Катионные пептиды как средство переноса ДНК в клетки млекопитающих тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Игнатович, Ирина Анатольевна

• Игнатович, Ирина Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Игнатович, Ирина Анатольевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Транскрипционный фактор ТАТ.

2.2. Пенетратины.

2.2.1. Характеристика пенетратинов.

2.2.2. Пенетратины как векторы доставки.

2.3. Механизмы проникновения веществ в эукариотическую клетку.

4 2.3.1. Эндоцитоз-опосредованные пути проникновения веществ в эукариотическую клетку.

2.3.2. Фагоцитоз.

2.3.3. Макропиноцитоз.

2.3.4. Клатрин-опосредованный эндоцитоз.

2.3.5. Рафт-опосредованный эндоцитоз.

2.3.6. Клатрин- и кавеолин-независимый эндоцитоз.

2.3.7. Судьба эндоцитозных везикул.

2.4. Способы доставки чужеродных макромолекул в клетки млекопитающих.

2.4.1. Системы доставки на основе вирусных векторов.,.;.

2.4.2. Невирусные системы доставки генетических конструкций.

2.4.3. Катионные липиды.;.:.

3.4.4. Молекулярные конъюгаты.

2.4.5. катионные пептиды.;.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Материалы и объекты исследований.

3.2. Формирование комплексов плазмидной ДНК с катионными пептидами.

3.3. Определение стехиометрии комплексов ДНК с катионными пептидами.

3.4. Трансфекция культуры клеток катионными пептидами, их комплексами с плазмидной ДНК, кальций-фосфатная трансформация.

3.5. Определение активности генов-маркеров.

- 3.6. Конфокальная флюоресцентная микроскопия.

3.7. Измерение уровня интернализации флюоресцентно меченого пептида TAT-F и его комплексов с плазмидной ДНК.

3.8. Измерение флюоресценции ДНК с этидием бромидом.

3.9. Взаимодействие BSA с флюоресцентно меченым TAT-пептидом.

3.10. Внутривенное введение комплексов ДНК с катионными пептидами мышам.51 ■

3.11. Выделение РНК, реакция обратной транскрипции (RT), полимеразная цепная реакция (PCR)

3.12. Определение уровня АроА-1 человека в сыворотке крови мышей.

3.13. Статистическая обработка.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Изучение условий комплексообразования ДНК с лизин-богатым пептидом К8.

4.2. Оценка цитотоксичности комплексов ДНК/К8.

4.3 Факторы, влияющие на эффективность трансфекции клеток HepG2 комплексами ДНК/К8 .61 4.4. Изучение взаимодействия и условий образования комплекса ТАТ-пептида с плазмидной

4.5 Механизм проникновения комплекса ДНК/TAT в клетки.

4.6. Распределение комплексов ДНК/TAT в тканях мыши после их инъекций в хвостовую вену мышей.

4.7. Влияние сывороточного альбумина на интернализацию комплексов ДНЮТАТи экспрессию гена доставленного в комплексе с носителем.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Катионные пептиды как средство переноса ДНК в клетки млекопитающих»

Актуальность работы

Проникновение макромолекул в эукариотические клетки является фундаментальной основой ряда процессов, обеспечивающих поддержание интегральной целостности организма. Исследование механизмов интернализации макромолекул клетками имеет принципиальное значение для понимания функционирования многоклеточных организмов в норме и при различных патологиях.

Эндоцитоз представляет собой классический путь интернализации макромолекул. Тем не менее, в последнее время накапливаются данные, свидетельствующие о способности ряда внутриклеточных ядерных белков (активатора транскрипции Tat вируса иммунодефицита человека I типа, гомеодомен-содержащего фактора транскрипции Antp и др.) переноситься из клетки в клетку без участия классического эндоцитоза. Механизм транслокации таких белков до сих пор остается мало понятным. По всей видимости, в проникновении этих белков через клеточную мембрану не участвуют какие-либо рецепторные молекулы (Prochiantz А., 2000; Rubartelli A. et al., 1998). В ряде работ делеционным анализом установлено, что за интернализацию отвечают короткие фрагменты белковой молекулы, отличающиеся высоким содержанием положительно заряженных аминокислотных остатков - пенетратины (Wender P. et al., 2000). Более того, пенетратины, будучи ковалентно-сцепленными с белками-репортерами способны обеспечивать эффективную доставку последних в ткани экспериментальных животных (Fawell S. et al., 1994; Schwarze S. R. et al., 1999). Показана важность остатков аргинина для процесса переноса через клеточные мембраны (Suzuki Т. et al., 2002).

В последние годы значительное внимание уделяется разработке методов генетической коррекции ряда патологий человека. Применение с этой целью вирусных векторов имеет существенные ограничения. В связи с этим, актуальной является разработка невирусных методов переноса ДНК. Несмотря на более низкую эффективность, невирусные средства лишены ряда недостатков вирусных векторов. Высокая эффективность пенетратинов, в частности фрагмента (47-57) основного домена белка ТАТ вируса HIV-1 (ТАТ-пептида), в качестве средства доставки ковалентно сцепленных с ними биологически активных макромолекул, а также наличие в их составе большого числа основных аминокислотных остатков позволило рассматривать ТАТ-пептид как перспективное средство переноса ДНК в клетки млекопитающих in vitro и in vivo. В этой связи, принципиальное значение имеют детальные исследования механизма проникновения комплексов ДНК с пенетратинами в клетки млекопитающих.

Цель и задачи исследования

Целью работы является изучение условий формирования комплексов ДНК с катионными пептидами и исследование механизмов проникновения таких комплексов в клетки млекопитающих. Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:

1. Изучить условия образования комплексов катионных олигопептидов, таких как ТАТ и Kg, с плазмидной ДНК.

2. Выяснить возможную роль эндоцитоза в поглощении клетками млекопитающих комплексов ДНК с катионными пептидами.

3. Разработать систему переноса ДНК в клетки млекопитающих на основе фрагмента (47-57) основного домена транскрипционного фактора ТАТ вируса HIV-1.

4. Апробировать комплексы ДНК/TAT в качестве средства доставки ДНК в организм млекопитающих и выяснить факторы, препятствующие эффективной экспрессии перенесенных генов при системном введении комплексов. .

Научная новизна

В результате настоящего исследования впервые показана способность фрагмента (4757) основного домена белка ТАТ вируса HIV-1 (ТАТ-пептида) электростатически взаимодействовать с плазмидной ДНК, образуя полиэлектролитные комплексы. Такие комплексы способны проникать в культивируемые клетки млекопитающих, обеспечивая эффективную экспрессию перенесенных генов. В ходе работы показан эндоцитоз-опосредованный механизм проникновения комплекса ДНК/TAT в клетки, аналогично процессу интернализации комплексов плазмидной ДНК с лизин-богатым пептидом Kg и другими поликатионными носителями. Впервые выяснено стимулирующие влияние избытка свободного положительно заряженного пептида в реакционной смеси на эффективность трансфекции клеток в культуре комплексом катион ный пептид /ДНК.

В то же время показано, что повышение содержания свободного пептида в реакционной среде при системном введении комплексов ДНК/Т AT и ДНК/Kg in vivo приводит к снижению экспрессии доставляемого гена. Полученные данные свидетельствуют, что низкий уровень экспрессии чужеродного гена в случае внутривенной доставки комплексов ДНК/TAT объясняется их инактивацией в кровеносном русле животного в результате взаимодействия с сывороточным альбумином.

Практическая значимость

Практическая значимость работы заключается в разработке в ходе проведенного исследования системы переноса генов в культивируемые клетки млекопитающих на основе ТАТ-пептида. Изучение механизмов проникновения комплексов ДНК/пептид, а так же влияния свободного пептида на эффективность доставки таких комплексов представляет определенную ценность для понимания механизмов переноса макромолекул через цитоплазматическую мембрану. Выяснение причин, препятствующих эффективной работе векторов экспрессии доставляемых с помощью катионных пептидов в организм животных позволяет вести работу по усовершенствованию средств доставки генетических конструкций. Результаты настоящего исследования могут быть использованы при разработке и реализации проектов, направленных на создание невирусных методов переноса ДНК в организм млекопитающих и человека.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Фрагмент основного домена транскрипционного фактора ТАТ (47-57) вируса

H1V-1 электростатически взаимодействует с плазмидной ДНК с образованием полиэлектролитных комплексов ДНК/TAT, которые способны проникать в клетки млекопитающих и обеспечивать эффективную экспрессию перенесенных генов.

2. Комплексы плазмидной ДНК с катионными пептидами ТАТ и Kg проникают в клетки млекопитающих путем эндоцитоза.

3. Низкая активность комплексов ДНК/TAT при системном введении мышам обусловлена, в частности, взаимодействием комплексов с сывороточным альбумином, что приводит к изменению путей интернализации комплексов.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано две статьи и 9 тезисов докладов и сообщений на всероссийских и международных конференциях, симпозиумах и съездах. Результаты работы докладывались на международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 2000, 2002 гг.), международной конференции «Human

Genome Meeting» (Шанхай, 2002), третьем Съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002 г.), 39-м Съезде Федерации европейских биохимических обществ «FEBS special meeting on signal transduction» (Брюссель, 2003 г.), 5-й международной конференции по биофизике «1СВР-2004» (Стокгольм, 2004 г.) и других конференциях.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на . страницах, содержит . рисунка и . таблиц. Список литературы содержит . источника.

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Игнатович, Ирина Анатольевна

6. выводы

Фрагмент основного домена транскрипционного фактора ТАТ (47-57) вируса HIV-1 электростатически взаимодействует с плазмидной ДНК с образованием полиэлектролитных комплексов ДНК/ТАТ, которые способны проникать в культивируемые клетки млекопитающих и обеспечивать эффективную экспрессию перенесенных генов.

Увеличение положительного заряда комплексов катионных олигопептидов Kg и ТАТ с плазмидной ДНК оказывает положительный эффект на эффективность трансфекции клеток in vitro.

Избыток свободных, не связанных с ДНК катионных пептидов приводит к увеличению эффективности трансфекции клеток млекопитающих комплексами ДНК/ТАТ и ДНК/Kg, по всей вероятности, благодаря защите комплексов от разрушения отрицательно заряженными протеогликанами клеточной поверхности.

Комплексы плазмидной ДНК с катионными пептидами ТАТ и К« проникают в клетки млекопитающих путем эндоцитоза.

Низкая активность комплексов ДНК/ТАТ при системном обусловлена взаимодействием комплексов с сывороточным приводит к изменению путей интернализации комплексов. введении мышам альбумином, что

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Игнатович, Ирина Анатольевна, 2005 год

1. Горман К. 1988. Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих: в книге "Клонирование ДНК. Методы." Под ред. Д. Гловера //М. "Мир", -1998,-с. 409463.

2. Aderem A., Underhill D. M. 1999. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu. Rev. Immunol. 1999(17):593-623.

3. Ahn С. H., Chae S. Y., Bae Y. H., Kim S. W. 2002. Biodegradable poly(ethylenimine) for plasmid DNA delivery, J. Controlled Release 80(l-3):273-82.

4. Albini A., Barillari G., Benelli R., Gallo R. C., Ensoli B. 1995. Angiogenic properties of human immunodeficiency virus type I Tat protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:48384842.

5. Albini, A., Benelli, R., Presta, M., Rusnati, M., Ziche, M., Rubartelli, A., Paglialunga, G., Bussolino, F., Noonan, D. 1996. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12(2):289-97,

6. Allinquant B, Hantraye P, Mailleux P, Moya K, Bouillot C, Prochiantz A. 1995. Downregulation of amyloid precursor protein inhibits neurite outgrowth in vitro. J. Cell. Biol. 128(5): 919-927.

7. Alio J. C., Midoux P., Merten M., Souil E., Lipecka J., Figarella C., Monsigny M., Briand P., Fajac I. 2000. Efficient gene transfer into human normal and cystic fibrosis

8. J- v tracheal gland serous cells with synthetic vectors. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 22:166175.

9. Anderson R. G. 1998. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67:199-225.

10. Andrews N. C., Faller D. V. 1991. A rapid micropreparation technique for extraction of DNA-binding proteins from limiting numbers of mammalian cells. Nucleic Acids Res. 19(9):2499.

11. Apodaca G. 2001. Endocytic traffic in polarized epithelial cells: role of the actin and microtubule cytoskeleton. Traffic 2: 149-151.i

12. Applied Biosystems Inc. (1990) Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems-iV \1.c., Foster City, CA.

13. Bendas G., Rothe U., Scherphof G, L., Kamps J. A. 2003. The influence of repeated injections on pharmacokinetics and biodistribution of different types of sterically stabilizedч immunoliposomes, Biochim. Biophys. Acta 1609(l):63-70.

14. Benkirane M., Chun R.F., Xiao H., Ogryzko V. V., Howard B.H., Nakatanj Y., Jeang

15. К. T. 1998. Activation of integrated provirus requires histone acetyltransferase. p300 and P/CAF are coactivators for HIV-1 Tat. J. Biol. Chem. 273:24898-24905.

16. Berkhout В., Silverman R. H., Jeang К. T, 1989. Tat trans-activates the human immunodeficiency virus through a nascent RNA target. Cell 59:273-282.

17. Berlose J. P., Convert O., Derossi D., Brunissen A., Chassaing G. 1996. Conformational and associative behaviours of he third helix of Antennapedia homeodomain in membrane-mimetic environments Eur. J. Biochem. 24:372 386.1. Лл