Окислительная модификация белков и активность протеаз, их расщепляющих, в тканях грызунов разного возраста тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Плешакова, Ольга Викторовна

• Плешакова, Ольга Викторовна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Плешакова, Ольга Викторовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

1.1. Характеристика и взаимные превращения активных форм кислорода

1.2. Митохондрии - основной источник свободных радикалов в клетке

1.3. Воспалительные процессы и нейтрофилы

1.4. Пероксисомы и микросомы как источники свободных радикалов

1.5. Экзогенные источники свободных радикалов: ионизирующая радиация

_ как модель старения ■

2. АНТИОКСИДАНТНЫЕ СИСТЕМЫ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ

2.1. Эндогенные антиоксидантные системы

2.2. Изменение активности эндогенных антиоксидантов при старении

2.3. Подходы к замедлению старения и увеличению продолжительности жизни

1) Ограничение калорийности пищи

2) Применение антиоксидантов

3. ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ И ПРОТЕОЛИЗ БЕЛКОВ В ОРГАНИЗМЕ

3.1. Окисление аминокислот и белков под действием ионизирующей радиации

3.2. Металл-катализируемое окисление белков

3.3. Модификация аминокислотных остатков продуктами ПОЛ

3.4. Неферментативное гликозилирование (гликатирование) белков

3.5. Изменение свойств белков при окислении и накопление модифицированных

белков при старении и "свободно-радикальных" патологиях

3.6. Кругооборот белков в клетке и его нарушение при старении 53.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Окислительная модификация и изменение свойств белков в тканях крыс

при старении и окислительном стрессе, вызванном у-облучением

1.1. Накопление карбонильных групп в белках субклеточных фракций

печени и селезенки старых и у-облученных крыс

1.2. Изменение чувствительности к протеолитической деградации и антигенных свойств белков печени, выделенных из старых и у-облученных крыс

1.3. Влияние диетического потребления смеси антиоксидантов и витаминов на накопление окисленных белков и изменение их свойств уу-облученных крыс

2. Активация протеаз в тканях грызунов под действием у-облучения и их участие

в элиминации окисленных белков

2.1. Активация гистон-ассоциированных протеаз в ядрах селезенки

у-облученных крыс

2.2. Влияние ингибиторов протеаз на динамику протеолитической активности и уровень карбонильных групп в белках субклеточных фракций печени у-облученных мышей С57В1

3. Нейтрофилы - источник протеаз, специфичных к окисленным белкам

3.1. Расщепление белков дрожжей и млекопитающих при их инкубации

с активированными нейтрофилами

3.2. Расщепление окисленных белков протеазами нейтрофилов

3.3. Изменение функциональной активности мышиных перитонеальных нейтрофилов при старении

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ABC - смесь антиоксидантов и витаминов

АФ - адъювант Фрейнда

АФК - активные формы кислорода

Г-6ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ГПО - глутатионпероксидаза

2,4-ДНФГ - 2,4-динитрофенилгидразин

ДТТ - дитиотреитол

КАТ - каталаза

МАО - моноаминоксидаза

МДА - малоновый диальдегид

МКП - мультикаталитическая протеиназа

МСО-система - система "окисления, катализируемого металлами" (metal-catalyzed oxidation)

НСТ - нитросиний тетразолиевый

ОК - ограничение калорий

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РБП - растворимые белки печени

СОД - супероксиддисмутаза

ТХУ- трихлоруксусная кислота

ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

AGE-белки - продукты поздних стадий реакции гликатирования (advanced glycation end products)^

ANT - переносчик адениловых нуклеотидов

BSA - бычий сывороточный альбумин

FITC - флуоресцеин изотиоцианат

4-HNE - 4-гидроксиноненаль

HSA, HSA0X, HSAgiyc -человеческий сывороточный альбумин (исходная форма, модифицированный в системе металл-катализируемого окисления и гликатированный, соответственно)

IAA - иодацетамид

LDL - липопротеин низкой плотности

8-OHdG - 8-гидрокси-2-дезоксигуанин

OVA, OVAox -овальбумин (исходная форма и модифицированный в системе металл-катализируемого окисления, соответственно)

PBN - а-фенил-И-терт-бутилнитрон

PB S - изотонический фосфатный буфер

РМА - форболмиристатацетат

PMSF - phenylmethylsulfonyl fluoride

SS - стрептомицин сульфат

TLCK - Na-p-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone

ТРСК - N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Окислительная модификация белков и активность протеаз, их расщепляющих, в тканях грызунов разного возраста»

ВВЕДЕНИЕ

Геронтологические исследования являются приоритетным направлением современной биологии и медицины. Демографическая статистика свидетельствует, что средняя продолжительность жизни в развитых странах превысила 75 лет (Kirkwood, 1996; Harman, 1994), а доля людей старше 65 лет приближается к 20% всего населения (Kirkwood, 1996). Однако, и в настоящее время большинство людей не достигает биологического предела продолжительности жизни, а период старости связан со снижением активности всех органов, утратой способности к физической адаптации к стрессу, а также с повышением риска возникновения целого ряда заболеваний (в первую очередь, сердечно-сосудистых, нейродегенеративных, рака и др.). В этой связи становится очевидным, что необходимо не просто увеличить число проживаемых лет, а продлить период активной жизнедеятельности человека, т.е. отсрочить или предотвратить процесс старения. Как звучит девиз Американской ассоциации геронтологов, надо "добавить больше жизни к годам, а не больше лет к жизни" ("add life into years and not years into life") (цит. по Канунго, 1982).

Для объяснения механизмов старения предложен ряд генных теорий (Szilard, 1959; Orgel, 4963).—Старение пытались объяснить нарушениями иммунологических функций (Walford, 1974), повреждением митохондрий (Miquel et al., 1980) и др.

В 1956 г Harman выдвинул свободно-радикальную теорию старения, которая получила дальнейшее развитие и экспериментальное подтверждение в его собственных работах (Harman, 1982; Harman, 1994) и многочисленных публикациях других авторов (см., напр., обзор Beckman and Ames, 1998). Согласно этой теории, старение организмов и связанные с ним болезни обусловлены повреждением важнейших клеточных макромолекул свободными радикалами, образующимися в целом ряде биохимических процессов (главным образом, в митохондриях). Организм, однако, снабжен рядом антиоксидантных ферментов и низкомолекулярных антиоксидантов, а также ферментов, репарирующих или элиминирующих поврежденные молекулы. Возрастание скорости генерации свободных радикалов или снижение эффективности защитных систем в организме с возрастом приведет к повышению стационарной концентрации свободных радикалов и накоплению поврежденных макромолекул в клетках. Внешние факторы (радиация, загрязнение среды, ксенобиотики) также могут усилить окислительный стресс и, таким образом, способствовать преждевременному старению.

Из трех основных типов мишеней свободных радикалов в клетке (липиды, нуклеиновые кислоты и белки), наиболее хорошо изучено аутоокисление липидов и его последствия для клетки (нарушение структуры мембран и активности мембранных ферментов) (Gutteridge and

Halliwell, 1990). Окислительное повреждение нуклеиновых кислот также интенсивно изучается. Накопление свободно-радикальных повреждений нуклеотидов (в частности, образование 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина, которое рассматривают как один из маркеров старения), очевидно, создает предпосылки для изменения конформации и возникновения разрывов молекулы ДНК (Ozawa, 1995; Ames et al., 1993) и, таким образом, может стать причиной повреждения структуры хромосом и функциональных расстройств, а также играет важную роль в канцерогенезе.

Окислительное повреждение белков гораздо менее изучено, хотя описан целый ряд модификаций белковых молекул, начиная с непосредственного повреждения боковых аминокислотных остатков свободными радикалами и кончая образованием перекрестных сшивок с продуктами перекисного окисления липидов, восстанавливающими сахарами и продуктами их окисления (Njoxoge and Monnier, 1989; Stadtman, 1993; Dean et al., 1997). Вместе с тем, накопление поврежденных окислением белков в клетке может оказать сильнейшее и очень быстрое отрицательное воздействие на ее метаболизм, поскольку, как показали многочисленные исследования in vitro, окисление нарушает структуру и конформацию белковой молекулы, ее электрический заряд, гидрофобность и связывание лигандов, а также, в случае ферментов, подавляет их активность (Fucci et al., 1983; Wolff and Dean, 1986; Stadtman, 1993; Giulivi et al., 1994). Одним из результатов окисления аминокислотных остатков является включение карбонильных групп в молекулу белка. Экспоненциальное возрастание содержания карбонильных групп с возрастом продемонстрировано для различных лабораторных животных (Starke-Reed and Oliver, 1989; Sohal et al., 1993). Повышенные уровни белковых карбонилов были обнаружены в фибробластах старых людей и пациентов с болезнями преждевременного старения (синдром Werner и прогерия) (Oliver et al., 1987), а также у животных под действием модельного окислительного стресса (гипероксия, ионизирующая радиация) (Starke-Reed and Oliver, 1989; Agarwal and Sohal, 1993; Carney and Carney, 1994). Уровень белковых карбонилов в тканях в настоящее время широко используется в качестве маркера старения и окислительного стресса (Stadtman, 1995). Однако, остается неясным, является ли включение карбонильных групп в белки простым индикатором их свободно-радикального повреждения или определяет нарушение их свойств и метаболизма клеток и органов в целом. Показано, что накопление окисленных белков (по уровню карбонильных групп) в тканях грызунов с возрастом коррелирует со снижением активности отдельных ферментов в них (Starke-Reed and Oliver, 1989; Carney and Carney, 1994). Однако, возможная корреляция этого маркера старения с изменением других свойств белков при старении и модельном окислительном стрессе in vivo

остается неизученной. Представляет также интерес изучение возможности коррекции окислительного повреждения белков и изменения их свойств диетическими антиоксидантами и витаминами.

Белки представляют собой семейство весьма разнородных молекул, которые могут проявлять различную чувствительность к окислительной модификации, так же как и последствия одинаковой модификации могут быть различны для разных белков. Имеющиеся в настоящее время литературные данные по чувствительности отдельных клеточных белков к окислительной модификации весьма немногочисленны (Agarwal and Sohal, 1995; Cabiscol and Levine, 1995; Yan et al., 1997). Вместе с тем, выявление предпочтительных мишеней для свободных радикалов в клетке необходимо для понимания механизмов нарушения ее метаболизма при старении. В различных органах и тканях чувствительность отдельных белковых фракций может различаться, что может обусловить особенности дегенеративных изменений в данном органе.

Одной из причин накопления поврежденных белков в тканях старых животных может быть снижение активности расщепляющих их протеаз. Изучение деградации окисленных белков в стареющем организме или в условиях стресса in vivo важно для выявления подходов к предотвращению накопления окисленных белков. Однако, имеющиеся литературные данные по изучению возрастных изменений протеолитической активности у лабораторных животных весьма противоречивы: в ряде работ показано снижение активности нейтральных и щелочных протеаз (Starke-Reed and Oliver, 1989; Agarwal and Sohal, 1994), в то время как другие авторы сообщают о сохранении протеолитической активности с возрастом (Sahakian et al., 1995; Cao and Cutler, 1995a). В большинстве таких работ в качестве субстратов использовались индивидуальные белки, окисленные in vitro в системах металл-катализируемого окисления или под действием высоких доз у-радиации. В то же время, при физиологическом старении накапливается широкий спектр окислительных модификаций в белках, природа которых не всегда известна. Поэтому особенно важно изучить связь между степенью окислительной модификации белков в тканях in vivo и их чувствительностью к действию различных эндогенных протеаз в зависимости от возраста животного.

Отдельный вопрос представляет собой поиск и идентификация протеаз, специфичных к окисленным белкам, в клетках. Основную роль в расщеплении большинства внутриклеточных белков играет сложный ферментативный комплекс - мультикаталитическая протеиназа (МКП), которая проявляет повышенное сродство к белкам с умеренной степенью окисления (Orlowski, 1990; Gruñe et al., 1996). Расщепление отживших (поврежденных) и регуляторных белков МКП играет важную роль в кругообороте белков в клетке. Однако, при различных

патологических состояниях (например, воспаление) внутриклеточные белки могут высвобождаться наружу из гибнущих клеток. При контакте с клетками иммунной системы они могут вызывать развитие аутоиммунного ответа. Существование протеаз, способных расщеплять собственные белки организма вне клеток и, таким образом, предотвращать развитие аутоиммунного ответа (гипотеза "рестрикционных" протеаз (Lefkovits, 1986)), и их специфичность к окисленным белкам (поскольку в очаге воспаления происходит сильное окислительное повреждение макромолекул как собственных, так и бактериальных клеток АФК фагоцитов) остается под вопросом. Вместе с тем, очевидно, что изучение активности таких протеаз и ее изменения с возрастом может пролить свет на некоторые аспекты нарушения иммунологической толерантности и повышения аутореактивности при старении. Поскольку нейтрофилы являются основным участником воспалительных реакций в организме и, с одной стороны, производят значительные количества АФК при активации, а, с другой стороны, обладают целым набором протеолитических ферментов (Маянский и Маянский, 1983), мы предложили их на роль источников таких протеаз и впервые исследовали расщепление различных белковых субстратов протеазами этих клеток.

Целью настоящего исследования явилось изучение накопления окислительных повреждений белков в тканях лабораторных грызунов разного возраста, а также под действием окислительного стресса, вызванного у-облучением животных, выявление корреляции между окислительным повреждением белков и изменением их свойств in vivo, а также изучение изменения активности протеаз, расщепляющих окисленные белки, с возрастом.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

1.1. Характеристика и взаимные превращения активных форм кислорода Молекулярный кислород составляет 21% в атмосфере Земли и является основным источником жизни для большинства живых организмов. Молекула 02 представляет собой дирадикал, т.к. она обладает двумя неспаренными электронами на разных орбиталях, имеющими однонаправленные спины. Из-за своей способности принимать электроны кислород является мощным окислителем. В силу спинового запрета одноэлектронное восстановление молекулы Ог энергетически более выгодно, чем четырехэлектронное (Fridovich, 1978; Chuaqui and Petkau, 1987): e" + Oz 02~* e + 02~* + 2 H+ ^H202 e" + H202 + H+ -» HO* + H20 e" + HO* + H+ -» H20

В тканях, благодаря наличию сложных ферментативных комплексов со специфическими электрон-транспортными простетическими и коферментативными группами, процесс восстановления 02 протекает по многоэлектронному механизму, что сводит до минимума возможность_образования и_освобождения его высокореактивных интермедиатов. Однако, в— ряде ферментативных и спонтанных реакций может происходить и одноэлектронное восстановление кислорода с образованием супероксидного анион-радикала 02~*.

Основным источником 02~* являются митохондриальная и микросомальная электрон-транспортные цепи. Супероксйд является также первичным продуктом респираторного взрыва фагоцитов в очаге воспаления. Ряд 02-утилизирующих ферментов (триптофангидроксилаза, индоламиндиоксигеназа, циклооксигеназа) непосредственно генерируют 02"*. Генерация 02~* может быть связана с окислительно-востановительными реакциями, катализируемыми флавиновыми оксидазами (ксантиноксидазой, альдегидоксидазой, галактозооксидазой) или дегидрогеназами (дигидрооротатдегидрогеназа и др.) (Massey et al., 1969). Супероксидный анион-радикал может образовываться при аутоокислении флавинов, катехоламинов, тетрагидроптеринов, тиолов (Massey et al., 1969; Fisher and Kaufman, 1973; Cohen and Heikkila, 1974; Misra, 1974). Примером неферментативной генерации 02"* служит также образование метгемоглобина (Caughey et al., 1975).

В водных растворах (V* является слабым основанием, нуклеофилом и при физиологических pH существует в равновесии со своей протонированной формой (НОг"*). При реакциях одноэлектронного переноса супероксидный радикал может выступать как оксидант и как восстановитель. Так, он окисляет катехолы, витамин Е и родственные соединения до хинонов и Н2О2 и восстанавливает хиноны и органические перекиси до семихинонов и оксирадикалов, соответственно, с образованием Ог. Однако, его реакционноспособность невелика из-за сильной сольватации в водной среде, что отражается в более высоком t\a (1 х 10"6 сек) по сравнению с другими радикалами (Reiter, 1995).

Хотя сам по себе супероксидный анион-радикал не очень токсичен и способен проникать через мембраны только через анионные каналы, он легко превращается в более активные фирмы. Основной его реакцией является дисмутация, спонтанная или~~ катализируемая супероксиддисмутазой (СОД), с образованием перекиси водорода Н2О2: 2 02"* + 2 Н+ Н202 + 02 (или '02)

Кроме СОД, перекись водорода генерируют оксидаза L-аминокислот, гликолатоксидаза, а также моноаминоксидаза (МАО) внешней митохондриальной мембраны.

Вклад различных органелл в уровень перекиси водорода в цитозоле: митохондрии - 15, микросомы - 45, пероксисомы - 35, цитозольные ферменты — 5%.

Реактивность Н2О2 как оксиданта низка и проявляется только при высоких концентрациях. Однако, в отличие от супероксида, перекись водорода легко проникает через клеточные мембраны и может действовать вдали от места своего образования. В присутствии Fe2+ или Си+ она разлагается до гидроксильного радикала ОН* и аниона ОН" (реакция Фентона). Гидроксильный радикал образуется также при катализируемом ионами металлов взаимодействии Н2О2 с радикалом Ог"* по реакции Haber-Weiss: 02"* + Н202 -» 02 (или ]02) + «ОН + ОН"

Реакция протекает в две стадии; последняя из них представляет собой реакцию Фентона: 02"* + Меп+ -> 02 (или '02) + Ме(п",)+ Ме(л-П+ + Н2о2 Ме"+ + «ОН + ОН"

Гидроксильный радикал *ОН обладает наибольшей токсичностью. Он реагирует с огромной скоростью практически с любой молекулой в пределах нескольких ангстрем (Á) от места своего образования, вызывая повреждение ДНК (модификацию дезоксирибозы, пуриновых и пиримидиновых оснований, разрывы цепей и т.д.) (Dizdaroglu, 1992), инициируя перекисное окисление липидов (ПОЛ) с образованием карбонильных соединений (малоновый

диальдегид (МДА), 4-гидроксиноненаль (4-HNE), 4-гидроксил-2,3-транс-ноненаль) (Gutteridge and Halliwell, 1990), повреждая белки (Dean et al., 1997).

------ В ряде-реакций с участием АФК в присутствии ионов переходных металлов образуется

синглетный кислород 'Ог. Из двух его форм - А и 8, различающихся тем, формирует ли возбужденный электрон электронную пару на той же самой орбитали или остается неспаренным на разных орбиталях, первая более стабильна. Синглетный кислород проявляет в растворе электрофильные свойства и взаимодействует с молекулами, обладающими областями с высокой электронной плотностью, т.е. содержащими двойные связи углерод-углерод (триптофан, метионин, гуанин, ненасыщенные жирные кислоты).

В последние годы возрос интерес к оксиду азота N0, который также участвует в реакциях окисления. NO-синтетаза, катализирующая его образование из L-аргинина, обнаружена в эндотелии сосудов, фагоцитах и нейронах. Молекула N0* содержит один неспаренный электрон и способна с крайне высокой скоростью реагировать с (V* с образованием пероксинитрита (ONOO ) (Beckman et al., 1990), который диффундирует на расстояния нескольких клеточных диаметров и вызывает окислительные повреждения липидов, ДНК и белков как сам по себе, так и в результате разложения до токсичных N02*, ОН* и ионов нитрония (N02 ). Оксид азота N0 также способен спонтанно и быстро реагировать с молекулярным кислородом с образованием диоксида NO2 и триоксида азота N2O3 - сильных окисляющих и N-нитрозилирующих агентов. Оксид азота является одной из основных бактерицидных молекул фагоцитов, а также действует как фактор релаксации сосудов (по Iadecola, 1997). Инактивация N0 супероксидным радикалом при окислительном стрессе препятствует релаксации сосудов и может лежать в основе развития гипертонии (Suzuki et al, 1998). Активация NO-синтетазы и индукция ее синтеза в нейронах, особенно при снижении уровня АТФ в них, в частности, с возрастом или при патологии, с образованием избыточных количеств оксида азота и далее высокотоксичного пероксинитрита, усиливает окислительный стресс, связанный с освобождением нейротрансмиттеров возбуждения (в первую очередь, глутамата) (Kucukkaya et al., 1996; Iadecola, 1997). Таким образом, NO играет важную роль в повреждении мозга при старении, ишемии и нейродегенеративных заболеваниях.

Ионы переходных металлов (железо и медь) играют особую роль в токсичности АФК. Во-первых, они катализируют образование высокоактивных радикалов ОН»; во-вторых, они взаимодействуют с гидроперекисями липидов и разрушают их до перокси- и алкоксирадикалов, которые реинициируют ПОЛ (Halliwell and Gutteridge, 1984). Перокси-,

алкокси- и другие радикалы могут возникать также в белках при реакции с ионами металлов или радикалами с центром в атоме углерода (Dean et al., 1997).

Как правило, процессы генерации АФК и их утилизации в метаболических процессах в организме сбалансированы. Однако, различные изменения в организме - стресс, гипоксия, гипероксия, воспаление - могут привести к повышению уровня АФК в клетках либо вследствие усиления их образования, либо вследствие нарушения, его дальнейшего использования в процессе окисления субстратов. Так, при ишемической гипероксии, в результате активации Са2+-зависимых протеаз, ксантиндегидрогеназа эндотелия сосудов, которая в норме катализирует процесс окисления ксантина до мочевой кислоты с участием NAD+, превращается в ксантиноксидазу (McCord, 1985):

Ксантин + Н20 + 2 Ог мочевая кислота + 2 Ог"*

Активация фосфолипаз при ишемии приводит к освобождению арахидоновой кислоты, при метаболизме которой в циклооксигеназной и липоксигеназной реакциях также образуется супероксид.

Мобилизация железа из комплекса с ферритином или разрушенных гемовых белков в условиях стресса (Дубинина, 1989) или освобождение Fe при инактивации ферментов с железо-серными кластерами супероксидным радикалом (Liochev and Fridovich, 1994) ускоряет образование гидроксильных радикалов.

Приведенные выше примеры свидетельствуют о необходимости детального изучения источников свободно-радикальных реакций в организме и изменениг их активности с возрастом.

1.2. Митохондрии — основной источник свободных радикалов в клетке

Поскольку митохондрии содержатся практически во всех клетках животных организмов (их количество варьирует от 2 до 1000 на одну клетку) и, являясь основной "энергетической фабрикой" клетки, утилизируют 90% потребляемого ею кислорода, они привлекают активное внимание исследователей. Установлено, что максимальная продолжительность жизни вида обратно коррелирует со скоростью метаболизма, которая определяется по количеству кислорода, поглощенного организмом в единицу времени, и зависит от содержания и-— активности митохондрий в соответствующих органах (Ku et al., 1993). Показано, что более крупные, дольше живущие животные имеют меньшее содержание митохондриальной цитохромоксидазы на клетку (Kunkel and Campbell, 1952).

Митохондриальная электрон-транспортная цепь (ЭТЦ) передает электроны от NADH и сукцината, образующихся в цикле Кребса, на молекулярный кислород с одновременным

векторным переносом протонов наружу, таким образом, преобразовывая энергию, высвобождающуюся при окислении субстратов, в разность электрохимических потенциалов ионов водорода (Ацн+) на внутренней мембране (« -200 мВ). Дыхательная цепь митохондрий состоит из нескольких высокомолекулярных белковых комплексов, расположенных во внутренней мембране: комплекс I - НАБН:убихинонредуктаза, комплекс II -сукцинат:убихинон-оксидоредуктаза, комплекс III - убихинол:цитохром с-оксидоредуктаза, комплекс IV - цитохром с:02-оксидоредуктаза (цитохромоксидаза). Комплекс V - АТФ-синтетаза - является протонной помпой, которая использует протонный градиент на мембране для синтеза АТФ, таким образом, обеспечивая энергетические потребности клетки. Комплексы состоят более чем из 60 полипептидов; только 13 из них синтезируются под контролем митохондриальной ДНК.

Восстановление кислорода происходит на уровне цитохромов aa¡ в комплексе IV и представляет собой последовательный перенос четырех электронов; при этом интермедиаты кислорода прочно удерживаются в активном центре цитохромоксидазы вплоть до полного восстановления его до НгО. Однако, восстановленные формы других элементов ЭТЦ могут передавать электрон непосредственно на кислород и освобождать супероксидный радикал из-за своей неспособности удерживать частично восстановленные кислородные интермедиаты. "Утечка" электронов из ЭТЦ и одноэлектронное восстановление кислорода происходит на уровне NADH-дегидрогеназы и цитохрома Ь5б6, входящего в состав комплекса III (Turrens and Boveris, 1980; Nohl and Jordan, 1986).

"""" Спонтанная или катализируемая митохондриальной СОД дисмутация Of* приводит к" образованию Н2О2, которая в присутствии низкомолекулярных комплексов железа и меди разлагается по реакции Фентона или, возможно, вступает в реакцию с радикалом восстановленного убисемихинона (Q*~) даже в отсутствие комплексов ионов металлов с образованием гидроксильных радикалов: Q" + Н202 -» Q + 'ОН + ОН"

Даже в нормально функционирующих (прочно сопряженных) митохондриях 2 - 5% всего поглощаемого ими кислорода превращается в супероксидный радикал и другие АФК вследствие "утечки" электронов из дыхательной цепи (Ames et al., 1993). Величина "утечки" протонов из дыхательной цепи, которая связана с продукцией АФК, обратно коррелирует с видоспецифической продолжительностью жизни (Perez Campo et al., 1998; Ku et al., 1993).

С возрастом вероятность такой "утечки" повышается, т.к. даже небольшое снижение содержания цитохрома ааз, наблюдаемое в процессе старения (Muller-Hocker, 1990; Itoh et al.,

1996), приводит к изменению стехиометрических соотношений между комплексами: относительное содержание убихинонов и семейства цитохромов Ъ возрастает.

Установлено, что скорость образования АФК возрастает при старении в изолированных митохондриях насекомых и различных тканей монгольских песчанок (Sohal and Dubey, 1994; Sohal et al., 1995a). Повышенная продукция оксидантов митохондриями была продемонстрирована также в интактных гепатоцитах старых крыс (Hagen et al., 1997).

Экспериментальный окислительный стресс, индуцированный в митохондриях домашней мухи воздействием 100% О2 или рентгеновского облучения, вызывал увеличение скорости образования ими Н2О2 (Sohal and Dubey, 1994). Обнаруженный цикл, функционирующий по типу положительной "обратной" связи, может лежать в основе наблюдаемого возрастания продукции АФК митохондриями при старении.

Отсутствие изменения продукции АФК с возрастом в некоторых исследованиях (Hansford et al.," 1997) можетГбыть связано с тем, что поврежденные митохондрии, которые могут составлять до 1/2 от общего количества, являются более хрупкими и могут разрушаться при выделении.

Оксиданты вызывают повреждения собственных компонентов митохондрий. Так, АФК инактивируют ряд ферментов ЭТЦ и АТФазу (Zhang et al., 1990). Пероксинитрит ингибировал СДГ, NADH-дегидрогеназу и АТФазу и усиливал продукцию Н202 в митохондриях сердца крысы (Radi et al., 1994).

У старых животных активности комплексов I и, особенно, IV (Takasawa et al., 1993; Hsieh et al., 1994), а также ANT (Kim et al., 1988), снижены. Обнаруженная линейная обратная зависимость между повышением уровня белковых карбонилов в синаптических митохондриях мозга мышей с возрастом и соотношением комплекс IV/комплекс I указывает на окислительное повреждение и дисбаланс компонентов дыхательной цепи (Martinez et al., 1996).

В митохондриях старых мух обнаружено окислительное повреждение фермента цикла Кребса аконитазы, которое блокирует нормальный поток электронов; накапливающиеся восстановленные метаболиты (NADH) могут генерировать АФК при аутоокислении и, таким образом, усиливать окислительный стресс (Yan et al., 1997).

Снижение активности мембранных ферментов может быть связано с нарушением целостной структуры мембранных фосфолипидов. Супероксидный радикал способен активировать фосфолипазу А2 в митохондриях, продукты которой, возможно, повреждают мембрану (Madesh and Balasubramanian, 1997). У старых животных повышено содержание легкоокисляемых длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (22 : 4, 22 : 5) в

фосфолипидах внутренней мнтохондриальной мембраны (Shigenaga et al., 1994). Интенсификация процессов ПОЛ в митохондриях в процессе старения (Wei et al., 1996) и взаимодействие его продуктов (особенно 4-HNE) с фосфолипидами (Chen and Yu, 1994) приводят к повышению жесткости внутренней мембраны. Повреждение кардиолипина играет, по-видимому,"критическую роль в снижении активности ключевых мембранных ферментов, в " частности, цитохромоксидазы, у старых животных (Paradies et al., 1997).

Продукты ПОЛ могут также взаимодействовать непосредственно с митохондриальными белками с образованием перекрестных сшивок (Cohn et al., 1996). Показано ингибирование транспортной активности переносчика адениловых нуклеотидов 4-HNE и 4-ННЕ вследствие модификации его функциональных SH-групп (Chen et al., 1995).

О нарушении нормальной структуры мнтохондриальной мембраны у старых животных свидетельствует снижение мембранного потенциала в митохондриях гепатоцитов (Hagen et al., 1997) и повышение их неспецифической проницаемости в лимфоцитах селезенки (Rottenberg and Wu, 1997).

Митохондриальная ДНК, в отличие от ядерной, не содержит гистонов и ферментов репарации ДНК и поэтому более чувствительна к воздействию оксидантов. Скорость накопления окислительных повреждений (измеряемая по образованию 8-гидрокси-2'-дезоксигуанина, 8-OHdG), а также скорость возникновения мутаций, в митДНК в 10 - 17 раз выше, чем в ядерной ДНК (Arnes et al., 1993; Shigenaga et al., 1994). Накопление делеций в митДНК, обнаруженное как при старении, так и при связанных с ним дегенеративных заболеваниях (Luft and Landau, 1995; Wei et al., 1996), связано, вероятнее всего, с окислительной модификацией дезоксигуанина, которая вызывает изменение конформации в молекуле ДНК и облегчает ее двухцепочечный разрыв (Ozawa, 1995). Накопление окислительных повреждений в митДНК считают одним из маркеров старения.

Накопление мутаций в мнтохондриальной ДНК или ядерной ДНК, кодирующей митохондриальные белки, которое может привести к снижению экспрессии соответствующих генов, окислительное повреждение комплексов ЭТЦ и АТФ-синтетазы, падение Avj/ — каждый из этих факторов по отдельности и все они вместе могут приводить к снижению эффективности окислительного фосфорилирования, наблюдаемому у старых животных (Kim et al., 1988; Nakahara et al., 1998). Дефицит АТФ в клетках, особенно в тканях, потребляющих большие количества энергии (ЦНС, сердечная и скелетные мышцы, почки, печень и эндокринная система), снижает их активность и способность к адаптации к различным типам стрессов и приводит к генерализованному повреждению тканей и органов и развитию фенотипических признаков старения. Бурное развитие "митохондриальной медицины" в

последние годы подтверждает важнейшую роль митохондрий как основного источника свободных радикалов в развитии процесса старения и связанных с ним заболеваний (Luft and Landau, 1995), возможно, как своеобразных "биологических часов", "включающих" процесс старения.

Логично было бы предположить, что митохондрии являются также и основной мишенью свободных радикалов в клетке; однако, данные по сравнительному изучению чувствительности различных субклеточных фракций к накоплению поврежденных окислением макромолекул при старении или окислительном стрессе отсутствуют.

1.3. Воспалительные процессы и нейтрофилы

Фагоцитирующие лейкоциты (нейтрофилы, макрофаги) обеспечивают неспецифическую защиту организма от различных инфекций, генерируя значительные количества АФК и других оксидантов в процессе фагоцитоза при воспалительных процессах.

Нейтрофилы - наиболее многочисленные лейкоциты (1.5 млрд. клеток/л крови, время жизни в кровотоке 6-10 час), которые первыми отвечают на инвазию патогена. Стимуляция нейтрофилов различными агентами (лейкотриен В4, фактор активации тромбоцитов, иммунные комплексы, компоненты комплемента, бактериальные продукты, форболовые эфиры) вызывает резкое возрастание нечувствительного к цианиду поглощения кислорода (так называемый "респираторный взрыв") с одновременным образованием значительных количеств супероксидного анион-радикала. В основе этого процесса лежит активация NADPH-оксидазы плазматической мембраны, которая представляет собой гем- и флавин-содержащий белковый комплекс и переносит один электрон от внутриклеточного NAD(P)H на молекулу кислорода по следующей цепи: NAD(P)H - флавопротеин - Qio - цитохром Ьцд -экзогенный кислород (Badwey and Karnovsky, 1986):

NADPH + 2О2 -» 20{* + NADP+ + H+

Активация нейтрофилов сопровождается секреторной дегрануляцией, т.е. выбросом содержимого двух типов гранул - азурофильных и более многочисленных специфических (Маянский и Маянский, 1983). Лизоцим и катионные белки обнаружены в обоих типах гранул. Азурофильные гранулы содержат миелопероксидазу и ряд кислых гидролаз (N-ацетил-а-глюкозаминидаза, ß-глюкуронидаза, ß-глицерофосфатаза, а-маннозидаза), способных разрушать полисахариды бактерий, соединительной и хрящевой ткани, а также протеолитические ферменты - катепсины В, D, G, эластазу, протеиназу 3 и некоторые другие нейтральные протеазы. В специфических гранулах находятся лактоферрин, активатор

плазминогена, а также проформы металлопротеиназ матрикса, желатиназы В и коллагеназы. Кроме того, про-желатиназа В обнаружена в желатиназных гранулах.

Высокая антимикробная активность нейтрофилов обусловлена прежде всего активацией кислородного метаболизма в них и окислительным повреждением бактериальных клеток. Так, пациенты с хроническим грануломатозом, при котором не функционируют NADPH-оксидазы и, следовательно, нарушена генерация АФК в нейтрофилах, страдают от хронических бактериальных инфекций (Curnutte, 1992). В деградации бактериальных компонентов участвуют ферменты гранул, освобождающиеся в фаголизосому.

Активированные нейтрофилы вызывают также гибель опухолевых клеток (Dallegri et al., 1983) и, таким образом, вовлечены в противоопухолевый иммунитет.

В силу невысокой реакционной способности 02~, а также потому, что большинство бактерий содержит СОД, основную роль в бактерицидности нейтрофилов играют продукты его дальнейшего превращения (Н2О2, ОН», 'Ог). При взаимодействии Н2О2 с СГ, катализируемом миелопероксидазой, образуется долгоживущая молекула - гипохлорит, который считается основным антимикробным оксидантом нейтрофилов (Weiss, 1989):

Н202 + СГ ОСГ + Н20

Гипохлорит вызывает галогенирование тирозиновых остатков в поверхностных белках клеток-мишеней (Klebanoff, 1967), а также расщепление пептидных связей и декарбоксилирование аминокислот (Selvaraj et al., 1974). При его реакции с аминами образуются хлорамины, которые также способны окислять и хлорировать белки клеток-мишеней (Weiss, 1989).

Нейтрофилы генерируют также значительные количества NO (McCall et al., 1989), который, возможно, дает вклад в их антимикробную активность.

В норме процесс воспаления находится под строгим контролем. Окислительное повреждение собственных белков (Oliver, 1987) и ДНК (Floyd et al., 1986) нейтрофилов, окисление клеточного глутатиона (Carr and Winterbourn, 1997), а также запуск их программируемой гибели в очаге воспаления, который также, очевидно, опосредуется оксидантами (Kettritz et al., 1997), сопровождается снижением их функциональной активности (Whyte et al., 1993) и приводит к их узнаванию и фагоцитозу макрофагами (Savill et al., 1989). Описанная последовательность событий приводит к удалению нейтрофилов и их токсических продуктов и, таким образом, может служить для прекращения острого воспаления.

Если этого не удается достичь, воспалительный процесс становится хроническим, и избыточная продукция оксидантов и протеолитических ферментов (особенно, нейтральных

протеаз) нейтрофилами может приводить к значительным повреждениям собственных тканей (Henson and Johnston, 1987).

Помимо описанного выше прямого действия АФК на мембраны и важнейшие клеточные макромолекулы, супероксидный анион-радикал окисляет внеклеточный аскорбат и глутатион в очаге воспаления, тем самым снижая защиту тканей от окислительного повреждения нейтрофилами (Thomas et al., 1988).

Оксиданты нейтрофилов изменяют баланс протеаз/антипротеаз в тканях. Так, гипохлорит и, возможно, некоторые липофильные N-хлорамины и активные интермедиаты азота могут инактивировать тканевые ингибиторы протеаз, такие как ai-антипротеиназа и осг-макроглобулин (Ossanna et al., 1986; Thomas et al., 1991). Кроме того, миелопероксидазная система может активировать латентную коллагеназу и желатиназу, секретируемые нейтрофилами (Weiss, 1989), а также протеазы могут активировать друг друга (Ferry et al., 1997). Окисление тканевых белков АФК нейтрофилов повышает их доступность для протеаз (см. главу 3) и, таким образом, создает условия для их неконтролируемой деградации при воспалении.

Активированные нейтрофилы (Daudi et al., 1991) или очищенная эластаза (Watanabe et al., 1990) вызывают значительную деградацию белков внеклеточного матрикса и базальной мембраны in vitro. Опосредованная АФК цитотоксичность нейтрофилов была продемонстрирована in vitro по отношению к сингенным эритроцитам (Weiss, 1980). Перекись водорода и эластаза нейтрофилов вызывают лизис эндотелиальных клеток в культуре (Ward, 1991; Smedly et al., 1986) и, возможно, опосредуют повышение проницаемости микрососудов и отек при воспалении. Эластаза нейтрофилов обнаружена в образцах тканей больных бронхопневмонией, полиартритом и ревматоидным артритом (Watanabe et al., 1990). Коллагеназа нейтрофилов вовлечена в разрушение коллагена хрящевой ткани (Konttinen et al., 1991). В настоящее время можно считать доказанной роль нейтрофилов и их метаболитов в патогенезе целого ряда легочных заболеваний (эмфизема, острый респираторный дистресс синдром) (Hogg, 1987), ревматоидного артрита (Edwards and Hallett, 1997), повреждения сердечно-сосудистой системы при инфаркте миокарда (Kilgore and Lucchesi, 1993) и, возможно, атеросклероза (Mohacsi et al., 1992).

Кроме своего цитотоксического действия, оксиданты нейтрофилов вызывают мутагенез в прокариотических и эукариотических клетках, что создает предпосылки для их злокачественной трансформации. Установлено, что развитию рака часто предшествует хроническое воспаление в данном органе (Weitzman and Gordon, 1990).

В связи с важной ролью нейтрофилов в организме, представляет интерес изучение изменения их активности при старении.

Количество нейтрофилов в периферической крови человека с возрастом не изменяется (Nagel et al., 1982). Обнаружено снижение способности нейтрофилов человека к хемотаксису и дегрануляции при стимуляции (McLaughlin et al., 1985). Адгезия на желатине - компоненте внеклеточного матрикса - снижалась, однако, хемотаксическая активность не изменялась (Perskin and Cronstein, 1991). Детальный анализ различных возрастных групп показал, что способность нейтрофилов крови к хемотаксису значительно снижалась у людей в возрасте 65 - 79 лет, в то время как у лиц старше 80 лет она была сравнима с молодыми людьми (18-48 лет), причем обнаружена корреляция между выживанием до такого возраста и способностью нейтрофилов к хемотаксису (Niwa et al., 1989). Эти же авторы не обнаружили заметных изменений других свойств нейтрофилов (фагоцитоза, продукции АФК) (Niwa et al., 1989). Нейтрофилы старых людей имели повышенные уровни Са в цитоплазме и фоновой продукции Ог в то же время, способность к активации респираторного взрыва различными стимулами у них была снижена (Mohacsi et al., 1992).

Несмотря на снижение продукции Ог"* в ответ на стимуляцию частицами латекса, бактерицидная способность нейтрофилов периферической крови по отношению к S. aureus была сходной у молодых (34 лет) и пожилых (68 лет) людей (Nagel et al., 1982).

Активация нейтрофилов в ответ на fMLP нарушалась при старении сильнее, чем активация в ответ на РМА (Indelicato et al., 1990; Lipschitz et al., 1991), что указывало на повреждение связанного с мембраной пути передачи сигнала либо вследствие нарушения сопряжения на уровне рецептора, либо изменения структуры мембранных липидов. Действительно, было обнаружено снижение вязкости плазматической мембраны нейтрофилов у стариков (Perskin and Cronstein, 1991) и нарушение генерации II мессенджеров -диацилглицерола и инозитол-трифосфата (Lipschitz et al., 1991), а также цАМФ (McLaughlin et al., 1985) при стимуляции. (Lipschitz et al., 1988) установили корреляцию между снижением образования супероксид-аниона в старости и нарушением кальциевого метаболизма в нейтрофилах.

Интересно, что функциональная активность нейтрофилов была заметно снижена у больных атеросклерозом (Mohacsi et al., 1992) и диабетом (Zozulinska et al., 1996), что может указывать на включение механизмов раннего старения у таких пациентов.

Несмотря на противоречивость имеющихся в литературе данных, общая тенденция к снижению активности нейтрофилов с возрастом может по крайней мере частично объяснить повышенную восприимчивость и смертность от инфекций у старых людей (Gardner, 1980), а

также указывает на то, что, в отличие от митохондрий, роль нейтрофилов как источника свободных радикалов в организме при старении не повышается.

Обнаруженные расхождения могут быть связаны с гетерогенностью человеческой популяции и условий жизни и питания, что приводит к высокому разбросу значений параметров между индивидуумами, а также с отсутствием единообразия при формировании экспериментальных групп (часто объединяющих людей, сильно различающихся по возрасту). Изменение активности нейтрофилов с возрастом требует дальнейшего изучения с использованием линейных лабораторных животных, содержащихся в стандартных условиях.

1.4. Пероксисомы и микросомы как источники свободных радикалов

Пероксисомы осуществляют ß-окисление длинноцепочечных жирных кислот и других молекул (стеролы, дикарбоновые кислоты, арахидоновая кислота, простагландины и др.). Функционирование набора оксидаз (главным образом, уратоксидазы, оксидазы D-аминокислот) сопровождается поглощением кислорода этими органеллами (в печени крысы до 20%) с образованием перекиси водорода (van den Bosch et al., 1992), которая далее расщепляется каталазой, присутствующей в достаточно больших количествах. Некоторое количество Н2О2, однако (в изолированных пероксисомах 11 - 42%; в клетке, по расчетам -2%) (Chance et al., 1979), может диффундировать наружу и накапливаться в цитоплазме.

У старых животных снижается содержание каталазы и повышается содержание тиолазы и уратоксидазы в пероксисомах (Beier et al., 1993), что, возможно, усиливает окислительный стресс в клетке. Гиполипидемические препараты (класс фибратов) вызывают пролиферацию пероксисом и индуцируют гепатокарциномы у животных, вероятно, по окислительному механизму, поскольку введение антиоксидантов снижает частоту этих опухолей (по Masters and Crane, 1995).

Свободные радикалы образуются также при окислении многочисленных эндогенных соединений и ксенобиотиков (лекарств, ядов, канцерогенов, пестицидов и компонентов пищи) в микросомах (Арчаков и Карузина, 1995). Микросомальные системы окисления состоят из двух компонентов: флавопротеина, содержащего FAD и FMN (NADPH-зависимая Р-450-редуктаза), и Р-450. Они расположены на мембране эндоплазматического ретикулума печени и других органов, а также в митохондриях коры надпочечников. Для Р-450 характерна множественность функций, основной из которых является монооксигеназная реакция. В присутствии доноров электронов (NADPH) Р-450 способен активировать молекулярный кислород, один атом которого затем внедряется в молекулу окисляемого субстрата, а другой восстанавливается до воды:

R + AH2 + 02 -> ROH + A + H20,

где R - субстрат, ROH - продукт, AH2 - донор электронов.

При диссоциации комплекса Р-450 с активированным кислородом (аутоокислении) могут образовываться супероксид и перекись водорода.

Продукты одноэлектронного восстановления хинонов (радикалы семихинона) могут спонтанно реагировать с 02 с образованием супероксидного радикала. Токсическое действие гербицида параквата на растения и животные, а также побочное действие ряда лекарственных препаратов и антибиотиков (фенилбутазон, нитрофурантоин, пеницилламин, стрептонигрин, митомицин и др.) связано с их циклическим восстановлением и окислением в микросомах с образованием супероксида (Fridovich, 1978). По сходному механизму действуют диабетогенный препарат аллоксан и противоопухолевые препараты (доксорубицин, адриамицин). Продукт метаболизма парацетамола цитохромом Р-450 в печени реагирует с глутатионом. При передозировке препарата происходит истощение глутатиона, которое индуцирует вторичный окислительный стресс и вызывает повреждения ткани печени.

1.5. Экзогенные источники свободных радикалов: ионизирующая радиация как модель старения

Ионизирующая радиация является мощным экзогенным индуктором окислительного стресса. Она оказывает биологическое воздействие, вызывая диссоциацию воды с образованием гидроксильного и водородного радикалов. С использованием клеток Е. coli было показано, что усиление летального действия ионизирующей радиации в присутствии кислорода связано с генерацией супероксида и перекиси водорода (Oberley et al., 1976):

Н20 -» НО* + eaq" + Н" (радиолиз воды)

6aq + 02 —» 02*-

н' + о2->но2*

Н02* Н+ + О2-

Гамма-облучение целого организма используется в качестве модели старения, т.к. оно вызывает изменения, сходные с теми, которые происходят при нормальном старении и укорачивают продолжительность жизни (Upton, 1957). Вместе с тем, эффекты, производимые эндогенными свободными радикалами, не полностью идентичны эффектам ионизирующего облучения из-за различий в концентрации и распределении свободных радикалов и в доступности их ингибиторов. Так, индуцированные облучением радикалы распределяются в организме случайным образом, в то время как радикалы эндогенного происхождения в

основном возникают и концентрируются в локализованных участках, таких, как митохондрии. Поскольку среднее время жизни свободных радикалов (особенно гидроксильного) очень коротко, вероятность взаимодействия эндогенных радикалов с отдаленными молекулами, например, ДНК в ядре, низка по сравнению с радикалами радиационного происхождения. Последние могут возникать в непосредственной близости от ДНК и реагировать с ней даже в присутствии высоких концентраций антиоксидантов.

Свободные радикалы образуются также при действии ультрафиолетовой радиации, микроволнового излучения, ультразвука и даже при гомогенизации тканей (стресс раздавливания) (Sies, 1993). Загрязненный воздух и сигаретный дым содержат оксиды азота (NOx), которые вызывают окисление макромолекул и истощают уровень антиоксидантов в организме (Reznick et al., 1992).

Несмотря на очевидное повреждающее действие свободных радикалов, реакции с их участием играют важную роль в целом ряде метаболических и регуляторных процессов. Так, оксиданты фагоцитов обеспечивают неспецифический иммунитет организма. АФК участвуют в синтезе тканевых медиаторов простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов, в окислительной деградации ксенобиотиков и т. д. Свободные радикалы рассматриваются как II мессенджеры, участвующие в сигнальных процессах в клетке и запускающие апоптоз, вероятно, через активацию фактора транскрипции NF-кВ (Buttke and Sandstrom, 1994).

В нормальных клетках поддерживается низкий уровень оксидантов благодаря функционированию эндогенных антиоксидантных систем. Токсическое действие свободных радикалов наблюдается при усилении процессов, связанных с их генерацией, или при ослаблении антиоксидантной защиты.

2. АНТИОКСИДАНТНЫЕ СИСТЕМЫ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ

2.1. Эндогенные антиоксидантные системы

Системы защиты организма от свободно-радикального повреждения включают в себя хелаторы ионов металлов, антиоксидантные ферменты и низкомолекулярные антиоксиданты. Ферменты, репарирующие повреждения или удаляющие поврежденные молекулы (ферменты репарации ДНК, липазы и протеазы), относят к "вторичной" антиоксидантной защите.

Концентрации свободных ионов железа и меди поддерживаются на предельно низком уровне с помощью комплексной системы транспортных и связывающих белков. Организм взрослого человека содержит около 4 г железа и 80 мг меди. Две трети железа связаны с гемоглобином, 10% - с миоглобином, незначительное количество с другими белками.

Остальное железо находится в клетках в комплексе с высокомолекулярным белком ферритином (MW 444000), который связывает до 4500 моль железа/моль белка и присутствует в основном в печени, селезенке и костном мозге и в меньших количествах в других тканях. Поступающее с пищей железо в форме Fe(III) переводится в растворимую форму НС1 желудочного сока, восстанавливается аскорбатом до Fe(II) и всасывается в кровь, где прочно связывается со специальным транспортным белком трансферрином. Сходный белок лактоферрин обнаружен в различных секретах организма (слезы, выстилка носовой полости, молоко), а также образуется фагоцитами. Таким образом, пул свободного железа поддержи вается_ в норме в плазме крови практически на нулевом, а во внеклеточных— жидкостях (синовиальной и цереброспинальной) - на микромолярном уровне (Halliwell and Gutteridge, 1984). Аналогично, 95% меди в плазме крови связано с церулоплазмином (который удерживает до 6 - 7 моль меди/моль белка), остальное количество - с альбумином и аминокислотами (Halliwell and Gutteridge, 1984). Церулоплазмин также способствует связыванию железа с трансферрином и обладает свойствами СОД-миметика, т.е. способен перехватывать супероксидный радикал (Goldstein et al., 1982). Гемопексин и гаптоглобин связывают свободный гем и гемовые белки и, таким образом, сводят к минимуму их способность катализировать свободно-радикальные реакции (Miller et al., 1997).

В то время как хелатирование металлов предотвращает инициацию свободно-радикальных реакций, антиоксиданты, присутствуя в низких концентрациях по сравнению с окисляемым субстратом, способны значительно замедлить или подавить его окисление, прерывая цепную реакцию путем перехвата свободных радикалов (Sies, 1993).

Три основных антиоксидантных фермента эукариотических организмов -супероксиддисмутаза (СОД), каталаза (КАТ) и глутатионпероксидаза (ГПО). Распределение этих ферментов в клетках соответствует местам наиболее активного образования АФК.

Поскольку СОД метаболизирует свободный радикал (02"*) до нерадикальной формы (Н2О2), ее считают основным компонентом антиоксидантной системы организма. Семейство белков СОД - это металлопротеины (Bannister et al., 1987). Си,7,п-СОД состоит из двух идентичных 16-кД субъединиц, каждая из которых содержит по одному атому меди и цинка, и локализована в цитозоле и ядре клеток всех типов, а также в межмембранном пространстве митохондрий, и чувствительна к высоким концентрациям цианида. Mn-СОД состоит из четырех идентичных 22-кД субъединиц, содержащих марганец, и находится в митохондриальном матриксе. Описана также внеклеточная СОД, которая, в отличие от других изоферментов, является гликопротеином и состоит из четырех 30-кД субъединиц, каждая из которых содержит атом меди и цинка. Она секретируется некоторыми типами клеток

(Marklund, 1990) и в основном связана с гепаран-сульфат протеогликанами в интерстициальном матриксе-тканей и гликокаликсе клеточных поверхностей, а также в '"*" небольшом количестве обнаружена во внеклеточных жидкостях (плазма, лимфа, синовиальная и цереброспинальная жидкости). У бактерий обнаружена Fe-СОД.

Механизм супероксддисмутазной реакции (по Fridovich, 1978):

Е-Ме" + 02~ Е-Ме'1"7 + ОГ

Е-Ме""' + 02" + 2 Н+ Е-Ме'1 + Н202

Перекись водорода является субстратом для каталазы, которая присутствует в основном в пероксисомах. Каталаза печени крысы имеет молекулярный вес 240000, состоит из 4 субъединиц, содержит Рс3+-протопорфирин (гем) в активном центре и проявляет как каталазную, так и пероксидазную активности (Chance et al., 1979):

1. Н202 + Н202 -» 2 Н20 + 02

2. Н202 + АН2 -> 2 Н20 + А"

Каталаза проявляет высокую специфичность к используемым перекисям: только перекись водорода, метил- и этилпероксид реагируют с заметной скоростью.

Глутатионпероксидаза (ГПО) - селен-зависимый фермент, который катализирует восстановление органических гидроперекисей, среди которых гидроперекиси ненасыщенных жирных кислот, а также производные нуклеотидов и стероидов, до спиртов, но также может восстанавливать и перекись водорода. В качестве донора водорода фермент использует восстановленный глутатион (GSH):

ROOH + 2 GSH -> ROH + GSSG + Н20

2 GSH + Н202 <-> 2 Н20 + GSSG

Распределение ГПО в клетке комплементарно распределению каталазы: фермент полностью отсутствует в пероксисомах, две трети находятся в цитозоле и одна треть в митохондриях (в матриксе и в местах контакта внешней и внутренней мембраны), что позволяет ей эффективно удалять Н202, образуемую СОД и МАО, а также гидроперекиси фосфолипидов во внутренней митохондриальной мембране.

Регенерация глутатиона происходит с участием NADPH-зависимой глутатионредуктазы. Восстановительные эквиваленты NADPH поставляются из гексозомонофосфатного шунта, главным образом, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой (Г-6ФДГ).

Оксиданты могут вызывать активацию и индукцию синтеза антиоксидантных ферментов (Niwa et al., 1990; Shull et al., 1991; Benderitter et al., 1995), a также Г-6ФДГ (Ursini et al., 1997).

Косвенные антиоксндантные функции выполняет МАОР(Н):хинонредуктаза (DT-диафораза), которая катализирует двухэлектронное восстановление хинонов до гидрохинонов, таким образом, снижая вероятность их одноэлектронного восстановления. Глутатион-S-трансферазы катализируют связывание глутатиона с реактивными электрофильными интермедиатами микросомального окисления метаболитов и ксенобиотиков с образованием тиоэфиров, называемых S-конъюгатами. Образование S-конъюгатов о-хинонов, образующихся при окислении катехоламинов в тканях мозга, предотвращало их редокс-циклирование, что может играть важную нейропротекторную роль (Baez et al., 1997).

В тканях животных и дрожжей обнаружен тиол-специфичный антиоксидантный фермент (ТСА), который обладает свойствами тиоловой пероксидазы и защищает белки от тиол-зависимого металл-катализируемого окисления (Netto et al., 1996). Тиоредоксин в присутствии тиоредоксинредуктазы и NADPH восстанавливает дисульфидные связи ТСА и других белков до тиолов. Кроме того, тиоредоксин + тиоредоксинредуктаза обладают активностью алкилгидропероксидредуктазы и являются эффективными донорами электронов для ГПО. Показано также, что HSA обладает свойствами тиоловой пероксидазы, особенно в присутствии GSH, и, таким образом, является пока единственным ферментом, способным удалять Н2О2 из плазмы крови (Cha and Kim, 1996).

Глутатион представляет собой трипептид глутамил-цистеинил-глицин с необычной пептидной связью, в которой участвует у-карбоксильная группа глутаминовой кислоты. В клетке он присутствует в высоких концентрациях (1-2 мМ), более 90% - в восстановленной форме, что делает его основным водорастворимым антиоксидантом (Slivka et al., 1987). Лишь следовые количества глутатиона обнаружены в плазме и большинстве других жидкостей тела, за исключением жидкостей, омывающих нижнюю часть дыхательного тракта, где он, возможно, способствует перехвату вдыхаемых токсинов (N02*, озон) или свободных радикалов, образуемых активированными фагоцитами в легких. Глутатион перехватывает свободные радикалы (Videla, 1983; Saez et al., 1993), а также поставляет восстановительные эквиваленты для тиоредоксиновой и глутаредоксиновой систем, передающих электроны рибонуклеотидредуктазе, редуктазе белковых дисульфидов и глутатионпероксидазе (Bjornstedt et al., 1997), и поэтому играет важную роль в поддержании нормального уровня синтеза белка и ДНК, эффективном удалении гидроперекисей липидов и в регуляции концентрации тиоловых дисульфидов ряда гликолитических ферментов, а также Са-АТФазы, косвенно регулируя гомеостаз Са в клетке (Ziegler, 1985). Истощение GSH влияет на многие зависимые от него ферменты (глутатионсинтетаза, глутатионпероксидаза, глутатионтрансфераза, лейкотриен С4-синтетаза, глиоксилаза I и II), что делает клетки более

чувствительными к дальнейшему воздействию. Так как для его синтеза требуется глутамат, он удаляет этот потенциально нейротоксичный фактор.

В клетке 90% GSH находится в цитозоле, и 10% - в митохондриях. Митохондрии не способны синтезировать глутатион и импортируют его через специальную транспортную систему (Кт около 60 мкМ), а также, в отличие от цитоплазматической мембраны, не способны выводить окисленный глутатион (Olafsdottir and Reed, 1988). Поэтому истощение GSH в условиях окислительного стресса особенно сильно сказывается на функциях митохондрий. Введение мышам ингибитора синтеза глутатиона сильно повышало чувствительность выделенных митохондрий к окислительному стрессу, индуцированному HPODE; добавление в реакционную среду метилового эфира глутатиона восстанавливало пул GSH в органеллах и предотвращало нарушение их функций (Masini et al., 1992). Селективное истощение митохондриального пула GSH усиливало цитотоксическое действие t-BuOOH на гепатоциты (Shan et al., 1993). Таким образом, защита митохондрий глутатионом важна для поддержания клеточного метаболизма в целом. В то время как митохондрии печени способны постепенно восстанавливать глутатион и глутатион-белковые дисульфиды, окисление GSH в митохондриях мозга является необратимым и, возможно, объясняет их повышенную чувствительность к окислительному стрессу (Ravindranath and Reed, 1990).

Возрастание уровня GSSG считают маркером окислительного стресса, а соотношение ([GSH] + 2 [GSSG])/(2 [GSSG] х 100) представляет индекс редокс состояния клетки (Benzi et al., 1988). В некоторых случаях, воздействие оксидантов вызывает повышение уровня GSH в клетке, которое,-возможно, отражает компенсаторную индукцию его син теза.

В мембранах наиболее эффективным антиоксидантом является а-токоферол (витамин Е), который содержит экранирующие метиловые группы вблизи фенольной гидроксильной группы хромановой структуры и встроен в гидрофобный липидный бислой с помощью своей боковой фитиловой цепи (Perly et al., 1985). Он отдает электрон липидному пероксирадикалу, образующемуся в цепной реакции ПОЛ, и, таким образом, относится к антиоксидантам -прерывателям цепи. Образующийся при этом токофероксильный радикал нереакционноспособен и далее либо постепенно разрушается, либо восстанавливается до витамина Е аскорбатом и глутатионом (Scarpa et al., 1984; Meister, 1994; Chan, 1993), а также за счет электронов, поставляемых дыхательной цепью митохондрий (Maguire et al., 1989). Несмотря на относительно невысокое содержание витамина Е в мембранах по сравнению с фосфолипидами (в митохондриях, например, 1 : 2100), его постоянная регенерация позволяет поддерживать ПОЛ и повреждение мембранных белков и липопротеинов на низком уровне. Пока неизвестно, однако, способен ли витамин Е непосредственно реагировать с белковыми

радикалами. Таким образом, а-токоферол, аскорбат и GSH обладают синергическим действием и образуют "антиоксидантную сеть".

Хотя из 8 энантиомеров витамина Е в клетки лучше проникает его физиологическая форма (ЯДД-а-токоферол), которая является основным компонентом фармакологических препаратов, у-токоферол более эффективно защищает липиды от повреждения пероксинитритом (Christen et al., 1997), что делает перспективным его использование как витаминной добавки для защиты от оксидов азота и других электрофильных мутагенов.

Роль витамина С (аскорбиновой кислоты) двойственна. Так, при высоких концентрациях свободного железа он превращается в радикал и генерирует гидроксильные радикалы, т.е. становится прооксидантом. In vivo, однако, аскорбат поддерживается в восстановленной форме с помощью GSH-зависимой дегидроаскорбатдегидрогеназы.

Эндогенный убихинон Q¡o является более сильным антиоксидантом, чем витамин Е (Stocker et al^_1991), и эффективно защищает LDL в плазме крови и митохондриальные белки — и ДНК от свободно-радикального повреждения, а также участвует в регенерации витамина Е (Emster and Dallner, 1995).

Антиоксидантными свойствами обладает также витамин А. Его предшественник ß-каротин принадлежит к семейству каротиноидов - природных пигментов, синтезируемых растениями и микроорганизмами. Это Сдо-соединения, построенные из восьми С5-изопреновых фрагментов. Основная функция каротиноидов в растительной клетке - защита ее структур от повреждающего действия свободных радикалов, образующихся в процессе фотосинтеза. Особенность строения каротиноидов - наличие у них полиеновой цепочки сопряженных двойных связей, в которой л-электроны делокализованы по всей длине. Энергетические характеристики этой молекулярной структуры определяют ее антиоксидантные свойства, суть которых заключается в возможности передачи возбужденного неспаренного электрона с '02 или пероксирадикала на молекулу каротиноида.

Антиоксидантные свойства каротиноидов усиливаются с увеличением длины полиеновой цепи (числа двойных сопряженных связей). На уровень антиоксидантной активности каротиноидов оказывают также влияние их кольцевые группы. Так, каротиноид ликопин, имеющий, как и ß-каротин, 11 двойных связей, имеет АО активность почти в 2 раза выше благодаря своей планарной структуре и, вследствие этого, более сбалансированной п-электронной системе (Капитанов и Пименов, 1996).

Поступающие с пищей каротиноиды распределяются в различных тканях, встраиваясь в клеточные и субклеточные мембраны, по-видимому, в соответствии с их фосфолипидным

. составом, где и проявляют свои антиоксидаитные свойства. Каротииоиды неэффективны при индукции радикалов в водной фазе, и, наоборот, увеличивают свой потенциал при совместном действии с другими жирорастворимыми антиоксидантами - ос-токоферолом и коэнзимом Qi0. Высокое парциальное давление кислорода сильно снижает их антиоксидантную активность, а при его возрастании до атмосферного каротиноиды начинают действовать как прооксиданты.

Мочевая кислота (продукт метаболизма пуринов) является селективным "перехватчиком" пероксинитрита (Whiteman and Halliwell, 1996). Альбумин, который имеет одну SH-группу на молекулу и присутствует в концентрации 0.5 мМ в плазме, билирубин (Frei et al., 1988) и, возможно, холестерол, продукты окисления которого метаболизируются и экскретируются печенью, вносят вклад в антиоксидантную защиту в плазме крови.

В последние годы обнаружены антиоксидаитные свойства некоторых гормонов. Так, показан защитный эффект ряда эстрогенов на первичные культуры нейронов мышей и крыс от гибели, индуцированной окислительным стрессом, который не зависел от активации эстрогеновых рецепторов и, таким образом, был обусловлен их антиоксидантными свойствами (Behl et al., 1997). Гормон эпифиза мелатонин (Ъ1-ацетил-5-метокситриптамин) легко проникает через гематоэнцефалический барьер в клетки мозга, где может проявлять сильные антиоксидаитные свойства, реагируя как с пероксильными, так и с гидроксильными радикалами (Pieri et al., 1994). Отдавая электрон радикалу ОН*, он превращается в стабильный индолил-катион-радикал, который, возможно, затем перехватывает супероксидный радикал. Благодаря своей водо- и жирорастворимости, мелатонин равномерно распределяется по всей клетке и эффективно защищает ДНК, липиды и белки от свободно-радикальной атаки (Melchiorri et al., 1995). Кроме того, мелатонин стимулирует активность ГПО в мозге (Barlow-Walden et al., 1995). Добавление мелатонина повышало выживаемость нейронов в культуре в условиях окислительного стресса (Iacovitti et al., 1997).

Содержание антиоксидантов неодинаково в различных тканях, что определяет их чувствительность к окислительному стрессу. Благодаря высокой активности каталазы в печени и почках, концентрация перекиси водорода в этих органах ниже, чем в сердце и мозге. Активность ГПО падает в ряду печень, эритроциты >сердце, легкие > мышца. По данным (Azhar et al., 1995), уровень витамина С у 4-месячных крыс Sprague-Dawley составлял в печени 1607, селезенке 4185, сердце 318, мозге 2378 и надпочечниках 21766 нмоль/г ткани; уровень витамина Е - в печени 39, селезенке 62, сердце 63, мозге 24 и надпочечниках 481 нмоль/г ткани. Кроме того, активности СОД (особенно Mn-формы) и ГПО в надпочечниках превышали таковые в печени, что указывает на высокую защищенность этого органа (Azhar et al., 1995). Плазма крови может претерпевать значительный окислительный стресс со стороны

активированных фагоцитов; однако, она защищена в основном неферментативными антиоксидантами, главным из которых считается аскорбат (Frei et al., 1988). Однако, органом, наиболее чувствительным к окислительному повреждению, является, безусловно, мозг в силу ряда своих особенностей. Он потребляет до 20% всего вдыхаемого кислорода, что способствует повышенному образованию АФК его митохондриями. Передача нервного возбуждения также сопровождается генерацией АФК. Показано высокое содержание в мозге полиненасыщенных жирных кислот, особенно чувствительных к окислению. Кроме того, мозг способен накапливать аскорбат с помощью специальной транспортной системы до концентраций, превышающих таковые в плазме крови в 10 раз. В сочетании с высокими концентрациями низкомолекулярных комплексов железа и меди в цереброспинальной жидкости аскорбат образует мощную прооксидантную систему. В то же время, соотношение ГПО/СОД в мозге ниже, чем в других органах, а активность каталазы очень низка (по Benzi and Moretti, 1995), т.е. этот орган не обладает достаточной антиоксидантной защитой.

Важность антиоксидантной системы для нормального функционирования организмов становится особенно очевидной на примере дефицита ее отдельных звеньев.

Мыши с разрушенным путем гомологической рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках геном внеклеточной СОД нормально развивались по крайней мере до 14-месячного возраста; причем не наблюдалось никакой компенсаторной индукции остальных антиоксидантных ферментов (Carlsson et al., 1995). Однако, в атмосфере с >99% 02 наблюдалось снижение выживаемости и более раннее развитие легочной эдемы у мутантов по сравнению с контролем. Таким образом, в нормальных физиологических условиях другие антиоксидантные системы могут заменить отсутствующую СОД; однако, в условиях стресса они оказываются недостаточно эффективными.

Мыши, нокаутные (knock-out) по гену Mn-СОД, доживали лишь до 3 недель и проявляли различные патологические признаки: сильная анемия, дегенерация нейронов и кардиомиоцитов с обширным повреждением их митохондрий (Lebovitz et al., 1996).

Пациенты с длительным дефицитом витамина Е вследствие нарушенного всасывания жиров в кишечнике страдают от неврологических расстройств, что демонстрирует важность витамина Е для функционирования мозга (Muller and Goss-Sampson, 1990). Экспериментальный дефицит витамина А повышал чувствительность к инфекционным заболеваниям и снижал уровень катепсина G в нейтрофилах (Twinning et al., 1996), а также ускорял появление аутоантител у мышей NZB (Gershwin et al., 1984).

Представление о том, что свободные радикалы играют определяющую роль в старении организмов и ограничивают максимальную продолжительность жизни вида, вызывает вопрос

о существовании корреляции между продолжительностью жизни вида и активностью его антиоксидантных систем. Хотя изучение 12 видов приматов и 2 видов грызунов не обнаружило прямой связи между активностью цитозольной СОД и продолжительностью жизни, отношение удельной активности СОД к удельной скорости метаболизма ткани или всего взрослого организма возрастало с увеличением максимальной продолжительности жизни вида (Tolmasoff et al., 1980). Таким образом, более долгоживущие виды лучше защищены от побочных продуктов кислородного метаболизма.

2.2. Изменение активности эндогенных антиоксидантов при старении

Согласно свободно-радикальной теории, одной из причин повышения уровня окислительного стресса и накопления окислительных повреждений в клетках при старении может быть снижение антиоксидантной защиты в организме.

Зарегистрировано снижение активностей СОД, КАТ и ГПО в надпочечниках старых крыс Wistar по сравнению с молодыми, которое сопровождалось повышением уровня ПОЛ и снижением кортикостероидогенеза, вероятно, вследствие окислительного повреждения систем транспорта холестерола в клетках надпочечника (Azhar et al., 1995). Впервые показано, что активности трех антиоксидантных ферментов, а также глутатионредуктазы и Г-6ФДГ, в предстательной железе 9-месячных крыс NBL, используемых в качестве модели рака предстательной железы человека, ниже, чем у 2-месячных, что указывает на окислительную этиологию этого заболевания (Ghatak and Но, 1996). (Congy et al., 1995) показали снижение уровня селена в плазме, СОД и ГПО в эритроцитах и плазме у людей в возрасте 85 лет vs. 20 -40 лет. У старых мышей С57В1 снижение активностей СОД и КАТ сопровождалось недостоверным снижением активности ГПО; в то же время, активность глутатионредуктазы снижалась значительно (Mo et al., 1995), что могло привести к значительному снижению глутатионового редокс-индекса, особенно, в очень старом возрасте.

Концентрация GSH снижается с возрастом пропорционально возрастанию GSSG (Azhar et al., 1995; Mo et al., 1995; Benzi et al., 1988); однако, это снижение (до 0.7 - 1 мМ) вряд ли имеет заметные последствия, т.к. остается в пределах насыщающих концентраций для известных глутатион-зависимых ферментов. Вместе с тем, при старении повышается чувствительность глутатионового редокс индекса к стрессу, вызванному перекисью водорода или другими оксидантами (Benzi et al., 1991).

У сублинии крыс Wistar, чувствительной к катарактогенному действию галактозы, повышенный уровень ПОЛ, окисленных белков и дисульфидов в плазме крови коррелировал со сниженными активностями СОД и каталазы (Yelinova et al., 1996). Таким образом,

снижение эффективности антиоксидантной защиты может усилить окислительные повреждения в организме и повысить риск возникновения заболеваний, например, катаракты.

Способность к индукции СОД в изолированных лейкоцитах периферической крови под действием параквата составляла 80% у 20 - 40-летних людей и только 8% у людей в возрасте 65 - 79 лет (Niwa et al., 1990). У пациентов, сохранивших способность к индукции СОД, наблюдалась корреляция с продолжительностью их жизни.

Поскольку во многих случаях снижение активности антиоксидантных ферментов отмечалось в таком позднем возрасте, когда падает активность многих других ферментов, высказываются предположения, что оно является не причиной накопления окисленных макромолекул в организме, а следствием окислительного повреждения самих этих ферментов. Очищенная СОД из печени старых крыс обладала гораздо меньшей активностью и имела повышенный уровень карбонильных групп, а также на 1 гистидин меньше, чем "молодой" фермент, вследствие его окислительной модификации (Santa María et al., 1995).

Вместе с тем, ряд авторов не обнаружили снижения содержания и активности антиоксидантов с возрастом. Так, (King and Barnett, 1995) показали, что увеличение частоты хромосомных аберраций в лимфоцитах человека с возрастом обусловлено снижением эффективности репарации ДНК, а не снижением антиоксидантной защиты, поскольку уровни билирубина, мочевой кислоты и церулоплазмина в плазме, а также антиоксидантных ферментов в эритроцитах не изменялись. Показано отсутствие различий в базальных и индуцированных окислительным стрессом уровнях активности антиоксидантных ферментов в лимфоцитах 75- и 30-летних людей (Garcia-Arumi et al., 1998). У коловраток обнаружено повышение активностей СОД и КАТ и отсутствие изменения ГПО с возрастом (Sawada and Carlson, 1990). Значительное возрастание СОД-активности при старении показано для 9 органов мышей C57Bl/6xCBA/6J (Cristiano et al., 1995) и 4 органов монгольских песчанок (Sohal et al., 1995а). У песчанок активность двух других антиоксидантных ферментов варьировала независимо от возраста (Sohal et al., 1995а). У мышей в тех органах, где возрастание активности Cu.Zn-СОД компенсировалось одновременным возрастанием активности ГПО (печень, сердце) или КАТ (легкие), уровни ПОЛ и окисленных белков с возрастом не повышались (Cristiano et al., 1995).

Очевидно, в нормально функционирующей клетке должно существовать равновесие активностей антиоксидантных ферментов, определяемое соотношением С u, Z п - С О Д/(Г П О + КАТ). Нарушение этого равновесия приведет к накоплению H202 с последующей генерацией высокотоксичных радикалов ОН*. Действительно, в мозге старых мышей соотношение Cu,Zn-СОД/(ГПО + КАТ) повышалось и коррелировало с накоплением поврежденных липидов, а в

печени и почках оно оставалось неизменным, и уровень ПОЛ в этих органах не изменялся с возрастом (de Haan et al., 1995). Изменение соотношения СОД/(ГПО + КАТ) может влиять на экспрессию генов, изменяя связывание факторов транскрипции (de Haan et al., 1995).

На важность сбалансированности активностей антиоксидантных ферментов указывает также тот факт, что пациенты с синдромом Дауна, характеризующимся трисомией по 21 хромосоме, несущей ген СОД, и, вследствие этого, повышенным уровнем экспрессии этого фермента, проявляют признаки умственной отсталости и преждевременного старения (Lejeune, 1990).

Концентрация витамина Е в плазме крови (10-40 мкМ) и различных органах животных и людей не изменяется с возрастом (Muller and Goss-Sampson, 1990; Azhar et al., 1995; Congy et al., 1995), но снижена в плазме крови пациентов с болезнью Альцгеймера (Zaman et al., 1992). Уровень аскорбата остается неизменным или слегка снижается при старении (Rikans and More, 1988).

В старости продукция мелатонина значительно падает (Reiter, 1992); вероятно, возрастные нейродегенеративные изменения частично связаны со снижением его уровня.

Расхождение результатов многочисленных исследований активности антиоксидантов при старений" может объясняться особенностями использованных линий животных, условий их содержания и питания, а также большим разнообразием методов измерения активности, что указывает на необходимость стандартизации таких экспериментов. Тем не менее, накопление окислительных повреждений в тканях ясно свидетельствует о том, что у старых животных антиоксидантная система недостаточно эффективна для "перехвата" образующихся с возрастающей скоростью свободных радикалов. Особенно сильно эта недостаточность проявляется в условиях окислительного стресса, поскольку у старых животных происходит более сильное истощение антиоксидантов и снижена способность к индукции антиоксидантных ферментов в ответ на стресс по сравнению с молодыми. Поэтому усилия, направленные на повышение антиоксидантной защиты, могут замедлить процесс старения и снизить риск развития "свободно-радикальных" заболеваний.

2.3. Подходы к замедлению старения и увеличению продолжительности жизни

С позиций свободно-радикальной теории, для увеличения продолжительности жизни организма необходимо снизить скорость инициации свободно-радикальных реакций и/или длину их цепей. Для достижения первой цели необходимо снижение: а) потребления пищи, богатой свободными ионами железа и меди и легко окисляемыми соединениями; б) калорийности пищи; в) температуры тела. Для достижения второй цели необходимо

повышение: а) концентрации ингибиторов свободно-радикальных реакций в организме; б) устойчивости его компонентов к свободно-радикальной атаке (Harman, 1994).

1) Ограничение калорийности пищи

Эксперименты на грызунах свидетельствуют, что ограничение калорийности (ОК) пищи на 30 - 40% является в настоящее время единственным способом повышения как средней, так и максимальной продолжительности жизни (Yu et al., 1982; Weindruch and Walford, 1982; Sohal et al., 1994), что, вероятно, отражает возрастание Дарвиновской приспособленности: в период малой доступности пищи происходит задержка репродуктивной функции, и все ресурсы организма используются на поддержание тела до наступления благоприятных для репродукции условий (Ames et al., 1993).

Кратковременное ограничение калорийности диеты макак-резусов на 30% вызывало снижение температуры тела и суточного расходования энергии (Lane et al., 1996), что предполагает индукцию энергосберегающего механизма. Пропорционально снижению потребляемых калорий снижается вес тела (Yu et al., 1982; Sheldon et al., 1995) и утилизация Ог (Yu et al., 1982). Замедление потока кислорода через клетки и ткани способствует уменьшению скорости образования свободных радикалов митохондриями (Sohal et al., 1994) и, таким образом, снижает окислительный стресс в организме. У животных, длительное время потреблявших низкокалорийный корм, наблюдалось снижение уровня ПОЛ (Sawada and Carlson, 1990), замедление накопления окисленных белков (Youngman et al., 1992; Sohal et al., 1994) и продуктов гликоксидации в коллагене кожи крыс (Cefalu et al., 1995). Накопление продукта окислительного повреждения ДНК (8-OHdG) (Kaneko et al., 1997) и мутаций в митДНК (Melov et al., 1997) снижалось при OK, вероятно, благодаря предотвращению падения с возрастом репарации ДНК (Haley-Zitlin and Richardson, 1993).

Изучение влияния OK на антиоксидантную защиту организма дало противоречивые результаты. ОК предотвращало снижение активности Gu.Zn-СОД с возрастом у крыс (Byun et al., 1995) и повышало уровень каталазы (Feuers et al., 1993); в то же время, (Sohal et al., 1994) не обнаружили никакого эффекта ОК на активности СОД, КАТ и ГПО у мышей.

Ограничение калорийности, но при адекватном потреблении незаменимых компонентов, замедляет дегенеративные изменения в стареющем организме. Снижение накопления белковых карбонилов и потери SH-групп в различных отделах мозга (Dubey et al., 1996) и накопления липофусцина (Idrobo et al., 1987) при ОК сопровождалось улучшением сенсомоторной функции, памяти и обучаемости старых животных, т.е. старение нервной системы замедлялось. ОК в диете предотвращало накопление продуктов ПОЛ и окисленных

белков в спленоцитах и сохраняло их способность к пролиферации в ответ на митоген у старых крыс (Tian et al., 1995). Замедление старения иммунной системы при ОК может лежать в основе повышения продолжительности жизни и предотвращения аутоиммунной патологии у мышей BXSB (Kubo et al., 1992). Пониженное потребление калорий снижало частоту и откладывало развитие спонтанных и индуцированных у-облучением опухолей у грызунов (Weindruch and Walford, 1982; Sheldon et al., 1995; Yoshida et al., 1997). Показано также, что у крыс продолжительное ограничение калорийности пищи или полное голодание в течение 8 дней замедляло репликацию ДНК и вызывало апоптоз пренеопластических клеток печени, таким образом, снижая риск канцерогенеза в этом органе (Grasl-Kraupp et al., 1994).

Интересно, что пониженное потребление белка также снижало окислительные повреждения (накопление продуктов ПОЛ и липофусцина) в различных органах мыши и усиливало антиоксидантную защиту (уровень СОД) в печени (De et al., 1983). Ограничение содержания казеина, содержащего легко окисляемые аминокислоты, в диете крыс с 20 до 5% заметно предотвращало возрастание карбонильных групп в белках печени, вызванное хроническим у-облучением (Youngman et al., 1992).

Попытки использования данных, полученных на лабораторных животных, для повышения продолжительности жизни человека должны учитывать необходимость сохранения его нормальной активности, поэтому для человека, очевидно, более приемлемо ограничение диеты по белку. Следует также помнить, что недоедание в раннем возрасте вредно, т.к. увеличивает риск возникновения гипертонии и сердечно-сосудистых заболеваний.

2) Применение антиоксидантов

Использование антиоксидантных ферментов при экспериментальных патологиях, связанных с повышенным образованием АФК, дало положительные результаты. Так, внутривенное введение СОД защищало клетки крови и костного мозга от гибели, вызванной сублетальными дозами Х-радиации (Petkau, 1988), снижало смертность и предотвращало возрастание проницаемости сосудов и развитие эдемы у крыс с экспериментальной гипертонией (Zhang and Ellis, 1990). Причем конъюгаты СОД с белками (Watanabe at al., 1989) или моносахаридами (Fujita et al., 1992), а также липосомные формы антиоксидантных ферментов (Freeman et al., 1985), оказались более эффективными благодаря своей повышенной стабильности в крови и способности проникать внутрь клеток-мишеней.

Особого внимания заслуживают работы по получению трансгенных животных со сверхэкспрессией антиоксидантных ферментов. Клетки, взятые от трансгенных мышей с повышенным уровнем экспрессии СОД, были более устойчивы к окислительному стрессу,

вызванному паракватом (Huang et al., 1992). В то же время, сами мыши проявляли клинические и биохимические признаки синдрома Дауна (Ceballos-Picot et al., 1992). Таким образом, возрастание экспрессии СОД должно компенсироваться возрастанием активности тесно связанных с ней ферментов - каталазы и глутатионпероксидазы. Действительно, средняя продолжительность жизни трансгенных дрозофил с одновременно повышенной экспрессией СОД и КАТ повышалась на одну треть, а также наблюдалось снижение окислительных повреждений в белках и ДНК и замедление физической дегенерации с возрастом (Orr and Sohal, 1994; Sohal et al., 1995).

Повышенное потребление фруктов и овощей снижает риск возникновения сердечнососудистых заболеваний и рака благодаря содержащимся в них разнообразным антиоксидантам и витаминам (Halliwell, 1996).

Включение природных и синтетических антиоксидантов в диету животных и людей в ряде случаев оказывает положительное действие.

Добавление Se - компонента ГПО - в пищу людей, живущих в районах с низким содержанием этого элемента в почве, снижает заболеваемость некоторыми формами рака (Fleet, 1997). Люди, в течение двух лет потреблявшие не менее 100 мг витамина Е в день, обнаруживали снижение на 40% риска коронарной болезни (Stampfer et al., 1993). Потребление людьми кофермента Q]0 повышало уровни убихинона и витамина Е в субфракциях LDL и снижало доступность их липидов для перекисного окисления (Alleva et al., 1995) и, таким образом, может снижать риск возникновения атеросклероза.

Недавно показано, что потребление дополнительных количеств селена и витамина Е предотвращало изменения липидного метаболизма и возрастание уровня ПОЛ в печени крыс с экспериментальным диабетом (Douillet et al., 1998).

Диетическое потребление больших количеств витамина Е (200 мг/кг вместо обычных 50 мг/кг) предотвращало накопление "антигена старения" в спленоцитах и клетках мозга мышей (Poulin et al., 1996). Внутрибрюшинное введение витамина Е крысами заметно повышало его содержание в мозгу и предотвращало окислительное повреждение и возрастание проницаемости синаптических мембран и морфологические изменения в нервных клетках при гипероксии, а также повышало активность ГПО (Urano et al., 1997).

Включение в диету мышей СВАЯ ß-каротина (90 мг/кг корма) оказывало радиопротекторное действие, значительно повышая их выживаемость к 30-м суткам и среднюю продолжительность Жизни после у-облучения 650 рад (Seifter et al., 1984). Добавление витамина С в корм снижало гибель клеток костного мозга у у-облученных мышей (Harapanhalli et al., 1996).

Включение тиоиролина в диету старых мышей повышало физиологическую и пролиферативную активность их лимфоцитов (de la Fuente et al., 1993).

Механизм положительного действия антиоксидантов может быть связан с частичным разобщением митохондрий, которое приводит к снижению образования ими АФК, т.к. компоненты дыхательной цепи более окислены.

Витамин Е снижал частоту появления фатальных опухолей и повышал среднюю продолжительность жизни мышей, не влияя, однако, на максимальную (Blackett and Hall, 1981). Увеличение средней продолжительности жизни показано для линии ускоренно стареющих мышей SAM, получавших препарат ß-катехин (смесь природных витаминов и фитовеществ) (Kumari et al., 1997). Диетическая добавка мелатонина поддерживала здоровое состояние животных до значительного возраста и повышала продолжительность их жизни на 20% (Pierpaoli and Regelson, 1994). Возрастание как средней, так и максимальной, продолжительности жизни при потреблении антиоксидантов отмечено у дрозофилы (Brack et al., 1997) и нематод (Epstein and Gershon, 1972).

Общую неспособность антиоксидантов увеличить максимальную продолжительность жизни объясняют их токсичностью для митохондрий в таких концентрациях, которые еще недостаточны для замедления свободно-радикального повреждения в этих органеллах.

Вместе с тем, в ряде работ сообщается об отсутствии защитного действия антиоксидантов. Так, длительное потребление Qio не влияло на продолжительность жизни и накопление липопигмента у крыс (Lonnrot et al., 1995). Добавление витаминов Е и С в богатую жирами диету кроликов не влияло на развитие у них атеросклероза (Sun et al., 1998). Более того, анализ возможного предотвращения антиоксидантами рака легких у людей обнаружил даже некоторое повышение заболеваемости и смертности при приеме ß-каротина, что ставит под сомнение его фармакологическое использование (Albanes et al., 1995).

Отсутствие положительного эффекта антиоксидантов в ряде случаев может объясняться их добавлением в пищу, уже достаточно богатую антиоксидантами. Наиболее сильного проявления действия антиоксидантов следует ожидать на фоне их дефицита в диете или в стрессовых условиях, когда происходит истощение эндогенных антиоксидантов. Кроме того, животные различных видов (линий), пола и возраста могут нуждаться в различных количествах таких добавок. Вероятно, для старых животных эти дозы выше. Однако, следует помнить, что высокие концентрации антиоксидантов могут стать токсичными (Cao and Cutler, 1993). Так, показано канцерогенное действие широко используемых фенольных антиоксидантов ВНА и ВНТ (Iverson, 1995). При определенных условиях каротиноиды, флавоноиды и аскорбат могут становиться прооксидантами. Поскольку у старых людей часто

повышен уровень железа в тканях, им не рекомендуются высокие дозы витамина С. На эффективность препаратов антиоксидантов или OK может влиять возраст животного в начале применения и его длительность (Lipman et al., 1995; Bezlepkin et al., 1996).

Следует помнить, что не всегда повышение уровня антиоксиданта в крови вызывает пропорциональное повышение его содержания в тканях, поэтому необходимо тщательное изучение распределения и динамики этих соединений в организме для подбора оптимального режима их применения в различных условиях.

Актуальным является также поиск более эффективных природных и синтетических антиоксидантов. В этом отношении перспективными являются спиновые ловушки -нитроновые или нитрозо-соединения. Они реагируют со свободными радикалами с образованием нитроксидов, которые легко восстанавливаются до гидроксиламинов, и, таким образом, блокируют инициацию свободно-радикальных реакций.

Внутрибрюшинное введение а-фенил-Ы-терт-бутилнитрона (PBN) улучшало временную и пространственную память старых песчанок до уровня молодых животных и вызывало снижение содержания окисленных белков в мозге и восстановление активностей глутаматсинтетазы и нейтральной протеазы (Carney et al., 1991), т.е. снижало стационарный уровень окислительных повреждений у старых животных. Однако, при отмене PBN все показатели старых животных возвращались к исходным.

Стабильные 5- и 6-членные циклические нитроксиды, окисляющие Fe++ до Fe+++, легко проникают через мембраны и защищают клетки от окислительного повреждения, проявляя активность миметиков СОД и каталазы (Mitchell et al., 1990; Baker et al., 1998).

Полезным может также оказаться применение хелаторов ионов переходных металлов -природных (рутин, липоевая кислота) и синтетических (десферриоксамин, лазароиды). Недавно показан защитный эффект аспирина на эндотелиальные клетки, обработанные Н2О2, который может быть связан с хелатированием свободного железа (Podhaisky et al., 1997).

Приведенные в первых двух главах литературные данные свидетельствуют о том, что при нарушении равновесия между скоростью образования и "перехвата" свободных радикалов с возрастом в организме повышается уровень окислительного стресса, который приводит к повреждению клеточных макромолекул. Свободно-радикальному повреждению белков и его последствиям для клетки и целого организма посвящена следующая глава.

3. ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ И ИРОТЕОЛИЗ БЕЛКОВ В ОРГАНИЗМЕ

3.1. Окисление аминокислот и белков под действием ионизирующей радиации Повреждение аминокислот под действием ионизирующей радиации обусловлено, главным образом, гидроксильным радикалом (Davies et al., 1987). Окисление алифатических аминокислот начинается с отщепления а-атома водорода. Образующийся радикал с центром в атоме углерода в присутствии кислорода превращается в пероксирадикал, который далее разрушается с образованием NH4 и а-кетокислот (реакция 1) или NH4 , С02 и либо альдегида (реакция 2), либо карбоновой кислоты (реакция 3) (Stadtman, 1993):

RCHNH3+COO" + 02 + Н20 ^ RCOCOO" + NH4+ + Н202 ( 1 )

RCHNH3+COO" + 02 + Н+ + Н20 RCHO + NH4+ + С02 + Н202 (2)

RCHNH3+COO" + 02 ^ RCOO" + NH4+ + С02 (3)

Окисление глицина и аланина в оксигенированном растворе практически полностью объясняется данным механизмом. Глицин дает глиоксаль и глиоксиловую кислоту, формальдегид и муравьиную кислоту; аланин - ацетальдегид и уксусную кислоту. • С увеличением длины боковой цепи аминокислоты возрастает количество локусов, доступных для атаки ОН», и радиолиз приводит к образованию смеси производных. Так, при окислении метиловых и метиленовых групп боковых цепей валина и лейцина образуются различные гидропероксиды и, в случае лейцина, циклические основания Шиффа (Fu and Dean, 1997).

В отсутствие кислорода, генерация пероксирадикалов подавлена, что благоприятствует восстановительному деаминированию, а также взаимодействию радикалов с центром в атоме углерода с образованием моно- и диамино производных дикарбоновых кислот.

Хотя все аминокислоты доступны для воздействия радиации, наиболее чувствительными являются ароматические и серосодержащие (Davies et al., 1987). При взаимодействии индольного кольца триптофана с радикалами кислорода образуется формилкинуренин. Окисление триптофана регистрируется по снижению его флуоресценции 275/320-420 нм (Wolff and Dean, 1986). Тирозин при окислении дает 3,4-дигидроксифенилаланин (dopa), фенилаланин - тирозин и различные другие гидрокси-производные. Продукты окисления гистидина и метионина пока до конца не идентифицированы, но вероятно, что гистидин дает аспартат, аспарагин и 2-оксогистидин, а метионин - метионинсульфоксид (цит. по Dean et al., 1997). Эти аминокислоты преимущественно окисляются и при воздействии озона (Stadtman, 1993).

Эффекты у-радиолиза на белки в анаэробных и аэробных условиях значительно отличаются (Wolff and Dean, 1986; Davies, 1987). В отсутствие кислорода, как правило,

образуются значительные количества высокомолекулярных агрегатов вследствие образования поперечных сшивок, а также гидрофобных и электростатических взаимодействий. Ковалентные сшивки могут возникать при взаимодействии двух белковых радикалов с центром в атоме углерода, путем образования S-S-мостиков между цистеиновыми остатками или 2,2'-бифениловой сшивки тирозиновых остатков, а также, возможно, с участием гистидиновых и лизиновых остатков (с образованием производных типа оснований Шиффа). Показана возможность передачи радикалов между ароматическими и алифатическими аминокислотами (Fu and Dean, 1997), что может способствовать образованию внутри- и межмолекулярных сшивок (Dean et al., 1997).

Напротив, в присутствии кислорода практически не происходит агрегации, но наблюдается значительная фрагментация белковой молекулы, предположительно, по пути а-амидации (Stadtman, 1993): в результате отщепления а-водородного атома аминокислотного остатка гидроксильным радикалом образуется радикал с центром атомом углерода, который далее реагирует с кислородом с образованием пероксирадикала. Последний далее разлагается до имино-производного, спонтанный гидролиз которого приводит к расщеплению связи а-углерод - азот с образованием двух пептидных фрагментов, один из которых содержит СООН-концевую амидную группу, а ИНг-конец другого блокируется а-кетоацильной группой, т.е. является карбонильным производным.

Вызванное у-облучением расщепление полипептидной цепи происходит, главным образом, по остаткам пролина (Stadtman, 1993) или глицина (Dean et al., 1997).

Заметным шагом вперед в изучении биохимии окисления белков стало понимание того, что в присутствии О2 происходит белково-радикальная цепная реакция с умеренным потреблением кислорода и длиной цепи около семи. В отличие от ПОЛ, при котором основной молекулой, обеспечивающей рост цепи, являются пероксильные радикалы, в данном процессе главную роль, очевидно, играют алкоксильные радикалы (RO*) (Dean et al., 1997).

В поддержании и усилении цепных реакций могут участвовать реактивные интермедиаты окисления аминокислот нерадикальной природы (Dean et al., 1997). Так, dopa, образующийся из тирозина, может восстанавливать ионы переходных металлов, таким образом усиливая реакции с гидроперекисями, а также индуцирует образование радикалов в реакциях с 02. Гидроперекиси, образующиеся на алифатических боковых цепях, а также, вероятно, на а-углеродах основной цепи, могут разрушаться ионами переходных металлов с образованием радикалов, которые вызывают дальнейший рост цепи. Гидроперекиси могут также восстанавливаться до гидроксидов без образования радикалов (Fu and Dean, 1997).

Несмотря на то, что ионизирующая радиация вызывает значительное окислительное повреждение белков, вряд ли ее можно считать основным источником таких повреждений in vivo, за исключением случаев, когда организм подвергается облучению случайно или в процессе терапии. Наибольшее биологическое значение имеют переходные металлы, озон и оксиды азота.

3,2. Металл-катализируемое окисление белков

Цитохром Р-450 редуктазу, а также большой класс флавопротеинов (КАО(Р)Н-оксидазы и дегидрогеназы, ксантиноксидаза, хинонредуктаза), относят к системам "окисления, катализируемого металлами" (metal-catalyzed oxidation, МСО) (Stadtman, 1993). В норме эти ферменты служат в качестве переносчиков электронов между различными метаболическими реакциями. Однако, в отсутствие подходящего акцептора электронов, восстановленные формы этих белков могут аутоокисляться, реагируя с 02 с образованием Н2О2, или восстанавливают Fe(III) до Fe(II) (либо Cu(II) до Си(1)) как 02"*-зависимым, так и независимым образом. Способность таких систем катализировать окисление белков, нуклеиновых кислот и липидов обусловлена, следовательно, взаимодействием Fe2+ с Н202 по реакции Фентона с образованием гидроксильного радикала (ОН*):

NAD(P)H + Н++ 02 -> Н202 + NAD(P)+

NAD(P)H + 2 Fe(III) ->2 Fe(II) + NAD(P)+ + H+

Fe(II) + H202 Off + ОН*' + Fe(III)

активные формы кислорода + белок —» окисленный белок (Stadtman, 1993).

В качестве модельных систем для изучения металл-катализируемого окисления белков in "vitro" используют аутоокисление аскорбата или сульфгидрильных соединений (RSH) в присутствии Fe3+ и 02.

Металл-катализируемое окисление подавляется каталазой, практически полностью зависит от присутствия ионов бикарбоната в среде и может либо стимулироваться, либо ингибироваться хелаторами ионов металлов, в зависимости от прочности комплекса и соотношения [хелатор]/[соль Fe], Например, для ЭДТА, образующего прочный комплекс 1 : 1 с железом, окисление протекает с максимальной скоростью при молярном соотношении хелатор/железо 1 : 1 и полностью подавляется при соотношении 1.1-1.2 (Stadtman, 1993).

Металл-катализируемое окисление аминокислот протекает по нескольким путям, детальный механизм которых неизвестен, но, возможно, напоминает отщепление а-атома водорода при радиолизе. Предполагают протекание первичных реакций с образованием NH41"

и либо а-кетокислоты (реакция 1), либо альдегида и СОг (реакция 2). Вторичные реакции 3 и 4 дают карбоновую кислоту, содержащую на один атом углерода меньше. Минорный многоступенчатый путь может привести к образованию оксима по суммарной реакции 5:

RCHNH3+COO" + Н202 RCOCOO" + NH4+ + Н20 (1)

RCHNH3+COO" + Н202 -» RCHO + NH4+ + НС03" (2)

RCOCOO" + Н202 -» RCOO" + С02 + Н20 (3)

RCHO + Н202 -» RCOO + Н+ + Н20 (4)

RCHNH3+COO" + 2Н202 RCH=NOH + С02 + ЗН20 (5)

Лейцин является единственной аминокислотой, для которой установлены все основные продукты окисления в системе Фентона и их точная стехиометрия: 93% составляет смесь приблизительно одинаковых количеств а-кетоизокапроата, изовалеральдегида и изовалерата (Stadtman, 1993).

В отличие от у-облучения, при котором все аминокислотные остатки доступны для атаки гидроксильными радикалами, металл-катализируемое окисление протекает в относительно замкнутом пространстве - металл-связывающем центре белковой молекулы, поэтому модификации обычно подвергаются лишь один или несколько аминокислотных остатков, которые бывает довольно трудно обнаружить и идентифицировать. Ароматические аминокислоты не являются в „этом случае основными мишенями, т.к. они обычно не присутствуют в металл-связывающих сайтах. Наиболее чувствительны к окислению, катализируемому металлами, гистидин, аргинин, лизин, пролин, метионин и цистеин (Amici et al., 1989). (Climent and Levine, 1991) показали, что модификация бактериальной глутаминсинтетазы в МСО-системе затрагивает His269 и Arg344 - металл-связывающие центры фермента.

В таблице представлены основные продукты окисления аминокислот. Видно, что некоторые аминокислотные остатки превращаются в карбонильные производные: пролин и аргинин - в у-глутамиловый полуальдегид, лизин - в 2-аминоадипилполуальдегид. Аскорбат-зависимое металл-катализируемое окисление ряда белков (глутаминсинтетазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) и синтетических полипептидов приводило к возрастанию уровня карбонильных групп в них (Amici et al., 1989).

Окисление остатков цистеина и тирозина способствует образованию внутри- и межмолекулярных сшивок в белках.

ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ

В БЕЛКАХ

(по Stadtman, 1992; Stadtman, 1993)

Residue modified Product formed

Arginine Glutamic semialdehyde

Cysteine -S-S-cross-links; mixed disulfides

Glutamic acid 4-Hydroxyglutamic acid, pyruvate a-ketoglutaric acid

Histidine Asparagine, aspartic acid, 2-oxohistidine

Leucine — 3- and 4-hydroxyleucine ~ .....

Lysine 2-Aminoadipic semialdehyde

Methionine Methionine sulfoxide, methionine sulfone

Phenylalanine 2-, 3-, and 4-hydroxyphenylalanine

Proline Glutamic semialdehyde, pyroglutamic acid, cis-trans-4-hydroxyproline, 2-pyrrolidone

Threonine 2-Amino-3-ketobutyric acid

Tryptophan N-Formylkynurenine, kynurenine, 2-, 4-, 5-, and 6-hydroxytryptophan

Tyrosine 3,4-Dihydroxyphenylalanine, Tyr-Tyr cross-links

Valine 3-Hydroxyvaline

Профили фрагментации белковой молекулы при действии радиации и систем металл-зависимого окисления различаются. Металл-катализируемое окисление остатков пролина до 2-пирролидона обеспечивает уникальный механизм расщепления пептидной связи, который не связан с образованием реактивной карбонильной группы.

Пространственная "замкнутость" металл-катализируемого окисления объясняет его относительно меньшую чувствительность к ингибированию ловушками свободных радикалов по сравнению с окислением под действием у-радиации, поскольку образующиеся свободно-радикальные интермедиа™ кислорода не диффундируют в окружающую среду.

И, наконец, металл-катализируемое окисление ферментов часто предотвращается в присутствии их специфических субстратов (Fucci et al., 1983); однако, мало вероятно, что субстраты могут защитить ферменты от радиационного повреждения.

Кроме металл-катализируемого окисления, аминокислотные остатки в белках могут избирательно повреждаться гипохлоритом - продуктом активированных нейтрофилов -(главным, образом, лизин, триптофан, цистеин и метионин) с образованием хлораминов.

Окисление LDL в системе миелопероксидаза + Н2О2 приводило к образованию о,о'~ дитирозина, вероятно, за счет модификации фенилаланиновых остатков; содержание дитирозина в LDL, выделенном из атеросклеротических бляшек человека, было в 100 раз выше нормального, что указывает на участие миелопероксидазной реакции в развитии атеросклероза (Leeuwenburgh et al., 1997).

Таким образом, как ионизирующая радиация, так и системы металл-катализируемого окисления, вызывают значительное повреждение аминокислотных остатков.

Непосредственное окисление аминокислот радикалами кислорода, однако, не является единственной свободно-радикальной модификацией, обнаруженной в белках. Взаимодействие аминокислотных остатков с продуктами ПОЛ или редуцирующими сахарами представляет собой другие важные модификации белков.

3.3. Модификация аминокислотных остатков продуктами ПОЛ

Малоновый диальдегид, обладающий двумя альдегидными группами, может вступать в реакцию с аминогруппами лизина на одной и той же или двух различных молекулах белка, образуя внутри- и межмолекулярные перекрестно сшитые основания Шиффа.

При взаимодействии s-аминогруппы лизина, сульфгидрильной группы цистеина или имидазольного кольца гистидина с а,|3-двойной связью 4-HNE по реакции присоединения Михаэля образуются соответственно вторичный амин, тиоэфир или третичный амин с сохранением альдегидной группы. Эти первичные продукты могут далее взаимодействовать с лизиновыми остатками или N-концевыми аминокислотами с образованием внутри- и межмолекулярных сшитых конъюгатов типа оснований Шиффа.

Рибонуклеаза А образует поперечные сшивки в присутствии окисляющегося липида или малонового диальдегида (Chio and Tappel, 1969); до 70 - 80% всех лизиновых остатков на молекуле фермента могут подвергаться модификации (Requena et al., 1997). Недавно аддукты МДА и 4-HNE были впервые идентифицированы на

лизиновых остатках LDL при его окислении, катализируемом медью (Requena et al., 1997). Альбумин обычно образует такие сшивки при хранении, так как большинство связанных с ним липидов являются полиненасыщенными. Образование таких сшивок в полипептидных цепях регистрируется по специфической флуоресценции 350/430 нм (Chance et al., 1979).

Липид-зависимое окисление белков играет основную роль в мембранных системах (митохондрии и_микросомы). Напротив, во внеклеточной соединительной ткани, белковое— окисление, очевидно, происходит без участия липидов.

3.4. Неферментативное гликозилирование (гликатирование) белков

Неферментативное гликозилирование белков - реакция Майяра (Maillard) - происходит во всех тканях организма и протекает в несколько стадий (Njoroge and Monnier, 1989). На ранней стадии свободные аминогруппы N-концевых аминокислот или боковых цепей лизина и аргинина взаимодействуют с альдегидной группой моносахаридов с образованием лабильных оснований Шиффа (альдиминов), которые далее подвергаются перегруппировке Амадори (Amadori) с образованием кетоаминов (1-амино-1-дезоксикетозы).

Наиболее активно реагируют с глюкозой альбумины и глобулины, в то время как белки соединительной ткани менее реакционноспособны. Гемоглобин является первым изученным гликозилированным белком; образование продуктов Амадори происходит по N-концевому валину обеих Р-цепей и s-аминогруппам лизина как а, так и {3-цепей (Shapiro et al., 1980). Основным местом гликозилирования альбумина является лизин (Day et al., 1979).

На промежуточной стадии связанные с белком продукты Амадори подвергаются окислению и дегидратации по свободно-радикальному механизму (гликоксидации), которые ускоряются в присутствии ионов переходных металлов. Фрагментация между атомами С2 и СЗ приводит к образованию Ne-карбоксиметиллизина (CML) и эритроновой кислоты, между СЗ и С4 - 3-(Не-лизино)-молочной и глицериновой кислот. Это необратимый процесс, в котором белок теряет положительный заряд и приобретает отрицательный. CML составлял 35% от общего количества гликатированных остатков лизина в лизоциме после 4-недельной инкубации с глюкозой (Ahmed et al., 1986).

Енолизация продуктов Амадори по различным положениям с расщеплением кетоаминной связи приводит к регенерации аминогруппы и освобождению реактивных аО-дикарбонильных соединений, называемых дезоксиглюкозонами (1-, 3-, или 4-DG), и радикалов кислорода. При более низком рН более вероятно образование 3-DG, а при нейтральном pH—1-DG, хотя возможно образование смеси обоих соединений.

Дезоксиглюкозоны далее либо разлагаются с образованием фурфуральдегида, редуктонов, пиранонов, либо взаимодействуют с аминогруппами, образуя пирролы, пиридины и пирролинон-редуктоны (Njoroge and Monnier, 1989). Эти поздние продукты реакции Майяра поглощают в ультрафиолете, но обычно неокрашены. Их функциональные группы могут реагировать далее с аминами или другими карбонилами с образованием перекрестно сшитых коричневых флуоресцентных соединений (advanced glycation end (AGE) products), структура которых до конца не установлена. Особенно трудной задачей является идентификация AGE-продуктов на белках in vivo из-за их сложного строения и присутствия в тканях в ограниченных количествах, а также вероятности их разрушения в процессе выделения.

НЕФЕРМЕНТАТИВНОЕ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ (РЕАКЦИЯ МАЙЯРА)

R..~ С—СН—NH —• R

of I

(СН2)4

I

nh2

лизин

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Плешакова, Ольга Викторовна

выводы

1. Показано накопление окисленных белков во всех субклеточных фракциях печени и селезенки старых крыс по сравнению с молодыми. Фракция ядерных белков имела наиболее высокий уровень карбонильных групп, вероятнее всего, вследствие интенсивной модификации лизиновых и аргининовых остатков в гистонах.

2. Впервые показано окислительное повреждение белков в субклеточных фракциях печени и селезенки при у-облучении животных в летальной дозе. Дополнительное диетическое потребление антиоксидантов и витаминов необходимо для повышения активности эндогенных антиоксидантных систем и частично предотвращает окислительное повреждение белков под действием у-радиации.

3. Обнаружена пострадиационная активация гистон-специфических протеаз ядерного матрикса, которая обеспечивает эффективную элиминацию окисленных белков из ядер у-облученных животных.

4. Показано возрастание чувствительности к протеолизу и антигенности белков тканей старых животных, которое обусловлено их модификацией.

5. Показано, что активность щелочных протеаз, предположительно, отвечающих за расщепление окисленных белков в ядрах клеток печени, селезенки и нейтрофилах, не снижается с возрастом.

6. Установлено, что мощный протеолитический аппарат нейтрофилов намного эффективнее расщепляет белки из эволюционно более близких видов, чем из отдаленных, а также специфичен по отношению к белкам, модифицированным в системе металл-катализируемого окисления in vitro. Белки старых животных гораздо менее чувствительны к расщеплению протеазами нейтрофилов, что может приводить к возрастанию концентрации аутоантигенов в организме и лежать в основе нарушения иммунологической толерантности при старении.

7. Окислительное повреждение белков в нейтрофилах старых мышей приводит к снижению способности этих клеток к активации "респираторного взрыва".

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Плешакова, Ольга Викторовна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Арчаков А.И. и Карузина И.И. (1995) Цитохром Р-450. В кн.: Белки и пептиды, т. 1. М.: Наука, стр. 95 - 102.

Дубинина Е.Е. (1989) Биологическая роль супероксидного анион-радикала и супероксидцисмутазы в тканях организма. Успехи современной биологии, том 108, вып. 1 (4), стр. 3-17.

Канунго М. Биохимия старения. Москва, "Мир", 1982.

Капитанов А.Б. и Пименов A.M. (1996) Каротиноиды как антиоксидантные модуляторы клеточного метаболизма. Успехи современной биологии, т. 116, вып. 2. стр. 179 - 193.

Маянский А.Н. и Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. М.: Наука, 1983, с. 9.

Сухарев С.А., Смирнов С.В., Плешакова О.В. и Садовников В.Б. (1995) Цитотоксичность перитонеальных клеток мыши в очаге воспаления in vivo. Доклады РАН, т. 343, №3, стр. 403 - 405.

Agarwal, S. and Sohal, R. (1993) Relationship between aging and susceptibility to protein oxidative damage. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 194, no. 3, pp. 1203 - 1206.

Agarwal, S. and Sohal, R. (1994) Aging and proteolysis of oxidized proteins. Arch. Biochem. Biophys., vol. 309, no. l,pp. 24-28.

Agarwal, S. and Sohal, R. (1995) Differential oxidative damage to mitochondrial proteins during aging. Mech. Ageing Dev., vol. 85, pp. 55 - 63.

Ahmed, M.U., Thorpe, S.R., and Baynes, J.W. (1986) Identification of N6-carboxymethyllysine a degradation product of fructose lysine in glycated protein. J. Biol. Chem., vol. 261, pp. 4889 - 4894.

Albanes, D., Heinonen, O.P., Huttunen, J.K., Taylor, P.R., Virtamo, J., Edwards, B.K., Haapakoski, J., Rautalahti, M., Hartman, A.M., and Palmgren, J. (1995) Effects of alpha-tocopherol and beta-carotene supplements on cancer incidence in the Alpha-Tocopherol Beta-Carotene Cancer Prevention Study. Am. J. Clin. Nutr., vol. 62, pp. 1427S - 1430S.

Alleva, R., Tomasetti, M., Battino, M., Curatola, G., Littarru, G.P., and Folkers, K. (1995) The roles of coenzyme Q]0 and vitamin E on the peroxidation of human low density lipoprotein subfractions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 92, pp. 9388 - 9391.

Ames, B.N., Shigenaga, M.K., and Hagen, T.M. (1993) Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, pp. 7915 - 7922.

Amici, A., Levine, R.L., Tsai, L., and Stadtman, E.R. (1989) Conversion of amino acid residues in proteins and amino acicfhomopolymers to carbonyl derivatives by metal-catalyzed oxidation reactions. J. Biol. Chem., vol. 264, no. 6, pp. 3341 - 3346.

Anselmi, В., Conconi, M., Veyrat-Durebex, C., Turlin, E., Biville, F., Alliot, J., and Friguet, B. (1998) Dietary self-selection can compensate an age-related decrease of rat liver 20 S proteasome activity observed with standard diet. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci., vol. 53, no. 3, pp. В173 - В179.

Azhar, S., Cao, L., and Reaven, E. (1995) Alteration of the adrenal antioxidant defense system during aging in rats. J. Clin. Invest., vol. 96, pp. 1414- 1424.

Badwey, J.A. and Karnovsky, M.L. (1986) Production of superoxide by phagocytic leukocytes: A paradigm for stimulus-response phenomena. Curr. Top.Cell. Regul., vol. 28, pp. 183 - 209.

Baez, S., Segura-Aguilar, J., Widersten, M., Johansson, A.-S., and Mannervik, B. (1997) Glutathione transferases catalyse the detoxication of oxidized metabolites (o-quinones) of catecholamines and may serve as an antioxidant system preventing degenerative cellular processes. Biochem. J., vol. 324, pp. 25 - 28.

Baker, K., Marcus, C.B., Huffman, K., Kruk, H, Malfroy, В., and Doctrow, S.R. (1998) Synthetic combined superoxide dismutase/catalase mimetics are protective as a delayed treatment in a rat stroke model: a key role for reactive oxygen species in ischemic brain injury. J. Pharmacol. Exp. Ther., vol. 284, no. 1, pp. 215 - 221.

Bannister, J.V., Bannister, W.H., and Rotilio, G. (1987) Aspects of the structure, function, and applications of superoxide dismutase. CRC Crit. Rev. Biochem., vol. 22, no. 2, pp. 111 - 180.

Barlow-Walden, L.R., Reiter, R.J., Abe, M., Pablos, M., Menendez-Pelaez, A., Chen, L.D., and Poeggeler, B. (1995) Melatonin stimulates brain glutathione peroxidase activity. Neurochem. Int., vol. 26, pp. 497 - 502.

Beckman, J.S., Beckman, T.W., Chen, J., Marshall, P.A., and Freeman, B.A. (1990) Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implication for endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 87, pp. 1620 - 1624.

Behl, C., Skutella, T., Lezoualc'h, F., Post, A., Widmann, M., Newton, C.J., and Holsboer, F. (1997) Neuroprotection against oxidative stress by estrogens: structure-activity relationship. Mol. Pharmacol., vol. 51, pp. 535 -541.

Beier, K., Volkl, A., and Fahimi, H.D. (1993) The impact of ageing on enzyme proteins of rat liver peroxisomes - quantitative analysis by immunoblotting and immunoelectron microscopy. Virchows Arch. B., vol. 63, pp. 139- 146.

Benderitter, M., Maingon, P., Abadie, C., Assem, M., Maupoil, V., Briot, F., Horiot, J.C., and Rochette, L. (1995) Effect of in vivo heart irradiation on the development of antioxidant defenses and cardiac functions in the rat. Radiat. Res., vol. 144, pp. 64 - 72.

Benzi, G. and Moretti, A. (1995) Age- and peroxidative stress-related modifications of the cerebral enzymatic activities linked to mitochondria and the glutathione system. Free Radic. Biol. Med., vol. 19, no. 1, pp. 77 -101.

Benzi, G., Pastoris, O., Gorini, A., Marzatico, F., and Villa, R.F. (1991) Influence of aging on the acute depletion of reduced glutathione induced by electrophilic agents. Neurobiol. Aging, vol. 12, pp. 227 - 231.

Benzi, G., Pastoris, O., Marzatico, F., and Villa, R.F. (1988) Influence of aging and drug treatment on the cerebral glutathione system. Neurobiol. Aging, vol. 9, pp. 371 - 375.

Beppu, M., Inoue, M., Ishikawa, T., and Kikugawa, K. (1994) Presence of membrane-bound proteinases that preferentially degrade oxidatively damaged erythrocyte membrane proteins as secondary antioxidant defense. Biochim. Biophys. Acta, vol. 1196, no. 1, pp. 81 - 87.

Bezlepkin, V.G., Sirota, N.P., and Gaziev, A.I. (1996) The prolongation of survival in mice by dietary antioxidants depends on their age by the start of feeding this diet. Mech. Ageing Dev., vol. 92, no. 2-3, pp. 227 - 234.

Bimie, G. D. (ed.). (1972) Subcellular components. Preparation and fractionation. Butterworths, London; University Park Press, Baltimore.

Bjornstedt, M., Kumar, S., Bjorkhem, L., Spyrou, G., and Holmgren, A. (1997) Selenium and the thioredoxin and glutaredoxin systems. Biomed. Environ. Sci., vol. 10, no. 2-3, pp. 271 - 279.

Blackett, A.D. and Hall, D.A. (1981) The effects of vitamin E on mouse fitness and survival. Gerontology, vol. 27, no. 3, pp. 133- 139.

Bonner, J., Chalkley, G.R., Dahmus, M., Fambrough, D., Fujimura, F., Huang, R.-C.C., Huberman, J., Jensen, R., Marushige, K., Ohlenbusch, H., Olivera, B., and Widholm, J. (1968) Isolation and characterization of chromosomal nucleoprotein. Methods Enzymol., vol. 12B, pp. 4 - 64.

Bosch van den, H., Schutgens, R.B., Wanders, R.J., and Tager, J.M. (1992) Biochemistry of peroxisomes. Annu. Rev. Biochem., vol. 61, pp. 157 - 197.

Brack, C., Bechter-Thuring, E., and Labuhn, M. (1997) N-acetylcysteine slows down ageing and increases the life span of Drosophila melanogaster. Cell. Mol. Life Sci., vol. 53, no. 11-12, pp. 960 - 966.

Bunn, H.F. and Higgins, PJ. (1981) Science, vol. 213, pp. 222 - 224.

Buttke, T.M. and Sandstrom, P.A. (1994) Oxidative stress as a mediator of apoptosis. Immunology Today, vol. 15, no. 1, pp. 7 - 10.

Byun, D.S., Venkatraman, J.T, Yu, B.P., and Fernandes, G. (1995) Modulation of antioxidant activities and immune response by food restriction in aging Fisher-344 rats. Aging (Milano), vol. 7, no. 1, pp. 40 - 48.

Cabiscol, E. and Levine, R.L. (1995) Carbonic anhydrase III. Oxidative modification in vivo and loss of phosphatase activity during aging. J. Biol. Chem., vol. 270, no. 24, pp. 14742 - 14747.

Candlish, J.K. (1993) Inhibition of the neutrophil respiratory burst by neoglycoalbumin. Pathology, vol. 25, pp. 148-151.

Cao, G. and Cutler, R.G. (1993) High concentrations of antioxidants may not improve defense against oxidative stress. Arch. Gerontol. Geriatr., vol. 17, pp. 189-201.

Cao, G. and Cutler, R.G. (1995) Protein oxidation and aging. I. Difficulties in measuring reactive protein carbonyls in tissues using 2,4-dinitrophenylhydrazine. Arch. Biochem. Biophys., vol. 320, pp. 106 - 114.

Cao, G7and Cutler7R.G. (1995aJ Protein oxidation and aging. II. Difficulties in measuring alkaline protease activity in tissues using the fluorescamine procedure. Arch. Biochem. Biophys., vol. 320, pp. 195-201.

Carlsson, L.M., Jonsson, J., Edlund, T., and Marklund, S.L. (1995) Mice lacking extracellular superoxide dismutase are more sensitive to hyperoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 92, pp. 6264 - 6268.

Carney, J.M. and Carney, A.M. (1994) Role of protein oxidation in aging and in age-associated neurodegenerative diseases. Life Sci.,""vol. 55, nos. 25/26, pp. 2097-2103.

Carney, J.M, Starke-Reed, P.E, Oliver, C.N, Landum, R.W, Cheng, M.S., and Wu, J.F. (1991) Reversal of age-related increase in brain protein oxidation, decrease in enzyme activity and loss of temporal and spatial memory by chronic administration of the spin-trapping compound N-/er/-butyl-a-phenylnitronc. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 88, pp. 3633 - 3636.

Carr, A.C. and Winterbourn, C.C. (1997) Oxidation of neutrophil glutathione and protein thiols by myeloperoxidase-derived hypochlorous acid. Biochem. J, vol. 327, pp. 275 - 281.

Caughey, W.S, Barlow, C.H, Maxwell, J.C, Volpe, J.A, and Wallace, W.J. (1975) Reactions of oxygen with hemoglobin, cytochrome c oxidase and other hemeproteins. Ann. N. Y. Acad. Sci, vol. 244, pp. 1-9.

Ceballos-Picot, I, Nicole, A, Clement, M, Bourre, J.M, and Sinet, P.M. (1992) Age-related changes in antioxidant en2ymes and lipid peroxidation in brains of control and transgenic mice overexpressing copper-zinc superoxide dismutase. Mutation Res, vol. 275, pp. 281 - 293.

Cefalu, W.T, Bell-Farrow, A.D, Wang, Z.Q, Sonntag, W.E, Fu, M.X, Baynes, J.W, and Thorpe, S.R. (1995) Caloric restriction decreases age-dependent accumulation of the glycoxidation products, N epsilon-(carboxymethyl)lysine and pentosidine, in rat skin collagen. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci, vol. 50, no. 6, pp. B337-341.

Cha, M.-K. and Kim, I.-H. (1996) Glutathione-linked thiol peroxidase activity of human serum albumin: a possible antioxidant role of serum albumin in blood plasma. Biochem. Biophys. Res. Commun, vol. 222, pp. 619-625.

Chai, Y.-C, Howe, P.H, DiCorleto, P.E, and Chisolm, G.M. (1996) Oxidized low density lipoprotein and lisophosphatidylcholine stimulate cell cycle entry in vascular smooth muscle cells. Evidence for release of fibroblast growth factor-2. J. Biol. Chem, vol. 271, no. 30, pp. 17791 - 17797.

Chan, A.C. (1993) Partners in defense, vitamin E and vitamin C. Can. J. Physiol. Pharmacol, vol. 71, pp. 725 -731.

Chance, B, Sies, H, and Boveris, A. (1979) Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. Physiol. Rev, vol. 59, no. 3, pp. 527-605.

Chao, C.-C, Ma, Y.-S, and Stadtman, E.R. (1997) Modification of protein surface hydrophobicity and methionine oxidation by oxidative systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, pp. 2969 - 2974.

Chen, J.J. and Yu, B.P. (1994) Alterations in mitochondrial membrane fluidity by lipid peroxidation products. Free Radic. Biol. Med, vol. 17, no. 5, pp. 411 - 418.

Chen, J. J., Bertrand, H., and Yu, B.P. (1995) Inhibition of adenine nucleotide translocator by lipid peroxidation products. Free Radie. Biol. Med., vol. 19, no. 5, pp. 583 - 590.

Chio, K.S. and Tappel, A.L. (1969) Inactivation of ribonuclease and other enzymes by peroxidizing lipids and by malonaldehyde. Biochemistiy, vol. 8, pp. 2827 - 2832.

Christen, S., Woodall, A.A., Shigenaga, M.K., Southwell-Keely, P.T., Duncan, M.W., and Ames, B.N. (1997) y-Tocopherol traps mutagenic electrophiles such as NOx and complements a-tocopherol: Physiological implications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, pp. 3217 - 3222.

Chuaqui, C.A. and Petkau, A. (1987) Chemical reactivity and biological effects of superoxide radicals. Radiat. Phys. Chem., vol. 30, no. 5/6, pp. 365 - 373.

Climent, I. and Levine, R.L. (1991) Oxidation of the active site of glutamine synthetase: conversion of arginine-344 to gamma-glutamyl semialdehyde. Arch. Biochem. Biophys., vol. 289, no. 2, pp. 371 - 375.

Cohen, G. and Heikkila, R. E. (1974) The generation of hydrogen peroxide, superoxide radical, and hydroxyl radical by 6-hydroxydopamine, dialuric acid, and related cytotoxic agents. J. Biol. Chem., vol. 249, no. 8, pp. 2447-2452.

Cohen, M.P., Wu, V.-Y., and Cohen, J.A. (1997) Glycated albumin stimulates fibronectin and collagen IV production by glomerular endothelial cells under normoglycemic conditions. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 239, pp. 91 - 94.

Cohn, J.A., Tsai, L., Friguet, B., and Szweda, L.I. (1996) Chemical characterization of a protein-4-hydroxy-2-nonenal cross-link: immunochemical detection in mitochondria exposed to oxidative stress. Arch. Biochem. Biophys., vol. 328, no. 1, pp. 158 - 164.

Conconi, M. and Friguet, B. (1997) Proteasome inactivation upon aging and on oxidation-effect of HSP 90. Mol. Biol. Rep., vol. 24, no. 1-2, pp. 45 - 50.

Congy, F., Bonnefont-Rousselot, D., Dever, S., Delattre, J., and Emerit, J. (1995) Étude du stress oxydant chez le sujet âgé (Oxidative stress in the elderly). La Presse Médicale, vol. 24, no. 24, pp. 1115 - 1118.

Cristiano, F., de Haan, J.B., Ianello, R.C., and Kola, I. (1995) Changes in the levels of enzymes which modulate the antioxidant balance occur during aging and correlate with cellular damage. Mech. Ageing Dev., vol. 80, pp. 93 - 105.

Curnutte, J.T. (1992) Molecular basis of the autosomal recessive forms of chronic granulomatous disease. Immunodef. Rev., vol. 3, no. 2, pp. 149 - 167.

Dallegri, F., Frumento, G., and Patrone, F. (1983) Mechanisms of tumour cell destruction by PMA-activated human neutrophils. Immunology, vol. 48, no. 2, pp. 273 - 279.

Daudi, I., Gudewicz, P.W., Saba, T.M., Cho, E., and Vincent, P. (1991) Proteolysis of gelatin-bound fibronectin by activated leukocytes: a role for leukocyte elastase. J. Leukocyte Biology, vol. 50. pp. 331 - 340.

Davies, K.J.A. (1987) Protein damage and degradation by oxygen radicals. I. General aspects. J. Biol. Chem., vol. 262, no. 20, pp. 9895 - 9901.

Davies, K.J.A., Delsignore, M.E., and Lin, S.W. (1987) Protein damage and degradation by oxygen radicals. II. Modification of amino acids. J. Biol. Chem., vol. 262, no. 20, pp. 9902 - 9907.

Davies, K.J.A., Lin, S.W., and Pacifici, R.E. (1987a) Protein damage and degradation by oxygen radicals. IV. Degradation of denatured protein. J. Biol. Chem., vol. 262, no. 20, pp. 9914 - 9920.

Day, J.F., Thomburg, R.W., Thorpe, S.R., and Baynes, J.W. (1979) Nonenzymatic glucosylation of rat albumin. Studies in vitro and in vivo. J. Biol. Chem., vol. 254, no. 19, pp. 9394 - 9400.

De, A.K., Chipalkatti, S., and Aiyar, A.S. (1983) Some biochemical parameters of ageing in relation to dietary protein. Mech. Ageing Dev., vol. 21, pp. 37 - 48.

Dean, R.T., Fu, S., Stocker, R., and Davies, M.J. (1997) Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation. Biochem. J., vol. 324, pp. 1-18.

Dizdaroglu, M. (1992) Oxidative damage to DNA in mammalian chromatin. Mutation Res., vol. 275, pp. 331 -341.

Douillet, C., Bost, M., Accominotti, M., Borson-Chazot, F., and Ciavatti, M. (1998) Effect of selenium and vitamin E supplements on tissue lipids, peroxides, and fatty acid distribution in experimental diabetes. Lipids, vol. 33, no. 4, pp. 393 - 399.

Dubey, A., Forster, M.J., Lai, H., and Sohal, R.S. (1996) Effect of age and caloric intake on protein oxidation in different brain regions and on behavioral functions of the mouse. Arch. Biochem. Biophys., vol. 333, no. 1, pp. 189- 197.

Edwards, S.W. and Hallett, M.B. (1997) Seeing the wood for the trees: the forgotten role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Immunology Today, vol. 18, no. 7, pp. 320 - 324.

Epstein, J. and Gershon, D. (1972) Studies on aging in nematodes. IV. The effect of antioxidants on cellular damage and life span. Mech. Ageing. Dev., vol. 1, pp. 275 - 264.

Ernster, L. and Dallner, G. (1995) Biochemical, physiological and medical aspects of ubiquinone function. Biochim. Biophys. Acta, vol. 1271, no. 1, pp. 195 - 204.

Ferry, G., Lonchampt, M., Pennel, L., de Nanteuil, G., Canet, E., and Tucker, G.C. (1997) Activation of MMP-9 by neutrophil elastase in an in vivo model of acute lung injury. FEBS Lett., vol. 402, pp. 111-115.

Feuers, R.J., Weindruch, R., and Hart, R.W. (1993) Caloric restriction, aging and antioxidant enzymes. Mutat. Res., vol. 295, pp. 191 -200.

Fisher, D.B. and Kaufman, S. (1973) Tetrahydropterin oxidation without hydroxylation catalyzed by rat liver phenylalanine hydroxylase. I. Biol. Chem., vol. 248, no. 12, pp. 4300 - 4304.

Fleet, J.C. (1997) Dietary selenium repletion may reduce cancer incidence in people at high risk who live in areas with low soil selenium. Nutr. Rev., vol. 55, no. 7, pp. 277 - 279.

Floyd, R.A., Watson, J.J., Harris, J., West, M., and Wong, P.K. (1986) Formation of . 8-hydroxydeoxyguanosine, hydroxy] free radical adduct of DNA in granulocytes exposed to the tumor promoter, tetradeconylphorbolacetate. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 137, p. 841 - 846.

Freeman, B.A., Turrens, J.F., Mirza, Z., Crapo, J.D., and Young, S.L. (1985) Modulation of oxidant lung injury by using liposome-entrapped superoxide dismutase and catalase. Fed. Proc., vol. 44, no. 10, pp. 2591 -2595.

Frei, B., Stacker, R., and Ames, B.N. (1988) Antioxidant defenses and lipid peroxidation in human blood plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 85, pp. 9748 - 9752.

Fridovich, I. (1978) The biology of oxygen radicals: the superoxide radical is an agent of oxygen toxicity; superoxide dismutases provide an important defense. Science, vol. 201, no. 4359, pp. 875 - 880.

Friguet, B. and Szweda, L.I. (1997) Inhibition of the multicatalytic proteinase (proteasome) by 4-hydroxy-2-nonenal cross-linked protein. FEBS Lett., vol. 405, no. 1, pp. 21 - 25.

Friguet, B., Szweda, L.I., and Stadtman, E.R. (1994) Susceptibility of glucose-6-phosphate dehydrogenase modified by 4-hydroxy-2-nonenal and metal-catalyzed oxidation to proteolysis by the multicatalytic protease. Arch. Biochem J3iophys., vol. 311, no. 1, pp. 168 - 173.

Fu, S.-L. and Dean, R.T. (1997) Structural characterization of the products of hydroxyl-radical damage to leucine and their detection on proteins. Biochem. J., vol. 324, pp. 41 - 48.

Fucci, L., Oliver, C.N., Coon, M.J., and Stadtman, E.R. (1983) Inactivation of key metabolic enzymes by mixed-function oxidation reactions: possible implication in protein turnover and ageing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 80, no. 6, pp. 1521 - 1525. _

Fuente de la, M., Ferrcndez, D., Munoz, F., de Juan, E., Miquel, J. (1993) Stimulation by the antioxidant thioproline of the lymphocyte functions of old mice. Mech. Ageing Dev., vol. 68, no. 1-3, pp. 27 - 36.

Fujita, T., Furitsu, H., Nishikawa, M., Takakura, Y., Sezaki, H., and Hashida, M. (1992) Therapeutic effects of superoxide dismutase derivatives modified with mono- or polysaccharides on hepatic injury induced by ischemia/reperfusion. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 189, no. 1, pp. 191 - 196.

Garcia-Arumi, E., Andreu, A.L., Lopez-Hellin, J., and Schwartz, S. (1998) Effect of oxidative stress on lymphocytes from elderly subjects. Clin. Sci., vol. 94, pp. 447 - 452.

Gardner, I.D. (1980) The effect of aging on susceptibility to infection. Rev. Infect. Dis., vol. 2, pp. 801 - 810.

Garner, M.H. and Spector, A. (1980) Selective oxidation of cysteine and methionine in normal and senile cataractous lenses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 77, no. 3, pp. 1274 - 1277.

Gaziev, A.I. and Kutsyi, M.P. (1992) y-Irradiated DNA activates histone Hl-specific proteinase of rat liver nuclei. Int. J. Radiat. Biol., vol. 61, pp. 169 - 174.

Gaziev, A.I., Podlutsky, A.Ja., Panfilov, B.M., and Bradbury, R. (1995) Dietary supplements of antioxidants reduce hprt mutant frequency in splenocytes of aging mice. Mutat. Res., vol. 338, vol. 1-6, pp. 77 - 86.

Gershwin, M.E., Lentz, D.R., Beach, R.S., and Hurley, L.S. (1984) Nutritional factors and autoimmunity. IV. Dietary vitamin A deprivation induces a selective increase in IgM autoantibodies and hypergammaglobulinemia in New Zealand Black mice. J. Immunol., vol. 133, no. 1, pp. 222 - 226.

Ghatak, S. and Ho, S. (1996) Age-related changes in the activities of antioxidant enzymes and lipid peroxidation status in ventral and dorsolateral prostate lobes of noble rats. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 222, pp. 362-367.

Giulivi, C., Pacifici, R.E., and Davies, K.J. (1994) Exposure of hydrophobic moieties promotes the selective degradation of hydrogen peroxide-modified hemoglobin by the multicatalytic proteinase complex, proteasome. Arch. Biochem. Biophys., vol. 311, no. 2, pp. 329 - 341.

Goldstein, I.M., Kaplan, H.B., Edelson, H.S., and Weissmann, G. (1982) Ceruloplasmin: an acute phase reactant that scavenges oxygen-derived free radicals. Ann. N. Y. Acad. Sci., vol. 389, pp. 368 - 379.

Gordillo, E., Ayala, A., Lobato, M.F., Bautista, J., and Machado, A. (1988) Possible involvement of histidine residues in the loss of enzymatic activity of rat liver malic enzyme during aging. J. Biol. Chem., vol. 263, pp. 8053- 8057.

Grant, A.J., Jessup, W., and Dean, R. T. (1992) Accelerated endocytosis and incomplete catabolism of radical-damaged protein. Biochim. Biophys. Acta, vol. 1134, pp. 203 - 209.

Grasl-Kraupp, B., Bursch, W., Ruttkay-Nedecky, B., Wagner, A., Lauer, B., and Schulte-Hermann, R. (1994) Food restriction eliminates preneoplastic cells through apoptosis and antagonizes carcinogenesis in rat liver. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, pp. 9995 - 9999.

Grune, T., Reinheckel, T., and Davies, K.J. (1997) Degradation of oxidized proteins in mammalian cells. FASEB J., vol. 11, no. 7, pp. 526 - 534.

Grune, T., Reinheckel, T., and Davies, K.J.A. (1996) Degradation of oxidized proteins in K562 human hematopoietic cells by proteasome. J. Biol. Chem., vol. 271, no. 26, pp. 15504 - 15509.

Gugllucci, A. and Bendayan, M. (1995) Histones from diabetic rats contain increased levels of advanced glycation end products. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 212, no. 1, pp. 56 - 62.

Gutteridge, J.M. and Halliwell, B. (1990) The measurement and mechanism of lipid peroxidation in biological systems. Trends Biochem. Sci., vol. 15, pp. 129 - 135.

Guzdek, A. and Stalinska, K. (1992) Glycated proteins as inducers of acute phase cytokines. Fol. Hystochem. Cytobiol., vol. 30, pp. 167 - 169.

Haan de, J.B., Cristiano, F., lannello, R.C., and Kola, I. (1995) Cu/Zn-superoxide dismutase and glutathione peroxidase during aging. Biochem. Mol. Biol. Int., vol. 35, no. 6, pp. 1281 - 1297.

Hagen, T.M., Yowe, D.L., Bartholomew, J.C., Wehr, C.M, Do, K.L., Park, J.-Y, and Ames, B.N. (1997) Mitochondrial decay in hepatocytes from old rats: membrane potential declines, heterogeneity and oxidants increase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, pp. 3064 - 3069.

Haley-Zitlin, V. and Richardson, A. (1993) Effect of dietary restriction on DNA repair and DNA damage. Mutat. Res., vol. 295, pp. 237 - 245.

Halliwell, B. (1996) Oxidative stress, nutrition and health. Experimental strategies for optimization of nutritional antioxidant intake in humans. Free Radic. Res., vol. 25, no. 1, pp. 57 - 74.

Halliwell, B. and Gutteridge, J.M.C. (1984) Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease. Biochem. J., vol. 219, no. 1, pp. 1 - 14.

Hamada, Y., Araki, N., Koh, N., Nakamura, J., Horiuchi, S., and Hotta, N. (1996) Rapid formation of advanced glycation end products by intermediate metabolites of glycolytic pathway and polyol pathway. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 228, pp. 539 - 543.

Hansford, R.G., Hogue, B.A., and Mildaziene, V. (1997) Dependence of H202 formation by rat heart mitochondria on substrate availability and donor age. J. Bioenerg. Biomembr., vol. 29, no. 1, pp. 89 - 95.

Harapanhalli, R.S., Yaghmai, V, Giuliani, D, Howell, R.W., and Rao, D.V. (1996) Antioxidant effects of vitamin C in mice following X-irradiation. Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol., vol. 94, no. 3, pp. 271 -287.

Harman, D. (1982) The free-radical theory of aging. Free Radicals in Biology, vol. V, pp. 259 - 275.

II arm an, D. (1994) Aging: prospects for further increases in the functional life span. Age, vol. 17, pp. 119 146: -

Hata, F., Igaki, N., Nakamichi, T., Masuda, S., Nishimoto, S., Oimomi, M., Baba, S., and Kato, H. (1988) Suppressive effect of a-ketoaldehyde dehydrogenase on the advanced process of the Maillard reaction. Diab. Res. Clin. Pract., vol. 5, pp. 5413 -.

Hayase, F., Nagaraj, R.H., Miyata, S., Njoroge, F.G., and Monnier, F.M. (1989) Aging of proteins: immunological detection of a glucose-derived pyrrole formed during Maillard reaction in vivo. J. Biol. Chem., vol. 264, pp. 3758-3764.

Hearn, M.G., Edland, S.D., Ogburn, C.E., Smith, A.C., Bird, T.D., Martin, G.M., and Fukuchi, K. (1994) Trypsin inhibitor activities of fibroblasts increase with age of donor and are unaltered in familial Alzheimer's disease. Exp. Gerontol., vol. 29, no. 6, pp. 611 - 623.

Henson, P.M. and Johnston, R.B. (1987) Tissue injury in inflammation. Oxidants, proteinases, and cationic proteins. J. Clin. Invest., vol. 79, pp. 669 - 674.

Hipkiss, A.R., Michaelis, J., Syrris, P., Kumar, S., and Lam, Y. (1994) Carnosine protects proteins against in vitro glycation and cross-linking. Biochem. Soc. Trans., vol. 4, p. 399S.

Hogg, J.C. (1987) Neutrophils kinetics and lung injury. Physiol. Rev., vol. 67, no. 4, pp. 1249 - 1295.

Horiuchi, S., Araki, N., and Morino Y. (1991) Immunochemical approach to characterize advanced glycation end products of the Maillard reaction. Evidence for a presence of a common structure. J. Biol. Chem., vol. 266, no. 12, pp. 7329-7332.

Hsieh, R.H., Hou, J.H., Hsu, H.S., and Wei, Y.H. (1994) Age-dependent respiratory function decline and DNA deletions in human muscle mitochondria. Biochem. Mol. Biol. Int., vol. 32, no. 6, pp. 1009 - 1022.

Huang, T.T., Carlson, E.J., Leadon, S.A., and Epstein, S.J. (1992) Relationship of resistance to oxygen free radicals to Cu, Zn-superoxide dismutase activity in transgenic, transfected and trisomic cells. FASEB J., vol. 6, pp. 903-910.

Iacovitti, L., Stull, N.D., and Johnston, K. (1997) Melatonin rescues dopamine neurons from cell death in tissue culture models of oxidative stress. Brain Res., vol. 768, pp. 317 - 326.

Iadecola, C. (1997) Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury. Trends Neurosci., vol. 20, pp. 132- 139.

Idrobo, F., Nandy, K., Mostofsky, D.I., Blatt, L., and Nandy, L. (1987) Dietary restriction: effects on radial maze learning and lipofuscin pigment deposition in the hippocampus and frontal cortex. Arch. Gerontol. Geriatr., vol. 6, no. 4, pp. 355 - 362.

Indelicate, S.R., Udipa, K.B., Balazovich, K.J., Boxer, L.A., and Lipschitz, D.A. (1990) Effect of age on phorbol-ester stimulation of human neutrophils. J. Gerontol., vol. 45, pp. 75 - 80.

Itoh, K., Weis, S., Mehraein, P., and Müller-Höcker (1996) Cytochrome c oxidase defects of the human substantia nigra in normal aging. J. Neurobiol. Aging, vol. 17, no. 6, pp. 843 - 848.

Iverson, F. (1995) Phenolic antioxidants: Health Protection Branch studies on butylated hydroxyanisole. Cancer Lett., vol. 93, no. 1, pp. 49- 54.

Johnson, P. and Hammer, J.L. (1992) Histidine dipeptide levels in ageing and hypertensive rat skeletal and cardiac muscles. Comp. Biochem. Physiol. [B], vol. 103, pp. 981 - 984.

Kaneko, T., Tahara, S.,and Matsuo, M. (1997) Retarding effect of dietary restriction on the accumulation of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in organs of Fischer 344 rats during aging. Free Radic. Biol. Med., vol. 23, no. 1, pp. 76-81.

Kaneto, H., Fujii, J., Myint, T., Miyuazawa, N., Islam, K.N., Kawasaki, Y., Suzuki, K., Nakamura, M., Tatsumi, H., Yamasaki, Y., and Taniguchi, N. (1996) Reducing sugars trigger oxidative modification and apoptosis in pancreatic ß-cells by provoking oxidative stress through the glycation reaction. Biochem. J., vol. 320,pp. 855 - 863.

Kettritz, R., Falk, R.J., Jennette, J.C., and Gaido, M.L. (1997) Neutrophil superoxide release is required for spontaneous and FMLP-mediated but not for TNF alpha-mediated apoptosis. J. Am. Soc. Nephrol., vol. 8, pp. 1091 - 1100.

Kilgore, K.S. and Lucchesi, B.R. (1993) Reperfusion injury after myocardial infarction: the role of free radicals and the inflammatory response. Clin. Biochem., vol. 26, pp. 359 - 370.

Kim, J.H., Woldgiorgis, G., Elson, C.E., and Shrago, E., (1988) Age-related changes in respiration coupled to phosphorylation. I. Hepatic mitochondria. Mech. Ageing Dev., vol. 46, no. 1-3, pp. 263 - 277.

King, C.M. and Barnett, Y.A. (1995) Oxidative stress and human aging. Biochem. Soc. Trans., vol. 23, p. 375S.

Kirkwood, T.B.L. (1996) Human senescence. Bioessays, vol. 18, no. 12, pp. 1009 - 1016.

Klebanoff, S.J and Pincus, S.H. (1971) Hydrogen peroxide utilization in myeloperoxidase-deficient leukocytes: a possible microbicidal control mechanism. J. Clin. Invest., vol. 50, pp. 2226 - 2229.

Konttinen, Y.T., Lindy, O., Kemppinen, O., Saari, H., Suomalainen, K., Vauhkonen, M., Lindy, S., and Sorsa, T. (1991) Collagenase reserves in polymorphonuclear neutrophil leukocytes from synovial fluid and peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Matrix, vol. 11, pp. 296 - 301.

Ku, H.H., Brunk, U.T., and Sohal, R.S. (1993) Relationship between mitochondrial superoxide and hydrogen peroxide production and longevity of mammalian species. Free Radic. Biol. Med., vol. 15, no. 6, pp. 621 -627.

Kubo, C., Gajar, A., Johnson, B.C., and Good, R.A. (1992) The effects of dietary restriction on immune function and development of autoimmune disease in BXSB mice. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 89, no. 7, pp. 3145-3149.

Kucukkaya, B., Haklar, G., and Yalcin, A.S. (1996) NMDA excitotoxicity and free radical generation in rat brain homogenates: application of a chemiluminescence assay. Neurochem. Research, vol. 21, no. 12, pp. 1535 - 1538.

Kuki, K., Maeda, K., Takauchi, S., Kakigi, T., Maeda, S., and Tanaka, C. (1996) Neurochemical and pathological alterations following infusion of leupeptin, a protease inhibitor, into the rat brain. Dementia, vol. 7, no. 5, pp. 233-238.

Kumari, M.V., Yoneda, T., and Hiramatsu, M. (1997) Effect of "beta CATECHIN" on the life span of senescence accelerated mice (SAM-P8 strain). Biochem. Mol. Biol. Int., vol. 41, no. 5, pp. 1005 - 1011.

Kunkel, H.O. and Campbell, J.E. (1952) J. Biol. Chem, vol. 198, pp. 229 - 236.

Kutsyi, M.P. and Gaziev, A.I. (1994) Gamma irradiation or hydrocortisone treatment of rats increases the proteinase activity associated with histones of thymus nuclei. Radiat Res., vol. 140, pp. 221 - 229.

Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature, vol. 227, pp. 680 - 685.

Lane, M.A., Baer, D.J., Rumpler, W.V., Weindruch, R., Ingram, D.K., Tilmont, E.M., Cutler, R.G., and Roth, G.S. (1996) Calorie restriction lowers body temperature in rhesus monkeys, consistent with a postulated anti-aging mechanism in rodents. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 93, pp. 4159 - 4164.

Lebovitz, R.M., Zhang, H., Vogel, H., Cartwright, Jr., J., Dionne, L., Lu, N., Huang, S., and Matzuk, M.M. (1996) Neurodegeneration, myocardial injury, and perinatal death in mitochondrial superoxide dismutase-deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 93, pp. 9782 - 9787.

Lee, M.H. and Park, J.-W. (1995) Lipid peroxidation products mediate damage of superoxide dismutase. Biochem. Mol. Biol. Int., vol. 35, no. 5, pp. 1093 - 1102.

Leeuwenburgh, C., Rasmussen, J.E., Hsu, F.F., Mueller, D.M., Pennathur, S., and Heinecke, J.W. (1997) Mass spectrometric quantification of markers for protein oxidation by tyrosyl radical, copper, and hydroxyl radical in low density lipoprotein isolated from human atherosclerotic plaques. J. Biol. Chem., vol. 272, no. 6, pp. 3520-3526.

Lefkovits, I. (1986) Self and non-self discrimination by "restriction proteases". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 83, pp. 3437 -3438.

Lejeune, J. (1990) Pathogenesis of mental deficiency in trisomy 21. Am. J. Med. Genet., vol. 7 (suppl.), pp. 20 -30.

Levine, R.L. (1984) Mixed-function oxidation of histidine residues. Methods Enzymol., vol. 197B, pp. 370 -376.

Levine, R.L., Garland, D., Oliver, C.N., Amici, A., Climent, I., Lenz, A.-G., Ahn, B.-W., Shaltiel, S., and Stadtman, E.R. (1990) Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Methods Enzymol., vol. 186, pp. 464 - 478.

Li, Y.M., Steffes, M., Donnelly, T., Liu, C, Fuh, H, Basgen, J., Bucala, R., and Vlassara, H. (1996) Prevention of cardiovascular and renal pathology of aging by the advanced glycation inhibitor aminoguanidine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 93, pp. 3902 - 3907.

Lichko, P.L. and Okorokov, L.A. (1984) Some properties of membrane-bound, solubilized and reconstituted into liposomes H+-ATPase of vacuoles of Saccharomyces carlsbergensis. FEBS Lett., vol. 174, pp. 233.

Liochev, S.I. and Fridovich, I. (1994) The role of 02~* in the production of HO*: in vitro and in vivo. Free Radic. Biol. Med. vol. 16, pp. 29 - 33.

Lipinska, A. and Klyszejko-Stefanowicz, L. (1980) The activity of chromatin-bound protease extracted selectively with histone H2B from calf thymus and rat liver. Int. J. Biochem., vol. 11, pp. 299 - 303.

Lipman, R.D., Smith, D.E., Bronson, R.T., and Blumberg, J. (1995) Is late-life caloric restriction beneficial? Aging (Milano), vol. 7, no. 2, pp. 136 - 139.

Lipschitz, D.A. et al. (1988) The role of calcium in the age-related decline of neutrophil function. Blood, vol. 71, pp. 659-665.

Lipschitz, D.A., Udupa, K.B., Indelicato, S.R., and Das, M. (1991) Affect of age on second messenger generation in neutrophils. Blood, vol. 78, no. 5, pp. 1347 - 1354.

Lonnrot, K., Metsa-Ketela, T., and Alho, H. (1995) The role of coenzyme Q-10 in aging: a follow-up study on life-long oral supplementation Q-10 in rats. Gerontology, vol. 41, suppl. 2, pp. 109 - 120.

Lowry, JD.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., and Randall, R.J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., vol. 193, pp. 265 - 275.

Luft, R. and Landau, B.R. (1995) Mitochondrial medicine. J. Intern. Med., vol. 238, pp. 405 - 421.

Madesh, M. and Balasubramanian, K.A. (1997) Activation of liver mitochondrial phospholipase A2 by superoxide. Arch. Biochem. Biophys., vol. 346, no. 2, pp. 187 - 192.

Maguire, J.J., Wilson, D.S., and Packer, L. (1989) Mitochondrial electron transport-linked tocopheroxyl radical reduction. J. Biol. Chem., vol. 264, no. 36, pp. 21462 - 21465.

Marklund, S.L. (1990) Expression of extracellular superoxide dismutase by human cell lines. Biochem. J., vol. 266, pp. 213-219.

Martinez, M., Hernandez, A.I., Martinez, N., and Ferrandiz, M.L. (1996) Age-related increase in oxidized proteins in mouse synaptic mitochondria. Brain Res., vol. 731, no. 1-2, pp. 246 - 248.

Masaki, H., Okano, Yu., and Hiromu, S. (1997) Generation of active oxygen species from advanced glycation end-products (AGE) under ultraviolet light A (UVA) irradiation. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 235, pp. 306-310.

Masini, A., Ceccarelli, D., Gallesi, D., Giovannini, F., and Trenti, T. (1994) Lipid hydroperoxide induced mitochondrial dysfunction following acute ethanol intoxication in rats. The critical role for mitochondrial reduced glutathione. Biochem. Pharmacol., vol. 47, no. 2, pp. 217 - 224.

Massey, V., Strickland, S., Mayhew, S.G., Howell, L.G., Engel, P.C., Matthews, R.G., Schuman, M., and Sullivan, P.A. (1969) The production of superoxide anion radicals in the reaction of reduced flavins and flavoproteins with molecular oxygen. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 36, no. 6, pp. 891 - 897.

Masters, C.J. and Crane, D.I. (1995) On the role of peroxisome in ontogeny, ageing and degenerative disease. Mech. Ageing Dev., vol. 80, pp. 69-83.

McCall, T.B., Boughton-Smith, N., Palmer, R.M.J., Whittle, B.J.R., and Moncada, S. (1989) Synthesis of nitric oxide from L-arginine by neutrophils. Biochem. J., vol. 261, pp. 293 - 296.

McCord, J.M. (1985) Oxygen-derived free radicals in postischemic tissue injury. N. Engl. J. Med., vol. 312, no. 3, pp. 159- 163.

McLaughlin, B., O'Malley, K., and Cotter T.G. (1986) Age-related differences in granulocyte chemotaxis and degranulation. Clinical Science, vol. 70, pp. 59 - 62.

Meister, A. (1994) Glutathione - ascorbic acid antioxidant system in animals. J. Biol. Chem., vol. 269, pp. 9397 - 9400.

Melchiorri, D., Reiter, R.J., Attia, A.M., Hara, M., and Nistico, G. (1995) Potent protective effect of melatonin on in vivo paraquat-induced oxidative damage in rats. Life Sci., vol. 56, pp. 83 - 89.

Melov, S., Hinerfeld, D., Esposito, L., and Wallace, D.C. (1997) Multi-organ characterization of mitochondrial genomic rearrangements in ad libitum and caloric restricted mice show striking somatic mitochondrial DNA rearrangements with age. Nucleic Acids Res., vol. 25, no. 5, pp. 974 - 982.

Miller, Yu.I., Altamentova, S.M., and Shaklai, N. (1997) Oxidation of low-density lipoprotein by hemoglobin stems from a heme-initiated globin radical: antioxidant role of haptoglobin. Biochemistry, vol. 36, pp. 12189 -12198.

Miquel, J., Economos, A.C., Fleming, J., and Johnson, J.E. (1980) Mitochondrial role in cell ageing. Exp. Gerontol., vol. 15, pp. 575 - 591.

Miskin, R. and Masos, T. (1997) Transgenic mice overexpressing urokinase-type plasminogen activator in the brain exhibit reduced food consumption, body weight and size, and increased longevity. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci., vol. 52, no. 2, pp. B118 - B124.

Misra, H.P. (1974) Generation of superoxide free radical during the autoxidation of thiols. J. Biol. Chem., vol. 249, no. 7, pp. 2151 -2155.

Mitchell, J.B., Samuni, A., Krishna, M.C., DeGraff, W.G., Ahn, M.S., Samuni, U., and Russo, A. (1990) Biologically active metal-independent superoxide dismutase mimics. Biochemistry, vol. 29, no. 11, pp. 2802 -2807.

Mo, J.Q, Horn, D.G, and Andersen, J.K. (1995) Decreases in protective enzymes correlates with increased oxidative damage in the aging mouse brain. Mech. Ageing Dev., vol. 81, pp. 73 - 82.

Mohacsi, A, Fulop, T, Kozlovszky, B, Seres, I, and Leovey, A. (1992) Superoxide anion production and intracellular free calcium levels in resting and stimulated polymorphonuclear leukocytes obtained from healthy and arteriosclerotic subjects of various ages. Clin. Biochem, vol. 25, no. 4, pp. 285 - 288.

Monnier, V.M. (1990) Nonenzymic glycosylation, the Maillard reaction and the aging process. J. Gerontol. Biol. Sci, vol. 45, B105.

Monnier, V.M, Stevens, V.J, and Cerami, A. (1981) Maillard reactions involving proteins and carbohydrates in vivo: relevance to diabetes mellitus and aging. Progr. Food. Nutr. Sci, vol. 5, pp. 315 - 327.

Monnier, V.M, Vishwanath, V, Frank, K.E, Elmets, C.A, Dauchot, P., and Kohn, R.R. (1986) Relation between complications of type I diabetes mellitus and collagen-linked fluorescence. N. Engl. J. Med, vol. 314, pp. 403-408.

Mullarkey, C.J, Edelstein, D, and Brownlee, M. (1990) Free radical generation by early glycation products: a mechanism for accelerated atherogenesis in diabetes. Biochem. Biophys. Res. Commun, vol. 173, pp. 932 -939.

Muller, D.P.R. and Goss-Sampson, M.A. (1990) Neurochemical, neurophysiological and neuropathological studies in vitamin E deficiency. Crit. Rev. Neurobiol, vol. 5, pp. 239 - 255.

Muller-Hocker, J. (1990) Cytochrome c oxidase deficient fibres in the limb muscle and diaphragm of man without muscular disease: and age-related alteration. J. Neurol. Sci, vol. 100, pp. 14-21.

Munch, G, Thome, J, Foley, P, Schinzel, R, and Riederer, P. (1997) Advanced glycation endproducts in ageing and Alzheimer's disease. Brain Res. Rev, vol. 23, pp. 134 - 143.

Nagel, J.E, Pyle, R.S, Chrest, F.J, and Adler, W.H. (1982) Oxidative metabolism and bactericidal capacity of polymorphonuclear leukocytes from normal young and aged adults. J. Gerontol, vol. 37, no. 5, pp. 529 -534.

Nakahara, H, Kanno, T, Inai, Y, Utsumi, K, Hiramatsu, M, Mori, A, and Packer, L. (1998) Mitochondrial dysfunction in the senescence accelerated mouse (SAM). Free Radic. Biol. Med, vol. 24, no. 1, pp. 85 - 92.

Netto, L.E.S, Chae, H.Z, Kang, S.-W, Rhee, S.G, and Stadtman, E.R. (1996) Removal of hydrogen peroxide by thiol-specific antioxidant enzyme (TSA) is involved with its antioxidant properties. TSA possesses thiol peroxidase activity. J. Biol. Chem, vol. 271, no. 26, pp. 15315 - 15321.

Nishio, E, Arimura, S, and Watanabe, Y. (1996) Oxidized LDL induces apoptosis in cultured smooth muscle cells: a possible role for 7-ketocholesterol. Biochem. Biophys. Res. Commun, vol. 223, pp. 413 - 418.

Niwa, T, Katsuzaki, T, Ishizaki, Y, Hayase, F, Miyazaki, T, Uematsu, T, Tatemichi, N, and Takei, Y. (1997) Imidazolone, a novel advanced glycation end product, is present at high levels in kidneys of rats with streptozotocin-induced diabetes. FEBS Lett, vol. 407, pp. 297 - 302.

Niwa, Y, Ishimoto, K, and Kanoh, T. (1990) Induction of superoxide dismutase in leukocytes by paraquat: correlation with age and possible predictor of longevity. Blood, vol. 76, no. 4, pp. 835 - 841.

Niwa, Y, Kasama, T, Miyachi, Y, and Kanoh, T. (1989) Neutrophil chemotaxis, phagocytosis and " parameters of reactive oxygen species in human aging: cross-sectional and longitudinal studies. Life Sci, vol. 44, pp. 1655- 1664.

Njoroge, F.G. and Monnier, V.M. (1989) The chemistry of the Maillard reaction under physiological conditions: a review. In: The Maillard Reaction in Aging, Diabetes, and Nutrition. Alan R. Liss, Inc., 1989, pp. 85 - 107.

Nohl, H. and Jordan, W. (1986) The mitochondrial site of superoxide formation. Biochem. Biophys. Res. Commun, vol. 138, no. 2, pp. 533 - 539.

Oberley, L.W, Lindgren, A.L, Baker, S.A, and Stevens, R.H. (1976) Superoxide ion as the cause of the oxygen effect. Radiat. Res, vol. 68, pp. 320 - 328.

Odetti, P., Angelini, G., Dapino, D., Zaccheo, D., Garibaldi, S., Dagna-Bricarelli, F., Piombo, G., Perry, G., Smith, M., Traverso, N., and Tabaton, M. (1998) Early glycoxidation damage in brains from Down's syndrome. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 243, pp. 849 - 851.

O'Farrell, P.H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem., vol. 250, pp. 4007-4021.

Olafsdottir, K. and Reed D.J. (1988) Retention of oxidized glutathione by isolated rat liver mitochondria during hydroperoxide treatment. Biochim. Biophys. Acta, vol. 964, no. 3, pp. 377 - 382.

Oliver, C.N. (1987) Inactivation of enzymes and oxidative modification of proteins by stimulated neutrophils. Arch. Biochem. Biophys., vol. 253, no. 1, pp. 62 - 72.

Oliver, C.N., Ahn, B.W., Moerman, E.J., Goldstein, S., and Stadtman, E.R. (1987) Age-related changes in oxidized proteins. J. Biol. Chem., vol. 262, pp. 5488 - 5491.

Orgel, L.E. (1963) The maintenance of the accuracy of protein synthesis and its relevance to ageing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 49, pp. 517 - 521.

Orlowski, M. (1990) The multicatalytic proteinase complex, a major extralysosomal proteolytic system. Biochemistry, vol. 29, no. 45, pp. 10289 - 10297.

Orr, W.C. and Sohal, R.S. (1994) Extension of life span by overexpression of superoxide dismutase and catalase in Drosophila melanogaster. Science, vol. 263, pp. 1128 - 1130.

Ossanna, P.J., Test, S.T., Matheson, N.R., Regiani, S., and Weiss, S.J. (1986) Oxidative regulation of neutrophil elastase-alpha-1 -proteinase inhibitor interaction. J. Clin. Invest., vol. 77, pp. 1939- 1951.

Ottnad, E., Parthasarathy, S., Sambrano, G.R., Ramprasad, M.P., Quehenberger, O., Kondratenko, N., Green, S., and Steinberg, D. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 92, pp. 1391 - 1395.

Oxenburgh, M.S. and Snoswell, A.M. (1965) Use of streptomycin in the separation of nucleic acids from protein in a bacterial extract. Nature, vol. 207, pp. 1416 - 1417.

Ozawa, T. (1995) Mitochondrial DNA mutations associated with aging and degenerative diseases. Experimental Gerontology, vol. 3, nos. 3/4, pp. 269 - 290.

Paciflci, R.E., Salo, D.C., and Davies, K.J.A. (1989) Macrooxyproteinase (MOP): a 670 kDa proteinase that degrades oxidatively denatured proteins in red blood cells. Free Rad. Biol. Med., vol. 7, pp. 521 - 536.

Palinski, W, Rosenfeld, M.E., Yla-Herttuala, S., Gurtner, G.C., Socher, S.S., Butler, S.W., Parthasarathy, S., Carew, Т.Е., Steinberg, D., and Witztum, J.L. (1989) Low density lipoprotein undergoes oxidative modification in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, pp. 1372 - 1376.

Paradies, G., Ruggiero, F.M., Petrosillo, G., and Quagliariello, E. (1997) Age-dependent decline in the cytochrome с oxidase activity in rat heart mitochondria: role of cardiolipin. FEBS Lett., vol. 406, no. 1-2, pp. 136 - 138.

Paz, M.A., Baynes, J.W., Frei, В., Schweiger, M., Sohal, R.S., Stadtman, E.R., Stahl, U., Swartz, H.M., Thorpe, S.R., and Yu, B.P. (1995) Group report: do research findings from diverse model systems support oxidative damage theories of aging? Molecular Aspects of Aging. Ed. by K. Esser and G.M. Martin. John Wiley & Sons Ltd., pp.144 - 161.

Perez Campo, R., Lopez Torres, M., Cadenas, S., Rojas, C., and Barja, G. (1998) The rate of free radical production as a determinant of the rate of aging: evidence from the comparative approach. J. Сотр. Physiol. [B], vol. 168, no. 3, pp. 149- 158.

Perly, В., Smith, I.C., Hughes, L., Burton, G.W., and Ingold, K.U. (1985) Estimation of the location of natural alpha-tocopherol in lipid bilayers by 13C-NMR spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta, vol. 819, no. 1, pp. 131-135.

Perskin, M.H. and Cronstein B.N. (1992) Age-related changes in neutrophil structure and function. Mech. Ageing Dev., vol. 64, pp. 303 - 313.

Petkau, A. (1988) Protection of bone marrow progenitor cells by superoxide dismutase. Mol. Cell. Biochem., vol. 84, pp. 133- 140.

Pieri, C., Marra, M., Moroni, F., Recchioni, R., and Marcheselli, F. (1994) Melatonin: a peroxyl radical scavenger more effective than vitamin E. Life Sci,, vol. 55, no. 15, pp. 271 - 276.

Pierpaoli, W. and Regelson, W. (1994) Pineal control of aging: effects of melatonin on aging mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, pp. 787-791.

Pirillo, A., Jacoviello, C., Longoni, C., Radaelli, A., and Catapano, A.L. (1997) Simvastatin modulates the heat shock response and cytotoxicity mediated by oxidized LDL in cultured human endothelial smooth muscle cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 231, pp. 437 - 441.

Podhaisky, H.-P., Abate, A., Polte, T., Oberle, S., and Schroder, H. (1997) Aspirin protects endothelial cells from oxidative stress - possible synergism with vitamin E. FEBS Lett., vol. 417, pp. 349 - 351.

Pongor, S., Ulrich, P.C., Bencsath, F.A., and Cerami, A. (1984) Aging of proteins: Isolation and identification of a fluorescent chromophore from the reaction of polypeptides with glucose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, pp. 2684-2688.

Poulin, J.E., Cover, C., Gustafson, M.R., and Kay, M.M.B. (1996) Vitamin E prevents oxidative modification of brain and lymphocyte band 3 proteins during aging. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 93, pp. 5600 - 5603.

Radi, R., Rodriguez, M., Castro, L., and Telleri, R. (1994) Inhibition of mitochondrial electron transport by peroxynitrite. Arch. Biochem. Biophys., vol. 308, no. 1, pp. 89 - 95.

Ravindranath, V. and Reed, D.J. (1990) Glutathione depletion and formation of glutathione-protein mixed disulfide following exposure of brain mitochondria to oxidative stress. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 169, pp. 1075- 1079.

Reiter, R.J. (1992) The aging pineal gland and its physiological consequences. BioEssays, vol. 14, pp. 169 -175.

Reiter, R.J. (1995) Oxidative processes and antioxidative defense mechanisms in the aging brain. FASEB J., vol. 9, pp. 526-533.

Requena, J.R., Fu, M.X., Ahmed, M.U, Jenkins, A.J., Lyons, T.J., Baynes, J.W., and Thorpe, S.R. (1997) Quantification of malondialdehyde and 4-hydroxynonenal adducts to lysine residues in native and oxidized human low-density lipoprotein. Biochem. J., vol. 322, pp. 317 - 325.

Reznick, A.Z., Cross, C.E., Hu, M.-L., Suzuki, Y.J., Khwaja, S., Safadi, A., Motchnik, P.A., Packer, L., and Halliwell, B. (1992) Modification of plasma proteins by cigarette smoke as measured by protein carbonyl formation. Biochem. J., vol. 286, pp. 607 - 611.

Rikans, L.E. and More, D.R. (1988) Effect of aging on aqueous-phase antioxidants in tissues of male Fischer rats. Biochim. Biophys. Acta, vol. 966, pp. 269 - 275.

Rivett, A.J. and Hare, J.F. (1986) Mixed-function oxidation of glutamine synthetase leads to its rapid degradation in vitro and after fusion-mediated injection into hepatoma cells. Biochem. Soc. Trans., vol. 14, pp. 643 - 644.

Rock, K.I., Gramm, C., Rothstein, L., Clark, K., Stein, R., Dick, L., Hwang, D., and Goldberg, A.L. (1994). Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell, vol. 78, pp. 761 - 771.

Roseman, J.E. and Levine, R.L. (1987) Purification of a protease from Escherichia coli with specificity for oxidized glutamine synthetase. J. Biol. Chem., vol. 262, no. 5, pp. 2101 - 2110.

Rottenberg, H. and Wu, S. (1997) Mitochondrial dysfunction in lymphocytes from old mice: enhanced activation of the permeability transition. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 240, no. 1, pp. 68 - 74.

Saez, G.T., Vails, V., Muniz, P., Perez-Broseta, C., Iradi, A., Oliva, M.R., Bannister J.V., and Bannister, W.H. (1993) The role of glutathione in protection against DNA damage induced by rifamycin SV and copper(II) ions. Free Radic. Res. Commun., vol. 19, no. 2, pp. 81 - 92.

Sahakian, J.A., Szweda, L.I., Friguet, B., Kitani, K., and Levine, R.L. (1995) Aging of the liver: proteolysis of oxidatively modified glutamine synthetase. Arch. Biochem. Biophys., vol. 318, pp. 411 - 417.

Sakai, M., Miyuazaki, A., Hakamata, H., Kodama, T., Suzuki, H., Kobori, S., Shichiri, M., and Horiuchi, S. (1996) The scavenger receptor serves as a route for internalization of lysophosphatidylcholine in oxidized low density lipoprotein - induced macrophage proliferation. J. Biol. Chem., vol. 271, no. 44, pp. 27346 - 27352.

Sambrano, G.K and Steinberg, D. (1995) Recognition of oxidatively damaged and apoptotic cells by an „ oxidized low density lipoprotein receptor on mouse peritoneal macrophages: Role of membrane phosphatidylserine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 92, pp. 1396- 1400.

Santa Maria, C., Revilla, E., Ayala, A., de la Cruz, C.P., and Machado, A. (1995) Changes in the histidine residues of Cu/Zn superoxide dismutase during aging. FEBS Lett., vol. 374, pp. 85 - 88.

Satoh, H., Togo, M., Hara, M., Miyata, T., Han, K., Maekawa, H., Ohno, M., Hashimoto, Y., Kurokawa, K., and Watanabe, T. (1997) Advanced' glycation endproducts stimulate mitogen-activated protein kinase and proliferation in rabbit vascular smooth muscle cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 239, pp. Ill -115.

Savill, J.S., Wyllie, A.H., Henson, J.E., Walport, M.J, Henson, P.M., and Haslett, C. (1989) Macrophage phagocytosis of aging neutrophils in inflammation: programmed cell death in the neutrophil leads to its recognition by macrophages. J. Clin. Invest, vol. 83, pp. 865 - 875.

Sawada, M. and Carlson, J.C. (1990) Biochemical changes associated with the mechanism controlling superoxide radical formation in the aging rotifer. J. Cell. Biochem, vol. 44, pp. 153 - 165.

Scarpa, M, Rigo, A, Maiorino, M, Ursini, F, and Gregolin, C. (1984) Formation of alpha-tocopherol radical and recycling of alpha-tocopherol by ascorbate during peroxidation of phosphatidylcholine liposomes. An electron paramagnetic resonance study. Biochim. Biophys. Acta, vol. 801, pp. 215-219.

Schnider, S. and Kohn, R.R. (1981) Effects of age and diabetes mellitus on the solubility and nonenzymatic glucosylation of human skin collagen. J. Clin. Invest, vol. 67, pp. 1630 - 1635.

Sebekova, K, Schinzel, R, Ling, H, Simm, A, Xiang, G, Gekle, M, Munch, G, Vamvakas, S, and Heidland, A. (1998) Advanced glycated albumin impairs protein degradation in the kidney proximal tubules cell line LLC-PK1. Cell. Mol. Biol. (Noisy-Le-Grand), vol. 44, no. 7, pp. 1051 - 1060.

Seifter, E, Rettura, G, Padawer, J, Stratford, F, Weinzweig, J, Demetriou, A.A, and Levenson, S.M. (1984) Morbidity and mortality reduction by supplemental vitamin A or beta-carotene in CBA mice given total-body gamma-radiation. J. Natl. Cancer Inst, vol. 73, no. 5, pp. 1167 - 1177.

Sell, D.R. and Monnier, V.M. (1989) Structure elucidation of a senescence cross-link from human extracellular matrix. Implication of pentoses in the aging process. J. Biol. Chem, vol. 264, no. 36, pp. 21597 — 21602.

Selvaraj, R.J, Paul, B.B, Strauss, R.R, Jacobs, A.A, and Sbarra, A.J. (1974) Oxidative peptide cleavage and decarboxylation by MPO-peroxide anti-microbial system. Infect. Immunol, vol. 9, pp. 255 - 260.

Shan, X, Jones, D.P, Hashmi, M, and Anders, M.W. (1993) Selective depletion of mitochondrial glutathione concentrations by (R,S)-3-hydroxy-4-pentenoate potentiates oxidative cell death. Chem. Res. Toxicol, vol. 6, no. 1, pp. 75-81.

Shang, F, Gong, X, Palmer, H.J, Nowell, T.R. Jr., and Taylor, A. (1997) Age-related decline in ubiquitin conjugation in response to oxidative stress in the lens. Exp. Eye Res, vol. 64, no. 1, pp. 21 - 30.

Shapiro, R, McManus, M.J, Zalut, C, and Bunn, H.F. (1980) Sites of nonenzymatic glycosylation of human hemoglobin A. J. Biol. Chem, vol. 255, no. 7, pp. 3120 - 3127.

Sheldon, W.G, Bucci, T.J, Hart, R.W, and Turturro, A. (1995) Age-related neoplasia in a lifetime study of ad libitum-fed and food-restricted B6C3F1 mice. Toxicol. Pathol, vol. 23, no. 4, pp. 458 - 476.

Shibatani, T, Nazir, M, and Ward, W.F. (1996) Alteration of rat liver 20S proteasome activities by age and food restriction. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci, vol. 51, no. 5, pp. B316-B322.

Shigenaga, M.K., Hagen, T.M., and Ames, B.N. (1994) Oxidative damage and mitochondrial decay in aging. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, pp. 10771 - 10778.

Shull, S., Heintz, N.H., Periasamy, M., Manohar, M., Janssen, Y.M., Marsh, J.P., and Mossman, B.T. (1991) Differential regulation of antioxidant enzymes in response to oxidants. J. Biol. Chem., vol. 266, pp. 24398 -24403.

Sies, H. (1993) Strategies of antioxidant defense. Eur. J. Biochem., vol. 215, pp. 213 - 219.

Signorini, C., Ferrali, M., Ciccoli, L., Sugherini, L., Magnani, A., and Comporti, M. (1995) Iron release, membrane protein oxidation and erythrocyte ageing. FEBS Lett., vol. 362, pp. 165 - 176.

Slivka, A., Spina, M.B., and Cohen, G. (1987) Reduced and oxidized glutathione in human and monkey brain. Neurosci. Lett., vol. 74, pp. 112-118.

Smedly, L.A., Tonnesen, M.G., Sandhaus, R.A., Haslett, C., Guthrie, L.A., Johnston, Jr, R.B., Henson, P.M., and Worthen, G.S. (1986) Neutrophil-mediated injury to endothelial cells. Enhancement by endotoxin and essential role of neutrophil elastase. J. Clin. Invest., vol. 77, pp. 1233 - 1243.

Sohal, R.S. and Dubey, A. (1994) Mitochondrial oxidative damage, hydrogen peroxide release, and aging. Free Radical Biol, and Med., vol. 16, pp. 621 - 626.

Sohal, R.S., Agarwal, S., and Orr, W.C. (1995) Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster. J. Biol. Chem., vol. 270, no. 26, pp. 15671 - 15674.

Sohal, R.S., Agarwal, S., and Sohal, B.H. (1995a) Oxidative stress and aging in the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Mech. Ageing Dev., vol. 81, pp. 15 - 25.

Sohal, R.S., Agarwal, S., Dubey, A., and Orr, W.C. (1993) Protein oxidative damage is associated with life expectancy of houseflies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, pp. 7255 - 7259.

Sohal, R.S., Ku, H.H., Agarwal, S., Forster, M.J., and Lai, H. (1994) Oxidative damage, mitochondrial oxidant generation and antioxidant defenses during aging and in response to food restriction in the mouse. Mech. Ageing Dev., vol. 74, no. 1-2, pp. 121 -133.

Stadtman, E.R. (1993) Oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins by radiolysis and by metal-catalyzed reactions. Annu. Rev. Biochem., vol. 62, pp. 797 - 821.

Stadtman, E.R. (1995) The status of oxidatively modified proteins as a marker of aging. In: Esser, K.; Martin, G.M., eds. Molecular Aspects of Aging. Chichester: John Wiley and Sons Ltd., pp. 129 - 143.

Stafford, R.E., Mak, I.T., Kramer, J.H., and Weglicki, W.B. (1993) Protein oxidation in magnesium deficient rat brains and kidneys. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 196, no. 2, pp. 596 - 600.

Stampfer, M.J., Hennekens, C.H., Mason, J.E., Colditz, G.A., Rosner, B., and Willett, W.C. (1993) Vitamin E consumption and the risk of coronary disease in women. N. Engl. J. Med., vol. 328, pp. 1444 - 1449.

Starke-Reed, P.E. and Oliver, C.N. (1989) Protein oxidation and proteolysis during aging and oxidative stress. Arch. Biochem. Biophys., vol. 275, pp. 559 - 567.

Stevens, V.J., Rouzer, C.A., Monnier, V.M., and Cerami, A. (1978) Diabetic cataract formation: potential role of glycosylation of lens crystallins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 75, no. 6, pp. 2918 - 2922.

Stocker, R., Bowry, V.W., and Frei, B. (1991) Ubiquinol-10 protects human low density lipoprotein more efficiently against lipid peroxidation than does alpha-tocopherol.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 88, pp. 1646 - 1650.

Strack, P.R., Waxman, L., and Fagan, J.M. (1996) Activation of the multicatalytic endopeptidase by oxidants. Effects on enzyme structure. Biochemistry, vol. 35, no. 22, pp. 7142 - 7149.

Sun, Y.P., Zhu, B.Q., Sievers, R.E., Norkus, E.P., Parmley, W.W, and Deedwania, P.C. (1998) Effects of antioxidant vitamins C and E on atherosclerosis in lipid-fed rabbits. Cardiology, vol. 89, no. 3, pp. 189 - 194.

Suzuki, H., DeLano, F.A., Parks, D.A., Jamshidi, N., Granger, D.N., Ishii, H., Suematsu, M., Zweifach, B.W., and Schmid Schnonbein, G.W. (1998) Xanthine oxidase activity associated with arterial blood pressure in spontaneously hypertensive rats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 95, no. 8, pp. 4754-4759.

Szilard, L. (1959) Nature, vol. 184, pp. 958 - 960.

Takasawa, M., Hayakawa, M., Sugiyama, S., Hattori, K., Ito, T., and Ozawa, T. (1993) Age-associated damage in mitochondrial function in rat hearts. Exp. Gerontol., vol. 28, no. 3, pp. 269 - 80.

Takata, K., Horiuchi, S., Araki, N., Shiga, M., Saitoh, M., and Morino, Y. (1988) Endocytic uptake of non-enzymatically glycosylated proteins is mediated by a scavenger receptor for aldehyde-modified proteins. J. Biol. Chem., vol. 263, no. 29, pp. 14819 - 14826.

Takemoto, L.J. (1996) Oxidation of cysteine residues from alpha-A crystallin during cataractogenesis of the human lens. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 223, pp. 216 - 220.

Thomas, E.L., Learn, D.B., Jefferson, M.M., and Weatherred, W. (1988) Superoxide-dependent oxidation of extracellular reducing agents by isolated neutrophils. J. Biol. Chem., vol. 263, no. 5, pp. 2178 - 2186.

Thomas, R.M., Nauseef, W.M, Iyer, S.S., Peterson, M.W., Stone, P.J, and Clark, R.A. (1991) J. Leukocyte Biol, vol.5, pp. 568-579.

Tian, L, Cai, Q, Bowen, R, and Wei, H. (1995) Effects of caloric restriction on age-related oxidative modifications of macromolecules and lymphocyte proliferation in rats. Free Radic. Biol. Med, vol. 19, no. 6, pp. 859-865.

Tolmasoff, J.M, Ono, T, and Cutler, R.G. (1980) Superoxide dismutase: correlation with life-span and specific metabolic rate in primate species. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 77, no. 5, pp. 2777 - 2781.

Turrens, J.F. and Boveris, A. (1980) Generation of superoxide anion by the NADH oxidase of bovine heart mitochondria. Biochem. J, vol. 191, pp. 421 -427.

Twinning, S.S. (1984) Fluorescein isothiocyanate-labeled casein assay for proteolytic enzymes. Anal. Biochem, vol. 143, pp. 30 - 34.

Twining, S.S, Schulte, D.P, Wilson, P.M., Zhou, X, Fish, B.L, and Moulder, J.E. (1996) Neutrophil catepsin G is specifically decreased under vitamin A deficiency. Biochim. Biophys. Acta, vol. 1317, pp. 112118.

Upton, A.C. (1957) Ionizing radiation and the aging process: a review. J. Gerontol, vol. 12, pp. 306 - 313.

Urano, S.U, Asai, Y, Makabe, S, Matsuo, M, Izumiyama, N, Ohtsubo, K, and Endo, T. (1997) Oxidative injury of synapse and alteration of antioxidative defense systems in rats, and its prevention by vitamin E. Eur. J. Biochem, vol. 245, pp. 64 - 70.

Ursini, M.V, Parrella, A, Rosa, G, Salzano, S, and Martini, G. (1997) Enhanced expression of glucoses-phosphate dehydrogenase in human cells sustaining oxidative stress. Biochem. J, vol. 323, pp. 801 -806.

Ushakova, T, Melkonyan, H, Nikonova, L, Gogvadze, B, Gaziev, A, and Bradbury, R. (1996) The effect of dietary supplements on gene expression in mice tissue. Free Radical Biol, and Med, vol. 20, pp. 279-284.

Videla, L.A. (1983) Assessment of the scavenging action of reduced glutathione, (+)-cyanidanol-3 and ethanol by the chemiluminescent response of the xanthine oxidase reaction. Experientia, vol. 39, no. 5, pp. 500 - 502.

Vishwanath, V, Frank, K.E, Elmets, C.A, Dauchot, P.J, and Monnier, V.M. (1986) Glycation of skin collagen in type I diabetes mellitus. Correlation with long-term complications. Diabetes, vol. 35, pp. 916 — 921.

Vitek, M.P, Bhattacharya, K, Glendening, J.M, Stopa, E, Vlassara, H, Bucala, R, Manogue, K, and Cerami, A. (1994) Advanced glycation end products contribute to amyloidosis in Alzheimer disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, pp. 4766 - 4770.

Vlassara, H, Brownlee, M, and Cerami, A. (1984) Accumulation of diabetic rat peripheral nerve myelin by macrophages increases with the presence of advanced glycosylation endproducts. J. Exp. Med, vol. 160, p. 197-207.

Vlassara, H, Brownlee, M, and Cerami, A. (1981) Nonenzymatic glycosylation of peripheral nerve protein in diabetes mellitus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 78, no. 8, pp. 5190 - 5192.

Vlassara, H, Valinsky, J, Brownlee, M, Cerami, C, Nishimoto, S, and Cerami, A. (1987) Advanced glycosylation endproducts on erythrocyte cell surface induce receptor-mediated phagocytosis by macrophages. J. Exp. Med, vol. 166, pp. 539 - 549.

Walford R.L. (1974) Immunologic theory of aging: current status. Fed. Proc, vol. 33, no. 9, pp. 2020-2027.

Ward, P.A. (1991) Mechanisms of endothelial cell killing by H2O2 or products of activated neutrophils. Amer. J. Medicine, vol. 91, S3C, S89 - S94.

Watanabe, H, Hattori, S, Katsuda, S, Nakanishi, I, and Nagai, Y. (1990) Human neutrophil elastase: degradation of basement membrane components and immunolocalization in the tissue. J. Biochem, vol. 108, pp. 753 -759.

Watanabe, N, Inoue, M, and Morino, Y. (1989) Inhibition of postischemic reperfusion arrhythmias by an SOD derivative that circulates bound to albumin with prolonged in vivo half-life. Biochem. Pharmacol, vol. 38, no. 20,pp. 3477-3483.

Wei, Y.H, Kao, S.H, and Lee, H.C. (1996) Simultaneous increase of mitochondrial DNA deletions and lipid peroxidation in human aging. Ann. N. Y. Acad. Sci, vol. 786, pp. 24 - 43.

Weindruch, R. and Walford, R.L. (1982) Dietary restriction in mice beginning at 1 year of age: effect on lifespan and spontaneous cancer incidence. Science, vol. 215, no. 4538, pp. 1415 - 1418.

Weiss, S.J. (1980) The role of superoxide in the destruction of erythrocyte targets by human neutrophils. J. Biol. Chem, vol. 255, no. 20, pp. 9912 - 9917.

Weiss, S.J. (1989) Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med, vol. 320, no. 6, pp. 365 - 375.

Weitzman, S.A—andLGordon, L.I. XI990) Inflammation and cancer. Role of phagocyte-generated oxidants in, — carcinogenesis. Blood, vol. 76, pp. 655 - 663.

Wells-Knecht, K.J, Zyzak, D.V, Litchfield, J.E, Thorpe, S.R, and Baynes, J.W. (1995) Mechanism of autooxidative glycosylation: identification of glyoxal and arabinose as intermediates in the autoxidative modification of proteins by glucose. Biochemistry, vol. 34, pp. 3702 - 3709.

Whisler, R.L, Chen, M, Beiqing, L, and Carle, K.W. (1997) Impaired induction of c-fos/c-jun genes and of transcriptional regulatory proteins binding distinct c-fos/c-jun promoter elements in activated human T cells during aging. Cell. Immunol, vol. 175, no. 1, pp. 41 - 50.

Whiteman, M. and Halliwell, B. (1996) Protection against peroxynitrite-dependent tyrosine nitration and alpha 1-antiproteinase inactivation by ascorbic acid. A comparison with other biological antioxidants. Free Radical Res, vol. 25, pp. 275 -283.

Whyte, M.K.B, Meagher, L.C, MacDermot, J, and Haslett, C. (1993) Impairment of function in aging neutrophils is associated with apoptosis. J. Immunol, vol. 150, no. 11, pp. 5124 - 5134.

Wieland, P. and Lauterburg, B.H. (1995) Oxidation of mitochondrial proteins and DNA following administration of ethanol. Biochem. Biophys. Res. Commun, vol. 213, no. 3, pp. 815 - 819.

Witztum, J.L, Steinbrecher, U.P, Kesaniemi, Y.A, and Fisher, M. (1984) Autoantibodies to glucosylated proteins in the plasma of patients with diabetes mellitus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, pp. 3204 - 3208.

Wolff, S.P. and Dean, R.T. (1986) Fragmentation of proteins by free radicals and its effect on their susceptibility to enzymic hydrolysis. Biochem. J, vol. 234, pp. 399 - 403.

Wu, V.-Y. and Cohen, M.P. (1994) Receptors specific for Amadori-modified glycated albumin on murine endothelial cells. Biochem. Biophys. Res. Commun, vol. 198, no. 2, pp. 734 - 739.

Yan, L.-J, Levine, R.L, and Sohal, R.S. (1997) Oxidative damage during aging targets mitochondrial aconitase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, pp. 11168 - 11172.

Yelinova, V., Glazachev, Yu., Khramtsov, V., Kudryuashova, L., Rykova, V., and Salganik, R. (1996) Studies of human and rat blood under oxidative stress: changes in plasma thiol level, antioxidant enzyme activity, protein carbonyl content, and fluidity of erythrocyte membrane. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 221, pp. 300 - 303.

Yoshida, K., Inoue, T., Nojima, K., Hirabayashi, Y., and Sado, T. (1997) Calorie restriction reduces the incidence of myeloid leukemia induced by a single whole-body radiation in C3H/He mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, no. 6, pp. 2615 -2619.

Yoshino, H., Hattori, N., Urabe, T., Uchida, K., Tanaka, M., and Mizuno, Y. (1997) Postischemic accumulation of lipid peroxidation products in the rat brain: immunohistochemical detection of 4-hydroxy-2-nonenal modified proteins. Brain Research, vol. 767, pp. 81 - 86.

Youngman, L.D., Park, J.Y.K., and Ames, B.N. (1992) Protein oxidation associated with aging is reduced by dietary restriction of protein or calories. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, pp. 9112 - 9116.

Yu, B.P:, Masoro; E.J., Murata, E.J., Bertrand, H.A., and Lynd, F.T. (1982) Life span study of SPF Fischer " 344 male rats fed ad libitum or restricted diets: longevity, growth, lean body mass and disease. J. Gerontol., vol. 37, pp. 130-141.

Zaman, Z., Roche, S., Fielden, P., Frost, P.G., Niriella, D.C., and Cayley, A.C.D. (1992) Plasma concentrations of vitamins A and E and carotenoids in Alzheimer's disease. Age and Ageing, vol. 21, pp. 91 -94.

Zhang, X.M. and Ellis, E.F. (1990) Superoxide dismutase reduces permeability and edema induced by hypertension in rats. Am. J. Physiol., vol. 259, no. 2, pt. 2, pp. H497 - H503.

Zhang, Y., Marcillat, O., Giulivi, C., Ernster, L., and Davies, K.J.A. (1990) The oxidative inactivation of mitochondrial electron transport chain components and ATPase. J. Biol. Chem., vol. 265, pp. 16330 - 16336.

Ziegler, D.M. (1985) Role of reversible oxidation-reduction of enzyme thiol-disulfides in metabolic regulation. Annu. Rev. Biochem., vol. 54, pp. 305 - 329.

Zozulinska, D.A., Wierusz-Wysocka, B., Wysocki, H., Majchrzak, A.E., Wykretowicz, A. (1996) The influence of insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) duration on superoxide anion and hydrogen peroxide production by polymorphonuclear neutrophils. Diabetes Research and Clinical Practice, vol. 33, pp. 139 -144.

Приношу искреннюю благодарность моим научным руководителям д.б.н., проф. Газиеву А. И. и к.б.н. Садовникову В.Б. за постоянное внимание к моей работе и ценные критические замечания при обсуждении планов и результатов экспериментов, которые были учтены мной при написании диссертации. Хочу также поблагодарить моих коллег по НПП "Биоцентр" ФИБХ РАН Сухарева С.А., Мошникову А.Б., Рассказову Е.А., Ситикову В.А. и Зимину М.В. за участие в работе, а также сотрудников лаборатории радиационной молекулярной биологии ИТЭБ РАН Куцего М.П. и Кузнецову Е.А. за помощь в проведении ряда экспериментов. Выражаю признательность проф. I. ЕеАсоукз (Институт иммунологии, Базель, Швейцария) за научное сотрудничество и техническую помощь. Особо хочется поблагодарить моих родителей Кублик Л.Н. и Цветкова В.Д. за интерес к моей работе и создание благоприятных условий для плодотворной работы над диссертацией.