Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы Rhodococcus opacus 1CP: кинетические и структурные свойства тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Коломыцева, Марина Павловна

• Коломыцева, Марина Павловна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Коломыцева, Марина Павловна

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Глава 1. Структурно-функциональные аспекты иитрадиольного расщепления ароматического кольца - ключевой реакции микробной деградации ароматических соединений.

1.1. Метаболические пути деградации ароматических соединений, ведущие к образованию ключевых иптермедиатов.

1.2. Пути разложения ключевых интермедиатов.

1.3. Генетические, физико-химические и структурные аспекты интрадиольных диоксигеназ.

1.3.1. Степень идентичности аминокислотных последовательностей.

1.3.2. Физико-химические свойства.

1.3.3. Структурные свойства.

1.3.3.1. Физические свойства кристаллов.

1.3.3.2. Архитектура молекул.

1.3.3.3. Координационная сфера Fe3+ активного центра.

1.3.3.4. Механизмы связывания и расщепления субстрата.

1.3.3.5. Взаимосвязь кинетических параметров и структуры ферментов. Характер взаимодействия субстратов и их аналогов с активным центром.

Экспериментальная часть

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Штамм, использованный в работе.

2.2. Культивирование штамма.

2.2.1. Состав сред.

2.2.2. Приготовление субстратов.

2.2.3. Проведение ферментаций и получение биомассы.

2.3. Выделение ферментов.

2.3.1. Получение бесклеточных экстрактов и определение концентрации белка.

2.3.2. Определение активности ферментов.

2.3.3. Очистка 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы.

2.3.4. Очистка 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы.

2.4. Определение кинетических характеристик ферментов.

2.5. Кристаллизация ферментов.

2.6. Рентгепоструктурный анализ.

2.6.1. Предварительный рентгеноструктурный анализ кристаллов ферментов.

2.6.2. Рентгеноструктурный анализ, проводимый для разрешения трехмерной структуры ферментов.

2.7. Методы структурного анализа.

2.7.1. Структурный анализ белковых молекул.

2.7.2. Структурный анализ молекул субстрата и его аналогов.

Глава 3. Результаты.

3.1. Очистка ферментов.

3.1.1. 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа.

3.1.2. 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа.

3.2. Кинетические свойства хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ.

3.2.1. Субстратная специфичность ферментов.

3.2.2. Ингибирование ферментов фенолом, его замещенными производными и бензоатом.

3.2.3. Структурные свойства субстратов и их аналогов.

3.2.4. Связь функционирования хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ с структурой субстратов и их аналогов.

3.2.4.1. Связывание замещенных фенолов ферментами.

3.2.4.2. Связывание замещенных пирокатехинов и его аналогов ферментами.

3.2.4.3. Катализ замещенных субстратных аналогов.

3.2.4.4. Избирательность хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ в отношении заместителя в положении СЗ-С4 бензольного кольца субстрата.

3.4. Кристаллизация ферментов.

3.4.1. Получение кристаллов 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигепазы.

3.4.2. Получение кристаллов 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы.

3.5. Трехмерная структура молекул хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ, связь структуры и функции.

3.5.1. Общая структура молекул.

3.5.2. Молекулярная поверхность входа в активный центр хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ в сравнении с подобными структурами интрадиольных диоксигеназ известной структуры.

3.5.3. Координационная сфера железа хлорпирокатехин 1,2диоксигеназ.

3.5.4. Форма и структура активных центров хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ.

3.5.5. Сравнительный анализ структуры активного центра 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы с структурами активных центров известных интрадиольных диоксигеназ.

3.5.5.1. Структуры активных центров, соответствующие С4-атому бензольного кольца субстрата или субстратного аналога.

3.5.5.2. Структуры активных центров, соответствующие СЗ-атому бензольного кольца субстрата или субстратного аналога.

3.5.5.3. Структуры активных центров, соответствующие Сб-атому бензольного кольца субстрата или субстратного аналога.

Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы Rhodococcus opacus 1CP: кинетические и структурные свойства»

Актуальность проблемы. Ароматические соединения содержатся в биосфере повсюду и имеют как природное, так и искусственное происхождение. Самым большим природным источником ароматических соединений служит растительный полимер -лигнин. Другим не менее масштабным источником ароматических соединений является хозяйственная и промышленная деятельность человека. Большинство ксенобиотиков, обладая высокой токсичностью, используются или образуются в процессе промышленного производства пластмасс, бумаги, смазочных материалов, охлаждающих жидкостей, взрывчатых веществ. В качестве загрязнителей окружающей среды также выступают гербициды, пестициды и инсектициды, применяемые в сельском хозяйстве. Основная нагрузка по разложению ароматических соединений в биосфере ложится па микроорганизмы, имеющие специфические пути деградации. В процессе биодеградации множество ароматических соединений превращаются в относительно небольшое количество интермедиатов, которые содержат две смежные гидроксильные группы в ароматическом кольце. Такие интермедиа™ в дальнейшем подвергаются ключевой реакции биодеградации, заключающейся в раскрытии ароматического кольца, которое осуществляется дециклизующими диоксигеназами. В этом случае, оба атома молекулярного кислорода посредством фермента включаются в субстрат с последующим его расщеплением. Такие реакции являются беспрецедентными в органической химии, и в настоящее время проявляется все больший интерес к структуре и механизмам действия дециклизующих диоксигеназ.

Состояние вопроса. На данный момент известны два типа дециклизующих диоксигеназ, различающихся по месту расщепления ароматического кольца -интрадиольные и экстрадиольные (Lipscomb and Orville, 1992; Lange and Que, 1998; Bugg, 2001, 2003). В зависимости от проявляемой ферментами специфической избирательности к тому или иному субстрату каждый тип подразделяется на группы. К интрадиольиым диоксигеназам относятся протокатехат 3,4-диоксигеназы, пирокатехин 1,2-диоксигеназы, хлорпирокатехии 1,2-диоксигеназы и гидроксигидрохинон 1,2-диоксигеназы. В свою очередь экстрадиольные диоксигеназы делятся на пирокатехин 2,3-диоксигеназы, протокатехат 2,3-диоксигеназы, гомопротокатехат 2,3-диоксигеиазы, протокатехат 4,5-диоксигеназы и 2,3-дигидроксибифенил 1,2-диоксигеназы. Накоплены данные по физико-химическим свойствам ряда иптрадиольных и экстрадиольных диоксигеназ. Однако существуют единичные работы, посвященные структуре этих ферментов. Так расшифрованы трехмерные структуры лишь пяти экстрадиольных диоксигеназ: пирокатехин 2,3-диоксигеназы из Pseudomonas putida (Kita et al., 1999), протокатехат 4,5-диоксигеназы из Sphingomonas paucimobilis SYK-6 (Sugimoto et al., 1999), 2,3дигидроксибифенил 1,2-диоксигеназы из Psendomonas sp. (Uragami et al., 2001, Sato et al., 2002), и двух гомопротокатехат 2,3-диоксигеназ из Arthrobacter globiformis и Brevibacterium fuscum (Vetting et al., 2004). Для интрадиольных диоксигепаз к началу нашей работы были известны структуры только трех ферментов: двух протокатехат 3,4-диоксигеназ из Pseudomonas putida (Orville et al., 1997a) и из Acinelobacter sp. ADP1 (Vetting and Ohlendorf, 2000) и одной пирокатехин 1,2-диоксигепазы из Acinelobacter sp. ADP1 (Vetting et al., 2000). К 2005 году в совместной работе нашей лаборатории и Флорентийского университета была расшифрована трехмерная структура гидроксигидрохипон 1,2-диоксигеназы из Nocardioides simplex ЗЕ (Ferraroni ct al., 2005). Однако ни одной структуры хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ не было известно.

Ранее в нашей лаборатории был выделен активный штамм Rhodococcits opticus 1СР, разлагающий 2- и 4-хлорфенолы (Горлатов с соавт., 1989; Maltseva et al., 1994; Моисеева с соавт., 1999, 2001). Изучены пути биодеградации этих соединений и выделены ферменты, участвующие в этом процессе, клонированы и секвенированы опероны, кодирующие эти ферменты. Показано наличие разных интрадиольных 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ, существенно отличающихся от ранее известных пирокатехин 1,2-диоксигеназ этого штамма (Maltseva et al., 1994; Моисеева с соавт., 2001). Неизвестными оставались причины функционального различия 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ между собой и отличия от других интрадиольных диоксигеназ известной структуры и функции. Ответить на этот вопрос стало возможным благодаря изучению трехмерной структуры данных ферментов и проведении структурно-функционального анализа.

Цель и задачи исследования. Целью работы было выявление взаимосвязи структуры и функции 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы из штамма R. opacus 1СР, утилизирующего 2-хлор и 4-хлорфенолы в качестве единственных источников углерода и энергии соответственно, и выяснение причин субстратной специфичности ферментов при сравнении с структурой и функцией других интрадиольных диоксигеназ.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получение гомогенных препаратов 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ.

2. Детальное изучение кинетических свойств ферментов.

3. Получение кристаллов 3-хлор- и 4-хлорпирокатехип 1,2-диоксигеназ, пригодных для проведения рентгеноструктурного анализа.

4. Расшифровка с помощью рентгеноструктурного анализа трехмерной структуры ферментов.

5. Проведение сравнительного структурно-функционального анализа 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеиаз из штамма R. opacus 1СР параллельно с интрадиольными диоксигеназами известной структуры, с целью выяснения причин субстратной специфичности ферментов.

Научная новизна. Впервые закристаллизованы 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы среди известных хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ. Впервые расшифрованы трехмерные структуры 3-хлор- и 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ. Показано, что хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы являются гомодимерами, состоящими из двух каталитических доменов и одного связующего домена, представляющего гидрофобный тоннель, внутрь которого погружены с обеих сторон две молекулы фосфолипидов. В каждом каталитическом домене хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ содержится активный центр с трехвалентным железом, в координационной сфере которого найдена дополнительная структура: молекула бензоата у 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы и молекула бензогидроксамата в структуре 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеиазы. На основе кинетических свойств ферментов и структурных свойств субстратных аналогов показано, что связывание последних в активном центре фермента определяется характером взаимодействия, образующегося между заместителем в молекуле субстратного аналога и внутренней поверхностью активного центра. Установлена • прямая зависимость каталитического процесса от величины заряда на кислороде первой гидроксильной группы субстрата. Показано прямое соответствие рассчитанной последовательности депротонирования смежных гидроксильных групп субстрата с ранее известной последовательностью связывания субстрата с железом активного центра интрадиольных диоксигеназ. Проведенный сравнительный структурно-функциональный анализ хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ между собой, а также с интрадиольными диоксигеназами известной структуры показал, что различия в их субстратной специфичности вызваны соответствующими изменениями в аминокислотном составе активных центров ферментов и их входов.

Практическое значение работы. Полученные данные открывают широкое поле деятельности для белково-ипженерных работ с целью получения ферментов с высокой субстратной специфичностью и заданным спектром атакуемых субстратов. Это позволит оптимизировать процессы деградации ряда ксенобиотиков путем конструирования эффективных штаммов деструкторов методами генной инженерии, а также получать высокочувствительные биосенсорные пленки, используемые для тестирования пирокатехина и его производных в почве и сточных водах.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Коломыцева, Марина Павловна

122 Выводы

1. Получены гомогенные препараты 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы (4-ХПК 1,2-ДО) и 3-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеиазы (3-ХПК 1,2-ДО) из клеток штамма R. opacus 1СР, утилизирующего 4-хлор- и 2-хлорфенолы в качестве единственных источников углерода и энергии соответственно. Ферменты были пригодны для последующей кристаллизации и проведения рентгеноструктурного анализа.

2. Впервые получены правильные кристаллы 4-ХПК 1,2-ДО- и 3-ХПК 1,2-ДО, дающие дифракцию рентгеновского излучения и позволяющие провести рентгеноструктурный анализ с целью разрешения пространственной структуры ферментов.

3. Детальный сравнительный анализ кинетических свойств ХПК 1,2-ДО позволил выявить различия в их избирательности к субстратным аналогам, имеющим заместитель в мета- или пара- положении ароматического кольца. Показана большая гидрофобность области активного центра 3-ХПК 1,2-ДО, соответствующей мета- и «ара-заместителю в молекуле субстратного аналога, по сравнению с 4-ХПК 1,2-ДО.

4. На основе кинетических свойств ХПК 1,2-ДО и структурных свойств субстратных аналогов показано, что связывание последних в активном центре фермента определяется характером взаимодействия, образующегося между заместителем в молекуле субстратного аналога и внутренней поверхностью активного центра. Основная роль в осуществлении каталитического процесса принадлежит первой гидроксильной группе субстратного аналога. Расчет величин зарядов на кислородных атомах реакционных гидроксильных групп позволил определить направленность процесса депротонировапия последних и объяснить последовательность связывания субстрата с железом в активном центре интрадиольных диоксигеназ.

5. Впервые расшифрованы трехмерные структуры 4-ХПК 1,2-ДО и 3-ХПК 1,2-ДО. Координаты атомов молекулярных структур ХПК 1,2-ДО из R. opacus 1СР размещены в электронной базе данных (Protein Data Bank) под идентификационными номерами: ls9a и 2Ьоу.

6. Сравнительный структурно-функциональный анализ изученных хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ и интрадиольных диоксигеназ известной структуры показал, что различия в их субстратной специфичности вызваны изменениями в аминокислотном составе внутренней поверхности активных центров ферментов и их входов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Коломыцева, Марина Павловна, 2005 год

1. Бландел Т., Джонсон JI. 1979. Кристаллография белка. Под ред. Стручкова Ю.Т., пер. с англ. Шкловера В.Е., Мир, Москва, с. 620.

2. Головлева JI.A., Катаева И.А., Ильченко В.Ю., Беляева Р.Х. 1983. Диоксигеназы пирокатехина у Pseudomonas aerugenosa 2х: обнаружение изофункциональных белков. Биохимия, Т.48, вып.4, сс. 463-532.

3. Горлатов С.Н., Мальцева О.В., Шевченко В.И., Головлева JI.A. 1989. Разложение хлорфенолов культурой Rhodococcus erythropolis. Микробиология, Т.58, сс. 802806.

4. Дьюар М., Догерти Р. 1977. Теория возмущений молекулярных орбиталей в органической химии. Под ред. Яновской JI.A., пер. с англ. Руденко Б.А., Серебрякова Э.П., Чижова О.С., Москва, Изд-во Мир, с. 695.

5. Мальцева О.В., Соляникова И.П., Головлева JI.A. 1991. Пирокатехазы штамма Rhodococcus erythropolis деструктора хлорфенолов: очистка и свойства. Биохимия, Т.56, вып. 12, сс. 2188-2197.

6. Маррел Дж., Кеттл С., Теддер Дж. 1980. Химическая связь, Москва, Изд-во Мир, с. 387.

7. Моисеева О.В., Линько Е.В., Баскунов Б.П., Головлева JI.A. 1999. Деградация 2-хлорфенола и 3-хлорбензоата Rhodococcus opacus 1СР. Микробиология, Т.68, вып.4, сс. 461-466.

8. Моисеева О.В., Белова О.В., Соляникова И.П., Шлеманп М., Головлева JI.A. 2001. Ферменты нового модифицированного орто-иут Rhodococcus opacus 1СР. Биохимия, Т.66, вып.5, сс.678-686.

9. Соляникова И.П., Мальцева О.В., Головлева JI.A. 1992. Очистка и свойства пирокатехазы II из штамма Pseudomonas putida 87. Биохимия, Т.57, вып. 12, сс. 1883-1891.

10. Степанов Н.Ф., Пупышев В.И. 1991. Квантовая механика молекул и квантовая химия. М., Изд-во МГУ, с. 384.

11. Суровцева Э.Г., Ивойлов B.C., Карасевич Ю.Н. 1986. Метаболизм хлорированных анилинов Pseudomonas diminuta. Микробиология, Т.55, сс.591-595.

12. Зайцев Г.М., Карасевич Ю.Н. 1985. Подготовительный метаболизм 4-хлорбензойной и 2,4-дихлорбензойной кислот у Corynebacterium sepedonicum. Микробиология, Т.54, вып.З, сс. 356-359.

13. Adachi К., Iwabuchi Т., Sano Н, Harayama S. 1999. Structure of the ring cleavagevproduct of l-hydroxy-2-naphthoate, an intermediate of the phenanthrene-degradative pathway of Nocardioides sp. strain KP7. J. Bacterid., V. 181, pp. 757-763.

14. An H.-R., Park H.-J., Kim E.-S. 2001. Cloning and expression of thermophilic catechol 1,2-dioxygenase gene (catA) from Streptomyces setonii. FEMS Microbiol. Lett., V.195, pp. 17-22.

15. Anderson J.J., Dagley S. 1980. Catabolism of aromatic acids in Trichosporon cutaneum. J. Bacterid., V. 141, pp. 534-543.

16. Aoki K., Konohana Т., Shinke R., Nishira H. 1984a. Two catechol 1,2-dioxygenases from an aniline-assimilating bacterium, Frateuria speshies ANA-18. Agric. Biol. Chem., V.48, N8, pp. 2097-2104.

17. Aoki, K., Ohtsuka K., Shinke R., Nishina H. 1984b. Rapid biodegradation of aniline by Frateuria species ANA-18 and its aniline metabolism. Agric. Biol. Chem., V.48, pp. 865-872.

18. Aoki K., Konohana Т., Shinke R., Nishira H. 1984c. Purification and characterization of catechol 1,2-dioxygenase from aniline-assimilating Rhodococcus erythropolis AN-13. Agric. Biol. Chem., V.48, N8, pp. 2087-2095.

19. Apajalachti J.A., Salkinoja-Salonen M.S. 1986. Degradation of polychlorinated phenols by Rhodococcus chlorophenolicus. Appl. Microbiol. Biotechnol., V.25, pp. 62-67.

20. Apajalachti J.A. 1987a. Chlorophenol metabolism of a polychlorophenol degrader, Rhodococcus chlorophenolicus sp. PhD Thesis, Department of General Microbiology, University of Helsinki, Finland.

21. Apajalachti J.A., Salkinoja-Salonen M.S. 1987b. Complete degradation of tetrachlorohydroquinone by cell extracts of pentachlorophenol-induced Rhodococcus chlorophenolicus. J. Bacteriol., V.169, pp. 5125-5130.

22. Apajalachti J.A., Salkinoja-Salonen M.S. 1987c. Dechlorination and para-hydroxylation of polychlorinated phenols by Rhodococcus chlorophenolicus. J. Bacteriol., V.169, pp. 675-681.

23. Arciero D.M., Lipscomb J.D., Huynh B.H., Kent T.A., Munck E. 1983. EPR and Mossbauer studies of protocatechuate 4,5-dioxygenase. Characterization of a new Fe environment. J. Biol. Chem., V.258, N24, pp. 14981-14991.

24. Armstrong S.M., Patel T.R. 1993. 1,3,5-trihydroxybenzene biodegradation by Rhodococcus sp. PPG-8. Can. J. Microbiol., V.39, pp. 175-179.

25. Armstrong S.M., Patel T.R. 1994. Microbial degradation of phloroglucinol and other polyphenolic compounds. J. Basic. Microbiol., V.34, N2, pp. 123-135.

26. Bachofer R., Lingens F. 1975. Conversion of aniline into pyrocatechol by a Nocardia sp.: incorporation of oxygen-18. FFEBS Lett., V.50, pp. 288-290.

27. Bayly R.C., Wigmore G.J. 1973. Metabolism of phenol and cresols by mutants of Pseudomonasputida. J. Bacteriol., V.l 13, pp. 1112-1120.

28. Bertini I., Briganti F., Mangani S., Nolting H.F., Scozzafava A. 1995. Biophysical investigation of bacterial aromatic extradiol dioxygenases involved in biodegradation processes. Coordination Chemistry Reviews, V.144, pp. 321-345.

29. Bollag J.M., Helling C.S., Alexander M. 1968. 2,4-D metabolism. Enzymatic hydroxylation of chlorinated phenols. J. Agr. Food. Chem., V.16, pp. 826-828.

30. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochem., V.72, pp. 248-254.

31. Briganti F., Pessione E., Guinta C., Scozzafava A. 1997. Purification, biochemical properties and substrate specificity of a catechol 1,2-dioxygenase from a phenol degrading Acinetobacter radioresistens. FEBS Lett., V.416, pp. 61-64.

32. Briganti F., Pessione E., Guinta C., Mazzolini R., Scozzafava A. 2000. Purification and catalitic properties of two catechol 1,2-dioxygenase isozymes from benzoate-grown cells of Acinetobacter radioresistens. J. Protein Chem., V. 9, N8, pp. 709-716.

33. Broderick J.В., Halloran V.O. 1991. Overproduction, purification and characterization of chlorocatechol dioxygenase, a non-heme iron dioxygenase with abroad substrate tolerance. Biochemystry, V.30, pp. 7349-7358.

34. Brown C.K., Vetting M.W., Earhart C.A., Ohiendorf D.H. 2004. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase. Annu. Rev. Microbiol., V.58, pp. 555-585.

35. Buchan A., Collier L.S., Neidle E.L., Moran M.A. 2000. Key aromatic-ring-cleaving enzyme, protocatechuate 3,4-dioxygenase, in the ecologically important marine Roseobacter lineage. Appl. Environ. Microbiol., V.66, N11, pp. 4662-4672.

36. Bugg T.D.H. 2001. Oxygenases: mechanisms and structural motifs for О г activation. Curr. Opin. Chem. Biol., V.5, pp. 550-555.44