Е.О., Скрябин Н.А., Кашеварова А.А. Акт №3 №045-2016 от 10 октября 2016 г., г. Томск.

2. Акт внедрения в диагностический процесс разработанной медицинской технологии: «Алгоритм молекулярно-цитогенетической диагностики микроструктурных хромосомных аберраций в регионе 18p11.31-p11.32 у детей с недифференцированными формами умственной отсталости», авторы разработки: Кашеварова А.А., Скрябин Н.А., Лопаткина М.Е., Беляева Е.О., Назаренко Л.П., Лебедев И.Н. Акт №4 №276/1-п 23 от 23 октября 2017 г., г. Томск.

3. Акт внедрения в диагностический процесс разработанной медицинской технологии: «Молекулярно-цитогенетическая диагностика хромосомных мутаций в регионе 12q24 у пациентов с недифференцированной умственной отсталостью и эпилепсией», авторы разработки: Кашеварова А.А., Скрябин Н.А., Лопаткина М.Е., Беляева Е.О., Назаренко Л.П., Лебедев И.Н. Акт №2 №276/1-п от 23 октября 2017 г., г. Томск.

Методические рекомендации по новой медицинской технологии «Разработка комплексного обследования и лечения детей с несиндромальными аутистическими расстройствами»

Настоящая медицинская технология разработана для возможности выявления генетических причин аутистического спектра, что позволит в дальнейшем проводить анализ наиболее частых хромосомных микроделеций и микродупликаций у пациентов с аутизмом.

Основу предлагаемой новой медицинской технологии составляет количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени с набором олигонуклеотидных праймеров на регионы наиболее частых реципрокных микроделеционных / микродупликационных синдромов, позволяющая улучшить эффективность выявления микроструктурных хромосомных аберраций в сравнении с традиционно используемыми для этих целей таргетными FISH и MLPA методами. Технология предназначена для экспресс-анализа наиболее частых хромосомных микроделеций и микродупликаций у пациентов с аутизмом.

Генетическая архитектура расстройств аутистического спектра весьма разнообразна. Выявляемые генетические нарушения можно разделить на три подгруппы: видимые под микроскопом хромосомные аномалии (30-35 %), субмикроскопические вариации числа копий ДНК, обнаруживаемые с помощью высокоразрешающих молекулярно-цитогенетических методов (10-35%) и моногенные мутации (5%) (Elsabbagh et al., 2012).

В связи с этим, пациентам предварительно должен быть проведён стандартный цитогенетический анализ для исключения крупных хромосомных перестроек и если подозревается известный синдром с набором характерных признаков, то молекулярно-цитогенетический метод FISH. Исключить необходимо наиболее частые наследственные синдромы, приводящие к аутизму (например, Мартина-Белл, Ретта, Смит-Магенис, Корнели и де Ланге, Ди

Джорджи, Клифстра, Вильямса, Фелан-Макдермит, туберозный склероз, нейрофоброматоз, мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера и др).

Среди группы заболеваний, обусловленных врождёнными дефектами метаболизма и сопровождающихся аутизмом, выделяют нарушения обмена аминокислот, при наличии клинических признаков нуждаются в исключении, такие заболевания, как: фенилкетонурия, синдром Леша-Нихана, синдром Смита-Лемли-Опитца (нарушение синтеза холестерина), синдром дефицита креатинина, расстройства цикла мочевины и митохондриальные болезни.

Генетическую неоднородность РАС подтверждает наличие патологических генов, обнаруженных в различных локусах. Определяются не только гены-кандидаты, но и каскады процессов-мишеней или генные (геномные) сети, нарушения в которых вызывают предрасположенность к этому заболеванию. На сегодняшний день известно более 200 генов-кандидатов аутизма (Guilmatre et al., 2009; El-Fishawy, State, 2010). Ранее в работе Холта с соавторами было обнаружено изменение числа копий участка ДНК в области гена ACAD10 (Holt et al., 2012), что позволило считать этот ген кандидатным для аутизма.

Группа больных с несиндромальным типом РАС (расстройством аутистического спектра) обследована на ген ACAD10, вовлеченный в расстройства аутистического спектра. Разработанное комплексное обследование больных с РАС позволит уточнить генетическую природу аутизма у обследованных детей. Однако, в настоящее время наилучшая оценка диагноза РАС основана на динамическом наблюдении истории развития ребенка и его поведения, в сочетании с современными диагностическими инструментами.

Показания и противопоказания к использованию метода.

Предложенное обследование может быть использовано в группе детей с несиндромальным аутизмом. Проведение молекулярно-цитогенетического исследования и уточнение диагноза необходимо для прогноза заболевания у пациента и членов семьи. Противопоказаний для проведения исследования нет.

Последовательность осуществления медицинской технологии.

Медицинская технология предполагает предварительное обследование детей с выставленными ранее диагнозом - аутизм:

1. Сбор родословной;

2. Анамнез жизни и заболевания;

3. Объективное обследование ребенка, и выявление синдромальной патологии (при необходимости дополнительное обследование для уточнения диагноза);

4. В выявленной группе детей с несиндромальными аутистическими расстройствами проводится исследование с использованием образцов геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови пробанда, его родителей и доступных родственников (для установления происхождения мутации - de novo или унаследованная), а также здорового индивида с нормальным кариотипом в качестве контроля. Из 445 обследованных пациентов у 3 обнаружено изменение числа копий участков ДНК в гене ACAD10.

Анализ проводится с набором ДНК-праймеров на регион, в котором наиболее часто регистрируются микроделеции и микродупликации при несиндромальных аутистических расстройствах. Для каждого региона используется две пары праймеров, подобранные на последовательности кандидатных генов. Проведенные исследования позволяют уточнить генетическую природу аутистического расстройства с помощью ПЦР в режиме реального времени.

Анализ проводится с набором ДНК-праймеров на ген ACAD10.

Последовательности праймеров:

1. ACAD 10 F 5 '-GAAGCCTGGAGTCTGTTTCAG-3'

2. ACAD10 R 5'-CATTTCTGTATGGTCAGCACCT-3'

В качестве контроля используются праймеры на последовательность гена HEXB:

1. HEXB F 5'-CCGGGCACAATAGTTGAAGT-3'

2. HEXB R 5'-TCCTCCAATCTTGTCCATAGC-3'

Своевременная диагностика этого сложного гетерогенного заболевания и раннее медицинское вмешательство могут способствовать улучшению прогноза и уменьшению вторичных поведенческих осложнений.

Методические рекомендации по новой медицинской технологии «Алгоритм молекулярно-цитогенетической диагностики микроструктурных хромосомных аберраций в регионе 18p11.31-p11.32 у детей с недифференцированными формами умственной отсталости»

Настоящая медицинская технология разработана для оптимизации диагностики генетических причин умственной отсталости (УО) у детей путем выявления с помощью ПЦР в режиме реального времени микроструктурных хромосомных аберраций в локусе 18p11.31-р11.32. Данная технология не имеет аналогов в Российской Федерации и за рубежом. До настоящего времени диагностика микроструктурных хромосомных аберраций в локусе 18p11.31-р11.32 с помощью матричной сравнительной геномной гибридизации и ПЦР в режиме реального времени не закреплена в национальных рекомендациях, несмотря на то, что в данном локусе расположены гены, продукты которых являются регуляторами конформации хроматина (SMCHD1) и эпигенетическими модификаторами (METTL4), что может объяснять их возможное влияние на регуляцию экспрессии генов в головном мозге.

Для реализации данной медицинской технологии проведено 2 этапа исследований: 1) выявление с помощью матричной сравнительной геномной гибридизации (aCGH) микроструктурных хромосомных мутаций в локусе 18p11.31-р11.32 у детей с недифференцированными формами умственной отсталости; 2) подтверждение с помощью ПЦР в режиме реального времени этих аберраций у пробандов и поиск их у родственников. С помощью aCGH микродупликация области 18p11.31-р11.32 обнаружена у пробанда (RUS 031) с нарушением интеллектуального развития. С использованием ПЦР в режиме реального времени и праймеров на гены SMCHD1 и METTL4 микродупликация

подтверждена у пробанда, и было показано, что она унаследована от здорового отца. Применение настоящей технологии позволяет выявлять микроделеции и микродупликации, затрагивающие область 18p11.31-р11.32. Широкое применение разработанной технологии может способствовать повышению эффективности диагностики микроструктурных хромосомных аберраций в группе пациентов с недифференцированными формами умственной отсталости, а также оказывать значительный экономический эффект, исключая необходимость предварительного использования aCGH.

Показания и противопоказания к использованию метода.

Диагностика показана пациентам в возрасте до 18 лет с недифференцированной формой умственной отсталости и дисморфиями, у которых предварительно исключены числовые и крупные структурные хромосомные аномалии, биохимические дефекты и некоторые известные моногенные наследственные синдромы, проявляющиеся нарушениями интеллектуального развития (Мартина-Белл, Прадера-Вилли, Ангельмана). Противопоказаний для проведения молекулярно-цитогенетической диагностики нет.

Последовательность осуществления медицинской технологии.

1. Предварительно пациентам должен быть проведён стандартный цитогенетический анализ с целью исключения числовых и крупных структурных хромосомных мутаций. Кроме того, должны быть исключены наиболее частые наследственные синдромы, приводящие к умственной отсталости (например, синдром Мартина-Белл, при наличии клинических признаков), а также нарушения обмена.

2. Подготовка образцов геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови пробанда, его родителей и доступных родственников (для установления происхождения мутации - de novo или унаследованная), а также здорового индивида с нормальным кариотипом в качестве контроля для ПЦР в режиме реального времени. В качестве контрольной ДНК для матричной сравнительной

геномной гибридизации (aCGH) используют контрольную ДНК (№5190-3796, Human Reference DNA, Agilent Technologies, США).

3. Проведение матричной сравнительной геномной гибридизации (aCGH). Матричную сравнительную геномную гибридизацию проводят согласно

протоколу производителя (Agilent Technologies, США) (см. п.2.3.2.).

4. Количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени. Методика проведения ПЦР описана в пункте 2.3.3.

Анализ проводится с набором ДНК-праймеров на гены METTL4 и SMCHD1. Последовательности праймеров:

1) METTL4 F 5' -CAGCTGGGTGGTTACTGGAT-3'

2) METTL4 R 5'-TCCAGAGGAGGACACAGAATC-3'

3) SMCHD1 F 5'-CCTCTGATTCTGTTCACATTACAA-3'

4) SMCHD1 R 5'-TGTGATAACCACAGCAGTAAAGC-3'

В качестве контроля используются праймеры на последовательность гена HEXB:

1) HEXB F 5'-CCGGGCACAATAGTTGAAGT-3'

2) HEXB R 5'-TCCTCCAATCTTGTCCATAGC-3'

Настоящая медицинская технология направлена на решение проблемы генетической диагностики микроструктурных хромосомных аберраций в локусе 18p11.31p11.32 у пациентов с недифференцированной формой умственной отсталости. Оценка числа копий области 18p11.31p11.32 проводится с помощью ПЦР в режиме реального времени с праймерами на гены SMCHD1 и METTL4. Данная технология не имеет аналогов в Российской Федерации и в мире, а ее широкое применение может способствовать повышению эффективности диагностики микроструктурных хромосомных аберраций в локусе 18p11.31p11.32 у детей с недифференцированной формой умственной отсталости.

Методические рекомендации по новой медицинской технологии

«Молекулярно-цитогенетическая диагностика хромосомных мутаций в регионе 12q24 у пациентов с недифференцированной умственной

отсталостью и эпилепсией»

Настоящая медицинская технология разработана для оптимизации диагностики генетических причин умственной отсталости (УО) у детей путем выявления с помощью ПЦР в режиме реального времени микроструктурных хромосомных аберраций в локусе 12q24. Данная технология не имеет аналогов в Российской Федерации и за рубежом. До настоящего времени диагностика микроструктурных хромосомных аберраций в локусе 12q24 с помощью матричной сравнительной геномной гибридизации (aCGH) и ПЦР в режиме реального времени не закреплена в национальных рекомендациях. Широкое применение разработанной технологии может способствовать повышению эффективности диагностики микроструктурных хромосомных аберраций в группе пациентов с недифференцированной умственной отсталостью и эпилепсией, а также оказывать значительный экономический эффект, исключая необходимость предварительного использования aCGH.

Для реализации данной медицинской технологии проведено 2 этапа исследований:

1) детекция с помощью матричной сравнительной геномной гибридизации микроструктурных хромосомных мутаций в локусе 12q24 у детей с недифференцированными формами умственной отсталости и задержкой развития;

2) подтверждение с помощью ПЦР в режиме реального времени этих аберраций у пробандов и поиск их у родственников. С помощью aCGH микродупликация области 12q24 обнаружена у 3 из 445 обследованных нами пациентов (№ П97, П98, П99). С использованием ПЦР в режиме реального времени и праймеров на ген ЛСЛ010 микродупликации подтверждены у всех пациентов, и было показано, что в двух случаях частичные трисомии

унаследованы от здоровой матери, а в другом исключено наследование по отцовской линии, поскольку материал матери был недоступен.

В локусе 12q24 содержится три гена: ACAD10, экспрессирующийся в головном мозге плода, MAPKAPK5, участвующий в неврологических процессах, и ALDH2, который вовлечён в процессы нейродегенерации. Точки разрыва находятся внутри гена ACAD10, кодирующего ацил-КоА-дегидрогеназу, которая участвует в метаболизме жирных кислот, уникальных для развития мозга, и гена MAPKAPK5.

В Базе данных хромосомного дисбаланса и фенотипов у человека (DECIPHER) имеется информация о 10 пациентах с микродупликациями 12q24 (№ 253257, 254079, 254080, 254081, 254082, 255000, 261485, 262606, 287392, 300426), также затрагивающими только 3 отмеченных нами гена. Еще два пациента (№ 275287, 274139) имеют микротрипликацию данного хромосомного субсегмента. У некоторых пациентов отмечена задержка развития и нарушения психики. В 7 случаях (70%) микродупликации были наследованы от фенотипически здоровых родителей. Обе микротрипликации также наследованы от родителей, которые однако, не были клинически обследованы. Ещё в 3 случаях происхождение перестройки было не установлено. Описаний микроделеции в этой области с вовлечением 3 генов в литературе и базах данных не обнаружено.

Показания и противопоказания к использованию метода.

Диагностика показана пациентам в возрасте до 18 лет с недифференцированной формой умственной отсталости и дисморфиями, у которых предварительно исключены числовые и крупные структурные хромосомные аномалии, биохимические дефекты и некоторые известные моногенные наследственные синдромы, проявляющиеся нарушениями интеллектуального развития (Мартина-Белл, Прадера-Вилли, Ангельмана). Противопоказаний для проведения молекулярно-цитогенетической диагностики нет.

Последовательность осуществления медицинской технологии.

1. Предварительно пациентам должен быть проведён стандартный цитогенетический анализ с целью исключения числовых и крупных структурных хромосомных мутаций. Кроме того, должны быть исключены наиболее частые наследственные синдромы, приводящие к умственной отсталости (например, синдром Мартина-Белл, при наличии клинических признаков), а также нарушения обмена.

2. Подготовка образцов геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови пробанда, его родителей и доступных родственников (для установления происхождения мутации - de novo или унаследованная), а также здорового индивида с нормальным кариотипом в качестве контроля для ПЦР в режиме реального времени. В качестве контрольной ДНК для матричной сравнительной геномной гибридизации (aCGH) используют контрольную ДНК (№ 5190-3796, Human Reference DNA, Agilent Technologies, США).

3. Проведение матричной сравнительной геномной гибридизации (aCGH). Матричную сравнительную геномную гибридизацию проводят согласно

протоколу производителя (Agilent Technologies, США) (см. п.2.3.2.)

4. Количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени. Методика проведения ПЦР описана в пункте 2.3.3.

Анализ проводится с набором ДНК-праймеров на ген ACAD10. Последовательности праймеров:

1) ACAD 10 F 5 '-GAAGCCTGGAGTCTGTTTCAG-3'

2) ACAD10 R 5'-CATTTCTGTATGGTCAGCACCT-3'

В качестве контроля используются праймеры на последовательность гена HEXB:

1) HEXB F 5'-CCGGGCACAATAGTTGAAGT-3'

2) HEXB R 5'-TCCTCCAATCTTGTCCATAGC-3'

Настоящая медицинская технология направлена на решение проблемы генетической диагностики микроструктурных хромосомных аберраций в локусе 12q24 у пациентов с недифференцированной умственной отсталостью и эпилепсией. Оценка числа копий области 12q24 проводится с помощью ПЦР в

режиме реального времени с праймерами на ген ЛCЛD10. Данная технология не имеет аналогов в Российской Федерации и в мире, а ее широкое применение может способствовать повышению эффективности диагностики микроструктурных хромосомных аберраций в локусе 12q24 у детей с недифференцированными формами интеллектуальных расстройств и эпилепсией.

Развитие практической медицины неразрывно связано с внедрением в неё фундаментальных знаний и технологий. В настоящее время происходит совершенствование подходов к диагностике, профилактике и лечению заболеваний с учётом информации о персональном геноме пациента. Представленные методические рекомендации демонстрируют потенциал современных молекулярно-генетических методов в идентификации генетических причин нарушений интеллектуального развития, в прогнозе их возникновения и особенностей течения. Данные технологии особенно востребованы для пренатальной экспресс-диагностики хромосомных микродупликаций в семьях с высоким генетическим риском, имеющих ребёнка с установленной перестройкой и умственной отсталостью. Являясь результатом решений задач фундаментального и прикладного поискового научного исследования, предложенные медицинские технологии направлены на обеспечение доступности для пациентов передовых генетических методов и позволяют улучшить диагностику, профилактику, медико-генетическое консультирование семей детей, страдающих интеллектуальными расстройствами.

Таким образом, три новые разработанные медицинские технологии диагностики хромосомных микродупликаций внедрены в практику Генетической клиники НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ и востребованы для экспресс-диагностики в семьях с высоким генетическим риском, имеющих ребёнка с установленной перестройкой и расстройством интеллектуального развития.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ворсанова С.Г., Юров И.Ю., Куринная О.С. и др. Геномные аномалии у детей с умственной отсталостью и аутизмом: использование технологии сравнительной геномной гибридизации на хромосомах in situ (HRCGH) и молекулярного кариотипирования на ДНК-микроматрицах (array CGH) // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2013. - Т. 113. - №. 8. - С. 46-49.

2. Кашеварова А.А., Лебедев И.Н. Геномная архитектура хромосомных болезней человека // Генетика. - 2016. - Т. 52. - №. 5. - С. 511-511.

3. Кашеварова А.А., Лебедев И.Н., Назаренко Л.П. Архитектура генома и хромосомные болезни. Синдромы реципрокных микроделеций и микродупликаций. - Томск: «Печатная мануфактура». - 2014.

4. Кашеварова А.А., Скрябин Н.А., Лебедев И.Н. Эволюционные аспекты архитектуры генома человека и хромосомные болезни // Генетика человека и патология. Проблемы эволюционной медицины. - 2014. - С. 26-30.

5. Кашеварова А.А., Скрябин Н.А., Лопаткина М.Е., Салюкова О.А., Филимонова М.Н., Лежнина О.В., Шорина А.Р., Масленников А.Б., Назаренко Л.П., Culic V., Лебедев И. Н. Молекулярное кариотипирование при недифференцированных формах интеллектуальных расстройств: от хромосомных мутаций к идентификации патогенетически значимых генов // Медицинская генетика. - 2016. - Т. 15. - №. 4. - С. 46-49.

6. Кашеварова А.А., Скрябин Н.А., Черемных А.Д. и др. Клинико-генетическая характеристика недифференцированной умственной отсталости на основе матричной сравнительной геномной гибридизации // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2013. - Т. 113. - №. 9. - С. 70.

7. Колотий А.Д., Ворсанова С.Г., Юров И.Ю. и др. Выявление микроаномалий хромосом у детей с недифференцированными формами умственной отсталости: оригинальный алгоритм анализа хромосом высокого разрешения методами молекулярной цитогенетики // Фундаментальные исследования. - 2013. - №. 6-6.

8. Куринная О.С., Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Воинова В.Ю., Кешишян Е.С., Юров И.Ю. Молекулярно-цитогенетическая диагностика новорожденных детей с микроаномалиями и врожденными пороками развития. // Российский Вестник Перинатологии и Педиатрии. - 2018. - Т.63. №4. - С.207-208.

9. Лавров А.В., Банников А.В., Чаушева А.И., Дадали Е.Л. Генетика умственной отсталости // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2016.

- Т. 61. - №. 6.

10. Лебедев И.Н. 100 трудов лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики // Генетика человека и патология. - 2017. - С. 9-22.

11. Лебедев И.Н., Назаренко Л.П., Кашеварова А.А. и др. Геномные технологии диагностики умственной отсталости: результаты проекта CHERISH // Бюллетень СО РАН. - 2013. - Т. 33. - №. 5. - С. 25-36.

12. Макаров И.В. Умственная отсталость у детей и подростков: клинические рекомендации (протокол лечения) / ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский психоневрологический институт им. В.М. Бехтерева» Минздрава России; Российское общество психиатров, секция детской психиатрии.

- 2015 г.

13. Назаренко Л.П., Лебедев И.Н., Салюкова О.А. и др. Организация скрининга семей, имеющих детей с нарушениями интеллектуального развития, на основе анализа микроделеционных и микродупликационных синдромов // Методические рекомендации по медицинским технологиям диагностики и лечения хромосомных, орфанных и многофакторных заболеваний человека / под редакцией проф. В.А. Степанова - Новосибирск: Академиздат. - 2016. - С. 7-28.

14. Назаренко Л.П., Назаренко М.С. Клинические аспекты интеллектуальных нарушений // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике / Под ред. чл.-корр. РАЕН А.Б. Масленникова. - Вып. 13. - Новосибирск: "Альфа Виста Н" - 2009. - С. 139-163.

15. Назаренко Л.П., Назаренко М.С., Салюкова О.А. и др. Генетические аспекты интеллектуальных нарушений (Наследственность и здоровье): Вып. 14.

учебное пособие / под ред. В.П. Пузырёва. - Томск: Литературное бюро. - 2017. -68 с.

16. Скрябин Н.А., Васильев С.А., Лебедев И.Н. Эпигенетический сайленсинг структурных вариаций генома // Генетика. - 2017. - Т. 53. - №. 10. - С. 1132-1140.

17. Скрябин Н.А., Кашеварова А.А., Лебедев И.Н. Возможности и перспективы метода матричной сравнительной геномной гибридизации в клинической практике // Якутский медицинский журнал. - 2014. - №. 2. - С. 51-52.

18. Юров И.Ю., Ворсанова С.Г., Куринная О.С. и др. Генетические аспекты психологических и поведенческих нарушений у детей с аутистическими расстройствами и трудностями в обучении: диагностика геномных и хромосомных нарушений с использованием ДНК-микрочипов // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - №. 3. - С. 383-383.

19. Юров Ю.Б., Ворсанова С.Г., Колотий А.Д. и др. Нарушения генома в клетках головного мозга как механизм патологии центральной нервной системы. // Российский Нейрохирургический Журнал им. профессора А.Л. Поленова. -2018. - Т.Х. Специальный выпуск. - С. 281.

20. http://www.gks.ru/wps/wcm/connect/rosstat_main/rosstat/ru/statistics/population/ healthcare/# - Федеральная служба статистики, 2018.

21. Ahn J.W., Bint S., Bergbaum A. et al. Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals-results from four years' clinical application for over 8,700 patients // Molecular cytogenetics. - 2013. - V. 6. - №. 1. -P. 16.

22. Aldahmesh M.A., Alshammari M.J., Khan A.O. et al. The syndrome of microcornea, myopic chorioretinal atrophy, and telecanthus (MMCAT) is caused by mutations in ADAMTS18 // Human mutation. - 2013. - V. 34. - №. 9. - P. 1195-1199.

23. Alesi V., Barrano G., Morara S. et al. A previously undescribed de novo 4p15 deletion in a patient with apparently isolated metopic craniosynostosis // American Journal of Medical Genetics Part A. - 2011. - V. 155. - №. 10. - P. 2543-2551.

24. Ali-Rahmani F., Schengrund C.L., Connor J.R. HFE gene variants, iron, and lipids: a novel connection in Alzheimer's disease // Frontiers in pharmacology. - 2014. - V. 5. - P. 165.

25. Allen N.J., Eroglu C. Cell biology of astrocyte-synapse interactions // Neuron. -2017. - V. 96. - №. 3. - P. 697-708.

26. Allen T.L., Brothman A.R., Carey J.C. et al. Cytogenetic and molecular analysis in trisomy 12p // American journal of medical genetics. - 1996. - V. 63. - №. 1. - P. 250-256.

27. Alpar A., Attems J., Mulder J. et al. The renaissance of Ca2+-binding proteins in the nervous system: secretagogin takes center stage // Cellular signalling. - 2012. - V. 24. - №. 2. - P. 378-387.

28. American Psychiatric Association (APA) Diagnostic and statistical manual of mental disorders // 4th ed., Rev. Washington, DC: American Psychiatric Association. -2000.

29. American Psychiatric Association (APA) Diagnostic and statistical manual of mental disorders (DSM-5) // Washington, DC: American Psychiatric Publishing. - 2013.

30. Amir Shaghaghi M., Murphy B., Eck P. The SLC2A14 gene: genomic locus, tissue expression, splice variants, and subcellular localization of the protein // Biochemistry and Cell Biology. - 2016. - V. 94. - №. 4. - P. 331-335.

31. Amps K., Andrews P.W., Anyfantis G. et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage // Nature biotechnology. - 2011. - V. 29. - №. 12. - P. 1132.

32. Arndt A.K., Schafer S., Drenckhahn J.D. et al. Fine mapping of the 1p36 deletion syndrome identifies mutation of PRDM16 as a cause of cardiomyopathy // The American Journal of Human Genetics. - 2013. - V. 93. - №. 1. - P. 67-77.

33. Bailey J.A., Eichler E.E. Primate segmental duplications: crucibles of evolution, diversity and disease // Nature Reviews Genetics. - 2006. - V. 7. - №. 7. - P. 552.

34. Barber J.C., Hall V., Maloney V.K. et al. 16p11.2-p12.2 duplication syndrome; a genomic condition differentiated from euchromatic variation of 16p11.2 // European Journal of Human Genetics. - 2013. - V. 21. - №. 2. - P. 182.

35. Barrientos T., Frank D., Kuwahara K. et al. Two novel members of the ABLIM protein family, ABLIM-2 and-3, associate with STARS and directly bind F-actin // Journal of Biological Chemistry. - 2007. - V. 282. - №. 11. - P. 8393-8403.

36. Bateman M.S., Mehta S.G., Willatt L. et al. A de novo 4q34 interstitial deletion of at least 9.3 Mb with no discernible phenotypic effect // American Journal of Medical Genetics Part A. - 2010. - V. 152. - №. 7. - P. 1764-1769.

37. Battaglia A., Doccini V., Bernardini L. et al. Confirmation of chromosomal microarray as a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental delay, intellectual disability, autism spectrum disorders and dysmorphic features // European journal of paediatric neurology. - 2013. - V. 17. - №. 6. - P. 589-599.

38. Baxter A.J., Brugha T.S., Erskine H.E. et al. The epidemiology and global burden of autism spectrum disorders // Psychological medicine. - 2015. - V. 45. - №. 3. - P. 601-613.

39. Beck C.R., Carvalho C.M., Banser L. et al. Complex genomic rearrangements at the PLP1 locus include triplication and quadruplication // PLoS genetics. - 2015. - V. 11. - №. 3. - P. e1005050.

40. Bellinger D.C., O'Leary K., Rainis H. et al. Country-specific estimates of the incidence of intellectual disability associated with prenatal exposure to methylmercury // Environmental research. - 2016. - V. 147. - P. 159-163.

41. Ben-David E., Shifman S. Combined analysis of exome sequencing points toward a major role for transcription regulation during brain development in autism // Molecular psychiatry. - 2013. - V. 18. - №. 10. - P. 1054.

42. Bergsland M., Werme M., Malewicz M. et al. The establishment of neuronal properties is controlled by Sox4 and Sox11 // Genes & development. - 2006. - V. 20. -№. 24. - P. 3475-3486.

43. Berkowicz S.R., Giousoh A., Bird P.I. Neurodevelopmental MACPFs: The vertebrate astrotactins and BRINPs // Seminars in cell & developmental biology. -Academic Press, 2017. - V. 72. - P. 171-181.

44. Bernier R., Golzio C., Xiong B. et al. Disruptive CHD8 mutations define a subtype of autism early in development // Cell. - 2014. - V. 158. - №. 2. - P. 263-276.

45. Bertelli M.O., Salvador-Carulla L., Scuticchio D. et al. Moving beyond intelligence in the revision of ICD 10: specific cognitive functions in intellectual developmental disorders // World Psychiatry. - 2014. - V. 13. - №. 1. - P. 93-94.

46. Bertelli M.O., Munir K., Harris J. et al. "Intellectual developmental disorders": reflections on the international consensus document for redefining "mental retardation-intellectual disability" in ICD-11 // Advances in mental health and intellectual disabilities. - 2016. - V. 10. - №. 1. - P. 36-58.

47. Bi W., Sapir T., Shchelochkov O.A. et al. Increased LIS1 expression affects human and mouse brain development // Nature genetics. - 2009. - V. 41. - №. 2. - P. 168.

48. Bransteitter R., Prochnow C., Chen X.S. The current structural and functional understanding of APOBEC deaminases // Cellular and molecular life sciences. - 2009. - V. 66. - №. 19. - P. 3137-3147.

49. Brisset S., Joly G., Ozilou C. et al. Molecular characterization of partial trisomy 16q24.1^qter: Clinical report and review of the literature // American journal of medical genetics. - 2002. - V. 113. - №. 4. - P. 339-345.

50. Brunetti-Pierri N., Berg J.S., Scaglia F. et al. Recurrent reciprocal 1q21.1 deletions and duplications associated with microcephaly or macrocephaly and developmental and behavioral abnormalities // Nature genetics. - 2008. - V. 40. - №. 12. - P. 1466.

51. Carulla L.S., Reed G.M., VAEZ-AZIZI L.M. et al. Intellectual developmental disorders: towards a new name, definition and framework for "mental retardation/intellectual disability" in ICD- 11 // World Psychiatry. - 2011. - V. 10. -№. 3. - P. 175-180.

52. Carvalho C.M.B., Lupski J.R. Mechanisms underlying structural variant formation in genomic disorders // Nature Reviews Genetics. - 2016. - V. 17. - №. 4. -P. 224.

53. Carvalho C.M.B., Pfundt R., King D.A. et al. Absence of heterozygosity due to template switching during replicative rearrangements // The American Journal of Human Genetics. - 2015. - V. 96. - №. 4. - P. 555-564.

54. Carvalho C.M.B., Zhang F., Liu P. et al. Complex rearrangements in patients with duplications of MECP2 can occur by fork stalling and template switching // Human molecular genetics. - 2009. - V. 18. - №. 12. - P. 2188-2203.

55. Chaabouni M., Martinovic J., Sanlaville D. et al. Prenatal diagnosis and molecular characterization of an interstitial 1q24.2q25.2 deletion // European journal of medical genetics. - 2006. - V. 49. - №. 6. - P. 487-493.

56. Chambers I., Colby D., Robertson M. et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells // Cell. - 2003. - V. 113. - №. 5. - P. 643-655.

57. Chelly J., Khelfaoui M., Francis F. et al. Genetics and pathophysiology of mental retardation // European Journal of Human Genetics. - 2006. - V. 14. - №. 6. - P. 701.

58. Chen C.P., Hung F.Y., Chern S.R. et al. Prenatal diagnosis and molecular cytogenetic characterization of de novo partial monosomy 3(3p26.3^pter) and partial trisomy 16q(16q23.1^qter) // Taiwanese Journal of Obstetrics and Gynecology. -2016. - V. 55. - №. 2. - P. 288-292.

59. Cheng B., Du Y., Wen Y. et al. Integrative analysis of genome-wide association study and chromosomal enhancer maps identified brain region related pathways associated with ADHD // Comprehensive psychiatry. - 2019. - V. 88. - P. 65-69.

60. Cheung H.C., Yatsenko S.A., Kadapakkam M. et al. Constitutional tandem duplication of 9q34 that truncates EHMT1 in a child with ganglioglioma // Pediatric blood & cancer. - 2012. - V. 58. - №. 5. - P. 801-805.

61. Chun T.H., Inoue M., Morisaki H. et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover // Diabetes. - 2010. - V. 59. - №. 10. - P. 2484-2494.

62. Chung B.H.Y., Mullegama S., Marshall C.R. et al. Severe intellectual disability and autistic features associated with microduplication 2q23.1 // European Journal of Human Genetics. - 2012. - V. 20. - №. 4. - P. 398.

63. Clark A.T., Rodriguez R.T., Bodnar M.S. et al. Human STELLAR, NANOG, and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma // Stem Cells. - 2004. - V. 22. - №. 2. - P. 169-179.

64. Comuzzie A.G., Cole S.A., Laston S.L. et al. Novel genetic loci identified for the pathophysiology of childhood obesity in the Hispanic population // PloS one. - 2012. -V. 7. - №. 12. - P. e51954.

65. Cooper G.M., Coe B.P., Girirajan S. et al. A copy number variation morbidity map of developmental delay // Nature genetics. - 2011. - V. 43. - №. 9. - P. 838.

66. Cooper J.A., Sept D. New insights into mechanism and regulation of actin capping protein // International review of cell and molecular biology. - 2008. - V. 267.

- P. 183-206.

67. Costa L.G., Cole T.B., Garrick J.M. et al. Metals and paraoxonases // Neurotoxicity of Metals. - Springer, Cham, 2017. - P. 85-111.

68. Coughlin C.R., Scharer G.H., Shaikh T.H. Clinical impact of copy number variation analysis using high-resolution microarray technologies: advantages, limitations and concerns // Genome medicine. - 2012. - V. 4. - №. 10. - P. 80.

69. Crespi B., Summers K., Dorus S. Genomic sister- disorders of neurodevelopment: an evolutionary approach // Evolutionary Applications. - 2009. - V. 2. - №. 1. - P. 81-100.

70. Croen L.A., Grether J.K., Selvin S. The epidemiology of mental retardation of unknown cause // Pediatrics. - 2001. - V. 107. - №. 6. - P. E86.

71. Crow J.F. The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation // Nature Reviews Genetics. - 2000. - V. 1. - №. 1. - P. 40.

72. Daniel A., Darmanian A., Peters G. et al. An innocuous duplication of 11.2 Mb at 13q21 is gene poor: Sub- bands of gene paucity and pervasive CNV characterize the chromosome anomalies // American Journal of Medical Genetics Part A. - 2007. - V. 143. - №. 20. - P. 2452-2459.

73. Deak K.L., Horn S.R., Rehder C.W. The evolving picture of microdeletion/microduplication syndromes in the age of microarray analysis: Variable expressivity and genomic complexity // Clinics in laboratory medicine. - 2011. - V. 31.

- №. 4. - P. 543-564.

74. Descartes M., Hain J.Z., Conklin M. et al. Molecular characterization of a patient with an interstitial 1q deletion [del(1)(q24.1q25.3)] and distinctive skeletal

abnormalities // American Journal of Medical Genetics Part A. - 2008. - V. 146. - №. 22. - P. 2937-2943.

75. Dittwald P., Gambin T., Szafranski P. et al. NAHR-mediated copy-number variants in a clinical population: mechanistic insights into both genomic disorders and Mendelizing traits // Genome research. - 2013. - V. 23. - №. 9. - P. 1395-1409.

76. Doco-Fenzy M., Leroy C., Schneider A. et al. Early-onset obesity and paternal 2p deletion encompassing the ACP1, TMEM18, and MYT1L genes // European Journal of Human Genetics. - 2014. - V. 22. - №. 4. - P. 471-479.

77. Dolcetti A., Silversides C.K., Marshall C.R. et al. 1q21.1 Microduplication expression in adults // Genetics in Medicine. - 2013. - V. 15. - №. 4. - P. 282.

78. Drabova J., Seemanova E., Hancarova M. et al. Long term follow-up in a patient with a de novo microdeletion of 14q11.2 involving CHD8 // American Journal of Medical Genetics Part A. - 2015. - V. 167. - №. 4. - P. 837-841.

79. D'Souza Y., Elharram A., Soon-Shiong R. et al. Characterization of Aldh2-/-mice as an age-related model of cognitive impairment and Alzheimer's disease // Molecular brain. - 2015. - V. 8. - №. 1. - P. 27.

80. Eid O.M. Molecular cytogenetic techniques for identification of copy-number variations // Middle East journal of medical genetics. - 2017. - V. 6. - №. 1. - P. 1-12.

81. Elghezal H., Sendi H.S., Monastiri K. et al. Large duplication 4q25-q34 with mild clinical effect // Annales de genetique. - Elsevier Masson, 2004. - V. 47. - №. 4. -P. 419-422.

82. Elsabbagh M., Divan G., Koh Y.J. et al. Global prevalence of autism and other pervasive developmental disorders // Autism Research. - 2012. - V. 5. - №. 3. - P. 160179.

83. Erlich P.M., Lunetta K.L., Cupples L.A. et al. Serum paraoxonase activity is associated with variants in the PON gene cluster and risk of Alzheimer disease // Neurobiology of aging. - 2012. - V. 33. - №. 5. - P. 1015. e7-1015. e23.

84. Faravelli F., Murdolo M., Marangi G. et al. Mother to son amplification of a small subtelomeric deletion: a new mechanism of familial recurrence in microdeletion

syndromes // American Journal of Medical Genetics Part A. - 2007. - V. 143. - №. 11. - P. 1169-1173.

85. Feenstra I., Vissers L.E., Orsel M. et al. Genotype-phenotype mapping of chromosome 18q deletions by high- resolution array CGH: An update of the phenotypic map // American Journal of Medical Genetics Part A. - 2007. - V. 143. - №. 16. - P. 1858-1867.

86. Feuk L., Carson A.R., Scherer S.W. Structural variation in the human genome // Nature Reviews Genetics. - 2006. - V. 7. - №. 2. - P. 85.

87. Filges I., Röthlisberger B., Noppen C. et al. 14.5 Mb interstitial deletion 13q21.1-13q21.33: Clinical and array- CGH study of a benign phenotype in a three- generation family // American Journal of Medical Genetics Part A. - 2009. - V. 149. - №. 2. - P. 237-241.

88. Funaki S., Nakamura T., Nakatani T. et al. Global DNA hypomethylation coupled to cellular transformation and metastatic ability // FEBS letters. - 2015. - V. 589. - №. 24PartB. - P. 4053-4060.

89. Gajecka M., Mackay K.L., Shaffer L.G. Monosomy 1p36 deletion syndrome // American Journal of Medical Genetics Part C: Seminars in Medical Genetics. -Hoboken : Wiley Subscription Services, Inc., A Wiley Company, 2007. - V. 145. - №. 4. - P. 346-356.

90. Gamba B. F., Zechi-Ceide R.M., Kokitsu-Nakata N.M. et al. Interstitial 1q21. 1 microdeletion is associated with severe skeletal anomalies, dysmorphic face and moderate intellectual disability // Molecular syndromology. - 2016. - V. 7. - №. 6. - P. 344-348.

91. Garrick J.M., Dao K., de Laat R. et al. Developmental expression of paraoxonase 2 // Chemico-biological interactions. - 2016. - V. 259. - P. 168-174.

92. Gerits N., Van Belle W., Moens U. Transgenic mice expressing constitutive active MAPKAPK5 display gender-dependent differences in exploration and activity // Behavioral and Brain Functions. - 2007. - V. 3. - №. 1. - P. 58.

93. Giannikou K., Fryssira H., Oikonomakis V. et al. Further delineation of novel 1p36 rearrangements by array-CGH analysis: narrowing the breakpoints and clarifying the "extended" phenotype // Gene. - 2012. - V. 506. - №. 2. - P. 360-368.

94. Gijsbers A.C.J., Schoumans J., Ruivenkamp C.A.L. Interpretation of array comparative genome hybridization data: a major challenge // Cytogenetic and genome research. - 2011. - V. 135. - №. 3-4. - P. 222-227.

95. Girirajan S., Campbell C.D., Eichler E.E. Human copy number variation and complex genetic disease // Annual review of genetics. - 2011. - V. 45. - P. 203-226.

96. Girirajan S., Eichler E.E. Phenotypic variability and genetic susceptibility to genomic disorders // Human molecular genetics. - 2010. - V. 19. - №. R2. - P. R176-R187.

97. Glass I.A., Trenholme A., Mildenhall L. et al. Mild phenotype in two siblings with distal monosomy 12p13.31—^ pter // Clinical genetics. - 2000. - V. 57. - №. 5. - P. 401-405.

98. Gokfümen O., Lee C. Copy number variants (CNVs) in primate species using array-based comparative genomic hybridization // Methods. - 2009. - V. 49. - №. 1. -P. 18-25.

99. Golzio C., Katsanis N. Genetic architecture of reciprocal CNVs // Current opinion in genetics & development. - 2013. - V. 23. - №. 3. - P. 240-248.

100. González G., Raggio-Risso V., Boidi-Hernández M., Tapié-Nicolini A., Roche-Lowezy L. Avances en la identificación etiológica del retraso mental // Rev Neurol. -2013. - V. 57. - №. Supl 1. - P. S75-83.

101. Goodman B.K., Capone G.T., Hennessey J. et al. Familial tandem duplication of bands q31.1 to q32.3 on chromosome 4 with mild phenotypic effect // American journal of medical genetics. - 1997. - V. 73. - №. 2. - P. 119-124.

102. Gu S., Posey J.E., Yuan B. et al. Mechanisms for the generation of two quadruplications associated with split- hand malformation // Human mutation. - 2016. - V. 37. - №. 2. - P. 160-164.

103. Hastings P.J., Ira G., Lupski J.R. A microhomology-mediated break-induced replication model for the origin of human copy number variation // PLoS genetics. -2009. - V. 5. - №. 1. - P. e1000327.

104. Hastings P.J., Lupski J.R., Rosenberg S.M. et al. Mechanisms of change in gene copy number // Nature Reviews Genetics. - 2009. - V. 10. - №. 8. - P. 551.

105. He M., Pei Z., Mohsen A.W. et al. Identification and characterization of new long chain acyl-CoA dehydrogenases // Molecular genetics and metabolism. - 2011. - V. 102. - №. 4. - P. 418-429.

106. Hehir-Kwa J.Y., Rodríguez-Santiago B., Vissers L.E. et al. De novo copy number variants associated with intellectual disability have a paternal origin and age bias // Journal of medical genetics. - 2011. - V. 48. - №. 11. - P. 776-778.

107. Heidari M., Johnstone D.M., Bassett B. et al. Brain iron accumulation affects myelin-related molecular systems implicated in a rare neurogenetic disease family with neuropsychiatric features // Molecular psychiatry. - 2016. - V. 21. - №. 11. - P. 1599.

108. Hemmat M., Rumple M.J., Mahon L.W. et al. Short stature, digit anomalies and dysmorphic facial features are associated with the duplication of miR-17~ 92 cluster // Molecular cytogenetics. - 2014. - V. 7. - №. 1. - P. 27.

109. Hexige S., Guo J., Ma L. et al. Expression pattern of growth/differentiation factor 3 in human and murine cerebral cortex, hippocampus as well as cerebellum // Neuroscience letters. - 2005. - V. 389. - №. 2. - P. 83-87.

110. Ho K.S., Twede H., Vanzo R. et al. Clinical Performance of an Ultrahigh Resolution Chromosomal Microarray Optimized for Neurodevelopmental Disorders // BioMed research international. - 2016a. - V. 2016.

111. Ho K.S., Wassman E., Baxter A. et al. Chromosomal microarray analysis of consecutive individuals with autism spectrum disorders using an ultra-high resolution chromosomal microarray optimized for neurodevelopmental disorders // International journal of molecular sciences. - 2016. - V. 17. - №. 12. - P. 2070.

112. Hogarth P. Neurodegeneration with brain iron accumulation: diagnosis and management // Journal of movement disorders. - 2015. - V. 8. - №. 1. - P. 1.

113. Hoglund P., Jalkanen R., Marttinen E. et al. Interstitial 1q25.3-q31.3 deletion in a boy with mild manifestations // American Journal of Medical Genetics Part A. - 2003. -V. 123. - №. 3. - P. 290-295.

114. Hollenbeck D., Williams C.L., Drazba K. et al. Mikhail F.M. Clinical relevance of small copy-number variants in chromosomal microarray clinical testing // Genetics in Medicine. - 2017. - V. 19. - №. 4. - P. 377.

115. Holt R., Sykes N.H., Conceicao I.C. et al. CNVs leading to fusion transcripts in individuals with autism spectrum disorder // European Journal of Human Genetics. -2012. - V. 20. - №. 11. - P. 1141.

116. Hu P., Wang Y., Meng L.L. et al. 1q25.2-q31.3 Deletion in a female with mental retardation, clinodactyly, minor facial anomalies but no growth retardation // Molecular cytogenetics. - 2013. - V. 6. - №. 1. - P. 30.

117. Inden M., Iriyama M., Zennami M. et al. The type III transporters (PiT-1 and PiT-2) are the major sodium-dependent phosphate transporters in the mice and human brains // Brain research. - 2016. - V. 1637. - P. 128-136.

118. Infante J., Prieto C., Sierra M. et al. Identification of candidate genes for Parkinson's disease through blood transcriptome analysis in LRRK2-G2019S carriers, idiopathic cases, and controls // Neurobiology of aging. - 2015. - V. 36. - №. 2. - P. 1105-1109.

119. Iourov I.Y., Vorsanova S.G., Korostelev S.A., Zelenova M.A., Yurov Y.B. Long contiguous stretches of homozygosity spanning shortly the imprinted loci are associated with intellectual disability, autism and/or epilepsy // Molecular cytogenetics. - 2015. -V. 8. - №. 1. - P. 77.

120. Itsara A., Cooper G.M., Baker C. et al. Population analysis of large copy number variants and hotspots of human genetic disease // The American Journal of Human Genetics. - 2009. - V. 84. - №. 2. - P. 148-161.

121. Iyer J., Girirajan S. Gene discovery and functional assessment of rare copy-number variants in neurodevelopmental disorders // Briefings in functional genomics. -2015. - V. 14. - №. 5. - P. 315-328.

122. Jasinska A.J., Service S., Jawaheer D. et al. A narrow and highly significant linkage signal for severe bipolar disorder in the chromosome 5q33 region in Latin American pedigrees // American Journal of Medical Genetics Part B: Neuropsychiatrie Genetics. - 2009. - V. 150. - №. 7. - P. 998-1006.

123. Jonsson L., Anckarsäter H., Zettergren A. et al. Association between ASMT and autistic-like traits in children from a Swedish nationwide cohort // Psychiatric genetics.

- 2014. - V. 24. - №. 1. - P. 21-27.

124. Jordan V.K., Zaveri H.P., Scott D.A. 1p36 deletion syndrome: an update // The application of clinical genetics. - 2015. - V. 8. - P. 189.

125. Kaminsky E.B., Kaul V., Paschall J. et al. An evidence-based approach to establish the functional and clinical significance of copy number variants in intellectual and developmental disabilities // Genetics in medicine. - 2011. - V. 13. - №. 9. - P. 777.

126. Kannu P., Campos-Xavier A.B., Hull D. et al. Post-axial polydactyly type A2, overgrowth and autistic traits associated with a chromosome 13q31.3 microduplication encompassing miR-17-92 and GPC5 // European journal of medical genetics. - 2013. -V. 56. - №. 8. - P. 452-457.

127. Karam S. M., Riegel M., Segal S.L. et al. Genetic causes of intellectual disability in a birth cohort: A population- based study // American Journal of Medical Genetics Part A. - 2015. - V. 167. - №. 6. - P. 1204-1214.

128. Kashevarova A., Nazarenko L., Skryabin N. et al. Array CGH analysis of a cohort of Russian patients with intellectual disability // Gene. - 2014. - V. 536. - №. 1.

- P. 145-150.

129. Kashevarova A.A., Nazarenko L.P., Skryabin N.A. et al. Array CGH analysis of a cohort of Russian patients with intellectual disability // Gene. - 2014. - V. 536. - №. 1.

- P. 145-150.

130. Kashevarova A. A., Nazarenko L.P., Skryabin N.A. et al. A mosaic intragenic microduplication of LAMA1 and a constitutional 18p11. 32 microduplication in a patient with keratosis pilaris and intellectual disability // American Journal of Medical Genetics Part A. - 2018. - V. 176. - №. 11. - P. 2395-2403.

131. Kato T. et al. Age has no effect on de novo constitutional t (11; 22) translocation frequency in sperm // Fertility and sterility. - 2007. - V. 88. - №. 5. - P. 1446-1448.

132. Kearney H.M., Thorland E.C., Brown K.K., Quintero-Rivera F., South S.T. American College of Medical Genetics recommendations for the design and performance expectations for clinical genomic copy number microarrays intended for use in the postnatal setting for detection of constitutional abnormalities // Genetics in Medicine. - 2011. - V. 13. - №. 7. - P. 676.

133. Kearney H.M., Thorland E.C., Brown K.K., Quintero-Rivera F., South S.T. American College of Medical Genetics standards and guidelines for interpretation and reporting of postnatal constitutional copy number variants // Genetics in Medicine.

- 2011a. - V. 13. - №. 7. - P. 680.

134. Kehrer M., Liehr T., Benkert,T. et al. Interstitial duplication of chromosome region 1q25.1q25.3: report of a patient with mild cognitive deficits, tall stature and facial dysmorphisms // American Journal of Medical Genetics Part A. - 2015. - V. 167.

- №. 3. - P. 653-656.

135. Kinchen J.M., Ravichandran K.S. Identification of two evolutionarily conserved genes regulating processing of engulfed apoptotic cells // Nature. - 2010. - V. 464. -№. 7289. - P. 778.

136. King B.H. Intellectual disability: Understanding its development, causes, classification, evaluation, and treatment // JAMA. - 2008. - V. 299. - №. 10. - P. 11941194.

137. Kirov G. CNVs in neuropsychiatric disorders // Human molecular genetics. -2015. - V. 24. - №. R1. - P. R45-R49.

138. Kirov G., Rees E., Walters J.T. et al. The penetrance of copy number variations for schizophrenia and developmental delay // Biological psychiatry. - 2014. - V. 75. -№. 5. - P. 378-385.