Каталитическое окисление миоглобина солями и комплексами меди и железа: кинетика и механизм тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Шеховцова, Екатерина Александровна

• Шеховцова, Екатерина Александровна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шеховцова, Екатерина Александровна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Окислительно-восстановительные реакции гемсодержащих белков с ионами и комплексами металлов

2.1.1. Редокс-реакции гемсодержащих белков с комплексами железа а) Цитохром С б) Цитохром Ь в) Белки - переносчики кислорода: гемоглобин, миоглобин г) Леггемоглобин

2.1.2. Окисление гемсодержащих белков ионами и комплексами меди а) Цитохром С б) Цитохром Ь в) Белки - переносчики кислорода: гемоглобин, миоглобин г) Леггемоглобин

3. МАТЕРИАЛЫ Й МЕТОДЫ

3.1. Получение интактных, химически модифицированных и мутантных белков

3.2. Изоэлектрофокусирование

3.3. Спектрофотометрическое титрование

3.4. Кинетические измерения

3.5. Изучение локализации меди методом ЯМР высокого разрешения

3.6. Расчет распределения электростатического потенциала и впадин и полостей в миоглобиновой молекуле

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Механизм окисления МЬОг ионами и комплексами меди: миоглобины, карбоксиметилированный и карбоксиамидированный по гистидину

4.2. Окисление оксимиоглобина, катализируемое ферроцианидом: нативные оксимиоглобины кашалота, лошади и свиньи, карбоксиметилированный по остаткам гистидина и мутантный (Н1б1 19->Азр) оксимиоглобины кашалота

5. ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Каталитическое окисление миоглобина солями и комплексами меди и железа: кинетика и механизм»

Миоглобин - мономерный гемсодержащий белок глобинового семейства переносчиков кислорода. В отличие от тетрамерного гемоглобина крови он отвечает за хранение внутриклеточного кислорода в мышцах и транспорт его от плазматической мембраны к клеточным митохондриям. Поддержание восстановленного состояния гемового комплекса в НЬОг и МЮ2 очень важно для их функционирования, так как окисленные мет-формы этих дыхательных белков не способны связывать кислород. Кроме того, окисление атома Fe гема является первой стадией денатурации гем-белков, так как сродство окисленного ферригема к глобину существенно меньше, чем восстановленного. В то же время в аэробной среде НЬОг и МЬОг могут самопроизвольно окисляться, особенно быстро при кислых рН, образуя мет-Mb и мет-Hb (автоокисление) [Shikama 1998; Brantley и др., 1993]. Показано также, что миоглобин и гемоглобин легко вступают в окислительно-восстановительные реакции с солями и комплексами различных металлов, из которых наибольший интерес для биологии представляют соединения железа и меди. Эти металлы участвуют во многих метаболических процессах в организме, а нарушение ионного гомеостаза может приводить к серьезным заболеваниям и даже смерти.

Железо в клетках животных, растений и бактерий является составной частью железо-серных кластеров и простетических гемовых групп важнейших ферментов, участвующих в процессах клеточного дыхания, азотфиксации и фотосинтеза, таких как каталазы, пероксидазы, и митохондриальные и микросомальные цитохромы -переносчики электрона. Медь также активно участвует в метаболизме в составе активных центров таких ферментов как азурины, пластоцианины, цитохром С-оксидаза и другие оксидазы. Механизм работы многих железо- и медьсодержащих ферментов, напрямую реагирующих с молекулярным кислородом, например, цитохром С-оксидазы митохондрий и цитохрома Р-450 микросом приводит к образованию активных форм кислорода, токсичных для биологических систем. В ряде работ продемонстрирована важная роль железа и меди в механизмах окислительного стресса.

Увеличивающееся загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами ведет в настоящее время к росту их концентрации во всех живых организмах и становится реальной угрозой их существования, включая человека [Hura и др., 2002]. Известно, что в аэробных условиях in vitro соединения переходных металлов, Си2+, Со3+ и Fe3+, в присутствии низкомолекулярных восстановителей способны претерпевать циклические редокс-превращения и служить центрами продукции активных форм кислорода, анион-радикала супероксида, О2", и НОг, а также перекиси водорода Н2О2 как конечного продукта их диспропордионирования [McCord и др., 1971]. Поскольку НЬОг и МЬОг, присутствующие в клетках в очень больших количествах, являются хорошими восстановителями соединений этих металлов, они могут непосредственно участвовать в таких процессах, что было показано на ряде модельных систем [Van Dyke и Saltman, 1996; Clopton и Saltman, 1997]. Например, эти белки способны активно восстанавливать комплекс Fe3+ с АТФ, а трансмембранный транспорт ионов Fe2+ в эритроцитах и ретикулоцитах коррелирует с восстановлением Fe3+ гемоглобином [Eguchi и Saltman, 1984; Egyed и др., 1980]. Важно отметить, что в редокс-реакциях металлокомплексов с участием НЬОг и МЬОг в отличие от таких реакций в присутствии низкомолекулярных восстановителей не обнаруживается активных форм кислорода, по-видимому, вследствие того, что мет-форма белка обладает высокой пероксидазной активностью.

Функционирование гемоглобина и миоглобина как восстановительных реагентов в биологических системах привлекает пристальное внимание исследователей, так как может быть важным в связи с выявлением роли клеточных белков в поддержании редокс-потенциала клетки и преодолении окислительного стресса [Hegetschweiler и др., 1987; Stadtman и Oliver, 1991]. Окисленные мет-Mb и мет-Hb могут быть снова восстановлены при помощи низкоспецифичных низкомолекулярных клеточных восстановителей, диафораз, и специализированных NADH-зависимых ферментов -мет-НЬ-редуктазы эритроцитов (NADH-Cyt Ь5-редуктазы) и мышечной мет-Mb -редуктазы. Компонентами мет-МЬ-редуктазной системы являются как Cyt bs мембран саркоплазматического ретикулума, так и близко родственный ему Cyt b внешней мембраны митохондрий [Arihara и др., 1995].

Особый интерес для биологии представляет процесс окисления НЬОг и МЬОг, катализируемый небольшими количествами ионов и комплексов двухвалентной меди [Rifkind, 1974; Rifkind и др.,1976; Христова и др., 1980 а,б]. В настоящее время этой реакции уделяется большое внимание, так как весьма вероятно, что она играет существенную роль в повреждении миокарда при ишемии и последующей реперфузии [Gunther и др., 1999]. Вследствие ацидоза в ишемированной ткани депонированная и связанная с белками Си2+ освобождается и может вступать в реакцию с миоглобином, в результате чего образуется мет-Mb и восстановленная медь [Berenshtein и др., 1997]. Реокисление же Си1+ кислородом приводит к образованию активных форм кислорода, которые оказывают повреждающее воздействие на ткань.

Катализируемый медью процесс окисления, как показано, протекает через • образование специфического комплекса реагента с белком, в котором участвуют остатки гистидина. Несмотря на то, что эти редокс-реакции изучаются уже более 30 лет, отсутствует представление о детальном, на молекулярном уровне, физическом механизме процесса. Остается неясной локализация гистидиновых остатков, связывающих медь с наибольшим сродством, эффективность различных комплексов в реакции переноса электрона от Fe тема, а также вклады этих комплексов в суммарную скорость окисления белка. Одной из причин, вероятно,является то, что объектом исследования был только Mb кашалота, в котором имеется 12 остатков гистидина, половина из которых локализованы на поверхности белка и способны с высоким сродством комплексировать медь.

Следует отметить, что до последнего времени было известно только окисление НЬОг и МЬОг, катализируемое соединениями Си с невысоким, порядка 100-150 mV, редокс-потенциалом (медный катализ). Было показано, что соединения других металлов, Ag, Mg, Mn, Со, Zn, Fe, Cr и т.д., с аналогичными редокс-потенциалами не катализируют процесс, но окисляют белки в присутствии избытка реагента. Считалось также, что эффективными катализаторами не могут быть сильные окислители, потенциал которых больше 400 mV, так как их восстановленные формы должны плохо реокисляться кислородом по термодинамическим соображениям.

Таким образом, наряду со своей основной функцией - обратимым связыванием Ог, миоглобин способен вступать в редокс-реакции с различными металлокомплексами, выступая в большинстве случаев в качестве восстановительного реагента. Эта его способность может играть существенную роль в функционировании организма, однако работы, посвященные выяснению механизмов редокс-реакций миоглобина с различными реагентами, весьма немногочисленны. К тому же анализ этих работ обнаруживает противоречивые утверждения разных авторов о механизме одних и тех же реакций и требует дополнительных исследований. В связи с этим актуальна задача детального изучения молекулярного механизма(ов) редокс-реакций оксимиоглобина с соединениями металлов, роли отдельных групп и структурных элементов белка в переносе заряда. Наиболее подходящими объектами для решения проблемы являются мономерные миоглобины.

Ранее нами было проведено сравнительное изучение кинетики катализируемого ионами Си2+ окисления МЬОг кашалота, лошади и свиньи [Моисеева, Постникова, 2001]. Эти белки имеют одинаковые редокс-потенциалы и гомологичны по пространственной структуре, но имеют разное количество остатков His, локализованных на поверхности и способных связывать медь («внутренние» гистидины у них инвариантны). Оказалось, что в одинаковых условиях, в присутствии эквимолярной концентрации Си2+, реакция в этих белках протекает по-разному. В случае МЮ2 свиньи наблюдается быстрое (за 2-3 мин) окисление только 10-15% от общего количества белка (быстрая фаза), которое н< е ощц споЪги-СЬэьи , сопровождается дальнейшим превращением в мет-МЬ остального белка. В случае же не сопровождается дальнейшим превращением в мет-МЬ ЬстальногЬ белка. В случае U МЬОг кашалота и лошади наблюдается гораздо более медленное окисление всего белка (катализ). То есть, механизм реакции зависит от того, с какими остатками His, локализованными на поверхности белка или же в гемовой полости, связывается катализатор.

Кроме того, нами впервые было обнаружено, что комплекс железа и сильный , ц а и окислитель - феррицианид калия является эффективным катализатором окисления МЬОг кашалота [Моисеева С.А. и др., 2001, а,б]. Показано, что механизм катализа включает специфическое связывание аниона ферроцианида" на поверхности белка в районе Hisl 19 „ ~ rc„/-r\n т4-. 1 и только связанный [Fe(CN)6] * в отличие от аниона в растворе приобретает способность быстро реокисляться кислородом, что необходимо для каталитического цикла. При ^ ■ g М ? , малых концентрациях феррицианида (5- 20% от концентрации белка) одновременно происходят два разных процесса - простой перенос электрона между реагентом и гемом и более медленное превращение МЬОг в мет-МЬ по каталитическому пути. О 2 ^ Проанализирована кинетическая схема реакции и определены^еравновесные и ^ кинетические параметры. • ^ ^^CscfiC iU

Гч & г\ Цели и задачи работы. В данной работе продолжено исследование молекулярного v механизма редокс- реакций миоглобина, катализируемых металлами. С этой целью г^ изучено окисление нативного МЬОг кашалота, его химически модифицированных производных, алкилированных по всем доступным гистидинам бромацетатом натрия 2+ + X) (СМ-МЬОг) и иодацетамидом (СА-МЬОг), в присутствии Си , Cu(GIy) и Cu(Gly)2. Кроме того, изучено катализируемое ферроцианидом окисление нативных МЬОг кашалота лошади и свиньи, СМ-МЬОг и мутантного МЬОг кашалота (His 119—>Asp). Бьши поставлены следующие задачи:

1. Спектрофотометрически исследовать кинетику окисления нативного МЬОг, карбоксиметилированного СМ-МЬОг и карбоксиамидированного СА-МЬОг кашалота в зависимости от концентрации Си2+, Си(С1у)+ и Си(01у)г, рН и ионной 2+ ^ силы среды, а также влияние на скорость реакции редокс-неактивных ионов Ъх\ ,

2. Методом ЯМР высокого разрешения проанализировать локализацию Си(01у)г в

Л' pi г> Ч конкурирующих с медью за связывание с гистидинами. Методом ЯМР высокого разрешения проанализировать нативном мет-МЬ кашалота, мет-МЬ лошади и СМ-мет-МЬ.

3. Изучить кинетику катализируемого ферроцианидом окисления нативных МЬОг кашалота лошади и свиньи, СМ-МЬОг и [МЬС^Шэ 119—>Азр)] кашалота в широком диапазоне условий рН и ионной силы среды, концентрации катализатора, а также при комплексировании МЬОг с конкурентным редокс-неактивным ионом цинка.

4. Проанализировать распределение электростатического потенциала на поверхности нативных МЬОг кашалота лошади и свиньи, а также [МЬОг(Н1з

119-»Азр)] при разных значениях рН в интервале рН 5 -8 на расстоянии 0.55 нм отбелка.

5. Расчитать и локализовать возможные впадины и полости на поверхности исследуемых миоглобинов, способные адаптировать анион ферроцианида.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Шеховцова, Екатерина Александровна

ВЫВОДЫ

1. Изучение спектрофотометрической кинетики окисления ионами и глициновыми комплексами двухвалентной меди разных оксимиоглобинов, нативного МЮ2 кашалота и его производных, алкилированных по доступным растворителю гистидинам бромацетатом натрия и иодацетамидом, а также изучение локализации в них Cu(Gly)2 методом ЯМР высокого разрешения показало, что процесс превращеия МЬОг в окисленную мет-форму протекает по сайт-специфическому механизму переноса электрона через предварительное связывание реагента с гистидинами.

2. Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что комплексирование меди с остатками His 12, His48, His81, Hisl 13, Hisl 16 и His 119, локализованными на поверхности белка (все шесть расположены на расстоянии 1.8-2.7 нм от гема), вносит лишь незначительный вклад в суммарную скорость процесса, не более 35%, в особенности в условиях большого, более 8-10 - кратного, избытка реагента. Заметный вклад остатков Hisl 13, Hisl 16 и His48, имеющих по данным ЯМР наибольшее сродство к меди, проявляется лишь при малых концентрациях реагента, до ~ 5-кратного молярного избытка по отношению к белку, на что указывает сигмоидная кривая рН-зависимости с рК перехода 6.5-6.7.

3. Основной вклад в скорость изучаемой реакции должно вносить комплексирование меди с «внутренними» гистидинами, His97 (0.66 нм от гема), образующим Н-связь с СОО'-группой гемового пропионата, и дистальным His64, сродство которых к меди существенно меньше, чем «поверхностных» гистидинов, и которые недоступны для модификации химическими реагентами.

4. Сравнительное изучение скорости катализируемого ферроцианидом окисления нативных МЬОг кашалота, лошади и свиньи, имеющих одинаковые редокс-потенциалы и гомологичные пространственные структуры, но отличающихся по количеству локализованных на поверхности остатков гистидина, а также карбоксиметилированного и мутантного МЬОг кашалота с заменой Hisl 19 на Asp показало, что для эффективного катализа необходимо специфическое связывание ферроцианидного аниона с белком в районе Hisl 19.

Избирательность комплексирования [Fe(CN)6]4* в районе Hisl 19 обусловлена большим локальным электростатическим потенциалом в этом участке поверхности миоглобина, а также наличием здесь полости подходящего размера для встраивания ферроцианидного аниона. Важную роль в образовании «активного» комплекса с реагентом играют не только электростатические, но и стерические взаимодействия, а также оптимальная динамика групп белка.

Показано, что связывание [Fe(CN)6]4* необходимое, но недостаточное условие для эффективного катализа. Важнейшую роль играет также протонирование локализованных поблизости остатков Hisl 13 и Hisl 16, что, с одной стороны, способствует лучшему электростатическому связыванию анионного катализатора, а с другой, кинетически ускоряет реокисление связанного аниона [Fe(CN)6]4* растворенным кислородом за счет локализации обоих реагентов необходимого для этого протона в оптимальном для реакции положении.

В рамках общего сайт-специфического внешнесферного механизма переноса электрона молекулярные механизмы окисления оксимиоглобина в присутствии ионов' меди и ферроцианида совершенно различны как по типу образующихся каталитических комплексов, так и по их локализации в структуре белка. Эффективность ферроцианидного катализа в кислой области рН (рН 5) в несколько раз выше (в среднем в 3-5 раз), чем медного; в нейтральной области, рН 6, она примерно одинакова (различается в 1.5-2 раза), а в щелочной области рН, напротив, катализ медью на порядок более эффективен, так как в этих условиях [Fe(CN)6]4* практически не связывается.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шеховцова, Екатерина Александровна, 2005 год

1. Арутюнян Э.Г., Сафонова Т.Н., Обмолова Г.В., Тепляков А.В., Попов А.Н., Русаков А.А., Рубинский С.В., Куранова И.П., Вайнштейн Б.К. Кристаллическая структура оксилеггемоглобина при разрешении 1.7 А. Биоорган. Химия., 1990,16,293- 302.

2. Комаров Ю.Е., Сивожелезов B.C., Постникова Г.Б. Применимость моделейэлектростатического взаимодействия молекул к описанию зависимости скорости реакции между миоглобином и цитохромом С от ионной силы. Биофизика, 1998, 43,16-25.

3. Моисеева С.А., Постникова Г.Б., Сивожелезов B.C. Окисление оксимиоглобина кашалота, ~ —катализируемое ионами ферроцианида: кинетика и механизм.-Биофизика, 2000,45,10191028.

4. Моисеева С.А., Постникова Г.Б. Механизм окисления оксимиоглобина ионами меди: сравнение миоглобинов кашалота, лошади и свиньи. Биохимия, 2001 а, 66(7), 959- 967.

5. Моисеева С.А., Постникова Г.Б., Сивожелезов B.C. Кинетика и механизм окисленияоксимиоглобина, катализируемого ферроцианидом калия. Биофизическая химия, 2001 б, 75(8), 1504- 1510.

6. Постникова Г.Б., Целикова С.В. Изучение переноса электрона.в гемопротеинах. IX. Влияние ионов цинка на скорость окисления окси-Mb феррицитохромом С. Молекуляр. биология, 1987,21,1040-1049.

7. Постникова Г.Б., Целикова С.В., Сивожелезов B.C. Изучение переноса электрона вгемопротеинах. X. Влияние рН, ионной силы и ионов цинка на скорость восстановления феррицитохрома С оксимиоглобином из сердца свиньи; Молекуляр. биология, 1992,26, 880-890.

8. Христова П.К., Деведжиев Я Д., Атанасов Б П., Волькенштейн М.В. Изучение переноса электрона в гемопротеинах. IV. Катализируемое ионами меди окисление оксимиоглобина кашалота. Молекуляр. биология, 1980 а, 14,1088-1097.

9. Христова П.К., Атанасов Б П. Изучение переноса электрона в гемопротеинах. III. Физико-химическая характеристика автоокисления оксимиоглобина кашалота. Молекуляр. биология, 1980 б, 14, 86-93.

10. Ahmed A. J., Millett F. Use of specific lysine modifications to identify the site of reaction between cytochrome С and ferricyanide. J. Biol. Chem., 1981,256,1611-1615.

11. Antonini E., Brunori M., Wyman J. Studies on the oxidation-reduction potentials of heme proteins. IV. The kinetics of oxidation of hemoglobin and myoglobin by ferricyanide. Biochemistry, 1965,4,545-551.

12. Antonini E., Brunori M. Hemoglobin and myoglobin in their reactions with ligands. AmsterdamLondon: Front Biol., 1971.

13. Arihara K., Cassens R.G., Greaser M.L., Luchansky J.B., Mozdziak P.E. Localization of metmyoglobin-reducing enzyme (NADH-cytochrome bs reductase) system components in bovine skeletal muscle. Meat Science, 1995,39,205-213.

14. Arnesano F., Banci L., Bertini I., Felli I.C.The solution structure of oxidized rat microsomal cytochrome bs. Biochemistry, 1998,37(1), 173-184.

15. Augustin M.A., Yandell J.K. Oxidation of heme proteins by copper(ll) complexes. Rates and mechanism of the copper catalysed autoxidation of cytochrome C, myoglobin and hemoglobin. Inorg. Chim. Acta, \919,37,11-18.

16. Bashford D., Case D.A., Dalvit C., Tennant L., Wright P.E. Electrostatic calculations of side- chain pK values in myoglobin and comparison with NMR data for histidines. Biochemistry, 1993,32, 8045-8056.

17. Bakan D.A., Saltman P., Theriault Y., Wright P.E. Kinetics and mechanisms of reduction of Cu(2) and Fe(3) complexes by soybean leghemoglobin a. Biochimica et Biophysica Acta, 1991,1079, 182-196.

18. Banaszak L.J, Watson H.C., Kendrew J.C. The binding of cupric and zinc ions to crystalline sperm whale myoglobin. J. Mot Biol., 1965,12,130-137.

19. Berenshtein E., Mayer B., Goldberg C., Kitrossky N., Chevion M. Patterns of mobilization of copper and iron following myocardial ischemia: possible predictive criteria for tissue injury. J. Mol. Cell. Cardiol., 1997,29,3025-3034.

20. Botelho L.H., Gurd F.R.N. Proton nuclear magnetic resonanse study of histidine ionization in myoglobins of various species. Specific assignment of individual resonances. Biochemistry, 1978, 17,5188-5196.

21. Brandt K.G., Parks P.C., Czerlinski G.H., Hess G.P. On the elucidation of the pH dependence of the oxidation-reduction potential of cytochrome C at alkaline pH. J. Biol. Chem., 1966,241,41804185.

22. Brantley R.E., Smerdon S.J., Wilkinson A.J., Singleton E.W., Olson J.S. The mechanism of autooxidation of myoglobin. J. Biol. Chem., 1993,268, 6995-7010.

23. Brunori M., Saggese U., Rotilio G.C., Antonini E., Wyman J. Redox equilibrium of sperm-whale myoglobin, Aplysia myoglobin, and Chironomus thummi hemoglobin. Biochemistry, 1971,10, 1604-1609.

24. Breslow E., Gurd F.R.N. Interaction of cupric and zinc ions with sperm whale metmyoglobin. J. Biol. Chem., 1963,238,1332-1342.

25. Buckingham D.A., Sargeson A.M. In: Chelating agents and metal chelated. Dwyer F.P., Mellor D.P., Eds.; Academic: New York, 1964,237-282.

26. Butler J., Davies D.M., Sykes A.G., Koppenol W.H., Osheroff N., Margoliash E. Use of singly modified cytochrome C derivatives to determine the site for electron transfer in reactions with inorganic complexes. J. Am. Chem. Soc., 1981 a, 103,469-471.

27. Butler J., Davies D.M., Sykes A.G. Kinetic data for redox reactions of cytochrome C with Fe(CN)sX complexes and the question of association prior to electron transfer. J. Inorg. Biochem., 1981 6,15,41-53.

28. Butler J., Chapman S.K., Davies D.M., Sykes A.G., Speck S.H., Osheroff N., Margoliash E. Preferred sites for electron transfer between cytochrome C and iron and cobalt complexes. J. Biol. Chem., 1983,258, 6400-6404.

29. Carver J.A., Bradbury J.H. Assignment of *H NMR resonances of histidine and other aromatic residues in met-, cyano-, oxy- and (carbon monoxy)myoglobins. Biochemistry, 1984,23,48904905.

30. Cassatt J.C., Marini C.P. The kinetics of oxidation of reduced cytochrome C by ferricyanide derivatives. Biochemistry, 1974,13, 5323-5328.

31. Cassatt J.C., Marini C.P., Bender J.W. The reversible reduction of horse metmyoglobin by the iron(II) complex of 1,2-diaminocyclohexane-iV,A'',N'//'-tetraacetate. Biochemistry, 1975, 14, 5470-5475.

32. Chang A.M., Austin R.H. Electron tunneling in cytochrome C. J. Chem. Phys., 1982, 77,52725283.

33. Bioorganic Chemistry (van Tamelen E.E., ed.), New York: Academic Press, 1978,4,117-146. Davison A.J. Kinetics of the copper-histidine catalysis of ferrocytochrome С oxidation. J. Biol.

34. Chem., 1968,243,6064-6067. Davison A. J., Hamilton R.T. Stimulation of cytochrome С oxidation by a copper citrate complex.

35. Arch. Biochem. Biophys., 1968,126,228-231. Dickerson R.E., Timkovich R. In: The enzymes (Boyer P.D., ed.), London: Academic Press, 1975, 11,397-547.

36. Dunn C.J., Rohlfs R.J., Fee J.A., Saltman P. Oxidation of deoxymyoglobin by Fe(CN)6.3*. J. Inorg.

37. Biochem., 1999,75,241-244 Eguchi L.A., Saltman P. The aerobic reduction of Fe(III) complexes by hemoglobin and myoglobin.

38. Garvan F.L. In: Chelating agents and metal chelates. Dwyer F.P., Mellor D.P., Eds.; Academic: New York, 1964,283-333.

39. Goucher C.R., Taylor J.F. Compounds of ferric iron with adenosine triphosphate and other nucleoside phosphates. J. Biol. Chem., 1964,239(7), 2251-2255.

40. Guex N., Diemand A., Peitsch M.C. Protein modelling for all. Trends Biochem. Sci. 1999,24(9), 364-367.

41. Gunther M.R., Sampath V., Caughey W.S. Potential roles of myoglobin autoxidation in myocardial ischemia-reperfusion injury. Free Radic. Biol. Med., 1999,26 (11/12), 1388-1395.

42. Harrington J.P., Hicks R.L. Spectral analysis of Fe (III) complex reduction by hemoglobin: possible mechanisms of interaction. Int. J. Biochem., 1994,26(9), 1111-1117.

43. Hartzell C.R., Hardman K.D., Gillspie J.M., Gurd F.R.N. Reversible disruption by cupric ions of myoglobin and its carboxamidomethyl derivative. J. Biol. Chem., 1967,242,47-53.

44. Hegetschweiler K., Saltman P., Dalvit C., and Wright P.E. Kinetics and mechanisms of the oxidation of myoglobin by Fe(III) and Cu(II) complexes. Biochim. Biophys. Acta, 1987,912, 384-397.

45. Hodges H.L., Holwerda R.A., Gray H.B. Kinetic studies of the reduction ferricytochrome C by Fe(EDTA)2". J. Amer. Chem. Soc., 1974,96,3132-3137.

46. Hughes M.N. In: The inorganic chemistry of biological processes. Wiley: New York, 1981, 125187.

47. Jameson R.F. Coordination chemistry of copper with regard to biological systems. In: Metal ions in biological systems (Sigel H., ed.), New York: Marcel Dekker, 1981,1-30.

48. Keyes S.R., Cinti D.L. Biochemical properties of cytochrome bs- dependent microsomal fatty acid elongation and identification of products. J. Biol. Chem., 1980,255,11357-11364.

49. Kihara H., Nakatani H., Hiromi K., Hon-Nami K., Oshima T. Kinetic studies on redox reactions of hemoproteins I. Reduction of thermoresistant cytochrome C-552 and horse heart cytochrome C by ferrocyanide. Biochim. Biophys. Acta, 1977,460,480-489.

50. Kihara H. Comparison of the redox reactions of various types of cytochrome C with iron hexacyanides. Biochim. Biophys. Acta, 1981,634, 93-104.

51. Koradi R., Billeter M., Wuthrich K.J. MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures. J. Mol. Graphics, 1996,14, 51-55.

52. Kozutsumi Y., Kawano T., Yamakawa T., Suruki A. Participation of cytochrome b5 in CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylation in mouse liver cytosol. J. Biochem. 1990,108,704-706.

53. Marcus R.A., Sutin N. Electron transfers in chemistry and biology. Biochim. Biophys. Acta, 1985, 811,265-322.

54. Mauk A.G., Scott R.A., Gray H.B. Distances of electron transfer to and from metalloprotein redox sites in reactions with inorganic complexes. J. Am. Chem. Soc., 1979,102,4360-4363.

55. Margalit R., Pecht I., Gray H.B. Oxidation-reduction catalytic activity of a pentaammineruthenium (III) derivative of sperm whale myoglobin. J. Amer. Chem. Soc., 1983,105,301-302.

56. Matheus F.S., Levine M., Argos P. Three-dimensional fourier synthesis of calf liver cytochrome bs at 2.8 a resolution. J. Biol. Chem., 1972, 64,449-464.

57. McCray J. A., Kihara T. Rates of reduced cytochrome C-ferricyanide binding and electron transfer. Biochim. Biophys. Acta, 1979,548,417-426.

58. McCord J.M., Keele B.B., Fridovich I. An enzime- based theory of obligate anaerobiosis: the physiological function of superoxide dismutase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1971,68(5), 1024-1027.

59. Margalit R., Pecht I., Gray H.B. Oxidation-reduction catalytic activity of a pentaammineruthenium (III) derivative of sperm whale myoglobin. J. Amer. Chem. Soc., 1983,105,301-302.

60. Martell A.E. In: Critical stability constants. Plenum: New York, 1982,1-5.

61. Martell A.E. In: Development of iron chelators for clinical use. (Martell A.E., Anderson W.F., Badman D.G., eds.), Elsevier / North Holland, New York, 1981, 67-104.

62. McArdle J. V., Gray H.B., Creutz C., Sutin N. Kinetic studies of the oxidation of ferrocytochrome C from horse heart and Candida krusei by tris(l,10-phenanthroline)cobalt(III). J. Am. Chem. Soc., 1974,96,5737-5741.

63. Miller W.G., Cusanovich M.A. Electron transport by C-type cytochromes. I. The reaction of horse heart cytochrome C with anionic reductants. Biophys. Struct. Mech., 1975,1,97-111.

64. Morton R.A., Overnell J., Harbury H.A. Electron transfer between cytochromes C from horse and Pseudomonas. J. Biol. Chem.,1970,245,4653-4657.

65. Mauk A.G., Scott R.A., Gray H.B. Distances of electron transfer to and from metalloprotein redox sites in reactions with inorganic complexes. J. Am. Chem. Soc., 1980,102,4360-4363.

66. Muskett F.W., Kelly G.P., Whitford D.The solution structure of bovine ferricytochrome bs determined using heteronuclear NMR methods. J. Mol. Biol, 1996,258,172-189.

67. Nigen A.M., Gurd F.R.N. Comparison of carboxymethylation patterns of harbor seal and sperm whale myoglobins. J. Biol. Chem.,1973,248,3708-3715.

68. Oaekley B.R., Kirsch D.R., Morris N.R. A simplifed ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrilamide gels. Anal. Biochem., 1980,105,361-366.

69. Ohno N., Cusanovich M.A. Reaction of C-type cytochromes with the iron hexacyanides. Biophys. J., 1981,36,589-605.

70. Peterman B.F., Morton R.A. The oxidation of ferrocytochrome C in nonbinding buffer. Can. J. Biochem., 1977,55,796-803.

71. Polozov R.V., Dzhelyadin T.R., Sorokin A.A., Ivanova N.N., Sivozhelezov V.S., Kamzolova S.G. Electrostatic potentials of DNA. Comparative analysis of promoter and nonpromoter nucleotide sequences. J. Biomol. Struct., Dyn. 1999,16,1135- 1143.

72. Postnikova G.B., Komarov Yu.E., Yumakova E.M. Fluorescence study of the conformational properties of myoglobin structure. II. pH- and ligand-induced conformational changes in ferric and ferrous myoglobins. Eur. J. Biochem., 1991,198,233-239.

73. Poulos T.L. Mauk A.G. Models for complexes formed between cytochrome bs and subunits of methemoglobin. J. Biol Chem., 1983,258,7369-7373.

74. Reid L.S., Mauk A.G. Kinetic analysis of cytochrome bs reduction by Fe(EDTA)2". J. Am. Chem. Soc., 1982,104, 841-845.

75. Reid L.S., Gray H.B., Dalvit C., Wright P.E., Saltman P. Electron transfer from cytochrome bs to iron and copper complexes. Biochemistry, 1987,26, 7102-7107.

76. Ragg E., Moore G.R. Association constants for metal hexacyanide binding to cytochrome C.

77. J. Inorg. Biochem., 1984,21,253-261.

78. Rifkind J.M. Copper and the autoxidation of hemoglobin. Biochemistry, 1974,13(12), 2475-2481.

79. Rifkind J.M., Lauer L.D., Chiang S.C., Li N.C. Copper and the oxidation of hemoglobin: acomparison of horse and human hemoglobins. Biochemistry, 1976,15(24), 5337-5343.

80. Rifkind J.M. Oxidation of (horse) hemoglobin by copper: an intermediate detected by electron spin resonance. Biochemistry, 1979,18,3860-3865.

81. Rifkind J.M. Copper and the oxidation of hemoglobin. In: Metal ions in biological systems (Sigel H., ed.), New York: Marcel Dekker, 1981,12, 192-232.

82. Rousseaux J., Dautrevaux M., Han K. Comparison of the amino acid sequence of pig heart myoglobin with other ungulate myoglobins. Biochim. Biophys. Acta, 1976,439,55-62.

83. Shikama K. The molecular mechanism of autoxidation for myoglobin and hemoglobin: a venerablepuzzle. Chem. -Rev., 1998,98,1357- 1373.

84. Sivozhelezov V.S. Modelling electrostatic interactions in proteins. Abstr of Int Conf. CSAM-93, St.-Petersburg, 1993, p.131.

85. Springer B.A., Sligar S.G. High-level expression of sperm whale myoglobin in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987,84, 8961- 8965.

86. Stadtman E.R., Oliver C.N. Metal-catalyzed oxidation of proteins. J. Biol. Chem., 1991,266,20052008.

87. Stellwagen E., Shulman R.G. Nuclear magnetic resonance study of the rate of electron transfer between cytochrome C and iron hexacyanides. JMol. Biol., 1973,80, 559-573.

88. Stellwagen E., Cass R.D. Complexation of iron hexacyanides by cytochrome C. Evidence for electron exchange at the exposed heme edge. J. Biol. Chem., 1975,250,2095-2098.

89. Sutin N., Christman D.R. The rate of oxidation of cytochrome C by ferricyanide ions. J. Am. Chem. Soc., 1961, 83,1773-1774.

90. Wei J.-F., Ryan M.D. The reduction of cytochrome C by iron EDTA-like complexes: implications on charge effect corrections to mediator-protein rate constants. J. Inorg. Biochem., 1982,17, 237-246.

91. Wherland S., Gray H.B. Metalloprotein electron transfer reactions: analysis of reactivity of horse heart cytochrome C with inorganic complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976,73,29502954.

92. Williams G., Eley C.G.S., Moore G.R., Robinson M.N., Williams R.J.P. The reaction of cytochrome C with Fe (EDTA)(H20).". FEBS Letters, 1982,150,293-299.

93. Williams G., Moore G.R. Reactions of mitochondrial cytochrome C with iron-polyaminocarboxylate complexes. J. Inorg. Biochem., 1984,22, 1-10.

94. Winterbourn C.C., Carrell R.W. Oxidation of human haemoglobin by copper. Mechanism and suggested role of the thiol group of residue 0-93. Biochem. J., 1977,165,141-148.

95. Yamada T., Marini C.P., Cassatt J.C. Oxidation-reduction reactions of hemoglobin A, hemoglobin M Iwate, and hemoglobin M Hyde Park. Biochemistry, 1978,17,231-236.

96. Yamazaki I., Yokota K., Shikama K. Preparation of cristalline oxymyoglobin from horse heart. J. Biol Chem., 1964,239,4151-4153.

97. Zabinski R.M., Tatti K., Czerlinski G.H. On the electron transfer reaction between ferricytochrome C and ferrohexacyanide in the pH range 5 to 7. J. Biol. Chem., 1974,249,6125-6129.

98. Zhang B.-J., Andrew C.R., Tomkinson N.P., Sykes A.G. Reactivity patterns for redox reactions of monomer forms of myoglobin, hemocyanin and hemerythrin. Biochim. Biophys. Acta, 1992 a, 1102,245-252.

99. Zhang B.-J., Smerdon S.J., Wilkinson A.J., Sykes A.G. Oxidation of residue 45 mutant forms of pig deoxymyoglobin with Fe(CN)6.3". J. Inorg. Biochem., 1992 6,48,79-84.

100. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

101. Шеховцова Е.А. Механизм окисления оксимиоглобина кашалота, катализируемого ионами меди. Биология- наука 21го века. 5м Путинская конференция молодых ученых. 16-20 апреля 2001 г., стр. 70.

102. Постникова Г.Б., Шеховцова Е.А., Моисеева С.А., Гораев Е.В., Сивожелезов B.C. Каталитическое окисление оксимиоглобинов ионами меди. III съезд биофизиков России. 24-29 июня 2004 г. Воронеж, стр. 88, Т.1.

103. Шеховцова Е.А., Гораев Е.В., Сивожелезов B.C., Постникова Г.Б. Окисление оксимиоглобинов кашалота, лошади и свиньи, катализивуемое ионами ферроцианида: кинетика и механизм. Биофизика, 2005, т.50, № 1, с.39-48.

104. Шеховцова Е.А., Гораев Е.В., Сивожелезов B.C., Постникова Г.Б. Механизм катализируемого ионами ферроцианида окисления оксимиоглобина: химически модифицированный и мутантный миоглобины кашалота. Биофизика, 2005, т.50,000 (в печати).

105. Шеховцова Е.А., Постникова Г.Б. Механизм окисления оксимиоглобина ионами меди: карбоксиметилированный и карбоксиамидированный по остаткам гистидина миоглобины. Биохимия, 2005, т.70, 000 (в печати).861. БЛАГОДАРНОСТИ

106. Данная работа проведена в лаборатории структуры и функции редокс-белков Института биофизики клетки РАН.

107. Хочу выразить глубокую признательность моим коллегам и друзьям за помощь в работе и моральную поддержку.