Хроматин-специфичная остановка РНК-полимераз на повреждениях ДНК\n

Герасимова Надежда Сергеевна

Хроматин-специфичная остановка РНК-полимераз на повреждениях ДНК\n тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Герасимова Надежда Сергеевна

Герасимова Надежда Сергеевна
кандидат наук
2016

Специальность ВАК РФ03.01.03

Количество страниц 104

$Герасимова Надежда Сергеевна. Хроматин-специфичная остановка РНК-полимераз на повреждениях ДНК\n: дис. кандидат наук: 03.01.03 - Молекулярная биология. ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова». 2016. 104 с.$

Оглавление диссертации кандидат наук Герасимова Надежда Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ТЕРМИНОЛОГИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ОДНОНИТЕВЫЕ РАЗРЫВЫ ДНК

2. ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК В ХРОМАТИНЕ

3. РЕПАРАЦИЯ ОДНОНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ ДНК

4. ТРАНСКРИПЦИЯ ХРОМАТИНА РНКП II

5. ЭФФЕКТ ОДНОНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ ДНК НА ТРАНСКРИПЦИЮ РНКП II

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. ФЕРМЕНТЫ И БЕЛКОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ

2. КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК

3. РЕАКТИВЫ

4. БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ И МНОГОКОМПОНЕНТНЫЕ РЕАКТИВЫ

5. КОММЕРЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ

6. ГОТОВЫЕ НАБОРЫ РЕАКТИВОВ

7. СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ

8. ОБОРУДОВАНИЕ

9. МЕТОДЫ

9.1. ОБЩАЯ СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА

9.2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СИСТЕМА

9.3. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

9.4. АМПЛИФИКАЦИЯ ФРАГМЕНТОВ ДНК МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)

39

9.5. ОЧИСТКА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ФЕНОЛОМ

9.6. ХОД ЭКСПЕРИМЕНТА

9.6.1. ПОЛУЧЕНИЕ ДНК-МАТРИЦ С ЗАДАННОЙ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ НА ОСНОВЕ СУЩЕСТВУЮЩЕЙ ДНК-МАТРИЦЫ

9.6.2. ПОЛУЧЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ ДНК С ИНТЕРЕСУЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ НУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ОПЫТОВ

9.6.3. ВНЕСЕНИЕ ПОЗИЦИОНИРОВАННЫХ ОДНОНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ ВО ФРАГМЕНТЫ ДНК ДЛЯ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ОПЫТОВ

9.6.4. СБОРКА НУКЛЕОСОМ

9.6.5. ТРАНСКРИПЦИЯ НУКЛЕОСОМ РНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ E. COLI IN VITRO

9.6.6. ПОЛУЧЕНИЕ РНК-МАРКЕРА ДЛЯ АНАЛИЗА ДЛИН ПРОДУКТОВ ТРАНСКРИПЦИИ

9.6.7. ПОЛУЧЕНИЕ ДНК-МАРКЕРА ДЛЯ АНАЛИЗА ДЛИН ПРОДУКТОВ ТРАНСКРИПЦИИ

9.6.8. АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ТРАНСКРИПТОВ ПО ДЛИНАМ МЕТОДОМ

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ В ПААГ В ДЕНАТУРИРУЮЩИХ УСЛОВИЯХ

9.7. ПОСТРОЕНИЕ ПРИМЕРНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСА ЭК+24 С РАЗРЫВОМ

НЕМАТРИЧНОЙ ЦЕПИ В ПОЛОЖЕНИИ +12 НПП

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СИСТЕМА

3. ПОЗИЦИОНИРОВАННЫЙ ОДНОНИТЕВОЙ РАЗРЫВ НЕМАТРИЧНОЙ ЦЕПИ ДНК МОЖЕТ ВЫЗЫВАТЬ ДИСКРЕТНУЮ НУКЛЕОСОМ-СПЕЦИФИЧНУЮ ОСТАНОВКУ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

4. ОСОБЕННОСТИ ОСТАНОВОК РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ НА РАЗРЫВАХ НЕМАТРИЧНОЙ ЦЕПИ НУКЛЕОСОМНОЙ ДНК

5. ПРЕДПОЛАГАЕМЫЙ МЕХАНИЗМ НУКЛЕОСОМ-СПЕЦИФИЧНОЙ ОСТАНОВКИ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ НА РАЗРЫВЕ НЕМАТРИЧНОЙ ЦЕПИ ДНК

6. ОБСУЖДЕНИЕ ПРЕДПОЛАГАЕМЫХ ФУНКЦИЙ ВНУТРИНУКЛЕОСОМНЫХ ПЕТЕЛЬ ДНК

7. ОБНАРУЖЕНИЕ РАЗРЫВОВ НЕМАТРИЧНОЙ ЦЕПИ С ПОМОЩЬЮ ВНУТРИНУКЛЕОСОМНЫХ ПЕТЕЛЬ ДНК

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

БЛАГОДАРНОСТИ

Список сокращений

АДФ (ADP) - аденозиндифосфат (Adenosine diphosphate)

А 1—Г " __" и и

АП-саит - апуриновыи или апиримидиновыи сайт

АТФ (ATP, А) - аденозинтрифосфат (Adenosine triphosphate)

АФК - активные формы кислорода

БСА, BSA - bovine serum albumin, бычий сывороточный альбумин ГТФ (GTP, G, Г) - гуанозинтрифосфат (Guanosine triphosphate) ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота кДа - килодальтон

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота мяРНК - малая ядерная рибонуклеиновая кислота НПП - нуклеосом-позиционирующая последовательность нт - нуклеотидных остатков

ОР, или SSB - однонитевой разрыв, single strand break

п.н. - пар нуклеотидных остатков

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

РНКП - РНК-полимераза

РНКП I - РНК-полимераза I

РНКП II - РНК-полимераза II

РНКП III - РНК-полимераза III

рРНК - рибосомная рибонуклеиновая кислота

тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота

УТФ (UTP, U, У) - уридинтрифосфат (Uridine triphosphate)

ЦТФ (CTP, C, Ц) - цитидинтрифосфат (Cytidine triphosphate)

ЭДТА, или EDTA - Ethylenediaminetetraacetic acid - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭК, или EC - элонгационный комплекс, elongation complex BER - base excision repair, эксцизионная репарация оснований dNTP - deoxynucleoside triphosphate - дезоксинуклеозидтрифосфат

FAM - fluorescein amidite, амидит флуоресцеина - флуоресцирующее производное

флуоресцеина с пиком поглощения при 495 нм и испускания - 520 нм,

применяемое при синтезе флуоресцеин-меченых олигонуклеотидов

FEN1 - flap structure-specific endonuclease 1, флэп-эндонуклеаза

H1 - histone 1, гистон Н1

H2A - histone 2А, гистон Н2А

H2B - histone 2B, гистон Н2В

H3 - histone 3, гистон Н3

H4 - histone 4, гистон Н4

L1 - лигаза

L3 - лигаза

LB - питательная среда Luria-Bertani Broth

NER - nucleotide excision repair, эксцизионная репарация нуклеотидов NTP - nucleoside triphosphate - нуклеозидтрифосфат

NT-SSB - single non-template strand break, однонитевой разрыв нематричной цепи ДНК

PAR - poly (ADP-ribose), поли(АДФ-рибоза)

PARG - poly (ADP-ribose) glycohydrolase, поли(АДФ-рибоза)-гликогидролаза PARP1 - poly (ADP-ribose) polymerase 1, поли(АДФ-рибоза)-полимераза 1 PCNA - proliferating cell nuclear antigen, ядерный антиген пролиферирующих клеток

PDB - protein data bank

Pol в - ДНК-полимераза в

Pol 8 - ДНК-полимераза

Pol е - ДНК-полимераза е

SSB - single strand break, однонитевой разрыв

TB - транскрипционный буфер, transcription buffer

TBE - Tris-borate-EDTA, трис-боратный электродный буфер

TC-NER - transcription-coupled nucleotide excision repair, ассоциированная с транскрипцией эксцизионная репарация нуклеотидов TOP1 - топоизомераза

XRCC1 - X-ray repair cross-complementing protein

ZF1 - домен типа «цинковый палец» 1 белка PARP1 ZF2 - домен типа «цинковый палец» 2 белка PARP1

Терминология

603 последовательность - нуклеосом-позиционирующая последовательность, предложенная в [Lowary, Widom, 1998], использованная в данной работе как основа для разработки нуклеосомных матриц для транскрипции. Внутринуклеосомная петля - петля ДНК, сформированная с помощью взаимодействий с гистонами одной нуклеосомы.

Гексасома - гексамер гистонов, состоящий из тетрамера гистонов Н3 и Н4 и одного димера Н2А-Н2В, сохраняющийся на ДНК после транскрипции по РНК-полимераза II - зависимому механизму.

Динуклеосома - фрагмент ДНК, содержащий две нуклеосомы. Мононуклеосома - фрагмент ДНК, содержащий одну нуклеосому. Разрыв +12 - однонитевой разрыв после двенадцатого нуклеотидного остатка нуклеосом-позиционирующей последовательности.

Нуклеосом-позиционирующая последовательность (НПП) - участок ДНК с последовательностью нуклеотидов, имеющей повышенное сродство к октамеру гистонов.

Нулевая (0) петля - внутринуклеосомная петля малого размера, содержащая транскрибирующий элонгационный комплекс РНК-полимеразы. Хроматин без гистона Н1 (донорный хроматин) - комплекс фрагментированной геномной ДНК и октамеров гистонов, выделенный из ядер эукариотических клеток (в данной работе куриных эритроцитов).

Элонгационный комплекс - комплекс, содержащий транскрибирующую РНК-полимеразу, ДНК и синтезируемую РНК.

РНКП П-зависимый механизм транскрипции хроматина - процесс элонгации РНК-полимеразы II через нуклеосому с сохранением положения нуклеосомы на ДНК, характеризующийся высоким нуклеосомным барьером и вытеснением одного из димеров Н2А-Н2В при умеренном уровне транскрипции.

Введение

Разрывы матричной цепи ДНК блокируют транскрипцию РНК-полимеразой II (РНКП II) in vivo и in vitro. Так как остановка РНКП II служит сигналом для начала процесса эксцизионной репарации нуклеотидов, ассоциированной с транскрипцией (transcription-coupled nucleotide excision repair, TC-NER), то часть скрытых в хроматиновой структуре разрывов может быть репарирована по такому пути. Тем не менее, разрывы, локализованные в нематричной цепи ДНК, не влияют существенно на транскрипцию свободной от гистонов ДНК in vitro, хотя они эффективно устраняются in vivo.

При умеренном уровне транскрипции РНКП II элонгация в хроматине происходит по сложному механизму, включающему формирование внутринуклеосомных петель ДНК и сохранение гистонов на ДНК во время транскрипции. Формирование альтернативных структур ДНК (таких, как внутринуклеосомные петли ДНК) может повлиять на процесс обнаружения и устранения повреждений в нематричной цепи ДНК. Эта возможность была оценена в предварительных экспериментах, которые показали, что разрывы, присутствующие в нематричной цепи ДНК, сильно влияют на скорость транскрипции нуклеосомной ДНК, но не транскрипции свободной от гистонов ДНК. Особенности такого влияния и его механизм стали предметом настоящего исследования.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Хроматин-специфичная остановка РНК-полимераз на повреждениях ДНК\n»

Актуальность исследования

Геном клетки постоянно подвергается разрушающему воздействию окружающей среды. Раннее выявление и восстановление поврежденной ДНК имеет большое значение для функционирования и выживания клеток.

Одними из самых частых повреждений ДНК оказываются однонитевые разрывы. В клетках млекопитающих такие нарушения распознаются белком поли (АДФ-рибоза)-полимеразой 1 (poly (ADP-ribose) polymerase 1, PARP1), и удаляются системой эксцизионной репарации оснований (base excision repair, BER). В ядрах эукариотических клеток ДНК упакована в хроматин - сложную надмолекулярную структуру, формирующуюся с участием большого числа белков-гистонов, мономером которой является нуклеосома. Многие исследования показали, что

организованная в нуклеосомы ДНК менее доступна для белков репарации, поэтому можно предположить, что часть включенных в хроматин разрывов будут скрыты от сенсорного белка PARP1.

Не устраненные разрывы препятствуют процессам транскрипции, репликации и репарации ДНК, индуцируют накопление двунитевых разрывов ДНК, увеличивают нестабильность генома и могут приводить к апоптозу, а нарушение путей репарации однонитевых разрывов приводит к развитию серьезных нейродегенеративных заболеваний. Таким образом, настоящее исследование актуально как для фундаментальной, так и для прикладной науки.

Цель исследования

Определить особенности и механизм действия разрывов нематричной цепи на эффективность транскрипции нуклеосомной ДНК по РНКП II - зависимому механизму.

Задачи исследования

Спроектировать и получить точно позиционированные нуклеосомы для транскрипции, содержащие одиночные однонитевые разрывы нематричной цепи ДНК в различных положениях на нуклеосом-позиционирующей последовательности. Провести эксперименты по транскрипции полученных матриц модельной РНК-полимеразой E. coli в различных экспериментальных условиях. По распределению остановок модельной РНК-полимеразы сделать выводы об особенностях и предполагаемому механизму влияния разрывов нематричной цепи на транскрипцию нуклеосомной ДНК.

Положения и результаты, выносимые на защиту

1. Одиночные разрывы нематричной цепи ДНК могут вызывать высокоэффективную, нуклеосом-специфичную остановку РНК-полимеразы E. coli при транскрипции.

2. Остановка РНК-полимеразы E. coli при транскрипции нуклеосом в присутствии одиночного разрыва нематричной цепи ДНК происходит после того, как активный центр фермента миновал положение разрыва и находится на расстоянии 7-12 п.н. от него.

3. Позиции остановок РНК-полимеразы E. coli при транскрипции нуклеосом в присутствии одиночных разрывов нематричной цепи ДНК дискретны и имеют 10-п.н. периодичность.

4. Определены три позиции остановок РНКП E. coli (+24, +34, +44 п.н. относительно ближайшей к промотору границы нуклеосомы).

5. Эффективность остановки РНК-полимеразы E. coli зависит от положения разрыва нематричной цепи в нуклеосоме.

6. Характер остановки РНК-полимеразы при транскрипции нуклеосом в присутствии одиночных разрывов нематричной цепи ДНК позволяет предположить, что остановка вызвана формированием небольших внутринуклеосомных петель ДНК.

7. Полученные данные позволяют предположить, что формирование небольшой внутринуклеосомной петли ДНК приводит к накоплению напряжений в двойной спирали при вращении РНК-полимеразы, облегчающих транскрипцию нуклеосом.

8. Полученные данные позволяют предположить, что разрывы нематричной цепи ДНК вызывают релаксацию напряжений двойной спирали, накопленных при прохождении РНК-полимеразы и облегчающих транскрипцию нуклеосом.

Научная новизна

В работе впервые показано, что разрывы нематричной цепи ДНК, в зависимости от их расположения в нуклеосомной структуре, могут вызывать почти полную остановку РНК-полимеразы. Такой эффект является хроматин-специфичным и не наблюдается на свободной от гистонов ДНК.

Известно, что остановка РНКП II in vivo служит сигналом к началу транскрипционно-зависимой ветви эксцизионной репарации нуклеотидов. Таким образом, в работе впервые были получены данные, позволяющие предположить существование хроматин-специфичного, транскрипционно-зависимого механизма, обеспечивающего обнаружение разрывов нематричной цепи ДНК, которые в противном случае оказываются скрытыми в нуклеосомной структуре и

недектируемыми другими системами репарации. Такой механизм является первым хроматин-специфичным способом распознавания повреждения ДНК.

Научно-практическая значимость работы

Настоящая работа предлагает возможность существования хроматин-специфичного узнавания повреждений ДНК и, таким образом, открывает новую тематику в исследованиях репарации хроматина.

Нарушения работы систем репарации однонитевых разрывов ДНК приводят к развитию нейродегенеративных заболеваний. При дальнейшем развитии тематики и доказанном эффекте разрывов нематричной цепи на эффективность транскрипции РНКП II in vivo могут быть найдены или спроектированы лекарственные средства, воздействующие на исследованный механизм детекции однонитевых разрывов.

Апробация работы и публикации

При подготовке материалов по теме диссертации опубликовано пять статей. Результаты данной работы докладывались на шести международных конференциях.

Обзор литературы

Геном клетки постоянно подвергается разрушающему воздействию окружающей среды. Накопление различных повреждений ДНК приводит к нарушению процессов метаболизма, возникновению мутаций и хромосомным перестройкам, раковому перерождению и апоптозу. Поддержание функциональности генетического аппарата клетки происходит за счет работы систем репарации. В некоторых случаях исходная структура ДНК восстанавливается в моноферментативной реакции. В большинстве же случаев за восстановление поврежденного участка отвечает сложный каскад ферментативных реакций. Некорректная работа систем репарации приводит к развитию тяжелых нарушений метаболизма. В ядрах эукариотических клеток ДНК упакована в хроматин, в котором должна успешно проходить её репарация. Исторически сложилось представление, что гистоны временно удаляются с репарируемой ДНК. В то же время накапливается все больше сведений в пользу того, что структура хроматина влияет на репарационный ответ, ограничивая его распространение, изменяя активность ферментов репарации, участвуя в определении пути ответа и возобновлении функциональности восстановленного участка генома [Christmann et al., 2003].

1. Однонитевые разрывы ДНК

Одними из самых частых повреждений ДНК являются однонитевые разрывы (single strand break, SSB). В клетке человека ежедневно под действием внешних и внутренних факторов возникают десятки тысяч таких нарушений.

Однонитевые разрывы образуются в результате различных процессов. Нарушение сахарофосфатного остова может происходить за счет спонтанного гидролиза ковалентых связей, но чаще всего разрывы возникают в результате атак активных форм кислорода (АФК) - различных и, как правило, небольших соединений, обладающих высокой химической активностью за счет неспаренного электрона на внешнем электронном уровне атома кислорода. АФК образуются в клетке под действием ионизирующего излучения и в результате химических реакций между экзогенными и/или эндогенными соединениями. К накоплению разрывов могут также приводить процессы клеточного метаболизма (абортивное

действие топоизомераз и ферментов репарации ДНК эксцизией оснований и нуклеотидов и др.) [Bradley, Kohn, 1979; Pogozelski, Tullius, 1998; Wang, 2002; Demple, DeMott, 2002; Hegde et al., 2008]. Сами по себе однонитевые разрывы не сказываются на структуре ДНК, однако их накопление может приводить к различным неблагоприятным последствиям. Не устраненные разрывы препятствуют процессам транскрипции, репликации и репарации, в которых ДНК используется как матрица. В активно делящихся клетках однонитевые разрывы индуцируют возникновение двунитевых, чем увеличивают нестабильность генома. Большое количество однонитевых разрывов может приводить к апоптозу. В покоящихся и дифференцированных клетках однонитевые разрывы нарушают транскрипцию, что сказывается на клеточном метаболизме. Особенно чувствительной к накоплению однонитевых разрывов оказываются клетки нервной системы, поэтому нарушение путей репарации однонитевых разрывов приводит к развитию серьезных нейродегенеративных заболеваний (рассмотренных в [Caldecott, 2008a; Reynolds, Stewart, 2013; Iyama, Wilson, 2013; Caldecott, 2014b]).

В большинстве случаев 5'- и/или З'-концы, образующиеся при однонитевом

разрыве ДНК, модифицированы и, следовательно, не доступны для немедленного

лигирования. Поэтому как и в случаях других повреждений, репарация

однонитевых разрывов начинается с их детекции. Сенсором однонитевых разрывов

считается белок поли(АДФ-рибоза)-полимераза 1 (PARP1). PARP1 постоянно,

независимо от наличия повреждений находится в хроматиновой структуре в

большом количестве (2*10л5 молекул на ядро [Ludwig et al., 1988]), и

взаимодействует с сахарофосфатным остовом ДНК через домен типа «цинковый

палец» ZF1 [Ju et al., 2004; Kim et al., 2004; Tulin, Spradling, 2003]. В присутствии

однонитевого разрыва один из свободных концов поврежденной цепи связывается

со вторым доменом типа «цинковый палец» ZF2. Так как участок с разрывом

сахарофосфатного остова становится более подвижным, при некотором развороте

ДНК со вторым свободным концом по такому же принципу связывается вторая

молекула PARP1. Благодаря близости двух молекул PARP1, совместно

находящихся в месте повреждения ДНК, каталитический домен одной молекулы

модифицирует акцепторный сайт другой, образуя на ней разветвленную цепь

поли(АДФ-рибозы), что и является непосредственным сигналом к началу

- 13 -

репарационного ответа [Ali et al., 2012] (модель связывания мононуклеотидной бреши доменами типа «цинковый палец» и механизм транс-аутомодификации PARP1 при связывании с однонитевым разрывом приведены на рисунке 2).

Обнаруженный разрыв легко удаляется по пути эксцизионной репарации оснований (base excision repair, BER) [Le Cam et al., 1994; Weinfeld et al., 1997; Caldecott, 2008a; Caldecott, 2014a; Caldecott, 2014b] (основные этапы репарационного ответа схематически представлены на рисунке 3). Так, к месту повреждения привлекаются белки, восстанавливающие концы ДНК, заполняющие образовавшуюся брешь и лигирующие концы ДНК.

Основание ч г $ Фосфат "О-р—о о- -0-™ ДНК

Основание ч У но - о-ла ДНК

Основание ч У о— ДНК

,Д) -о-р-о 1 0" -о— ДНК

Основание "Г>А„ о и но\/ II и / ^О-Р-О-Р-О 1 1 О" О" -о— ДНК

Неповрежденный 5'-конец

5'- гидроксил

ТОР1 (ингибиторы топоизомеразы!, АФК, генотоксины)

5'- альдегид

Прямой разрыв (АФК)

5'- дезоксирибофосфат (АП-сайт)

Опосредованный разрыв, ВЕК (АФК, алкшшрующие агенты, спонтанное повреждение и/или потеря основания)

5'-АМФ

Абортивная активность лигазы

Б

Рисунок 1. Варианты модификаций 5'- и 3'-концов ДНК в месте однонитевого разрыва и основные причины их возникновения (А и Б,

соответственно; по [СаШесоИ, 2008Ь]).

Б

Рисунок 2. Детекция однонитевых разрывов ДНК белком PARP1. А)

Модель узнавания однонуклеотидной бреши двумя доменами типа «цинковый палец» белка PARP1. ZF2 связывается со свободным концом поврежденной цепи ДНК (зелёной), в то время как ZF1 связывает сахарофосфатный остов неповрежденной цепи (выделенной фиолетовым цветом) (другие домены белка PARP1 не показаны). Б) Механизм транс-аутомодификации PARP1 при взаимодействии с однонитевым разрывом. PARP1 независимо от наличия повреждений связан с хроматиновой структурой через относительно слабые взаимодействия домена ZF1 с сахарофосфатным остовом ДНК (1). При возникновении разрыва происходит связывание свободного конца цепи ДНК с доменом ZF2 (2). С другим свободным концом поврежденной цепи связывается вторая молекула PARP1 (3). Каталитический домен одной из молекул поли(АДФ)-рибозилирует акцепторный участок другой молекулы (4), что и служит сигналом к привлечению репарационных белков (по [Ali et al., 2012]). Неповрежденные цепи ДНК выделены фиолетовым цветом, цепи с разрывом - зеленым. ZF1 выделен голубым цветом, ZF2 - жёлтым. Другие домены белка PARP1 обозначены серым цветом. Модифицированный поли(АДФ-рибозой) акцепторный участок одной из молекул PARP1 выделен красным цветом.

Поврежденная цепь

Рисунок 3. Схема процесса репарации однонитевых разрывов ДНК.

PARP1 связывает однонитевой разрыв, что приводит к его транс-аутомодификации (7^2). Поли(АДФ-рибоза) привлекает белки репарации (3). Прежде всего происходит восстановление функциональности 3'-конца, с которого происходит встраивание одного или более нуклеотидных остатков (левая и правая ветви реакций, соответственно) (4). В случае встраивания одного остатка 5'-конец также восстанавливается. В случае достраивания большего количества нуклеотидных остатков это не требуется, так как вытесненный участок ДНК удаляется эндонуклеазой FEN1. На последнем этапе происходит лигирование концов ДНК и восстановление её первичной структуры (5) [Caldecott, 2007; Caldecott, 2014Ь].

2. Повреждения ДНК в хроматине

В эукариотических клетках ядерная ДНК организована в хроматин -сложную надмолекулярную структуру с участием большого числа белков. Для поддержания стабильности и работоспособности генома репарация ДНК должна успешно проходить в хроматиновом окружении.

Мономеры хроматина - нуклеосомы - компактные комплексы участка ДНК и белков-гистонов. Нуклеосомы состоят из нуклеосомного ядра (сердцевины), промежуточного участка ДНК (линкера) и линкерного гистона Н1. Опоясанный 146 п.н. ДНК белковый октамер из центрального тетрамера (H3-H4)2, окруженного двумя димерами H2A-H2B, имеющий форму диска с диаметром около 11 нм и высотой около 5,7 нм, составляет нуклеосомную сердцевину [Kornberg, Thomas, 1974; Luger et al., 1997]. Молекулярная масса такого комплекса составляет около 210 кДа. Сердцевинные гистоны имеют общий план строения, называемый гистоновой укладкой: две короткие альфа-спирали и длинная средняя альфа-спираль, разделенные небольшими мостиками [Arents, Moudrianakis, 1995]. За связывание Н3-Н4 димеров между собой отвечают взаимодействия между гистонами Н3, а за связывание центрального тетрамера с Н2А-Н2В димерами -взаимодействия между гистонами Н4 и Н2В. Взаимодействия между гистонами Н3 гораздо менее гидрофобны, поэтому легко сохраняются при более низких ионных силах. Поэтому при физиологических условиях центральный тетрамер стабилен, а октамер стабилен только при высоких концентрациях солей или при стабилизации ДНК [Workman, Kingston, 1998]. На рисунке 4 изображена кристаллографическая структура нуклеосомного ядра с выделенными разными цветами гистонами.

Особую роль выполняют N-концевые участки - «хвосты» гистонов -наиболее часто подвергаемые посттрансляционным модификациям. Они наименее структурированы и выходят за границы нуклеосомного ядра, что позволяет им взаимодействовать с ДНК и белками [Arents, Moudrianakis, 1995].

Организация ДНК в надмолекулярные структуры защищает её от многих разрушающих воздействий. Например, большие участки нуклеосомной ДНК оказываются недоступными для нуклеаз [Noll, 1974; Wigler, Axel, 1976]. Такое экранирование распространяется не только на относительно крупные молекулы

ферментов, но и на очень небольшие агенты, например, гидроксильные радикалы [Hayes et al., 1990]. Экранирование ДНК в хроматине не распространяется, видимо, только на прямое воздействие ультрафиолета и радиации [Tijsterman et al., 1999].

Рисунок 4. Кристаллографическая структура нуклеосомной сердцевины. http://www.molecularstation.com/ru/molecular-biology-images/502-dna-pictures/59-nucleosome-crystal-structure.html. Красным цветом обозначены гистоны Н2В, желтым - Н2А, синим - Н3, зеленым - Н4. На рисунке обозначены альфа-спирали и ^концевые «хвосты» гистонов.

Будучи довольно стабильными структурами, нуклеосомы сохраняются даже при значительных изменениях ДНК [Odell et 2013], поэтому защита ДНК от взаимодействия с окружающими веществами оказывается и негативным фактором, замедляющим поиск и репарацию повреждений. Это можно объяснить в рамках теории, предполагающей, что поиск нарушений ДНК сенсорными белками идет в два этапа. Первый заключается в неспецифическом связывании молекулы фермента с ДНК при диффузии в объеме - трехмерном пространстве. После связывания белок начинает одномерное сканирование ДНК до связывания с повреждением [ВЫпеу et г!, 2009]. Таким образом, нуклеосома будет затруднять протекание обоих этапов распознавания.

Действительно, организация ДНК в нуклеосомы заметно снижает ее

доступность для белков репарации. В неделящихся, покоящихся клетках NER идет

- 19 -

медленно, преимущественно в активно транскрибируемых генах [Nouspikel, Hanawalt, 2002]. Фотоповреждения в нематричной цепи ДНК транскрибируемых, но сохраняющих нуклеосомную структуру генов удаляются с характерной периодичностью, указывающей на менее эффективную репарацию ДНК в составе нуклеосом [Tijsterman et al., 1999]. Фермент системы BER - урацил-ДНК-гликозилаза - заметно лучше связывает уридиловые остатки, направленные к поверхности нуклеосомы [Hinz et al., 2010]. Видимо, по этой причине в участках конденсированного хроматина наблюдается большее количество мутаций, чем в ДНК активных геномных локусов [Teytelman et al., 2008; Schuster-Bockler, Lehner, 2012].

3. Репарация однонитевых разрывов ДНК

Ранее было показано, что PARP1 как минимум на порядок менее эффективно связывает неповрежденную нуклеосомную ДНК, чем свободную от гистонов [Clark et al., 2012]. Таким образом, связывание домена ZF1 заметно ухудшается при организации ДНК в хроматин. Исходя из модели механизма распознавания однонитевых разрывов белком PARP1, предложенной в [Eustermann et al., 2011; Ali et al., 2012] и представленной на рисунке 2, обнаружение и связывание по крайней мере некоторых разрывов ДНК в нуклеосомной структуре будет пространственно затруднено.

Некоторые не поддающиеся детекции разрывы могут быть обнаружены процессивными ферментами, перемещающимися вдоль ДНК. В частности, разрывы матричной цепи ДНК блокируют транскрипцию РНК-полимеразой 2 (РНКП II) in vivo и in vitro [Zhou, Doetsch, 1993; Kathe et al., 2004]. Остановка РНКП II служит сигналом для начала процесса эксцизионной репарации нуклеотидов, ассоциированной с транскрипцией (transcription-coupled nucleotide excision repair, TC-NER). Таким образом, в транскрипционно активных клетках, остановка РНКП II может служить сигналом к репарации однонитевого разрыва матричной цепи транскрибируемого участка ДНК [Fousteri, Mullenders, 2008]. Тем не менее, разрывы, локализованные в нематричной цепи ДНК (NT-SSBs), не влияют существенно на транскрипцию свободной от гистонов ДНК in vitro [Belotserkovskii

et al., 2013], хотя они эффективно устраняются in vivo [Bielas, 2006; Dorazi et al., 2007].

Несмотря на то, что на глобальном уровне удаление однонитевых разрывов происходит через активацию системы BER, есть некоторые свидетельства, что путь TC-NER также может быть задействован при репарации однонитевых разрывов [Flohr et al., 2003; Khobta et al., 2010]. Так, для удаления некоторых однонитевых разрывов ДНК оказывается необходимой активность белка CSB (Cockayne syndrome group B), действие которого характерно и специфично для транскрипционно-зависимого пути NER [Fousteri, Mullenders, 2008].

Из-за протекторных свойств ДНК-связывающих белков, повреждения чаще происходят в менее конденсированном хроматине. Недавно было показано, что доступность ДНК может довольно значительно сказываться на интенсивности повреждения [Strand et al., 2014]. Таким образом, под ударом находятся активно открытые участки генома и транскрибируемые гены, тем не менее уровень мутаций в этих участках оказывается ниже, чем в участках высококонденсированного хроматина [Teytelman et al., 2008; Schuster-Bóckler, Lehner, 2012]. Это увеличивает роль транскрипционно-зависимой ветви NER (transcription-coupled NER, TC-NER), сигналом для начала которой служит остановка РНКП II на повреждении.

Абсолютное большинство генов транскрибируется РНКП II. При высоком уровне транскрипции происходит потеря нуклеосом, в то время как при умеренном уровне транскрипции РНКП II сохраняется нуклеосомная структура генов. РНКП II сравнима по размеру с нуклеосомой, поэтому механизм транскрипции РНКП II через нуклеосому представляет собой фундаментальный интерес для понимания процессов регуляции транскрипции и сохранения гистонового «кода».

4. Транскрипция хроматина РНКП II

Транскрипция - это ферментативный синтез РНК на матрице ДНК. Она осуществляется ДНК-зависимыми РНК-полимеразами и происходит при участии белковых факторов, выполняющих различные функции. Прокариоты имеют одну РНК-полимеразу (РНКП), ответственную за транскрипцию всех типов РНК. Эукариотические организмы имеют одну митохондриальную и как минимум 3

ядерных РНК-полимеразы (1, 2 и 3), каждая из которых участвует в синтезе разных типов клеточных РНК.

Процесс транскрипции состоит из нескольких этапов: связывания промотора РНК-полимеразой, инициации, элонгации и терминации. Регуляция транскрипции - ключевой момент в клеточном развитии. Каждый из этапов (особенно первые три) в той или иной степени регулируется с участием различных генетических и эпигенетических механизмов.

О транскрипции хроматина РНК-полимеразой 1, ответственной за синтез рибосомных РНК, кроме 5S рРНК, известно крайне мало. РНК-полимераза III (РНКП III) участвует в транскрипции тРНК, 5S рРНК, U6 мяРНК и ряда других малых РНК. Считается, что абсолютное большинство генов, транскрибируемых третьей эукариотической РНК-полимеразой, довольно короткие, и они все время покрыты транскрипционными факторами, мешающими посадке нуклеосом [Gerlach et al., 1995]. Тем не менее, механизм, характерный для РНКП III и РНК-полимеразы бактериофагов SP6 и Т7, отличается внутриматричным переносом октамера гистонов с находящейся впереди ДНК на пройденную без потери/обмена гистонов H2A-H2B, и относительно низким нуклеосомным барьером [Studitsky et al., 1995; Studitsky et al., 1994; Studitsky et al., 1997; Bednar et al., 1999].

Большинство клеточных некодирующих регуляторных РНК и все мРНК синтезируются РНКП II. Наиболее изученной в отношении механизма элонгации через нуклеосомы сейчас является РНК-полимераза II.

РНК-полимераза II (РНКП II) представляет собой гетеромультимерный комплекс общей массой более 500 кДа, состоящий из 12 различных субъединиц [Meyer et al., 2006]. Во время транскрипции РНКП II делает полный оборот каждые 10 п.н. вдоль спирали ДНК, двигаясь через сильно компактизованную структуру хроматина [Gnatt et al., 2001]. Нуклеосомная упаковка хроматина существенно затрудняет как доступ ферментов и факторов транскрипции к ДНК, так и движение транскрибирующей РНКП II. Таким образом, расположение нуклеосом регулирует доступность ДНК, препятствуя или способствуя связыванию транскрипционных факторов и РНК-полимераз [Zhao et al., 2001; Whitehouse et al., 2007; Lam et al., 2008; Boeger et al., 2008; Petesch, Lis, 2008; Kim, O'Shea, 2008]. Несмотря на то, что

хроматин удаляется при активации генов в живых клетках, кодирующие области умеренно транскрибируемых генов остаются упакованными в нуклеосомы [Hartzog et al., 2002]. Нуклеосомы могут быть временно удалены из эукариотических генов при высоком уровне транскрипции [Lee et al., 2004; Kristjuhan, Svejstrup, 2004; Schwabish, Struhl, 2004], но большинство транскрибируемых генов сохраняют нуклеосомную организацию, и, таким образом, как правило, РНКП II сталкивается с нуклеосомами во время элонгации.

Элонгация протяженных участков ДНК (до более сотен тысяч п.н.), организованных в нуклеосомы, происходит с высокой скоростью (3-4 тысячи п.н. в минуту [Singh, Padgett, 2009]). Подобная скорость транскрипции наблюдается in vitro на ДНК, свободной от гистонов [Izban, Luse, 1992; Cheng, Price, 2007].

Каким образом РНКП II преодолевает нуклеосомный барьер во время транскрипции? Схема, обобщающая результаты многолетних исследований, представлена на рисунке 5 [Kulaeva et al., 2013]. При приближении (комплекс 1) и вхождении в нуклеосому РНКП II (комплекс 2), происходит частичное разворачивание ДНК, находящейся сзади фермента от октамера гистонов [Kulaeva et al., 2009]. Прохождение барьера опосредуется с помощью формирования в +49 положении внутринуклеосомной петли ДНК очень небольшого размера (нулевой петли, рисунок 5, комплекс 3). Название нулевой петли данная структура получила вследствие своих малых размеров. В данном комплексе сохраняются исходные, «пре-транскрипционные» ДНК-гистоновые взаимодействия как в области, находящейся перед транскрибирующей РНКП II, так и в области, уже пройденной ферментом. Следует отметить ряд особенностей элонгационного комплекса, содержащего нулевую петлю, выявленных анализом модели комплекса высокого разрешения [Kulaeva et al., 2009]. Важно отметить, что структура ЭК +49 несовместима с наличием двух витков нуклеосомной ДНК; в такой структуре один ДНК виток должен быть вытеснен. В результате формирования нулевой петли происходит стерическое вытеснение и разворачивание нуклеосомной ДНК по ходу движения РНКП II и облегчение дальнейшей транскрипции (рисунок 5, комплекс 4). Затем происходит реформирование исходных ДНК-гистоновых взаимодействий и восстановление структуры нуклеосом после прохождения их РНКП II.

Рисунок 5. Модель транскрипции РНКП II через нуклеосому [Kulaeva et 81., 2009]. РНК-полимераза подходит к нуклеосоме ((1), маленькая стрелка показывает направление транскрипции), ДНК частично разворачивается с октамера (2). Затем формируется временная 0-петля в позиции +49 (3), ДНК-гистоновые контакты перед ферментом позволяют восстановить взаимодействия после РНК-полимеразы. Таким образом, гистоновый октамер или гексамер сохраняется. Затем РНК-полимераза замещает промотор-дистальный участок нуклеосомной ДНК (4).

Во время транскрипции через нуклеосому нулевая петля формируется по

крайней мере дважды, в +39 и +49 положениях [Kulaeva et я1., 2009; Hsieh et

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Герасимова Надежда Сергеевна, 2016 год

Список использованной литературы

1. Ali A.A.E., Timinszky G., Arribas-Bosacoma R., Kozlowski M., Hassa P.O., Hassler M., Ladurner A.G., Pearl L.H., Oliver A.W. The zinc-finger domains of PARP1 cooperate to recognize DNA strand breaks // Nat. Struct. Mol. Biol. 2012. Т. 19. № 7. С. 685-692.

2. Arents G., Moudrianakis E.N. The histone fold: a ubiquitous architectural motif utilized in DNA compaction and protein dimerization // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. Т. 92. № 24. С. 11170-11174.

3. Artsimovitch I., Svetlov V., Murakami K.S., Landick R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions // J. Biol. Chem. 2003. Т. 278. № 14. С. 12344-12355.

4. Ausio J., Seger D., Eisenberg H. Nucleosome core particle stability and conformational change. Effect of temperature, particle and NaCl concentrations, and crosslinking of histone H3 sulfhydryl groups // J. Mol. Biol. 1984. Т. 176. № 1. С. 77-104.

5. Bancaud A., Wagner G., Conde E Silva N., Lavelle C., Wong H., Mozziconacci J., Barbi M., Sivolob A., Le Cam E., Mouawad L., Viovy J.-L., Victor J.-M., Prunell A. Nucleosome chiral transition under positive torsional stress in single chromatin fibers // Mol. Cell. 2007. Т. 27. № 1. С. 135-147.

6. Bazett-Jones D.P., Mendez E., Czarnota G.J., Ottensmeyer F.P., Allfrey V.G. Visualization and analysis of unfolded nucleosomes associated with transcribing chromatin // Nucleic Acids Res. 1996. Т. 24. № 2. С. 321-329.

7. Bednar J., Studitsky V.M., Grigoryev S.A., Felsenfeld G., Woodcock C.L. The nature of the nucleosomal barrier to transcription: direct observation of paused intermediates by electron cryomicroscopy // Mol. Cell. 1999. Т. 4. № 3. С. 377-386.

8. Belotserkovskii B.P., Neil A.J., Saleh S.S., Shin J.H.S., Mirkin S.M., Hanawalt P.C. Transcription blockage by homopurine DNA sequences: role of sequence composition and single-strand breaks // Nucleic Acids Res. 2013. Т. 41. № 3. С. 1817-1828.

9. Bielas J.H. Non-transcribed strand repair revealed in quiescent cells // Mutagenesis. 2006. T. 21. № 1. C. 49-53.

10. Blainey P.C., Luo G., Kou S.C., Mangel W.F., Verdine G.L., Bagchi B., Xie X.S. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA // Nat. Struct. Mol. Biol. 2009. T. 16. № 12. C. 1224-1229.

11. Boeger H., Griesenbeck J., Kornberg R.D. Nucleosome retention and the stochastic nature of promoter chromatin remodeling for transcription // Cell. 2008. T. 133. № 4. C.716-726.

12. Bondarenko V.A., Steele L.M., Ujvâri A., Gaykalova D.A., Kulaeva O.I., Polikanov Y.S., Luse D.S., Studitsky V.M. Nucleosomes can form a polar barrier to transcript elongation by RNA polymerase II // Mol. Cell. 2006. T. 24. № 3. C. 469-479.

13. Bradley M.O., Kohn K.W. X-ray induced DNA double strand break production and repair in mammalian cells as measured by neutral filter elution // Nucleic Acids Res. 1979. T. 7. № 3. C. 793-804.

14. Brenowitz M., Senear D.F., Shea M.A., Ackers G.K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions // Methods Enzymol. 1986. T. 130. C. 132-181.

15. Caldecott K.W. DNA single-strand break repair // Exp. Cell Res. 2014b. T. 329. № 1. C. 2-8.

16. Caldecott K.W. Mammalian single-strand break repair: mechanisms and links with chromatin // DNA Repair. 2007. T. 6. № 4. C. 443-453.

17. Caldecott K.W. Protein ADP-ribosylation and the cellular response to DNA strand breaks // DNA Repair. 2014a. T. 19. C. 108-113.

18. Caldecott K.W. Single-strand break repair and genetic disease // Nat. Rev. Genet. 2008a. T. 9. № 8. C. 619-631.

19. Caldecott K.W. Single-strand break repair and genetic disease // Nat. Rev. Genet. 2008b. T. 9. № 8. C. 619-631.

20. Chang H.-W., Kulaeva O.I., Shaytan A.K., Kibanov M., Kuznedelov K., Severinov K.V., Kirpichnikov M.P., Clark D.J., Studitsky V.M. Analysis of the mechanism of

nucleosome survival during transcription // Nucleic Acids Res. 2014. T. 42. № 3. C. 1619-1627.

21. Chen T.A., Allfrey V.G. Rapid and reversible changes in nucleosome structure accompany the activation, repression, and superinduction of murine fibroblast protooncogenes c-fos and c-myc // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987. T. 84. № 15. C.5252-5256.

22. Chen T.A., Smith M.M., Le S.Y., Sternglanz R., Allfrey V.G. Nucleosome fractionation by mercury affinity chromatography. Contrasting distribution of transcriptionally active DNA sequences and acetylated histones in nucleosome fractions of wild-type yeast cells and cells expressing a histone H3 gene altered to encode a cysteine 110 residue // J. Biol. Chem. 1991. T. 266. № 10. C. 6489-6498.

23. Cheng B., Price D.H. Properties of RNA polymerase II elongation complexes before and after the P-TEFb-mediated transition into productive elongation // J. Biol. Chem. 2007. T. 282. № 30. C. 21901-21912.

24. Christmann M., Tomicic M.T., Roos W.P., Kaina B. Mechanisms of human DNA repair: an update // Toxicology. 2003. T. 193. № 1-2. C. 3-34.

25. Clark N.J., Kramer M., Muthurajan U.M., Luger K. Alternative modes of binding of poly(ADP-ribose) polymerase 1 to free DNA and nucleosomes // J. Biol. Chem. 2012. T. 287. № 39. C. 32430-32439.

26. Cole H.A., Nagarajavel V., Clark D.J. Perfect and imperfect nucleosome positioning in yeast // Biochim. Biophys. Acta. 2012. T. 1819. № 7. C. 639-643.

27. Cramer P., Bushnell D.A., Kornberg R.D. Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 angstrom resolution // Science. 2001. T. 292. № 5523. C. 18631876.

28. Demple B., DeMott M.S. Dynamics and diversions in base excision DNA repair of oxidized abasic lesions // Oncogene. 2002. T. 21. № 58. C. 8926-8934.

29. Dion M.F., Kaplan T., Kim M., Buratowski S., Friedman N., Rando O.J. Dynamics of replication-independent histone turnover in budding yeast // Science. 2007. T. 315. № 5817. C. 1405-1408.

30. Dorazi R., Götz D., Munro S., Bernander R., White M.F. Equal rates of repair of DNA photoproducts in transcribed and non-transcribed strands in Sulfolobus solfataricus // Mol. Microbiol. 2007. T. 63. № 2. C. 521-529.

31. Enright H.U., Miller W.J., Hebbel R.P. Nucleosomal histone protein protects DNA from iron-mediated damage // Nucleic Acids Res. 1992. T. 20. № 13. C. 3341-3346.

32. Eustermann S., Videler H., Yang J.-C., Cole P.T., Gruszka D., Veprintsev D., Neuhaus D. The DNA-binding domain of human PARP-1 interacts with DNA singlestrand breaks as a monomer through its second zinc finger // J. Mol. Biol. 2011. T. 407. № 1. C. 149-170.

33. Feser J., Truong D., Das C., Carson J.J., Kieft J., Harkness T., Tyler J.K. Elevated histone expression promotes life span extension // Mol. Cell. 2010. T. 39. № 5. C. 724-735.

34. Flohr C., Bürkle A., Radicella J.P., Epe B. Poly(ADP-ribosyl)ation accelerates DNA repair in a pathway dependent on Cockayne syndrome B protein // Nucleic Acids Res. 2003. T. 31. № 18. C. 5332-5337.

35. Fousteri M., Mullenders L.H.F. Transcription-coupled nucleotide excision repair in mammalian cells: molecular mechanisms and biological effects // Cell Res. 2008. T. 18. № 1. C. 73-84.

36. Fu J., Gnatt A.L., Bushnell D.A., Jensen G.J., Thompson N.E., Burgess R.R., David P.R., Kornberg R.D. Yeast RNA polymerase II at 5 A resolution // Cell. 1999. T. 98. № 6. C. 799-810.

37. Gaykalova D.A., Kulaeva O.I., Bondarenko V.A., Studitsky V.M. Preparation and analysis of uniquely positioned mononucleosomes // Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 2009. T. 523. C. 109-123.

38. Gerlach V.L., Whitehall S.K., Geiduschek E.P., Brow D.A. TFIIIB placement on a yeast U6 RNA gene in vivo is directed primarily by TFIIIC rather than by sequence-specific DNA contacts // Mol. Cell. Biol. 1995. T. 15. № 3. C. 1455-1466.

39. Gnatt A.L., Cramer P., Fu J., Bushnell D.A., Kornberg R.D. Structural basis of

transcription: an RNA polymerase II elongation complex at 3.3 A resolution //

Science. 2001. T. 292. № 5523. C. 1876-1882.

- 86 -

40. Harp J.M., Hanson B.L., Timm D.E., Bunick G.J. Asymmetries in the nucleosome core particle at 2.5 A resolution // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2000. T. 56. № Pt 12. C. 1513-1534.

41. Hartzog G.A., Speer J.L., Lindstrom D.L. Transcript elongation on a nucleoprotein template // Biochim. Biophys. Acta. 2002. T. 1577. № 2. C. 276-286.

42. Hayes J.J., Tullius T.D., Wolffe A.P. The structure of DNA in a nucleosome // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990. T. 87. № 19. C. 7405-7409.

43. Hegde M.L., Hazra T.K., Mitra S. Early steps in the DNA base excision/single-strand interruption repair pathway in mammalian cells // Cell Res. 2008. T. 18. № 1. C. 2747.

44. Heinemann U., Alings C., Bansal M. Double helix conformation, groove dimensions and ligand binding potential of a G/C stretch in B-DNA // EMBO J. 1992. T. 11. № 5. C. 1931-1939.

45. Hinz J.M., Rodriguez Y., Smerdon M.J. Rotational dynamics of DNA on the nucleosome surface markedly impact accessibility to a DNA repair enzyme // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2010. T. 107. № 10. C. 4646-4651.

46. Hsieh F.-K., Fisher M., Ujvari A., Studitsky V.M., Luse D.S. Histone Sin mutations promote nucleosome traversal and histone displacement by RNA polymerase II // EMBO Rep. 2010. T. 11. № 9. C. 705-710.

47. Hughes A.L., Rando O.J. Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo // Annu. Rev. Biophys. 2014. T. 43. C. 41-63.

48. Iyama T., Wilson D.M. DNA repair mechanisms in dividing and non-dividing cells // DNA Repair. 2013. T. 12. № 8. C. 620-636.

49. Izban M.G., Luse D.S. Factor-stimulated RNA polymerase II transcribes at physiological elongation rates on naked DNA but very poorly on chromatin templates // J. Biol. Chem. 1992. T. 267. № 19. C. 13647-13655.

50. Jamai A., Imoberdorf R.M., Strubin M. Continuous histone H2B and transcription-dependent histone H3 exchange in yeast cells outside of replication // Mol. Cell. 2007. T. 25. № 3. C. 345-355.

51. Jiang C., Pugh B.F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics // Nat. Rev. Genet. 2009. Т. 10. № 3. С. 161-172.

52. Ju B.-G., Solum D., Song E.J., Lee K.-J., Rose D.W., Glass C.K., Rosenfeld M.G. Activating the PARP-1 sensor component of the groucho/ TLE1 corepressor complex mediates a CaMKinase Ildelta-dependent neurogenic gene activation pathway // Cell. 2004. Т. 119. № 6. С. 815-829.

53. Kathe S.D., Shen G.-P., Wallace S.S. Single-stranded breaks in DNA but not oxidative DNA base damages block transcriptional elongation by RNA polymerase II in HeLa cell nuclear extracts // J. Biol. Chem. 2004. Т. 279. № 18. С. 18511-18520.

54. Khobta A., Lingg T., Schulz I., Warken D., Kitsera N., Epe B. Mouse CSB protein is important for gene expression in the presence of a single-strand break in the non-transcribed DNA strand // DNA Repair. 2010. Т. 9. № 9. С. 985-993.

55. Kim H.D., O'Shea E.K. A quantitative model of transcription factor-activated gene expression // Nat. Struct. Mol. Biol. 2008. Т. 15. № 11. С. 1192-1198.

56. Kim M.Y., Mauro S., Gévry N., Lis J.T., Kraus W.L. NAD+-dependent modulation of chromatin structure and transcription by nucleosome binding properties of PARP-1 // Cell. 2004. Т. 119. № 6. С. 803-814.

57. Kireeva M.L., Komissarova N., Waugh D.S., Kashlev M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex // J. Biol. Chem. 2000. Т. 275. № 9. С. 6530-6536.

58. Kireeva M.L., Walter W., Tchernajenko V., Bondarenko V., Kashlev M., Studitsky V.M. Nucleosome remodeling induced by RNA polymerase II: loss of the H2A/H2B dimer during transcription // Mol. Cell. 2002. Т. 9. № 3. С. 541-552.

59. Kornberg R.D., Thomas J.O. Chromatin structure; oligomers of the histones // Science. 1974. Т. 184. № 4139. С. 865-868.

60. Korzheva N., Mustaev A. Transcription elongation complex: structure and function // Curr. Opin. Microbiol. 2001. Т. 4. № 2. С. 119-125.

61. Kristjuhan A., Svejstrup J.Q. Evidence for distinct mechanisms facilitating transcript elongation through chromatin in vivo // EMBO J. 2004. Т. 23. № 21. С. 4243-4252.

62. Kulaeva O.I., Gaykalova D.A., Pestov N.A., Golovastov V.V., Vassylyev D.G., Artsimovitch I., Studitsky V.M. Mechanism of chromatin remodeling and recovery during passage of RNA polymerase II // Nat. Struct. Mol. Biol. 2009. T. 16. № 12. C. 1272-1278.

63. Kulaeva O.I., Gaykalova D.A., Studitsky V.M. Transcription through chromatin by RNA polymerase II: histone displacement and exchange // Mutat. Res. 2007. T. 618. № 1-2. C. 116-129.

64. Kulaeva O.I., Hsieh F.-K., Studitsky V.M. RNA polymerase complexes cooperate to relieve the nucleosomal barrier and evict histones // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2010. T. 107. № 25. C. 11325-11330.

65. Kulaeva O.I., Maliuchenko N.V., Nikitin D.V., Demidenko A.V., Chertkov O.V., Efimova N.S., Kirpichnikov M.P., Studitskii V.M. [Molecular mechanisms of transcription through a nuclesome by RNA polymerase II] // Mol. Biol. (Mosk.). 2013. T. 47. № 5. C. 754-766.

66. Lam F.H., Steger D.J., O'Shea E.K. Chromatin decouples promoter threshold from dynamic range // Nature. 2008. T. 453. № 7192. C. 246-250.

67. Lavelle C. Forces and torques in the nucleus: chromatin under mechanical constraints // Biochem. Cell Biol. Biochim. Biol. Cell. 2009. T. 87. № 1. C. 307-322.

68. Le Cam E., Fack F., Menissier-de Murcia J., Cognet J.A., Barbin A., Sarantoglou V., Revet B., Delain E., Murcia G. de. Conformational analysis of a 139 base-pair DNA fragment containing a single-stranded break and its interaction with human poly(ADP-ribose) polymerase // J. Mol. Biol. 1994. T. 235. № 3. C. 1062-1071.

69. Lee C.-K., Shibata Y., Rao B., Strahl B.D., Lieb J.D. Evidence for nucleosome depletion at active regulatory regions genome-wide // Nat. Genet. 2004. T. 36. № 8. C. 900-905.

70. Lilley D.M. DNA opens up--supercoiling and heavy breathing // Trends Genet. TIG. 1988. T. 4. № 4. C. 111-114.

71. Liu L.F., Wang J.C. Supercoiling of the DNA template during transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987. T. 84. № 20. C. 7024-7027.

72. Ljungman M., Hanawalt P.C. Efficient protection against oxidative DNA damage in chromatin // Mol. Carcinog. 1992. T. 5. № 4. C. 264-269.

73. Lowary P.T., Widom J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning // J. Mol. Biol. 1998. T. 276. № 1. C. 19-42.

74. Ludwig A., Behnke B., Holtlund J., Hilz H. Immunoquantitation and size determination of intrinsic poly(ADP-ribose) polymerase from acid precipitates. An analysis of the in vivo status in mammalian species and in lower eukaryotes // J. Biol. Chem. 1988. T. 263. № 15. C. 6993-6999.

75. Luger K., Mäder A.W., Richmond R.K., Sargent D.F., Richmond T.J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution // Nature. 1997. T. 389. № 6648. C. 251-260.

76. Ma J., Bai L., Wang M.D. Transcription under torsion // Science. 2013. T. 340. № 6140. C. 1580-1583.

77. Mahy N.L., Perry P.E., Bickmore W.A. Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH // J. Cell Biol. 2002. T. 159. № 5. C. 753-763.

78. Martens J.A., Wu P.-Y.J., Winston F. Regulation of an intergenic transcript controls adjacent gene transcription in Saccharomyces cerevisiae // Genes Dev. 2005. T. 19. № 22. C. 2695-2704.

79. Meyer P.A., Ye P., Zhang M., Suh M.-H., Fu J. Phasing RNA polymerase II using intrinsically bound Zn atoms: an updated structural model // Struct. Lond. Engl. 1993. 2006. T. 14. № 6. C. 973-982.

80. Nacheva G.A., Guschin D.Y., Preobrazhenskaya O.V., Karpov V.L., Ebralidse K.K., Mirzabekov A.D. Change in the pattern of histone binding to DNA upon transcriptional activation // Cell. 1989. T. 58. № 1. C. 27-36.

81. Noll M. Internal structure of the chromatin subunit // Nucleic Acids Res. 1974. T. 1. № 11. C. 1573-1578.

82. Nouspikel T., Hanawalt P.C. DNA repair in terminally differentiated cells // DNA Repair. 2002. T. 1. № 1. C. 59-75.

83. Odell I.D., Wallace S.S., Pederson D.S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin // J. Cell. Physiol. 2013. T. 228. № 2. C. 258-266.

84. Pestov N.A., Gerasimova N.S., Kulaeva O.I., Studitsky V.M. Structure of transcribed chromatin is a sensor of DNA damage // Sci. Adv. 2015. T. 1. № 6. C. e1500021.

85. Petesch S.J., Lis J.T. Rapid, transcription-independent loss of nucleosomes over a large chromatin domain at Hsp70 loci // Cell. 2008. T. 134. № 1. C. 74-84.

86. Pogozelski W.K., Tullius T.D. Oxidative Strand Scission of Nucleic Acids: Routes Initiated by Hydrogen Abstraction from the Sugar Moiety // Chem. Rev. 1998. T. 98. № 3. C. 1089-1108.

87. Prior C.P., Cantor C.R., Johnson E.M., Littau V.C., Allfrey V.G. Reversible changes in nucleosome structure and histone H3 accessibility in transcriptionally active and inactive states of rDNA chromatin // Cell. 1983. T. 34. № 3. C. 1033-1042.

88. Reynolds J.J., Stewart G.S. A nervous predisposition to unrepaired DNA double strand breaks // DNA Repair. 2013. T. 12. № 8. C. 588-599.

89. Rufiange A., Jacques P.-E., Bhat W., Robert F., Nourani A. Genome-wide replication-independent histone H3 exchange occurs predominantly at promoters and implicates H3 K56 acetylation and Asf1 // Mol. Cell. 2007. T. 27. № 3. C. 393-405.

90. Schuster-Böckler B., Lehner B. Chromatin organization is a major influence on regional mutation rates in human cancer cells // Nature. 2012. T. 488. № 7412. C. 504-507.

91. Schwabish M.A., Struhl K. Evidence for eviction and rapid deposition of histones upon transcriptional elongation by RNA polymerase II // Mol. Cell. Biol. 2004. T. 24. № 23. C. 10111-10117.

92. Schwartz B.E., Ahmad K. Transcriptional activation triggers deposition and removal of the histone variant H3.3 // Genes Dev. 2005. T. 19. № 7. C. 804-814.

93. Sidorenkov I., Komissarova N., Kashlev M. Crucial role of the RNA:DNA hybrid in the processivity of transcription // Mol. Cell. 1998. T. 2. № 1. C. 55-64.

94. Singh J., Padgett R.A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes // Nat. Struct. Mol. Biol. 2009. Т. 16. № 11. С. 1128-1133.

95. Strand J.M., Scheffler K., Bj0ras M., Eide L. The distribution of DNA damage is defined by region-specific susceptibility to DNA damage formation rather than repair differences // DNA Repair. 2014. Т. 18. С. 44-51.

96. Studitskii V.M., Orlovskii I.V., Chertkov O.V., Efimova N.S., Loginova M.A., Kulaeva O.I. Molecular mechanisms of chromatin transcription by RNA polymerase III. Part 1 // Mosc. Univ. Biol. Sci. Bull. 2012a. Т. 67. № 3-4. С. 96-100.

97. Studitskii V.M., Orlovskii I.V., Chertkov O.V., Efimova N.S., Loginova M.A., Kulaeva O.I. Molecular mechanisms of transcription through chromatin by RNA polymerase III: Part 2 // Mosc. Univ. Biol. Sci. Bull. 2012b. Т. 67. № 3-4. С. 101106.

98. Studitsky V.M., Clark D.J., Felsenfeld G. A histone octamer can step around a transcribing polymerase without leaving the template // Cell. 1994. Т. 76. № 2. С. 371-382.

99. Studitsky V.M., Clark D.J., Felsenfeld G. Overcoming a nucleosomal barrier to transcription // Cell. 1995. Т. 83. № 1. С. 19-27.

100. Studitsky V.M., Kassavetis G.A., Geiduschek E.P., Felsenfeld G. Mechanism of transcription through the nucleosome by eukaryotic RNA polymerase // Science. 1997. Т. 278. № 5345. С. 1960-1963.

101. Sydow J.F., Brueckner F., Cheung A.C.M., Damsma G.E., Dengl S., Lehmann E., Vassylyev D., Cramer P. Structural basis of transcription: mismatch-specific fidelity mechanisms and paused RNA polymerase II with frayed RNA // Mol. Cell. 2009. Т. 34. № 6. С. 710-721.

102. Tang H., Kim Y., Severinov K., Goldfarb A., Ebright R.H. Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme: rapid reconstitution from recombinant alpha, beta, beta', and sigma subunits // Methods Enzymol. 1996. Т. 273. С. 130-134.

103. Teytelman L., Eisen M.B., Rine J. Silent but not static: accelerated base-pair substitution in silenced chromatin of budding yeasts // PLoS Genet. 2008. Т. 4. № 11. С. e1000247.

104. Thaström A., Lowary P.T., Widlund H.R., Cao H., Kubista M., Widom J. Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences // J. Mol. Biol. 1999. T. 288. № 2. C. 213-229.

105. Thiriet C., Hayes J.J. Replication-independent core histone dynamics at transcriptionally active loci in vivo // Genes Dev. 2005. T. 19. № 6. C. 677-682.

106. Tijsterman M., Pril R. de, Tasseron-de Jong J.G., Brouwer J. RNA polymerase II transcription suppresses nucleosomal modulation of UV-induced (6-4) photoproduct and cyclobutane pyrimidine dimer repair in yeast // Mol. Cell. Biol. 1999. T. 19. № 1. C. 934-940.

107. Tulin A., Spradling A. Chromatin loosening by poly(ADP)-ribose polymerase (PARP) at Drosophila puff loci // Science. 2003. T. 299. № 5606. C. 560-562.

108. Walia H., Chen H.Y., Sun J.M., Holth L.T., Davie J.R. Histone acetylation is required to maintain the unfolded nucleosome structure associated with transcribing DNA // J. Biol. Chem. 1998. T. 273. № 23. C. 14516-14522.

109. Walter W., Kireeva M.L., Studitsky V.M., Kashlev M. Bacterial polymerase and yeast polymerase II use similar mechanisms for transcription through nucleosomes // J. Biol. Chem. 2003. T. 278. № 38. C. 36148-36156.

110. Wang J.C. Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002. T. 3. № 6. C. 430-440.

111. Weinfeld M., Chaudhry M.A., D'Amours D., Pelletier J.D., Poirier G.G., Povirk L.F., Lees-Miller S.P. Interaction of DNA-dependent protein kinase and poly(ADP-ribose) polymerase with radiation-induced DNA strand breaks // Radiat. Res. 1997. T. 148. № 1. C. 22-28.

112. Wellinger R.E., Thoma F. Nucleosome structure and positioning modulate nucleotide excision repair in the non-transcribed strand of an active gene // EMBO J. 1997. T. 16. № 16. C. 5046-5056.

113. Whitehouse I., Rando O.J., Delrow J., Tsukiyama T. Chromatin remodelling at promoters suppresses antisense transcription // Nature. 2007. T. 450. № 7172. C. 1031-1035.

114. Wigler M.H., Axel R. Nucleosomes in metaphase chromosomes // Nucleic Acids Res. 1976. T. 3. № 6. C. 1463-1471.

115. Wirbelauer C., Bell O., Schübeler D. Variant histone H3.3 is deposited at sites of nucleosomal displacement throughout transcribed genes while active histone modifications show a promoter-proximal bias // Genes Dev. 2005. T. 19. № 15. C. 1761-1766.

116. Workman J.L., Kingston R.E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation // Annu. Rev. Biochem. 1998. T. 67. C. 545-579.

117. Zhao J., Herrera-Diaz J., Gross D.S. Domain-wide displacement of histones by activated heat shock factor occurs independently of Swi/Snf and is not correlated with RNA polymerase II density // Mol. Cell. Biol. 2005. T. 25. № 20. C. 89858999.

118. Zhao X., Pendergrast P.S., Hernandez N. A positioned nucleosome on the human U6 promoter allows recruitment of SNAPc by the Oct-1 POU domain // Mol. Cell. 2001. T. 7. № 3. C. 539-549.

119. Zhou W., Doetsch P.W. Effects of abasic sites and DNA single-strand breaks on prokaryotic RNA polymerases // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993. T. 90. № 14. C.6601-6605.

Приложения

рТ257Я-(+12_603) Длина 3170 пн. Длина встройки 282 пн. ...GGATCC... - вставка ...TCTCCG... - НПП

CCGGGATCCAGATCCCGAAAATTTATCAAAAAGAGTATTGACTTAAAGTCTAACCTATAGGATACTTACAGCCATCGAGAG

GGACACGGCGAAAAGCCAACCCAAGCGACACCGGCACTGGGGCCCGGTGTCTCCGCCCGCCTGCCGAGTGAAATCGTCA

CTCGGGCTTCTAAGTACGCTTAGCGCACGGTAGAGCGCAATCCAAGGCTAACCACCGTGCATCGATGTTGAAAGAGGCCC

TCCGTCCTGAATTCTTCAAGTCCCTGGGGTACGGATCCGACGAATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCA

AGCTTTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATT

CCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCT

CACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTAT

TGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGG

TAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAA

AAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAA

ACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGA

TACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGC

TCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGT

AAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTG

AAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAG

TTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAA

AGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGA

GATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGG

TCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTC

GTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAG

ATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAA

TTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCAC

GCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCG

GTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTC

TCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGAC

CGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTC

TTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCAT

CTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAAT

GTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTA

TTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGC

GGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCT

CGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACC

CCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACG

TTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCG

ATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTCCAT

TCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTG

CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTAC

CTCGCGAATGCATCTAGATT

СОТСООАТССОТАССССАОООАСТТОААОААТТСАООАСООАОООССТСТТТСААСАТСОАТОСАСООТООТТАОССТТО

ОАТТОСОСТСТАССОТОСОСТААОСОТАСТТАОААОССАОАОТОАСОАТТТСАСТСООСАООСОАОАССОСОААССОООС

СССАОТОССООТОТСОСТТООСТТООСТТТТСОССОТОТСССТСТСОАТОССТОТААОТАТССТАТАООТТАОАСТТТААО

ТСААТАСТСТТТТТОАТАААТТТТСОООАТСТООАТСССООААТСООАТСССОООСССОТСОАСТОСАОАООССТОСАТОСАА

ОСТТТСССТАТАОТОАОТСОТАТТАОАОСТТООСОТААТСАТООТСАТАОСТОТТТССТОТОТОАААТТОТТАТССОСТСАСААТТС

САСАСААСАТАСОАОССООААОСАТАААОТОТАААОССТООООТОССТААТОАОТОАОСТААСТСАСАТТААТТОСОТТОСОСТС

АСТОСССОСТТТССАОТСОООАААССТОТСОТОССАОСТОСАТТААТОААТСООССААСОСОСООООАОАООСООТТТОСОТАТТ

ОООСОСТСТТССОСТТССТСОСТСАСТОАСТСОСТОСОСТСООТСОТТСООСТОСООСОАОСООТАТСАОСТСАСТСАААООСООТ

ААТАСООТТАТССАСАОААТСАООООАТААСОСАООАААОААСАТОТОАОСААААООССАОСААААООССАООААССОТАААА

АООССОСОТТОСТООСОТТТТТССАТАООСТССОССССССТОАСОАОСАТСАСАААААТСОАСОСТСААОТСАОАООТООСОААА

СССОАСАШАСТАТАААОАТАССАООСОТТТСССССТООААОСТСССТСОТОСОСТСТССТОТТССОАСССТОССОСТТАССООАТ

АССТОТССОССТТТСТСССТТСОООААОСОТООСОСТТТСТСАТАОСТСАСОСТОТАООТАТСТСАОТТСООТОТАООТСОТТСОСТ

ССААОСТОООСТОТОТОСАСОААССССССОТТСАОСССОАССОСТОСОССТТАТССООТААСТАТСОТСТТОАОТССААСССООТА

АОАСАСОАСТТАТСОССАСТООСАОСАОССАСТООТААСАООАТТАОСАОАОСОАООТАТОТАООСООТОСТАСАОАОТТСТТОА

АОТООТООССТААСТАСООСТАСАСТАОААОААСАОТАТТТООТАТСТОСОСТСТОСТОААОССАОТТАССТТСООАААААОАОТ

ТООТАОСТСТТОАТССООСАААСАААССАССОСТООТАОСООТООТТТТТТТОТТТОСААОСАОСАОАТТАСОСОСАОААААААА

ООАТСТСААОААОАТССТТТОАТСТТТТСТАСООООТСТОАСОСТСАОТООААСОААААСТСАСОТТААОООАТТТТООТСАТОАО

АТТАТСАААААООАТСТТСАССТАОАТССТТТТАААТТАААААТОААОТТТТАААТСААТСТАААОТАТАТАТОАОТАААСТТООТ

СТОАСАОТТАССААТОСТТААТСАОТОАООСАССТАТСТСАОСОАТСТОТСТАТТТСОТТСАТССАТАОТТОССТОАСТССССОТСО

ТОТАОАТААСТАСОАТАСОООАОООСТТАССАТСТООССССАОТОСТОСААТОАТАССОСОАОАСССАСОСТСАССООСТССАОА

ТТТАТСАОСААТАААССАОССАОССООААОООССОАОСОСАОААОТООТССТОСААСТТТАТССОССТССАТССАОТСТАТТААТ

ТОТТОССОООААОСТАОАОТААОТАОТТСОССАОТТААТАОТТТОСОСААСОТТОТТОССАТТОСТАСАООСАТСОТООТОТСАСО

СТСОТСОТТТООТАТООСТТСАТТСАОСТССООТТСССААСОАТСААООСОАОТТАСАТОАТСССССАТОТТОТОСААААААОСОО

ТТАОСТССТТСООТССТССОАТСОТТОТСАОААОТААОТТООССОСАОТОТТАТСАСТСАТООТТАТООСАОСАСТОСАТААТТСТ

СТТАСТОТСАТОССАТССОТААОАТОСТТТТСТОТОАСТООТОАОТАСТСААССААОТСАТТСТОАОААТАОТОТАТОСООСОАСС

ОАОТТОСТСТТОСССООСОТСААТАСОООАТААТАССОСОССАСАТАОСАОААСТТТААААОТОСТСАТСАТТООААААСОТТСТ

ТСООООСОААААСТСТСААООАТСТТАССОСТОТТОАОАТССАОТТСОАТОТААСССАСТСОТОСАСССААСТОАТСТТСАОСАТС

ТТТТАСТТТСАССАОСОТТТСТОООТОАОСАААААСАООААООСААААТОССОСААААААОООААТААОООСОАСАСООАААТО

ТТОААТАСТСАТАСТСТТССТТТТТСААТАТТАТТОААОСАТТТАТСАОООТТАТТОТСТСАТОАОСООАТАСАТАТТТОААТОТАТ

ТТАОАААААТАААСАААТАООООТТССОСОСАСАТТТССССОААААОТОССАССТОАСОСОСССТОТАОСООСОСАТТААОСОСО

ОСОООТОТООТООТТАСОСОСАОСОТОАССОСТАСАСТТОССАОСОСССТАОСОСССОСТССТТТСОСТТТСТТСССТТССТТТСТС

ОССАСОТТСОССООСТТТССССОТСААОСТСТАААТСОООООСТСССТТТАОООТТССОАТТТАОТОСТТТАСООСАССТСОАССС

СААААААСТТОАТТАОООТОАТООТТСАСОТАОТОООССАТСОСССТОАТАОАСООТТТТТСОСССТТТОАСОТТООАОТССАСОТ

ТСТТТААТАОТООАСТСТТОТТССАААСТООААСААСАСТСААСССТАТСТСООТСТАТТСТТТТОАТТТАТААОООАТТТТОССОА

ТТТСООССТАТТООТТААААААТОАОСТОАТТТААСАААААТТТААСОСОААТТТТААСААААТАТТААСОСТТАСААТТТССАТТ

СОССАТТСАООСТОСОСААСТОТТОООААОООСОАТСООТОСОООССТСТТСОСТАТТАСОССАОСТООСОАААОООООАТОТОС

ТОСААООСОАТТААОТТОООТААСОССАОООТТТТСССАОТСАСОАСОТТОТААААСОАСООССАОТОААТТСОАОСТСООТАСС

ТСОСОААТОСАТСТАОАТТ

CGTCGGATCCGTACCCCAGGGACTTGAAGAATTCAGGACGGAGGGCCTCTTTCGACATCGATGCACGGTGGTTAGCCTTG

GATTGCGCTCTACCGTGCGCTAAGCGTACTTAGAAGCCCGAGTGACGACTTCACTCGGGAGACGGGCGCGCGAACCGGG

CCCCAGTGCCGGTGTCGCTTGGGTTGGCCTTTCGCCGTGTCCCTCTCGATGGCTGTAAGTATCCTATAGGTTAGACTTTAA

GTCAATACTCTTTTTGATAAATTTTCGGGATCTGGATCCCGGAATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCA