Кариология штаммов Agaricus bisporus (Lange) Imbach с разными типами жизненного цикла тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.24, кандидат биологических наук Волкова, Вера Николаевна

• Волкова, Вера Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Волкова, Вера Николаевна

Введение

Обзор литературы

Жизненный цикл высших грибов

Общая характеристика

Монокариотическое плодоношение

Особенности жизненного цикла Agaricus bisporus

Вегетативный мицелий и плодовые тела

Гипотеза о постоянной задержке мейоза

Соматическая рекомбинация

Природные четырехспоровые популяции Agaricus bisporus

Три разновидности Agaricus bisporus

Окрашивание ядер

Ядерные флуорохромы

Методы количественного определения ДНК

Окрашивание DAPI ядерной ДНК у грибов

Материалы и методы

Штаммы

Получение мицелия и плодовых тел

Поведение ядер

Окрашивание препаратов

Метод НС1-Гимза

Метод Фельгена

Просмотр препаратов

Количество ядерной ДНК

Окрашивание препаратов

Метод Фельгена

Метод окрашивания с помощью реактива DAPI

Просмотр препаратов

Электронная микроскопия

Результаты и их обсуждение

Поведение ядер в вегетативном мицелии

Размер интерфазных ядер

Количество ядер в клетках

Ядерно-плазменное отношение (ЯПО)

Амитоз и миграция ядер

Поведение ядер в гимении плодового тела

Субгимениальные клетки

Размер и положение ядер

Сравнение двух методов окрашивания ядер

Морфогенез базидий

Постмейотический митоз

Типы ориентации веретен второго деления

Среднее количество спор на базидии

Количественное определение ядерной ДНК

Электронная микроскопия

Реконструкция жизненных циклов

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кариология штаммов Agaricus bisporus (Lange) Imbach с разными типами жизненного цикла»

Agaricus bisporus (Lange) Imbach - активно культивируемый вид, промышленное выращивание которого было начато во Франции три века назад, а сто лет назад достигло и Северной Америки (Xu et al., 1997). Не так давно начаты исследования, показавшие, что по питательной и медицинской ценности шампиньон сопоставим с такими известными в медицине грибами как шиитаке и вешенка (Beelman et al., 2004).

К середине 90-х годов в научной литературе накопилось значительное количество данных, свидетельствующих о разнообразии типов жизненного цикла A bisporus (Callac, 1995; Kerrigan, 1995; Kerrigan et al., 1995; Xu et al., 1997; Moquet, 1998), что позволило отнести его к группе амфиталличных видов. Амфиталлизм у грибов определяется ядерным статусом спор, которые могут нести как однотипные, так и различающиеся по локусу типа спаривания ядра. На данный момент в пределах вида существуют три разновидности, различающиеся по жизненным циклам, размерам спор, среднему числу спор на базидии и некоторым характеристикам ITS полиморфизма (Callac et al., 2003). Постоянно появляются новые штаммы A. bisporus, как дикие, так и полученные в лаборатории, требующие всестороннего изучения их онтогенеза - в том числе и с точки зрения цитологии, - что давало бы возможность более эффективно влиять на выведение новых сортов.

Не менее важно для исследования особенностей жизненного цикла и поведение ядерного аппарата в вегетативной стадии развития гриба, но цитологических работ, затрагивающих этот вопрос еще не так много (Evans, 1956, 1959; Saksena et al., 1976; Hou, Elliott, 1978; Heath et al., 1995; Камзолкина, 1996).

Обзор литературы

A. bisporus - широко культивируемый амфиталличный базидиаль-ный гриб, относящийся к порядку Agaricales группы гименомицетов. Характерными особенностями данного вида является отсутствие пряжек на гетерокариотическом мицелии и многоядерность клеток вегетативного мицелия.

Жизненный цикл высших грибов

Общая характеристика

Жизненный цикл у подавляющего большинства высших базиди-альных грибов включает три фазы: гаплофазу, дикариофазу и диплофа-зу. Базидиоспора прорастает вегетативным мицелием, каждая клетка которого содержит одно ядро, - монокарион. У многих видов дальнейшее развитие нуждается в спаривании совместимых штаммов, которое ведет к образованию дикариона. У этих видов гаплофаза может существовать неопределенное время. Дикариофаза представлена клетками, содержащими по два ядра. Этот дикариотический мицелий, хотя и может оставаться в вегетативном состоянии неопределенное время, является предпосылкой к половой репродукции. Как правило, только дикариотический мицелий продуцирует специализированные клетки (базидии), в которых происходит кариогамия и мейоз.

Кариогамия ведет к короткой диплофазе, и мейоз происходит почти сразу после слияния ядер; постмейотические ядра поступают в бази-диоспоры, которые образуются экзогенно на базидии. После чего бази-диоспоры распространяются и образуют монокариотический мицелий.

У некоторых видов слияние гаплоидных ядер ведет к стабильному диплоидному состоянию, образующему вегетативный мицелий. Таков жизненный цикл японских штаммов осеннего опенка Armillaria mellea (Ota et al., 1998), у которых моноспоровые изоляты формируют зрелые плодовые тела. Молодые базидии этого вида образуются без помощи пряжек, и каждая клетка содержит по одному ядру (содержание ДНК -2с). После мейоза в базидии образуется четыре гаплоидных ядра, которые в процессе формирования базидиоспор попарно сливаются в диплоидные ядра. Каждое такое ядро мигрирует в спору, где проходит через митотическое деление, и в некоторых случаях одно из ядер мигрирует обратно в базидию. Таким образом, образуются безъядерные, одно- и двуядерные споры (в одно- и двуядерных спорах ядра были диплоидными).

У высших грибов переход от гаплофазы через дикариофазу к половому размножению может проходить по-разному: без спаривания с другим мицелием (гомоталлизм) и только после спаривания (гетероталлизм). Из литературы известно, что для самостерильных моноспоровых культур характерен нетипично медленный рост с отсутствием воздушного мицелия, больший угол отхождения боковых ответвлений и более толстые гифы (Kligman, 1943; Камзолкина, 1996). Видимо, у гомокарио-нов нарушен строгий баланс между синтетическими и литическими процессами (в отличие от гетерокарионов), происходящими в клетке и участвующими в биосинтезе клеточной стенки, что приводит к усилению ветвления, изменению угла бокового ветвления и утолщению клеточной стенки.

Многие двуспоровые виды (например, Coprinus bilanatus (Ross, Margalith, 1987), двуспоровые формы видов Galera tenera (= С. sassii) и С. ephemerus (Sass, 1929)), а в том числе и A. bisporus, обнаруживают псевдогомоталлизм, или вторичный гомоталлизм (Raper et al., 1972). При вторичном, или гетерокариотическом, гомоталлизме распределение постмейотических ядер в базидии таково, что два ядра, обладающих комплементарными генотипами, входят в одну спору. Мицелий, образующийся из таких спор, может формировать дикарион и самостоятельно переходить к полному половому развитию.

По месту прохождения постмейотического деления четырехспоро-вые агариковые делятся на 4 типа (Chang, 1978; Степанова, Васильев, 1994):

1) митоз происходит в апексе базидии, 4 ядра мигрируют в споры (по одному в каждую), а 4 остаются и дегенерируют в базидии (споры одноядерные);

2) митоз происходит в стеригмах, 4 ядра возвращаются и остаются в базидии (споры одноядерные);

3) митоз происходит в спорах, 4 ядра возвращаются в базидию и дегенерируют (споры одноядерные);

4) митоз происходит в спорах, но все ядра остаются в них (споры двуядерные).

У большинства гименомицетов преобладают третий и четвертый тип, причем четвертый чаще.

Возможно и некоторое усложнение жизненного цикла, связанное с явлением амфиталлизма. Вероятно, все в норме биспоровые Agaricales амфиталличны (Kiihner, 1977), так как базидиоспоры могут нести как совместимые, так и несовместимые по локусу типа спаривания ядра (Kennedy, Burnett, 1956).

Монокариотическое плодоношение

У некоторых видов высших грибов было описано кроме нормального, гетерокариотического (дикариотического) плодоношения, и гомо-кариотическое (монокариотическое). Оно происходит строго в гаплоидной фазе, при этом у плодовых тел не зафиксировано ни кариогамии, ни мейоза, а развитые базидии несли по 2 споры, в отличие от базидий норнормального, дикариотнческого плодоношения, имеющих обычно по 4 споры (Meinhardt, Esser, 1983). У Polyporus ciliatus (Stahl, Esser, 1976) за инициацию монокариотического плодоношения отвечает один ген (fl+/fi), а добавочные гены контролируют форму плодового тела (fb+/fb) и его фертильность (mod+/mod). Кроме того, гетерогенность по фактору несовместимости В блокирует монокариотическое плодоношение, а ген fi влияет на урожайность дикариотических плодовых тел. У Agrocybe aegerita ген su+/su подавляет дифференциацию плодового тела в своей активной форме, а гены fi+/fi и fb+/fb выполняют те же функции, что и у P. ciliatus, и достаточно присутствия одной активной формы любого из этих двух генов хотя бы в одном из ядер дикариона для дифференциации нормального плодового тела (Esser et al., 1974; Esser, Meinhardt, 1977).

Однако монокариотическое плодоношение с его небольшой возможностью соматической рекомбинации является тупиком эволюции и в естественных условиях встречается редко, так как масса спор с одного плодового тела выбрасывается на небольшое расстояние, и дикариоти-зация происходит здесь практически сразу после прорастания. Но есть и исключения: например, у двуспоровых форм Мусепа galericulata большинство монокариотических штаммов теряет способность к слиянию и образованию дикариотнческого мицелия (как при наличии генов стерильности), и тогда образование монокариотических плодовых тел -единственный способ спорообразования и размножения для гриба.

Вегетативный мицелий и плодовые тела

Agaricus bisporus - амфиталличный гриб, но в его гимении дву-споровых базидий от 82 до 91%, поэтому большинство моноспоровых мицелиев гомоталличны. Однако в гимении плодовых тел всегда присутствует некоторое количество трех- семиспоровых базидий с одноядерными спорами, которые могут составлять 19% всех базидиоспор (Chang, 1978; автор, однако, не указывает, на какой стадии зрелости спор проводился подсчет количества ядер в них, т. о., возможно, в части одноядерных спор произошло митотическое деление, и они были отнесены к многоядерным, а на самом деле доля одноядерных спор была больше 19%). Одноядерные споры формируют гомокариотические мицелии, и между ветвями отдельных гиф образуются анастомозы, в результате чего возникает гетерокариотический мицелий (его ядра разно-качественны по происхождению, но не по половому знаку). Гетеротал-личность более примитивна для агариковых грибов (Гарибова, 1982).

Т. о., для вида характерен вторичный гомоталлизм. Генетически различные ядра в одной споре делают ее самофертильной. Рецессивные аллели отдельных генов маскируются в гетерозиготах, что способствует выживанию большего числа потомков. Учитывая однофакторную систему несовместимости A. bisporus, можно рассчитать предполагаемую долю самофертильных спор (спор, которые гипотетически могли бы получить два совместимых по типу спаривания ядра и прорасти способным к размножению гетерокарионом) по формуле (Kerrigan, Ross, 1987):

СФС = (0,222 х ЗСБ) + (0,667 х БСБ) + МСБ, где СФС - предполагаемая доля самофертильных спор (%),

ЗСБ - доля триспоровых базидий (%), БСБ - доля биспоровых базидий (%), МСБ - доля моноспоровых базидий (%).

Однако, эти расчеты примерны, так как основаны на предположении о случайном распределении разнокачественных ядер по базидиос-порам (у двуспоровых базидиомицетов с однофакторной системой несовместимости, образующих четыре постмейотических ядра в базидии, вероятность того, что в одну спору попадут два совместимых по типу спаривания ядра, равна 0,667). Такие факторы как различная жизнеспособность двуядерных и одноядерных спор, неслучайная миграция ядер, безъядерные споры, дополнительные деления ядер в базидии и т. д. этой формулой не учитываются.

Клетки мицелия A. bisporus содержат различное количество ядер (характерна многоядерность). Число ядер в гифах гриба по данным разных авторов варьирует: от 7 до 11 (Клюшникова, 1938), от 1 до 15 (Raper, Кауе, 1978) или от 1 до 36 (Evans, 1959). При этом в апикальных клетках оно выше, чем в интеркалярных, так как деление клеток не связано с делением ядер; у типичных гименомицетов клетки одно- или дву-ядерны соответственно в гомо- или гетерокариотической фазе. Сообщалось и о том, что наиболее часто в клетках гиф содержится по три ядра (Saksena et al., 1976). Кроме того, у A. bisporus отсутствуют миграция ядер и пряжки (Гарибова, 1982), т. о. гетерокариотизированными становятся только те клетки, между которыми произошла плазмогамия. У других представителей гименомицетов взаимная миграция ядер двух анастомозирующих мицелиев способствует образованию из двух гомо-карионов генетически однородного гетерокариона (Raper et al., 1972).

В клетках трамы и гимения наблюдалась редукция числа ядер. Эванс (Evans, 1959) исследовал ткани шляпки, не связанные с развитием базидий, и в среднем, по его подсчетам, количество ядер в них составило 6,44 ±0,08.

Покоящиеся ядра в клетках были двух типов, которые различались по размеру и сродству к красителям (кристаллический фиолетовый и метиловый зеленый): крупные, гомогенные, слабо окрашиваемые ядра 1-2 мкм в диаметре, и мелкие, гранулированные, обладающие высокой степенью сродства к красителям. Мелкие ядра оказались наиболее характерными для клеток субгимения, трамы, мицелия, стареющих плодовых тел, однако оба типа ядер могли встречаться в одной клетке. Приведенные различия в строении ядер не связаны с какой-либо определенной стадией клеточного цикла и генетическими особенностями.

Эванс (Evans, 1959) сообщил, что базидии A. bisporus могут быть дву-, трех- и четырехспоровыми, при этом наиболее часто встречаются двуспоровые. В результате мейоза каждая спора большинства биспоро-вых базидий получает два гаплоидных ядра, которые чаще всего имеют разные (совместимые) локусы типа спаривания (Raper et al., 1972).

Пробазидии A. bisporus развиваются из гифальных кончиков суб-гимениальных клеток, проникающих в гимениальный слой (Wood et al., 1985). В отличие от соматических клеток они содержат две крупные вакуоли в апексе и базальной части (в вакуоли может присутствовать содержимое, что отмечено как для A. bisporus (Thielke, 1967), так и для других базидиомицетов (McLaughlin, 1982)) и только два ядра (Evans, 1959), которые, переместившись в утолщенную часть клетки, сливаются и дают диплоидное ядро 4,5-5,5 мкм в диаметре. Процесс кариогамии был достаточно подробно описан на электронно-микроскопическом уровне у дискомицетов (Камалетдинова, Васильев, 1982) и базидиомицетов (Thielke, 1982). Известно, что у них в месте слияния оболочки обоих ядер сначала располагаются параллельно и близко друг к другу на определенном (довольно большом) протяжении. Затем от них отходят несколько эвагинаций навстречу друг другу, в которых наблюдается слияние (анастомозы) мембран; наконец, содержимое ядер объединяется и в промежутках между эвагинациями. Ядрышки обычно сливаются последними, поэтому некоторое время в диплоидном ядре видны два ядрышка. У базидиомицетов имеет место та же последовательность событий при кариогамии, что было описано у Coprinus lagopus (Lu, 1967). Тилке полагает, что кариогамию инициируют полярные тельца веретена, а в целом морфологическое поведение ядерной мембраны как при митозе, так и при мейозе идентично во всех группах высших грибов (Thielke, 1982).

Далее начинается первое деление мейоза. В течение всего мейоза ядра окружены добавочной двойной мембраной из цистерн эндоплазма-тического ретикулума, которые потом принимают участие в формировании ядерной оболочки и исчезают перед миграцией ядер в стеригмы (Thielke, 1968). У A. bisporus (Evans, 1959) в пахитене хромосомы образуют пары, и их можно измерить (самая крупная - около 5,5 мкм, самая мелкая - 1 мкм). На стадии зиготены (сначала в ядрышке) образуются синаптонемные комплексы (СК), объединяющие гомологичные хромосомы (Thielke, 1982). В пахитене формирование их заканчивается. В СК различаются центральный и два латеральных компонента белковой природы (гены большинства этих белков экспрессируются только при мейо-тическом делении (Roeder, 1997)), объединенные поперечными сшивками. На срезе они имеют вид трех продольных электронно-плотных полос, разделенных светлыми промежутками, и общая толщина СК разная у разных видов агариковых (независимо от таксономического положения) - от 0,02 мкм до 0,23 мкм (Васильев, Степанова, 1994). В ядрышке выявляется только центральный компонент. Латеральные компоненты ассоциируются с хромосомами еще до их объединения, на этих более ранних стадиях профазы I представляя собой белковые тяжи вдоль хромосом, и частично сохраняются еще в диплотене, в районах хиазм.

Во время образования веретена центриоли у A. bisporus (Evans, 1959) не замечены. В метафазе ясно различимы 12 бивалентов (п = 12), не объединенных в метафазную пластинку. В поздней анафазе ядро принимает гантелевидную форму (Thielke, 1982), которая сохраняется до телофазы, когда ядра окончательно разъединяются и приобретают компактную структуру, но вскоре увеличиваются в размере.

Гаплоидное число хромосом п = 12 оказалось самым высоким для автобазидиомицетов, которым наиболее характерно п = 4, и изначально Эванс выдвинул предположение о полиплоидности A. bisporus, но сам опроверг эту гипотезу, так как мультиваленты им найдены не были (Evans, 1956).

Второе деление обычно проходит синхронно в обоих ядрах, и наиболее интересной его особенностью является разнообразие взаимной ориентации веретен деления (табл. 1). Возможно, определяющим фактором здесь являются незначительные различия в форме и размере клеток, что, в свою очередь, влияет на количество свободного пространства, необходимого для организации длинных веретен деления. То, какие два из четырех ядер попадут в одну спору, зависит от расположения ядер относительно друг друга и стеригм, т. е. от ориентации веретен второго деления мейоза. Это играет решающую роль в определении фертильности спор, при условии, что слившиеся при кариогамии ядра генетически разнородны. Эванс разделил все возможные типы ориентации веретен на 4 категории (по Evans, 1959):

1) параллельно друг другу и длинной оси базидии (А);

2) параллельно друг другу, но перпендикулярно продольной оси базидии; так как базидия в поперечном сечении имеет округлые очертания, эти веретена будут находиться на различных уровнях относительно продольной оси клетки (В);

3) перпендикулярно друг другу и в плоскости, перпендикулярной длинной оси базидии; в боковой проекции будут видны только три из четырех ядер (С);

4) типы ориентации, не подпадающие ни под одну из приведенных выше категорий (D).

Таблица 1

Способы взаимной ориентации веретен второго деления мейоза и ожидаемое распределение гена М (•) и его аллеля m (О) в базидиоспорах при условии, что редукционным является первое деление (по Evans,

1959)

Тип ориентации А В С D D1 D2

У VQ/ VQ/ а ® ®® ® шт

Частота,% 17,4 29,4 47,7 5,5

После окончания мейоза ядра мигрируют через стеригмы в споры и почти сразу делятся митотически (в редких случаях митоз происходит еще в базидии до миграции ядер, что Эванс связывает с задержкой развития стеригм). Если веретена были ориентированы по типу А, то каждая спора будет содержать сестринские ядра, в случаях В и С обе бази-диоспоры гетерокариотичны, а при расположении веретен по типу D возможны оба варианта. Эванс, зная частоту встречаемости всех типов ориентации веретен второго деления, рассчитал, что приблизительно 20% спор будут нести сестринские ядра, а около 80% - несестринские и окажутся гетерокариотическими, т. е. гетерозиготными по локусу, расположенному близко к центромере, так как редукционным является первое деление мейоза. Если все же происходит кроссинговер между данным локусом и центромерой, то расщепления не происходит до второго деления мейоза, и гетерокариотическими окажутся все споры, образующиеся на базидиях с ориентацией веретен типа А, 50% спор с базидий типов В и С и 75% спор с базидий типа D. То есть в целом 60% спор будут содержать несестринские ядра.

Гипотеза о постоянной задержке мейоза

Эта довольно спорная гипотеза (Allen et al., 1992) возникла на основе работ по изучению мейотической рекомбинации и кроссинговера, указывающих на достаточную редкость этих явлений в жизненном цикле A. bisporus, в том числе анализа изоферментных локусов и RFLP-анализа, свидетельствующих о малом генетическом разнообразии потомства (Raper et al., 1972). Авторы гипотезы связали это с образованием базидиоспор в результате митоза, хотя и не исключали полностью мей-оз. В рамках этой гипотезы двуспоровый фенотип можно рассматривать как мутантный с подавлением мейотического деления, что объясняет образование большого числа гетерокарионов с родительским фенотипом. Тогда редкое образование рекомбинантов и сегрегантов, следует отнести к исключительным случаям, когда все же происходит мейоз.

Цитологические исследования показали, что кариогамия в основном имеет место (Evans, 1959). Далее протекание мейотического деления останавливается или замедляется. Лишь небольшое количество клеток гимениального слоя на протяжении всего спороношения содержало по 4 ядра, большинство же были одноядерными. Как и в гимении других представителей этого рода, у A. bisporus отсутствуют дифференцированные структурные клетки, кроме крупных многоядерных стерильных элементов, проходящих по краю пластинок, и своей формой цистиды не отличаются от базидий. Последние постепенно развиваются, замещая друг друга, что дает возможность плодовому телу спорулировать около 5-7 дней. Аллен и его коллеги считают, что это достигается благодаря остановке деления в профазе, поэтому одноядерные базидии наиболее распространены.

Но вскоре возможная амейотичность базидиоспорогенеза у этого вида была полностью опровергнута. Керриган с коллегами (Kerrigan et al., 1993) проанализировали расщепление 64 маркеров у потомства F2 от двух гомокарионов и построили генетическую карту с 11 группами сцепления и определили наличие 13 хромосом. Они не смогли определить точное местоположение для двух дополнительных групп сцепления. В итоге они пришли к выводу о наличии у A. bisporus нормального мейотического деления и кроссинговера, частота которого, однако, ниже, чем у других грибов (для моноспоровых изолятов она составила 2,4%). Но пониженная частота кроссинговера, возможно, является характеристикой отдельных аллелей, а не всего генома в целом. В некоторых районах генома, особенно в центромерных участках хромосом, рекомбинация вообще не происходит (к нерекомбинирующим маркерам относится и локус типа спаривания {МАТ-локус), находящийся на хромосоме I). Возможно, отбор на самофертильность развивает механизм консервации гетерозиготности по МАТ-локусу, которым является предпочтительное спаривание несестринских ядер. Однако эта гипотеза нуждается в подтверждении, так как Моке с коллегами (Moquet et al., 1998) обнаружили большее разнообразие по RAPD-маркерам, чем Керриган. Но в его работе, как он сам приводит, около 10% гомокарионов могли остаться неучтенными из-за очень низкой скорости роста или же они могли оказаться нежизнеспособными, что могло привести к искажению данных о расщеплении по локусам, кодирующим фенотипические характеристики скорости роста и жизнеспособности. Позднее карта была дополнена (Callac et al., 1997), и авторы пришли к выводу, что более высокий уровень рекомбинации для представителей A. bisporus var. burnettii может быть связан с аутбредным поведением у этой разновидности A. bisporus.

Соматическая рекомбинация

Некоторое время назад канадские ученые (Xu et al., 1996) получили интересные данные по парасексуальному процессу у A. bisporus. Используя 18 ядерных и 2 митохондриальных маркера, они проанализировали культуры, выделенные из зон срастания двух гетерокариотических штаммов и зон срастания гетерокариотического с гомокариотическим штаммом. При том, что изолятов было всего 20 (из 5 скрещиваний), половина из них оказалась рекомбинантами по одному и более маркерам. Это свидетельствовало либо о митотическом кроссинговере, либо об анеуплоидии. Рекомбинантов из гетерокариона без присутствия другого штамма выделить не удалось, из чего авторы делают предположение о стимуляции соматической рекомбинации наличием в мицелии более двух типов ядер. Рекомбинантов по митохондриальным маркерам обнаружено не было.

Природные четырехспоровые популяции Agaric us bisporus

В 1978 году в пустыне Сонора Коахелльской долины (США, штат Калифорния) была обнаружена популяция шампиньона (Callac et al., 1993), которая по макроморфологическим признакам оказалась гораздо ближе к A. bisporus, чем к какому-либо из четырехспоровых видов Aga-ricus (A. subperonatus (Lange) Sing., A. subfloccosus (Lange) Pilat и A. bi-torquis (Quel.) Sass), процент сходства с которыми составлял только 10%. Однако на всех плодовых телах образовывались преимущественно четырехспоровые базидии. Дальнейшее изучение микроморфологии показало, что базидиоспоры у представителей этой популяции мельче, а базидии крупнее (в 1,4 раза). Новые штаммы успешно скрещивались с различными двуспоровыми, формируя фертильные гетерокарионы, которые в первом поколении преимущественно имели трех- и четырехспоровые базидии (что указывает на доминантность признака многоспоро-вости) и нормально спорулировали. Это отличало новые штаммы от известного A. bisporus, который редко образует более 5-10% четырехспоровых базидий (Elliott, 1977), но могут демонстрировать увеличение доли трех- и четырехспоровых базидий в незрелом состоянии, в поздних волнах плодоношения и при пониженных температурах. Но все-таки между A. bisporus и четырехспоровыми видами рода всегда была четкая граница, которая теперь представляется слегка размытой.

Использованные авторами генетические маркеры и полная интер-фертильность двуспоровых штаммов и новых четырехспоровых показали, что популяция из Коахелльской долины принадлежит к A. bisporus. Т. о., таксономический статус новой разновидности был определен так: Agaricus bisporus (Lange) Imbach var. burnettii Kerrigan et Callac var. nov. Все двуспоровые штаммы были отнесены к Agaricus bisporus var. bisporus. Сравнение разновидностей приведено в таблице 2.

Таблица 2

Процентное соотношение базидий с различным числом спор у дву- и четырехспоровых представителей^, bisporus (по Callac et al., 1993)

Штамм ВП Доля базидий с соответствующим числом спор N

1 2 3 4 5 6 7 8 var. bisporus

RWK1547 1 0,3 98,3 1,0 0 0 0 0 0 300

RWK1295 2 0 17,0 59,0 24,0 0 0 0 0 200

FC19 3 0 95,7 4,3 0 0 0 0 0 300

TV2 1 0,5 65,0 32,0 2,5 0 0 0 0 300 var. burnettii

JB2 1 0 0 1,0 99,0 0 0 0 0 300

JB3 1 0 0 6,0 92,3 1,7 0 0 0 300

JB106 3 0 0 0 100 0 0 0 0 300

JB123 3 0 0 4,0 96,0 0 0 0 0 300

ВП - волна плодоношения

N - количество измерений

Представители var. bisporus были обнаружены на Калифорнийском побережье и в горах провинции Альберта (Канада). Канадский штамм имел уникальные ядерные и митохондриальные маркеры, в то время как многие североамериканские изоляты сходны по этим маркерам с европейскими культивируемыми штаммами, т. е. появились в результате произошедших в природе скрещиваний аборигенных изолятов с заносными. Это указывает на то, что географическое происхождение еще не указывает на принадлежность к той или иной разновидности А. bisporus (Kerrigan et al., 1995).

Так как, в строгом смысле, A. bisporus имеет амфиталлический жизненный цикл, то псевдогомоталличность или гетероталличность его определяется уровнем плоидности споры, которая может быть гетерока-риотической (п + п) или гомокариотической (п). А уровень плоидности спор коррелирует с количеством их на одной базидии (Callac et al., 1996). Было обнаружено, что число базидиоспор в основном определяется единственным генетическим локусом - BSN. Этот локус связан с ло-кусом типа спаривания (МАТ) и другими локусами на хромосоме I. Предполагается, что локус BSN является основным локусом, определяющим выбор между двумя альтернативными программами размножения (Callac, 1995; Imbernon et al., 1996) и, т. о., принадлежность к одной из разновидностей.

В этих исследованиях гомокариотическое потомство нескольких тетраспоровых изолятов (A. bisporus var. burnettii) было скрещено с го-мокарионами более широко распространенной гомокариотической популяции (A. bisporus var. bisporus). В этих скрещиваниях всегда наблюдалась передача признака доминирования многоспоровых базидий (преобладание четырехспоровых или, редко, трехспоровых базидий) с различной степенью выраженности (Callac et al., 1996). Доминантный аллель был обозначен Bsn-t (четырехспоровые базидии), а рецессивный -Bsn-b (двуспоровые базидии). У гетерозигот Bsn-t/b частота рекомбинации в районе гена BSN была выше, чем у гомозигот Bsn-b/b, что позволяет сделать вывод о большей частоте рекомбинации в популяциях А. bisporus var. burnettii. Внедряя аллель Bsn-t в гетерокарионы, из скрещиваний между тетраспоровыми и двуспоровыми штаммами можно получить гаплоидное потомство с высокой частотой рекомбинации. Но, к сожалению, один из компонентов гетерокариона при этом должен быть из популяции Сонорской пустыни, что ограничивает генетическую базу, доступную для скрещиваний.

Однако вскоре во Франции был обнаружен дикий представитель A. bisporus, имеющий необычно высокую долю четырехспоровых базидий - Bs 261 (Callac, 1995). Это первый четырехспоровый изолят, найденный вне Калифорнии (Северная Бретань), а позже были найдены еще 2 подобных изолята в Бордо (Bs 423 и Bs 514). Все моноспоровые изо-ляты с плодового тела Bs 261 росли очень медленно, что указывало на их гомокариотичность. Гибриды его с var. burnettii все оказались четы-рехспоровыми, а с var. bisporus показали расщепление на дву- и четы-рехспоровые. Как оказалось, четырехспоровость Bs 261 является результатом экспрессии доминантного аллеля BSN (Bsn-t), и, учитывая расщепление в первом поколении гибридов его со штаммами var. bisporus, его генотип может быть определен как Bsn-b/t. Моноспоровые изоляты из плодовых тел Bs 423 и Bs 514 оказались гомокариотическими, фертиль-ными и давали начало плодовым телам, морфологически идентичным родительским. Эти представители оказались гомоталличными, при стандартных условиях культивирования на компосте плодоносили нормально и по времени начала плодоношения были сравнимы с дикими изоля-тами var. bisporus, но урожайность их была ниже на 20-40% по сравнению с коммерческими штаммами. Штаммы Bs 423 и Bs 514 частично интерфертильны с представителями двух уже известных разновидностей A. bisporus, и их генотип может быть определен как Bsn-t. В итоге таксономический статус этих штаммов был определен следующим образом: A. bisporus (Lange) Imbach var. eurotetrasporus Callac et Guinberteau var. nov. Штамм Bs 261 оказался природным гибридом между var. bisporus и var. eurotetrasporus, несущим ядра двух типов: ядро А несет аллель Bsn-b и идентично ядрам var. bisporus, а ядро В несет аллель Bsn-t и полностью генетически идентично ядрам var. eurotetrasporus. Жизненные циклы этих штаммов схематически изображены в табл. 3.

Таблица 3 Схема жизненных циклов A. bisporus

Гетероталлизм Псевдогомоталлизм Гомоталлизм

Спора (п) (n + n) (п)

Мицелий стерилен фертилен фертилен

Плазмогамия (n) + (n)^(n + n) нет нет

Спорокарп (n + n) (n + n) (п)

Базидия ютвд (Ь(У)

Количество бази- 4 (или больше) 3 2 (или 1) 2, 3, или 4 диоспор 1 1

85% - 14% - 1% 1% - 18% - 81%

Тип базидий

Жизненные циклы Преобладает гете- Преобладает псев- Гомоталлизм

A. bisporus роталлизм догомоталлизм

• Калифорнийская • Калифорнийское •Bs 423

Представленность пустыня (var. burnettii) • Bs 261 побережье •Альберта • Франция

Гетерокариотические споры получают два совместимых мейоти-ческих продукта. Гомокариотические споры гетерокариотических штаммов дают начало мицелию, который обычно стерилен, но изредка фертилен (по результатам тестов на плодоношение). В результате плазмогамии и следующего за ней анастомозирования два гомокариотиче-ских первичных мицелия при условии половой совместимости дают начало гетерокариотическому вторичному мицелию.

Но в настоящее время остается еще множество вопросов. Во-первых, неизвестно, происходит в базидиях var. eurotetrasporus гомо-миктический или амиктический половой процесс? Можно лишь отметить, что споры различаются в размерах и их жизнеспособность составляет только 10%, в то время как теоретически они гаплоидны и генетически идентичны. Во-вторых, существует ли гомоталлизм у других разновидностей вида? Гаплоидное плодоношение наблюдалось в культуре гомокарионов var. bisporus (Dickhardt, 1985) и var. burnettii (Callac et al., 1993), но плодоношение было скудным и запаздывающим. Нет точных данных о явлении гомоталлизма в природных условиях, хотя у некоторых диких штаммов гетерозиготность не была обнаружена (Xu et al., 1997); такие штаммы, в основном принадлежащие к var. burnettii, могут оказаться гомокариотическими. Для var. bisporus гомоталлизм менее ожидаем, чем для var. burnettii, т.к. псевдогомоталлизм поддерживает высокий уровень гетерозиготности, а также известно об инбредной депрессии (Xu, 1995). И наконец, какова генетическая база гомоталлизма у A. bisporusl Анализ небольшого гомокариотического потомства Bs 261 показал, что около половины его было способно к плодоношению (Callac et al., 1998). Это предполагает относительно простую генетическую базу, однако для ее подтверждения требуется анализ большего числа потомков гибридизации представителей var. eurotetrasporus и var. bisporus.

Существование в природе четырехспоровых изолятов A. bisporus кажется странным, если принять во внимание их изолированность друг от друга и ограниченность мест обитания. В таких условиях, видимо, и развился вторичный гомоталлизм. Однако на тех небольших островках благоприятных для вида условий существования, где он встречается, его огромное количество и скученность поражают (Kerrigan et al., 1995).

Три разновидности Aearicus bisporus

Таким образом, на данный момент в пределах вида выделяется уже три разновидности на основе различий в жизненных циклах, числе базидиоспор и частоте рекомбинации.

1. A. bisporus var. bisporus - преимущественно псевдогомоталличе-ские популяции, культивируемые. Среднее количество спор на базидии

- 2,2 (при стандартных условиях культивирования INRA). Большинство спор прорастает гетерокариотическим мицелием, на котором могут образовываться плодовые тела. Остальные споры гомокариотичны. Плазмогамия может происходить только при встрече очень редких для штамма гомокариотических мицелиев, однако, также существует ограниченная возможность плазмогамии между штаммами, когда один из них (или даже, возможно, оба) гетерокариотичен. Высокая гетерозигот-ность, возможно, объясняется тем, что каждая спора получает два несестринских постмейотических ядра, или тем, что уровень рекомбинации очень низок. Цитологические исследования показали, что клетки гиме-ния изначально двуядерны, кариогамия и мейоз происходят.

2. A. bisporus var. burnettii - на данных момент известна одна изолированная преимущественно гетероталлическая популяция в пустыне Сонора (США, штат Калифорния). Среднее количество спор на базидии

- 3,84. Большинство спор дает гомокариотический мицелий, иногда способный к плодоношению. Остальные споры гетерокариотические (прорастают фертильным мицелием). Плазмогамия между двумя совместимыми гомокарионами восстанавливает фертильность. Низкая гетерози-готность - возможно, из-за самофертильности. Вероятно, клетки гиме-ния гетерокариотичны, а кариогамия, мейоз и спорогенез - типичные для базидиомицетов.

3. A. bisporus var. eurotetrasporus - первично гомоталлическая популяция, представленная изолятами в Греции и во Франции, имеющими одинаковый генотип. Среднее количество спор на базидии - 3,72. Все без исключения споры дают гомокариотические мицелии, каждый из которых уже способен к плодоношению. Плазмогамия не обнаружена; отрицательная реакция на внутриродовое скрещивание. Гетерозиготность не обнаружена, и штамм определен как штамм с гаплоидным генотипом. Данные по цитологическим наблюдениям событий мейоза в литературе отсутствуют.

Окрашивание ядер

Для окрашивания ядер в клетках различных организмов были разработаны разнообразные методики световой и люминесцентной микроскопии. Обычно биологические образцы стабилизируют с помощью фиксации, основная цель которой - сохранить неизменной тонкую структуру клеток объекта. При кариологических исследованиях для фиксации обычно применяют жидкость Карнуа (смесь этилового спирта, хлороформа и уксусной кислоты в разных соотношениях в зависимости от объекта). Для окрашивания ядерного аппарата чаще всего используют следующие методы: метод HCl-Гимза и метод окраски по Фельгену (последний является также одним из основных световых методов количественного определения ДНК). Эти методы окрашивания позволяют учесть количество и размер ядер в клетках, определить также количество и размер ядерных хромосом. Однако обе методики довольно трудоемки, т.к. требуют дополнительной обработки материала с помощью кислотного гидролиза.

В последнее время все больше предпочтение отдается люминесцентным красителям, таким как DAPI, Hoechst Dyes, акридиновый оранжевый и некоторые другие. Эти красители просты в применении и часто не требуют даже фиксации окрашиваемого материала. Кроме того, хромосомы, окрашенные люминесцентными красителями, лучше визуально различимы на препарате, чем хромосомы, окрашенные по методу Гимза (Taga, Murata, 1994). Наиболее широко используемым красителем количественного определения ДНК является 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), специфически связывающийся с А-Т нуклеотидны-ми парами (Schnedl et al., 1977), который может быть также использован для изучения структуры ДНК. Единственным недостатком люминесцентных красителей, пожалуй, можно назвать их быстрое выцветание при микроскопироваиии. Однако и этот недостаток преодолим при условии применения различных препятствующих быстрому выцветанию жидкостей.

Ядерные флуорохромы

Классические люминесцентные ядерные красители можно разделить на три группы (http://www.probes.com/handbook/index.html).

Фенантридины и акридины

Это встраивающиеся красители, такие как этидиум бромид, про-пидиум йодид и другие. этидиум бромид пропидиум йодид

ЭБ и ПИ можно возбудить ртутной или ксеноновой лампой, что делает их подходящими для флуоресцентной, конфокальной лазерно-сканирующей микроскопии, потоковой цитометрии и флуорометрии. Эти красители связываются без какого-либо предпочтения (или с малым предпочтением) с любой последовательностью нуклеотидных пар в соотношении одна молекула красителя на 4-5 пар оснований ДНК. Возбуждение комплекса ЭБ-ДНК может привести к обесцвечиванию и одно-цепочечным разрывам. ЭБ и ПИ связываются также и с РНК, что делает необходимым обработку нуклеазами для четкого разделения ДНК и РНК. ПИ обычно используется как количественный краситель для ядер и хромосом. ЭБ в настоящее время чаще используется как главный геле-вый краситель НК. Оба эти красителя - потенциальные мутагены, однако он могут полностью разрушиться в буфере при реакции с нитритом натрия и фосфорноватистой кислотой.

Высокоочищенный акридиновый оранжевый может быть использован для потоковой цитометрии: он взаимодействует с ДНК и РНК, встраиваясь в них или при электростатических взаимодействиях. Однако в конденсированном хроматине большая масса ДНК упакована настолько, что краситель не может эффективно встроиться в ее структуру. Этот катионный краситель имеет зеленое свечение с максимумом испускания 525 нм при встраивании в ДНК и красное с максимумом испускания 650 нм при связывании с РНК.

Индолы и имидазолы

Эти красители связываются с малой бороздкой ДНК; к ним относятся DAPI и разные варианты Hoechst.

•HCI акридиновый оранжевый он

Hoechst 33258, пентагидрат

Красители Hoechst являются ДНК-селективными и при связывании с ДНК флуоресцируют ярко-синим светом; они неплохо растворяются в воде и относительно нетоксичны. Hoechst Dyes возбуждаются УФ светом аргон-ионного лазера или более традиционными источниками флуоресцентного возбуждения и имеют относительно большой сдвиг Стокса (максимумы возбуждения и испускания составляют 350 и 460 нм соответственно), что делает их применимыми для экспериментов с многоцветным маркированием. Группа красителей Hoechst демонстрирует широкий спектр последовательно-зависимого сродства к ДНК. Спектр их испускания также зависит от молекулярного соотношения краситель : нуклеиновое основание. Тем не менее, эти красители широко используются в цитологических исследованиях, таких как изучения клеточного цикла, апоптоза и даже при количественных измерениях.

DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) обладает свечением в синей области спектра при связывании с ДНК и может быть возбужден ртутной лампой или УФ светом аргон-ионного лазера. Как и Hoechst Dyes, DAPI связывается с малой бороздкой двухцепочечной молекулы ДНК, выявляя предпочтение к АТ-кластерам (рис. 1); имеются сведения, что DAPI также способен связываться с последовательностями ДНК, содержащими последовательно всего лишь два АТ-основания. По другим данным DAPI скорее встраивается в ДНК, чем связывается с молекулой на основе только электростатических взаимодействий катиона с отрица

DAPI, дигидрохлорид тельно заряженной поверхностью ДНК (Masotti et al., 1982). Окрашивает как ядерную, так и митохондриальную ДНК (Butt et al., 1989). Возможно, краситель может встраиваться в РНК при условии АУ-избирательности. Однако избирательность DAPI к ДНК по сравнению с его избирательностью к РНК выше, чем у ЭБ и ПИ. Более того, комплекс DAPI-PHK по сравнению с комплексом DAPI-дцДНК имеет максимум испускания, смещенный в длинноволновую область спектра (около 500 нм и около 460 нм соответственно), да и количество испускаемых комплексом DAPI-PHK квантов света составляет всего 20% от количества, испускаемого комплексом DAPI-ДНК. Несмотря на то, что при связывании с ДНК свечение Hoechst Dyes часто ярче, они обладает меньшей фотостабильностью, чем DAPI. Этот краситель широко используется для количественных ядерных исследований и для дифференциального окрашивания хромосом; он хорошо растворяется в воде, но имеет ограниченную растворимость в фосфатном буфере.

Рис. 1. Кристаллическая структура комплекса DAPI-ДНК (молекула красителя связывается с ДНК в малой бороздке).

Другие ядерные красители

К этой группе относятся разнообразные ядерные красители, включая 7-AAD, LDS 751 и другие. сн„

L-Pro -D-Val — L-Thr -С С -L-Thr - D'Val — L-Pro t I li и I I

Sar—L-MeVal —О О О O-L-MeVal —Sar

7-AAD

7-AAD (7-аминоактиномицин Д) - флуоресцирующий встраивающийся краситель, комплекс которого с ДНК может быть возбужден аргон-ионным лазером и имеет максимум испускания больше 610 нм, что делает его полезным для многоцветной флуоресцентной микроскопии, конфокальной лазерно-сканирующей микроскопии и иммунофенотипи-рования с помощью потоковой цитометрии. Краситель имеет предпочтение к ГЦ-парам, поэтому используется также для дифференциального окрашивания политенных хромосом. ch3)2n N сю-чсн=сн -сн^сн сн2сн3

СН3)2

LDS 751

LDS 751 - ядерный краситель, применяемый для различения ин-тактных ядерных клеток и безъядерных или поврежденных ядерных клеток, а также для определения различных типов клеток в смешанных популяциях из нейтрофилов, лейкоцитов и моноцитов методом потоковой цитометрии. Краситель, связанный с дцДНК, можно возбудить аргон-ионным лазером и использовать при многоцветном окрашивании, так как он имеет длинноволновой максимум испускания - около 712 нм. При связывании LDS 751 с РНК максимум испускания смещается в красную область (около 607 нм), что дает возможность использовать его для визуального разделения ДНК и РНК в клетках.

Основные свойства ядерных флуорохромов приведены на рис. 2 и в табл. 4.

Длина волны, нм

Рис. 2. Спектры испускания некоторых флуоресцентных красителей: 1 -Hoechst 33258,2 - акридиновый оранжевый, 3 - этидиум бромид, 4-7

AAD.

Таблица 4

Свойства классических ядерных флуорохромов

Название красителя Возб/исп, нм Цвет свечения Применение

Этидиум бромид 518/605 Красный • Встраивание в дцЦНК • Окрашивание мертвых клеток • Подсчет хромосом • Электрофорез • Потоковая цитометрия • Возбуждается аргон-ионным лазером

Пропидиум йодид 535/617 Красный • Окрашивание мертвых клеток • Подсчет хромосом и ядер

Hoechst 33258 352/461 Синий • АТ-избирателен • Связывание с малой бороздкой • дцДНК-селективное связывание • Изучения жизненных циклов • Подсчет хромосом и ядер

DAPI 358/461 Синий • АТ-избирателен • Изучения жизненных циклов • Определение микоплазмы • Подсчет хромосом и ядер • Дифференциальное окрашивание хромосом

7-AAD 546/647 Красный • ГЦ-избирателен • Потоковая цитометрия • Дифференциальное окрашивание хромосом

LDS 751 543/712 ДНК 590/607 РНК Красный / инфракрасный • Большой сдвиг Стокса • Длинноволновой спектр • Потоковая цитометрия

Методы количественного определения ДНК

Методы количественного анализа компонентов клетки, основанные на оптических свойствах связанного с ними красителя (цитофото-метрия в видимой области спектра), нашли широкое применение в биологических исследованиях.

Любой строго количественный метод цитофотометрии должен удовлетворять следующим условиям:

1) окрашивание должно быть строго специфичным;

2) должна существовать строгая пропорциональность между количеством связанного красителя и количеством исследуемого компонента клетки (стехиометричность их взаимодействия);

3) метод учета количества связанного красителя должен быть достаточно точен.

Так как легче всего доказать стехиометричность гистохимических реакций, с помощью которых выявляется ДНК, наибольшее распространение получили методы количественного определения именно ядерной ДНК. Важной особенностью абсорбционной фотометрии является то, что определение содержания вещества по величине светопропускания существенно затруднено, если данное вещество распределено неравномерно. Однако, был найден метод, при котором характер распределения исследуемого компонента не имеет значения - это метод, основанный на флуоресценции связывающегося с веществом красителя. В этом случае, если свет флуоресценции собирается от всех точек объекта, общая интенсивность флуоресценции должна быть пропорциональна количеству красителя в объекте (Розанов, Кудрявцев, 1967).

Кроме того, применяемый для цитофотометрии краситель в связанном состоянии должен иметь достаточно высокий квантовый выход флуоресценции при малом коэффициенте экстинкции. Этим требованиям не удовлетворяет, например, основной фуксин, связанный с ДНК, использующийся в реакции Фельгена. Поэтому, хотя основной фуксин, связанный с ДНК, и способен флуоресцировать, обычная реакция Фельгена не может служить основой для разработки строго количественного флуорометрического метода.

Окрашивание DAPI ядерной ДНК у грибов

Основное направление использования красителя DAPI в исследованиях грибов связано с подсчетом ядер и хромосом. Комбинированное окрашивание комплексом DAPI с FITC-конъюгированными антителами использовалось для изучения мейоза у почкующихся дрожжей (Kilmartin, Adams, 1984; Toda et al., 1981) и формирования аппрессорий у Uromyces appendiculatus (Hoch et al., 1987). До сих пор среди авторов нет единого мнения в отношении необходимости предварительной фиксации материала, который предполагается окрашивать DAPI. Батт с коллегами (Butt et al., 1989) приводят данные о том, что DAPI с большей готовностью воспринимается живыми клетками из-за малого размера молекул (молекулярный вес 350), но не начинает светиться, пока не свяжется с ДНК.

Окрашивание ядерной ДНК у грибов затруднено из-за малого количества ядерного материала (Panwar et al., 1987). В упомянутой работе авторы сравнивали различные методы окрашивания ядер Phytophthora nicotianae, Rhizoctonia solani, Ceratobasidium sp. и Ascochyta rabiei. Живой материал (мицелий и споры) и материал после фиксации в различных спиртовых фиксаторах окрашивали водным раствором DAPI. Окрашивание фиксированного материала оказалось неудачным, а витальное окрашивание, опробованное на R. solani, привело к деградации ядер; флюоресцирующий ядерный материал был распределен по всей клетке.

Окрашивание DAPI было использовано для определения успешности прохождения слияния между тестерами из 11 различных "анасто-мозных групп" R. solani и одним штаммом, принадлежность которого к какой-либо из этих групп была неясна (Kuiik, Dery, 1995). В случае неудачного анастомоза (штаммы, принадлежащие к одной "анастомозной группе") одна или несколько клеток каждой гифы в зоне слияния погибают, однако при слиянии различных гиф одного штамма гибели клеток не происходит. Гибель клеток сопровождается деградацией ядер или плазмолизом, что часто сложно увидеть на световом микроскопе. При использовании DAPI в этом исследовании авторы опирались на тот факт, что DAPI взаимодействует только с живыми ядрами и показали, что при слиянии штаммов одной "анастомозной группы" ядра в нескольких соседствующих с анастомозом клетках не окрашиваются. Материал выдерживался некоторое время в буфере, потом окрашивался, затем промывался снова в буфере и микроскопировался в глицерине.

Окрашивание митотических ядер Botrytis cinerea и Alternaria alternate с помощью DAPI позволило четко разграничить и посчитать хромосомы, несмотря на то, что митотические хромосомы имеют меньший размер по сравнению с мейотическими и потому изучаются у мицели-альных грибов реже (Taga, Murata, 1994). Фиксированный жидкостью

Карнуа (этанол : уксусная кислота = 3:1) материал помещался в раствор DAPI в жидкости, препятствующей быстрому выцветанию (Johnson, Araujo, 1981), и сразу микроскопировался. Авторам не удалось различить сестринские хроматиды, что указывает на их тесную сближенность, однако для обоих исследованных видов удалось определить число хромосом. Было установлено, что наибольшая из хромосом (около 2 мкм) более чем в 2 раза превышает по длине наименьшую (1 мкм). И у В. cinerea, и у A. alternate при кариотипировании были замечены в геноме хромосомы с центромерными перетяжками.

Кроме того, на протяжении последних десятилетий данный краситель использовался для количественного определения ядерной ДНК у базидиомицетов с помощью методов цитофотометрии, но в основном на мицелии (Motta, 1986; Bresinsky et al., 1987; Meixner, Bresinsky, 1988; Ota et al., 1998).

Цель данной работы: выяснение последовательности кариологических событий в жизненных циклах штаммов, принадлежащих трем различным разновидностям А bisporus.

Задачи:

1. изучение поведения ядер в вегетативном мицелии штаммов;

2. наблюдение за изменениями ядерного аппарата в процессе ба-зидиогенеза;

3. подбор методики количественного определения ядерной ДНК на разных этапах жизненного цикла A. bisporus;

4. подсчет количества ядерной ДНК на различных стадиях развития гриба.

Материалы и методы

Штаммы

Объектами изучения были три французских штамма Agaricus bisporus, любезно предоставленные доктором Ф. Каллаком:

•Bs 26 - коммерчески культивируемый "белый гибрид" (Horst), принадлежащий к преимущественно псевдогомоталлической разновидности var. bisporus; характеризуется относительно высокими скоростью роста мицелия и активностью плодоношения; плодовые тела белые, крепкие, мясистые;

•Bs 94 (=JB 3, =JB 3-ms; АТСС: 200853 и коллекция ARP) - штамм, выделенный из многоспоровой культуры дикого калифорнийского (пустыня Сонора, штат Калифорния, США) представителя преимущественно гетероталлической разновидности var. burnettii (Callac et al., 1993); характеризуется высокими скоростью роста мицелия и активностью плодоношения; плодовые тела кремового цвета, по консистенции не отличаются от плодовых тел предыдущего штамма;

•Bs 423 (АТСС: MYA-2386; и коллекция INRA) - штамм, выделенный из тканевой культуры французского представителя гомоталлической разновидности var. eurotetrasporus (Callac et al., 1998, 2003); характеризуется очень низкими скоростью роста и активностью плодоношения; плодовые тела внешне не отличаются от плодовых тел Bs 94.

РОССИЙСКАЯ государственная БИБЛИОТЕКА

Получение мицелия и плодовых тел

Мицелий выращивали на сусло-агаре, на целлофановых пленках, по стандартной методике при температуре 25°С в течение 5-7 суток (в зависимости от скорости роста каждого отдельного штамма).

Плодовые тела выращивали в совхозе "Заречье", в производственной камере искусственного климата с контролируемыми параметрами влажности и температуры. Пастеризованный компост в каждом ящике инокулировали пшеничным зерном с мицелием и через 10-13 суток наносили покровную смесь. Влажность в камере поддерживали на уровне 90±5%, температуру в период роста мицелия - 24-25°С, а во время плодоношения - 15-17°С. Плодовые тела собирали на стадии зрелого частного покрывала.

Поведение ядер

Для наблюдений за поведением ядер в мицелии и базидиях в процессе базидиоспорогенеза, а так же для подсчета количества ядер в мицелии были использованы следующие методы окрашивания ядер: по HCl-Гимза и по Фельгену (основываясь на вариантах, приведенных в Справочнике по методам экспериментальной микологии, 1998). Срезы гимениального слоя плодовых тел на стадии зрелого частного покрывала делали вручную с помощью опасной бритвы (толщина срезов - около 10-15 мкм, что соответствует примерно 1-2 слоям клеток); наблюдения проводили на давленых препаратах.

Окрашивание препаратов

Метод НС1-Гимза

Мицелий и срезы плодовых тел фиксировали жидкостью Карнуа (96%-ный этанол: хлороформ : концентрированная уксусная кислота = 6 : 3 : 1) в течение 7 мин., затем отмывали в 70% этаноле. Далее проводили кислотный гидролиз, для чего материал отмывали от спирта дистиллированной водой и помещали в IN НС1 при комнатной температуре на 1-2 мин., а затем - в IN НС1 при 60°С на 7 мин. Гидролиз останавливали в холодной IN НС1 и промывали материал в водопроводной воде.

Ядра окрашивали по модифицированному методу НС1-Гимза. Приготовление красителя: 3,8 г азур-эозина растворяют в 125 мл глицерина при 60°С (на водяной бане), добавляют 395 мл метанола, затем раствор фильтруют. Материал помещали в раствор красителя (из расчета 5 капель краски на 2 мл 0,2М фосфатного буфера, рН 6,9) и оставляли на 3 суток при комнатной температуре.

После окрашивания следует промывка в водопроводной воде. Далее объект помещали в каплю воды на предметное стекло, накрывали покровным стеклом, слегка раздавливали и заклеивали медицинским клеем БФ-6. В таком виде препараты хранились 2-3 недели (иногда до 2 месяцев).

Метод Фельгена

Метод сильно зависит от особенностей объекта, поэтому оптимальное время и температура гидролиза, при которых удается получать стабильные результаты, были подобраны индивидуально для Agaricus bisporus.

Мицелий и срезы фиксировали в модифицированной жидкости Карнуа (96% этанол : хлороформ : концентрированная уксусная кислота = 5 : 7 : 2) в течение 10 мин. (Evans, 1959), отмывали в 96% этаноле (2-3 мин.) и помещали в 70% этанол.

Перед гидролизом материал промывали в дистиллированной воде и помещали в IN НС1 при комнатной температуре на 1-2 мин. Затем срезы в той же емкости ставили на водяную баню при 60°С и гидролизова-ли в течение 10 мин. (с учетом времени, уходящего на нагрев кислоты). Однако мицелий после выдерживания в холодной IN НС1 лучше поместить в уже нагретый до 60°С раствор кислоты, где гидролизовать в течение тех же 10 мин. В процессе гидролиза температура может колебаться в пределах 57-61°С, а останавливают его так же, как и при окрашивании по методу НС1-Гимза.

Материал без предварительной отмывки в воде помещали в реактив Шиффа при комнатной температуре на 3-3,5 часа для срезов и 3,5-4 часа для мицелия. Приготовление реактива Шиффа: 0,5 г основного фуксина растворяют в 90 мл кипящей дистиллированной воды, охлаждают до 50°С, фильтруют и добавляют 2 мл концентрированной НС1. Отдельно в 10 мл холодной воды растворяют 2 г безводного или 4 г кристаллического Na2S03. Полученный раствор соли приливают к раствору фуксина, охлажденному до 25°С.

Промывали материал в трех сменах сернистых вод по 5 мин. в каждой, потом - в водопроводной воде (три смены по 5 мин. каждая). Приготовление сернистых вод: к 200 мл дистиллированной воды прибавляют 4 мл концентрированной НС1. Отдельно в 20 мл дистиллированной воды растворяют 4 г безводного или 8 г кристаллического Na2S03, приливают этот раствор к подкисленной воде, взбалтывают и дают отстояться.

При хранении препарата в воде он довольно быстро обесцвечивается, поэтому мы заключали его в слегка щелочную среду, приготовленную следующим образом: раствор Na2HP04 в водопроводной воде концентрацией 50 г/л смешивают с глицерином в соотношении 1 : 9. Кислотность такой среды составляет около 8,2 единиц рН и позволяет препарату не выцветать в течение 2-3 недель.

Просмотр препаратов

Подсчет количества ядер и измерение их размера проводили по методу "светлого поля" на микроскопах "МБИ-15" (увеличения объектива х40 (подсчет количества ядер) и х90 (измерение ядер)) и "Biolar" (увеличения объектива х40 (подсчет количества ядер) и хЮО (измерение ядер)).

Фотографировали на черно-белую пленку "Микрат-200" или цветную пленку "Kodak-400" ("МБИ-15", при увеличении х1200).

Количество ядерной ДНК

Для количественного определения ядерной ДНК в мицелии и ба-зидиях использовали метод окрашивания по Фельгену (световая микроскопия) и окрашивание с помощью реактива DAPI (люминесцентная микроскопия). Материал фиксировался в модифицированной жидкости Карнуа (см. выше). Мицелий окрашивали непосредственно после фиксации, а кусочки гимениального слоя плодовых тел на стадии зрелого частного покрывала заливали в парапласт. За основу методики заливки была взята стандартная методика заливки в парапласт срезов фиксированных животных клеток, описываемая в книге «Микроскопическая техника (руководство для врачей и лаборантов)».

По стандартной методике обезвоживание препаратов проводится в серии спиртов возрастающей концентрации: в 70% и 80% этанолах препарат выдерживали по 30 мин. в каждом, в 96% - 2 раза по 30 мин., далее 2 раза по 30 мин. в ацетоне и 2 раза по 15 мин. в гептане. Однако, в этом случае после заливки в парапласт материал начинал крошиться при резке, что говорило о его неудовлетворительной пропитке. Поэтому методика была модифицирована: увеличено число ступеней спиртов, сокращено время экспозиции для каждой ступени обезвоживания. Кроме того, учитывая, что парапласт содержит в составе полиизобутилен, было выдвинуто предположение, что лучшая пропитка материала будет достигаться после обработки материала изобутиловым спиртом. Замена гептана на изобутиловый спирт дало положительные результаты, и окончательно методика стала выглядеть следующим образом.

Обезвоживание препаратов проводилось в серии спиртов возрастающей концентрации: в 40%, 50%, 60%, 70% этанолах препарат выдерживали по 15 мин. в каждом, в 80% и 96% - по 10 мин., далее 2 раза по 10 мин. в ацетоне и 2 раза по 10 мин. в изобутиловом спирте. Обезвоженные препараты заливали расплавленным парапластом и помещали на 2 часа в термостат при 60°С. Пропитанный парапластом материал резали на пирамитоме MSE-London, получая срезы толщиной 4 мкм, которые далее помещали на предметное стекло. Парапласт растворяли, проводя срезы через ксилол, затем 96%, 50% и 35% спирты (по 2-3 мин. в каждом).

Окрашивание препаратов

Метод Фельгена

Окрашивание стекол с препаратами проводилось как описано выше. Перед наблюдением окрашенный материал помещали в каплю глицерина.

Метод окрашивания с помощью реактива DAPI

Окрашивание срезов проводили в течение 10 мин. в растворе DAPI в Na-фосфатном буфере (рН6,9) концентрацией 500 нг/мл (Ota et al., 1996). Далее без промывания помещали срезы в 50% (по объему) водный раствор глицерина и микроскопировали.

Просмотр препаратов

Препараты, окрашенные по Фельгену, просматривали на микроскопе Axioskop 40 FL при увеличении объектива хЮО, данные документировали при помощи фотокамеры AxioCam MRc. При окрашивании с помощью DAPI для наблюдения использовался как микроскоп Axioskop 40 FL (увеличение объектива хЮО, блок светофильтров № 02, G 365 нм, FT 395 нм, LP 420 нм) с камерой AxioCam MRc, так и микроскоп Axioplan ((увеличение объектива хЮО, фильтр возбуждения с максимумом 390-400 нм, дихроичная пластина 410 нм) с фотокамерой Caf400 SinSis.

Полученные фотографии обрабатывали с помощью компьютерных программ Photometries и AxioVision (программы позволяют получить результаты специфического окрашивания ядер), а также Scionlmage (измерение площади и интенсивности свечения ядер). Результаты обрабатывались в Microsoft Excel.

Электронная микроскопия

Для исследования методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ) образцы плодовых тел с пластинками помещали в 5% раствор глутарового альдегида ("Merck") с добавлением 5% DMSO и 1 М сахарозы на ОДМ Na-фосфатном буфере (рН 7,2) на 2 часа со сменой растворов через 1 час (при комнатной температуре). После промывки в буфере (15 мин.) проводили постфиксацию в 1% растворе 0s04 1 час при комнатной температуре. Материал промывали в растворе буфера, обезвоживали и заливали в EPON ("Ferak"). Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-8800, докрашивали по Рейнольдсу (Reynolds, 1963) и исследовали с помощью микроскопа "Jeol" (JEM-100В).

Результаты и их обсуждение

Поведение ядер в вегетативном мицелии

Состояние ядерного аппарата вегетативного мицелия изучалось по таким параметрам как размер интерфазных ядер, количество ядер в клетках и ядерно-плазменное отношение (ЯПО).

Размер интерфазных ядер

Ядра располагаются в основном в центральной части гифы, данные по их размеру соответствуют данным, полученным другими авторами (Степанова, Васильев, 1994; Evans, 1959 и др.); он составляет примерно 3x1 мкм при окрашивании по HCl-Гимза (табл. 5). Различий между штаммами по этому признаку не выявлено, что согласуется с высказанным ранее утверждение о его стабильности для вида в целом. Однако при сравнении двух использованных для световой микроскопии методов заметно, что фиксируемый размер ядра зависит от примененного красителя, что будет рассмотрено ниже.

Таблица 5

Размер интерфазных ядер вегетативного мицелия A. bisporus при окрашивании по НС1-Гимза

Штамм Размер ядра, мкм N среднее наименьшее наибольшее длина ширина

Bs 26 3,22 ±1,28 1,11 ±0,37 1,11 х 0,67 4,40 х 2,20 143

Bs 94 2,96 ±1,05 1,15 ±0,43 1,00x0,80 3,61 х 2,22 140

Bs 423 3,01 ± 1,37 1,02 ±0,32 0,94 х 0,67 3,30 х 2,50 140

N - количество измерений

Количество ядер в клетках

Ядра в клетках мицелия лежат по отдельности, крайне редко - по два. По форме ядра часто бывают не только округлыми, но и веретено-видными (соотношение длина : ширина примерно 3-4 : 1) и даже червеобразными (длина : ширина от 5 : 1 и больше). Количество ядер варьирует от 1 до 8 на клетку, но большинство клеток у всех штаммов содержит по 3-4 ядра (рис. 3), причем у природных изолятов Bs 94 и Bs 423 наблюдается плавный переход по процентному содержанию от двуядер-ных к восьмиядерным клеткам, а у культивируемого Bs 26 - выраженный пик на трех- и четырехъядерных клетках. Эти результаты лежат между результатами, полученными Саксеной (Saksena et al., 1976) при окрашивании по Фельгену, который сообщил о преобладании 3-ядерных клеток, и результатами, полученными Ху и Эллиоттом (Hou, Elliott, 1978) при окрашивании гомо- и гетерокариотических штаммов по НС1-Гимза. В работе Ху и Эллиотта количество ядер на клетку достигало 17 для гетерокарионов и 26 для гомокарионов, и наибольшее число клеток имело от 5 до 8 ядер в среднем, но различий между гомо- и гетерокарионами тоже выявлено не было. Также очень мало различались по количеству ядер на клетку гомо- и гетерокариотические штаммы Agaricus аг-vensis (Sonnenberg, Fritsche, 1989). Кроме того, один из гомокариотиче-ских штаммов, исследованных в их работе, имел среднее число ядер 4,78±0,12, что довольно близко к нашим результатам. Авторы предположили, что отсутствие дифференцированной регуляции количества ядер у гомо- и гетерокарионов A. bisporus является эволюционно более прогрессивным признаком, в отличие от регулярного дикариона A. bi-torquis, которому двуядерность вторичного мицелия необходима для поддержания стабильного состояния.

Количество ядер в клетках вегетативного мицелия A. bisporus

60 50 40 зо 20 10 о о4 ЕI ярЩЩЩ г • :

V ■ jj.

1 Ж П II L 1 f. ' ' a Bs26 ■ Bs94 □ Bs423|

TV г-1 . ■■:. /■.::■■■■ "

3 4 5 6 количество ядер в клетке

Рис. 3. Количество ядер в клетках вегетативного мицелия.

Ядерно-плазменное отношение (ЯПО)

Очевидно, что ЯПО (количество ядер, отнесенное к длине той гифы, в которой производится подсчет) связано со скоростью роста мицелия, которая значительно ниже у гомокарионов, чем у гетерокарионов (Камзолкина, 1996). В нашем случае различия между гомокарионом Bs 423 и гетерокарионами Bs 26 и Bs 94 обнаруживаются на уровне как апикальной (50 мкм от кончика гифы), так и субапикальной зоны (50 мкм от конца апикальной зоны) (табл. 6).

Таблица 6

ЯПО в апикальной и субапикальной зонах вегетативного мицелия

Штамм Зона гифы ЯПО (на 10 мкм длины гифы) N

Bs 26 апикальн. 1,52 ±0,47 45 субапик. 1,13 ±0,41 40

Bs 94 апикальн. 1,41 ±0,48 33 субапик. 0,95 ± 0,23 36

Bs 423 апикальн. 1,97 ±0,57 16 субапик. 1,30 ±0,33 20

N - количество измерений

Однако исследования, проведенные нами ранее на различных гомо- и гетерокариотических штаммах, показали, что в среднем ЯПО для гомо- и гетерокарионов в апикальной зоне примерно одинаково (0,84 и 0,87 соответственно), а различия проявляются в субапикальной зоне, где ЯПО гомокарионов в среднем в 1,3 раза выше и равно 1,05, в то время как у гетерокарионов оно составляет 0,82. У Bs 423, отличающегося пониженной скоростью роста, ЯПО оказался выше, и это говорит о том, что у него рост гифы "отстает" от ядерных делений. Более высокое значение ЯПО для апикальной зоны позволяет предположить, что ядерные деления идут там более активно, чем в субапикальной зоне.

Амитоз и миграция ядер

В клетках вегетативного мицелия мы наблюдали амитоз. Чанг (Chang, 1978) считает, что грибы гетерогенны по отношению к механизму митоза, а в гифах Agaricus bisporus наблюдались оба типа митотиче-ского деления: неклассический (амитоз) и классический митоз, - причем иногда даже в пределах одной клетки.

Была отмечена нами и миграция ядер через септы. На рис. 4 видно, что форма ядра меняется при прохождении его через канал поры (как приводят Степанова и Васильев (1994), диаметр его у A. bisporus равен 0,12 мкм), а по окончании прохождения оно опять становится сферическим. Даже если предположить, что септальная пора увеличивается при миграции через нее ядра, это явление остается непонятным. Ведь у вегетативного мицелия в структуре долипорового аппарата присутствуют и парентесомы с перфорациями очень небольшого диаметра (0,04-0,08 мкм). Единственное объяснение прохождения ядра через такую структуру - возможность разборки септального аппарата при миграции ядра и восстановление его по окончании миграции. Было показано, что доли-поровый аппарат базидиальных грибов не является постоянной структурой (Chang, 1978), и его разборка состоит в полном исчезновении доли-поровых утолщений (валиков) и парентесом, связанном с прохождением через септу ядра. Однако миграция ядер наблюдалась нами довольно редко и не могла сильно влиять на разнообразие количества ядер в клетках мицелия.

Рис. 4. Различные стадии миграции ядер через септу в вегетативном мицелии (окрашивание по Фельгену; стрелка указывает на мигрирующее через септу ядро, отрезок равен 10 мкм).

Поведение ядер в гимении плодового тела

Субгимениальные клетки

Клетки еубгимения всех трех штаммов содержат в основном по два ядра, но имеется некоторое отклонение от этого среднего значения (табл. 7). Для Bs 423 статистически достоверных данных не получено. В двуядерных клетках ядра, как правило сближены, а в трех- и четырехъя-дерных - собраны в одну группу или (редко) образуют дикарионы.

Таблица 7

Количество ядер в клетках еубгимения у двух из исследуемых штаммов

Штамм Доля клеток с данным числом ядер, % Ср.кол. ядер/кл. N

1-яд. 2-яд. 3-яд. 4-яд.

Bs 26 14,4 73,3 10,3 2,1 2,00 146

Bs 94 10 82,5 5,8 1,7 1,99 120

N - количество измерений

При окрашивании по обеим методикам, примененным в нашей работе для световой микроскопии, ядра еубгимения оказались мельче ядер мицелия примерно в 1,4 раза. Объяснить это явление пока трудно, т. к. различия в размерах не должны быть связаны с плоидностью (ядра в обоих случаях гаплоидны). Возможно, однако, что роль играет разная синтетическая активность. Известно, что во время спорогенеза активные синтетические процессы идут в базидиях, где даже увеличивается количество и размер митохондрий (Степанова и Васильев, 1994; Manocha, 1965), а из клеток еубгимения в базидии транспортируются запасные вещества, образовавшиеся ранее. На такой однонаправленный транспорт веществ указывает в частности то, что долипоровая септа у базидиальной клетки имеет парентесому только со стороны еубгимения (Chang, 1978; Степанова, Васильев, 1994).

Размер и положение ядер

При окрашивании по HCl-Гимза наблюдали типичную картину поведения ядер во время морфогенеза базидий у штаммов Bs 26 и Bs 94, что позволило разделить этот процесс на несколько стадий:

I - два ориентируются ядра вдоль продольной оси базидии (до кариогамии);

II - одно ядро в клетке (после кариогамии);

III - два ядра располагаются по разные стороны продольной оси клетки (после первого деления);

IV - четыре ядра в базидии (после второго деления);

V - ядра в спорах.

По имеющимся данным размер (диаметр) ядер в базидиях четы-рехспорового штамма Bs 94 примерно в 1,15 раза больше, чем в базидиях двуспорового штамма Bs 26 (сравнение проводилось по всем стадиям морфогенеза); в пересчете на объем это составляет разницу в 1,54 раза. Кроме того ядра штамма Bs 94 окрашивались менее интенсивно, чем ядра штамма Bs 26, что позволяет выдвинуть предположение о различной степени конденсации ядерного материала у этих штаммов. Другой причиной таких различий, скорее всего, является разница в размере базидий, которая может быть связана с поддержанием определенного для стадии морфогенеза базидии ядерно-плазменного отношения (табл. 8).

Таблица 8

Соотношение размеров базидий и ядер, окрашенных по HCl-Гимза, на разных стадиях морфогенеза, мкм

Стадия Штамм

Bs 26 Bs 94 Bs 423 разм. Я/Б N разм. Я/Б N разм. Я/Б N

I 5,57 0,18 8 7,20 0,18 1 4,40 0,29 13

II 6,25 0,42 15 7,15 0,40 18 4,43 0,40 8

III 6,66 0,26 4 8,70 0,26 5 — — —

IV 6,40 0,19 4 9,00 0,15 4 5,67 0,15 9

V 6,67 0,11 5 9,90 0,08 4 6,01 0,11 21

Я/Б - отношение диаметра ядра к ширине базидии N - количество измерений

Ядра в клетках еубгимения штамма Bs 423 по размеру занимают промежуточное положение между ядрами Bs 26 и Bs 94. Таким образом, самыми мелкими оказались ядра субгимениальных клеток у Bs 26: они в 1,15 раза меньше, чем у Bs 94, ив 1,04 раза мельче, чем у Bs 423, однако данные по трем штаммам перекрываются, хотя и незначительно. Было обнаружено также, что штаммы различаются по характеру расположения базидий в гимениальном слое. У Bs 94 после кариогамии базидия заметно приподнимается над поверхностью гимениального слоя. Это, однако, не наблюдалось у штаммов Bs 26 и Bs 423, базидии которых в процессе всего своего морфогенеза остаются плотно упакованными.

Что касается Bs 423, то оценить поведение его ядер в базидиях оказалось сложнее, т. к. при окрашивании по HCl-Гимза не удавалось обнаружить базидий на стадии III, а в двуядерных базидиях, которые мы наблюдали, ядра располагались только вдоль продольной оси клетки.

Таким образом, оказалось невозможным определить, происходит ли в базидиях у Bs 423 мейоз или его ядра делятся амейотически. Тогда возникла идея использовать метод окрашивания ядер, более специфический к ДНК, чем НС1-Гимза.

Сравнение двух методов окрашивания ядер

Как известно, краситель HCl-Гимза взаимодействует с комплексом ДНК-белок; в отличие от него реактив Шиффа воздействует на альдегидные группы, которые образуются в результате гидролиза дезоксири-бозы. Поэтому метод Фельгена используется при определении плоидно-сти ядер растений и животных, основанном на том, что степень окрашенности ядра (количество связанного красителя) напрямую коррелирует с количеством ДНК в нем. Поэтому мы сравнили эти два метода, основываясь на видимом размере ядер (табл. 9).

Измерение диаметра интерфазных ядер в вегетативном мицелии показало, что ядра, окрашенные по методу Фельгена (размеры варьировали от 1,25 х 1,00 мкм до 2,08 х 1,40 мкм), в среднем в 1,8 раза мельче ядер, окрашенных по методу HCl-Гимза (варьирование размеров от 2,72 х 0,96 мкм до 3,52 х 1,20 мкм). В спорах ядра мельче, но и там картина примерно та же. Для базидий эта закономерность, однако, соблюдается не на всех стадиях, что может быть связано со сложностью протекающих в процессе спорогенеза изменений ядерного аппарата.

Таблица 9

Сравнение размеров ядер (мкм), окрашенных двумя разными методами (в скобках указано стандартное отклонение)

Штамм

Метод Стадия Bs 26 Bs 94 Bs 423 размер N размер N размер N миц-й 3,22 х 1,11 (1,28) (0,37) 143 2,96 х 1,15 (1,08) (1,09) 140 3,01 х 1,02 (1,37) (0,33) 140

I 1,16x0,91 (0,22) (0,22) 12 1,53 х 1,11 (0,27) (0,27) 6 1,36 х 1,20 (0,38) (0,38) 25 ев | II 2,94 х 2,34 (0,53) (0,53) 17 3,18x2,52 (0,53) (0,53) 21 1,79 х 1,66 (0,47) (0,47) 8 г) S £ оЗ Ю III 2,04 х 1,48 (0,34) (0,34) 12 2,84 х 1,65 (0,65) (0,65) 22 —

1 о я IV 1,31 х 1,13 (0,34) (0,34) 17 1,62 х 1,15 (0,44) (0,44) 20 0,88 х 0,80 (0,16) (0,16) 32 спора V 0,87 х 0,63 (0,20) (0,14) 25 0,93 х 0,65 (0,28) (0,17) 20 0,67 х 0,67 (0,14) (0,14) 41

СГ 1,62 х 1,24 (0,36) (0,36) 57 1,86 х 1,43 (0,35) (0,35) 57 1,72 х 1,27 (0,34) (0,34) 33 миц-й 1,53 х 1,35 (0,22) (0,22) 34 2,08 х 1,48 (0,40) (0,46) 33 1,58 х 1,05 (0,74) (0,36) 34

I 0,80 х 0,80 (0,00) (0,00) 4 1,83 х 1,42 (0,24) (0,45) 6 1,44 х 1,19 (0,39) (0,24) 8 базидия II 2,63 х 2,03 (0,99) (0,73) 15 3,09 х 2,06 (1,09) (1,12) 17 3,09 х 2,28 (0,79) (0,75) 16

Фельген III 1,01 х 0,88 (0,20) (0,18) 26 1,29x0,96 (0,50) (0,14) 24 1,28 х 1,06 (0,38) (0,23) 18

IV 1,10 х 1,10 (0,10) (0,10) 8 1,00 х 1,00 (0,00) (0,00) 12 1,42 х 1,25 (0,34) (0,38) 12 спора V 0,36 х 0,36 (0,26) (0,26) 30 0,37 х 0,37 (0,20) (0,20) 55

СГ 1,02 х 1,02 (0,11) (0,11) 9 1,20 х 1,20 (0,22) (0,22) 8 1,16 х 1,16 (0,29) (0,29) 12 миц-й - мицелий

СГ - субгимений N - количество измерений

Окрашивание по Фельгену в нашем опыте совпало во времени с активизацией плодоношения Bs 423, у которого во время проведения опыта с применением красителя HCl-Гимза было получено всего несколько плодовых тел. Поэтому использование метода Фельгена так же позволило нам обнаружить у Bs 423 и базидии на стадии III, что не удавалось ранее. Мы выяснили, что внешне поведение ядер этого штамма похоже на то, что наблюдалось у двух других штаммов. Таким образом, нами был прослежен процесс морфогенеза базидий A. bisporus в отношении их роста, изменения формы клеток, изменения положения ядер и вакуолей.

Морфогенез базидий

Рис. 5. Морфогенез базидий: 1 - инициаль базидии, или пробази-дия, 2 - базидия после кариогамии, 3 - профаза I, 4 - телофаза I, 5 -профаза II, 6 - телофаза II, 7 - постмейотическая базидия.

Наблюдения отражены на схематическом рисунке, приведенном выше (рис. 5). Пробазидия обычно имеет размер 4-5 мкм, и ядра в ней занимают центральное положение, ориентируясь вдоль продольной оси клетки. Практически все остальное пространство приходится на крупные апикальную и базальную вакуоли, хотя иногда в апексе базидии видны 2-3 вакуоли. После кариогамии диплоидное ядро располагается на месте давшего ему начало премейотического дикариона и размер его увеличивается до 4,5-5,5 мкм (т. е. такое ядро более чем в два раза крупнее исходных гаплоидных). Возможно, именно такое состояние ядра ошибочно принимается за профазу I мейоза (Степанова, Васильев, 1994). В это время базидия уже начинает принимать булавовидную форму, которая сохраняется ею в дальнейшем. Далее вакуоль в апикальной части клетки исчезает, и ядро перемещается туда, чтобы приступить к первому делению. Время от окончания кариогамии до начала мейоза разными авторами оценивается по-разному. Обычно считается, что диплоидное ядро приступает к мейотическому делению сразу после кариогамии, и хромосомы еще при слиянии образуют профазные биваленты. Но Эванс (Evans, 1959) в своей работе сообщает о наличии короткого периода покоя. Благодаря специфическому окрашиванию хромосом нам удалось даже различить отдельные стадии первого деления мейоза. После первого деления в апикальной части базидии видны два ядра, по размеру сопоставимые с премейотическими, расположенные по разные стороны продольной оси клетки. Веретена второго деления ориентируются обычно параллельно друг другу и вдоль клетки, а в апексе базидии иногда еще можно видеть небольшую вакуоль. Четыре постмейотических ядра оказываются в верхней части клетки, но немного смещены к центру. В это время к ним вплотную подходит базальная вакуоль, а выше в некоторых случаях все еще можно видеть мелкие вакуоли, оставшиеся после распада крупной апикальной. Степанова и Васильев (1994) у исследованных ими видов агариковых отмечают миграцию ядер после первого деления из апекса в центральную часть клетки, потом вновь в апекс, где проходит второе деление, и четыре постмейотических ядра перемещаются снова в центр базидии, где образуют довольно стабильную группу вплоть до начала продвижения в споры. Движение ядер после первого деления мейоза из апикальной части в центральную и возвращение их в апекс для второго деления наблюдали Росс и Маргалит (Ross, Margalith, 1987) у Coprinus bilanatus, а также Камада и Танабе (Kamada, Tanabe, 1995) у С. cinereus. Эванс в своей работе (Evans, 1959), однако, таких движений не наблюдал, и наши данные совпадают с его. Как приводят Степанова и Васильев, многие микологи считают, что растущая базальная вакуоль выталкивает постмейотические ядра в споры, но они в своей работе (Степанова и Васильев, 1994) обнаружили, что миграция ядер в споры не связана с током цитоплазмы и давлением растущей базальной вакуоли. По их данным у некоторых видов агариковых сначала происходила миграция ядер из цитоплазмы базидии в споры, а затем только начинались формирование и рост вакуоли.

Подтверждений задержки мейоза на стадии профазы I (Allen et al., 1992) получено не было, т. к. у старых плодовых тел большинство базидий несло споры, а значит, все же завершило мейоз, но у сравнительно молодых плодовых тел действительно большая часть базидий находилась именно в стадии профазы I.

По нашим данным образование стеригм часто начиналось не только в процессе второго деления мейоза, но и в конце первого (в ана- или телофазе), и даже в профазе I (рис. 6а). Подобные данные приводит и Эванс (Evans, 1959), указывая на несинхронизированное со стадией мейоза образование стеригм, которое все же чаще начинается к концу второго деления.

Рис. 6. Отклонения от нормального поведения ядер в процессе базидио-генеза и споргенеза (отрезок равен 10 мкм).

Несмотря на утверждение Степановой и Васильева (1994) о том, что ядра мигрируют в стеригмы только после окончания роста спор, нами нередко наблюдалась миграция ядер в стеригмы и одновременно с ростом последних (до начала спорогенеза), и одновременно с процессом формированием спор (рис. 66).

Для Bs 26 и Bs 94 характерны несинхронность второго деления мейоза (рис. 6в) и прохождения первой пары ядер в стеригмы (рис. 6г).

Постмейотический митоз

Исключительно редко удавалось зафиксировать постмейотический митоз у штаммов Bs 26 и Bs 94, проходящий в базидиях, а не в спорах, что характерно для большинства представителей порядка Agaricales, у которых все образовавшиеся в результате этого ядра остаются в спорах

Степанова, Васильев, 1994). Эванс (Evans, 1959) связывает митоз в базидии с задержкой образования стеригм. В нашем случае точных данных о дальнейшем поведении образовавшихся в базидии восьми ядер нет, но можно предположить, что они все попадают в споры, т. к. A. bisporus не относится к тем видам Agaricales, у которых на заключительных этапах развития 4 ядра остаются в базидиях и в дальнейшем дегенерируют (при том, что в спорах находятся тоже 4 ядра).

Наблюдались разные типы взаимной ориентации веретен во втором делении мейоза. Кроме типов, которые приводит в своей работе Эванс (Evans, 1959), было замечено еще несколько - все они приведены на рис. 7.

Рис. 7. Типы взаимной ориентации веретен второго деления мейоза у штаммов Bs 26 и Bs 94.

Типы ориентации веретен второго деления

000 А Б

Как видно из рисунка, в процессе продвижения постмейотических продуктов в стеригмы на базидиях группы А образуются гомокариоти-ческие споры, а на базидиях группы Б - гетерокариотические.

Среднее количество спор на базидии

После подсчета среднего количества спор на базидии было обнаружено отклонение от результатов, полученных ранее в целом для обеих разновидностей и первично гомоталлической популяции, представителем которой является штамм Bs 423 (Callac et al., 2003), что отражено в таблицах 10 и 11.

Таблица 10

Среднее количество спор на базидиях A. bisporus, наши данные

Штамм Доля базидий, % ASN N

1-спор. 2-спор. 3-спор. 4-спор. 5-спор.

Bs 26 13,6 54,2 27,4 4,2 0 2,22 95

Bs 94 7,7 25 40 27 0,3 2,87 260

Bs 423 19 31 30 20 0 2,51 100

ASN - среднее количество спор на базидии (от average spore number) N - количество измерений

Таблица 11

Сравнение наших данных по количеству базидиоспор на базидии с данными Каллака (Callac et al., 2003)

Доля базидий, % Bs 26 Bs 94 Bs 423

U 3 BSC 67,8 32,7 50

X X со ч я 3SC 27,4 40 30

TSC 4,2 27,3 20 аз ASN 2,22 2,87 2,51 данные о Каллаку BSC 80,40 0,98 2,50

3SC 18,33 14,14 23,85

TSC 1,27 84,88 73,65 и ASN 2,21 3,84 3,71

BSC - биспоровый класс (моно- и биспоровые базидии)

3SC - триспоровый класс (трехспоровые базидии)

TSC - тетраспоровый класс (базидии с четырьмя и более спорами)

ASN - среднее количество спор на базидии (от average spore number)

Видимо, четырехспоровые штаммы менее стабильны, и на колебания условий культивирования отвечают изменением ASN (average spore number - среднее число базидиоспор). Главная роль в этом принадлежит, прежде всего, температуре и влажности окружающей среды (Elliott, Challen, 1984; Kerrigan, Ross, 1987), а плодовые тела исследованных нами штаммов подвергались воздействию пониженных температур при транспортировке от места выращивания в лабораторию. Однако, Керри-ган и Росс согласны с тем, что обнаружили Эллиотт и Шаллен, только в отношении реальности влияния низкой температуры на число спор. В первом случае преобладавшие двуспоровые базидии в значительной мере замещались трех- и четырехспоровыми базидиями, если плодовые тела выращивали как при более низких, так и при более высоких температурах относительно контроля (20°С). А Керриган и Росс (Kerrigan, Ross, 1987) определили, что у A. subrufescens Peck, в норме тетраспорового, с понижением температуры, наоборот, число двуспоровых базидий увеличивается, что и происходило в нашем случае.

Количественное определение ядерной ДНК

На одном из исследуемых в работе штаммов (Bs 94) было проведено сравнение двух методов количественного определения ДНК: по Фельгену и с помощью DAPI (табл. 12).

Таблица 12

Сравнение двух методов количественного определения ядерной ДНК в базидиях штамма Bs 94

Метод Плоидность Площадь ядра Количество ДНК N

DAPI In 0,40 ±0,08 44,70 ±10,00 27

2п 1,12 ±0,05 61,55 ± 10,50 6

Фельген In 0,30 ± 0,08 44,20 ±10,57 14

2п 1,44 ±0,68 230,24 ±112,77 6

N - количество измерений

Из полученных данных можно сделать вывод о большей точности флуорометрического метода (DAPI) по сравнению с абсорбционным (Фельген). Проведенный для метода Фельгена учет площади измеряемых ядер не помог существенно снизить стандартное отклонение. Даже если учесть способность основного фуксина в связанном с ДНК состоянии флуоресцировать, его применение для цитофотометрии нежелательно (Розанов, Кудрявцев, 1967), так как для него показатель отношения квантового выхода к коэффициенту экстинкции невысок. Поэтому далее для количественного определения ядерной ДНК был использован метод окрашивания при помощи DAPI.

При окрашивании с помощью DAPI у штаммов Bs94 и Bs26 были найдены те же стадии морфогенеза базидий, которые уже были выделены раньше при окрашиваниях для световой микроскопии (рис. 8): стадия I (два ядра, расположенные вдоль продольной оси клетки, до кариогамии); стадия II (одно ядро, после кариогамии); стадия III (два ядра, находящиеся по разные стороны продольной оси клетки, после первого деления мейоза); стадия IV (четыре ядра, после второго деления мейоза). На каждой из этих стадий измерили относительное количество ДНК и сравнили среднее относительное количество ДНК в гаплоидных и диплоидных ядрах (табл. 13).

Рис. 8. Стадии морфогенеза базидий (отрезок равен 10 мкм).

Таблица 13

Относительное количество ДНК в ядрах базидий при окрашивание с помощью DAPI

Штамм Плоидность Стадия Площадь оптического среза ядра, кв.мкм Интенсивность свечения ядра, отн.ед. Количество измерений

Bs 26 In I 0,45 ± 0,02 41,65 ± 4,50 15

Ш 0,50 ± 0,04 55,42 ± 5,02 38

IV 0,31 ±0,06 35,23 ± 4,36 41

I 0,42 ± 0,10 44,42 ± 10,04 94

2n П 0,98 ±0,11 60,85 ± 7,55 23

Bs 94 In I 0,42 ± 0,05 35,26 ± 4,60 32

Ш 0,38 ± 0,05 50,41 ± 5,30 49

IV 0,35 ± 0,06 42,74 ± 7,05 16

I 0,40 ± 0,08 44,15 ± 10,32 97

2n П 1,13 ±0,05 63,81 ±9,82 29

Bs 423 In I 0,27 ± 0,04 43,24 ±5,91 10

Ш 0,38 ± 0,03 42,89 ± 7,35 21

IV 0,23 ± 0,02 40,02 ± 4,67 30

7, 0,34 ±0,10 41,54 ±8,29 61

2n П 0,95 ± 0,03 59,24 ±4,57 11

X - обобщенные данные для всех гаплоидных ядер

Расчеты показали, что количество ДНК в диплоидных ядрах в среднем в 1,36-1,42 раза выше, чем в гаплоидных. Количество ДНК в диплоидных ядрах по отношению к гаплоидным существенно не различается у исследованных штаммов и составляет 1,42 у штамма Bs 423, 1,36 у штамма Bs 26 и 1,45 у штамма Bs 94 (табл. 13). Эти данные не соответствуют теоретически ожидаемому результату (разница между гаплоидными и диплоидными в 2 раза), однако в дальнейшем возможно усовершенствование методики проведения измерений и подсчета с целью получения более четких данных.

Таким образом, модифицированный в процессе данного исследования метод окрашивания ядер с помощью реактива DAPI обладает высокой чувствительностью и может быть использован для количественного измерения ядерной ДНК даже у объектов, ядра которых имеют размер около 1 мкм.

Электронная микроскопия

На электронно-микроскопическом уровне различий в поведении ядер между штаммами тоже не обнаружено. Все они демонстрируют типичный морфогенез базидий.

Гимений у всех трех штаммов, как видно на срезе, состоит из цилиндрических клеток, которые в процессе развития увеличиваются и приподнимаются над гимениальным слоем, а форма их становится булавовидной. Клетки субгимения двуядерны, и от одной субгимениальной клетки могут отходить две базидии, демонстрируя ветвление (рис. 9).

Рис. 9. Ветвление клеток в субгимении (DS - долипоровые септы; отрезок равен 1 мкм).

Молодые базидии (пробазидии) в центральной своей части имеют по два сближенных ядра, ориентированных вдоль продольной оси клетки, а в апексе и базальной части - по одной крупной вакуоли (см. рис. 10). Перед слиянием они сближаются, но сам процесс кариогамии нам зафиксировать не удалось. Часто в базидиях можно было наблюдать ядрышки типичной структуры; по литературным данным ядрышко в диплоидном ядре у A. bisporus крупнее и имеет размер около 1,2 мкм, в то время как в гаплоидных ядрах размер ядрышек равен примерно 0,6-0,7 мкм.

Рис. 10. Пробазидии в гимении плодового тела штамма Bs 94 (V - вакуоль, N - ядро; отрезок равен 1 мкм).

После слияния ядро попадает в апикальную часть базидии, где начинает первое деление мейоза. В это время базидия увеличивается в размере и приподнимается над гимением. В пахитенных ядрах более или менее четко проявляются синаптонемные комплексы (СК) - участки обьеденения гомологичных хромосом (рис. 11). Обычно они имеют палочковидную форму, но иногда изгибаются петлеобразно. Часто СК видны прикрепленными к внутренней мембране ядерной оболочки, а в диплотене они сохраняются только в районе хиазм. Наличие их в базидиях у Bs 423 однозначно говорит о мейотическом делении при споро-генезе. Размер СК, определенный по фотографиям, составляет для Bs 26 примерно 0,20 мкм, для Bs 94 - 0,16 мкм, а для Bs 423 - 0,13 мкм.

Рис. 11. Синаптонемный комплекс в профазном ядре: N - ядро, NM -ядерная мембрана, SC - синаптонемный комплекс (LC - латеральный компонент, СС - центраяльный окмпонент); а - отрезок равен 0,5 мкм, б

- отрезок равен 0,1 мкм.

После первого деления в клетке два ядра ориентируются по разные стороны продольной оси и приступают ко второму делению. Образовавшиеся в результате четыре постмейотических ядра мигрируют в споры.

Реконструкция жизненных циклов

Таким образом, полученные нами с помощью электронной микроскопии данные по морфогенезу базидий совпадают с наблюдениями световой микроскопии и позволяют выстроить последовательность событий в жизненном цикле каждого из штаммов.

У псевдогомоталлического штамма Bs 26 спора, несущая ядра двух типов, прорастает фертильным гетерокариотическим мицелием, клетки которого многоядерны. В субгимении плодового тела происходит сокращение числа ядер до двух на клетку, причем ядра эти разнока-чественны и гаплоидны. В пробазидии происходит слияние двух таких ядер (кариогамия) и редукционное деление образовавшегося диплоидного ядра. Таким образом, в базидии образуются четыре гаплоидных ядра - по два каждого типа. В каждую из двух спор обычно попадает по два разнокачественных ядра, которые в дальнейшем могут претерпевать ми-тотические деления. Эта гетерокариотическая спора прорастает мицелием.

У гетероталлического штамма Bs 94 спора несет гаплоидные ядра только одного типа, и при прорастании образует первичный гомокарио-тический многоядерный стерильный мицелий. При слиянии разнокачественных первичных мицелиев образуется фертильный гетерокариоти-ческий мицелий, клетки которого многоядерны и становятся двуядер-ными только на уровне субгимения. Кариогамия и редукционное деление происходят так же, как и у предыдущего штамма. Но на базидиях образуется по четыре споры, в каждую из которых мигрирует по одному ядру, способному в дальнейшем делиться митотически. Таким образом, каждая зрелая спора этого штамма несет гаплоидные ядра только одного типа и прорастает гомокариотическим мицелием.

У первично гомоталлического штамма Bs 423 все ядра одного типа, и спора прорастает фертильным гомокариотическим первичным мицелием, клетки которого многоядерны. В субгимении наблюдаются дву-ядерные клетки, и развитие базидии происходит так же, как и у предыдущих штаммов, за исключением того, что сливаются при кариогамии гаплоидные ядра одного качества. На базидии образуются четыре споры, каждая из которых получает по одному гаплоидному постмейотическо-му ядру. В споре могут происходить добавочные митотические деления, отчего она становится многоядерной и прорастает гомокариотическим мицелием.

Полученные результаты особенно важны для штамма Bs 423. Так как данный штамм гомокариотичен и дает гомогенное фертильное гомо-кариотическое потомство (Callac et al., 2003), ранее был сделан вывод, что мейоз сохранился у него как остаточное явление, и кариогамия и мейоз в базидиях происходят между предположительно генетически идентичными ядрами (гомомиксис). Цитологический подход позволил показать наличие полового процесса у A. bisporus var. eurotetrasporus, а также и гомоталлического жизненного цикла в строгом смысле. Ранее это не удавалось подтвердить с помощью генетических методов, так как невозможно было получить расщепление аллелей у потомства подобных гомокариотических штаммов. Однако, совсем недавно были получены аллельные сегреганты и кроссоверы среди гомокариотического потомства гибрида U1-2 х Bs 423 (Couture, 2004). Это позволяет предположить, что генетически мейоз у штамма Bs 423, принадлежащего к A. bisporus var. eurotetrasporus, не утратил своих функций. В том же исследовании автор проанализировал расщепление потомства по способности к гаплоидному плодоношению: генетическая детерминанта этого признака не была обнаружена, но данные четко указывают на несвязанность ее с МАТ-локусоы. С другой стороны, частичная интерфертильность var. eurotetrasporus с обеими другими разновидностями позволяет выдвинуть гипотезу об отсутствии или повреждении аллеля локуса типа спаривания, что наблюдается у другого вида, сочетающего в себе биполярный гетероталлизм и первичный гомоталлизм, Sistotrema hrinkmannii (Ullrich, Raper, 1975). Однако, для Sistotrema hrinkmannii гораздо более употребим термин "интерстерильность", так как оба типа штаммов в приведенном исследовании были представлены ауксотрофами и выращивались in vitro на маркированных по источникам питания средам; в то время как у A. bisporus гибридизация наблюдается в природе (Callac et al., 1998) или легко может быть получена in vitro с участием небольшого количества партнеров. Нельзя полностью исключать влияния аллеля типа спаривания для var. eurotetrasporus, но до настоящего момента подтверждение также не было получено.

Таким образом, все три известных для базидиомицетов типа полового воспроизведения (гетеромиксис, интрамиксис и гомомиксис) существуют у A. bisporus. Соответствующие типы жизненного цикла (гетероталлизм, псевдогомоталлизм и первичный гомоталлизм), после учета всех обнаруженных в данной работе особенностей поведения ядер, представлены на рис. 12. Не стоит, однако, забывать, что изображенные на рис. 12 жизненные циклы не могут полностью охарактеризовать каждый отдельный штамм: например, штамм, принадлежащий var. bisporus, преимущественно псевдогомоталличен, а частично гетероталличен, если принять во внимание небольшую долю гомокариотических базидиоспор. В то же время тип спор (гетерокариотические или гомокариотические) не дает полной характеристики штамма, так как определенные гомокариотические споры потенциально могут быть частью как гомоталличе-ского, так и гетероталлического жизненного цикла. субгииеиий lt + Й

Bs26 вторичный мицелий

R»n

31 ntt

0-0-0-0

Zn

• в субгииеиий п ♦ п

Bs94 вторичный мицелий п ♦ я

S1 первичный мицелий п

0-0-04?

2п

I? * I у т« субгииеиий п

Bs423 первичный мицелий п

Рис. 12. Схематическое изображение жизненных циклов трех штаммов, принадлежащих различным разновидностям A. bisporus.

Выводы

1) Размер ядер, окрашенных по методу HCl-Гимза и методу Фельгена, различается и связан со специфичностью красителя к ДНК; ядра, окрашенные более специфическим реактивом Шиффа, в среднем в 1,8 раза мельче ядер, окрашенных азур-эозином, взаимодействующим со всем комплексом ДНП.

2) Значение ЯПО для всех штаммов выше в апикальной зоне, чем в субапикальной, примерно в 1,4 раза, а у гомокариона Bs 423 ЯПО выше, чем у гетерокарионов Bs 26 и Bs 94, в среднем в 1,3 раза.

3) В вегетативном мицелии обнаружена миграция ядер через долипоро-вую септу.

4) Все стадии мейоза были обнаружены у исследованных трех штаммов.

5) Проведено подробное описание морфогенеза базидий для штаммов Agaricus bisporus с тремя разными типами жизненного цикла на уровне световой микроскопии и на электронно-микроскопическом уровне; обнаружены несинхронность второго деления мейоза, несинхронность прохождения постмейотических ядер в стеригмы и добавочный митоз в базидии.

6) Отработана методика количественного определения ядерной ДНК у Agaricus bisporus; получены данные по количеству ДНК в ядрах на разных стадиях спорогенеза.

7) У Bs 423 впервые цитологически подтверждено наличие мейотиче-ского деления в базидиях.

8) Реконструированы жизненные циклы штаммов из различных разновидностей шампиньона двуспорового проведен сравнительный анализ циклов.

Список литературы

1. Гарибова JI. В. Морфология, биология и систематика рода Agaricus Fr. Emend. Karst. Дис. докт. биол. наук. М: 1982. 346 с.

2. Камалетдинова Ф. И., Васильев А. Е. Цитология дискомицетов. Алма-Ата: Наука, 1982. 176 с.

3. Камзолкина О. В. Цитологические исследования гомокариотиче-ских и гетерокариотических штаммов Agaricus bisporus (J. Lange) Imbach // Микробиология. 1996. Т. 2. № 65. С. 228-234.

4. Кпюшникова Е. С. К вопросу о половой дифференцировке культурного шампиньона (Psalliota campestris Fr.) // Бюллетень М. о-ва исп. природы, отд. биологии. 1938. Т. XLVII. № 1. Стр. 30-38.

5. Методы экспериментальной микологии. Справочник. Киев: Нау-кова думка. 1982.462 с.

6. Микроскопическая техника (руководство для врачей и лаборантов). М.: Медицина. 1996. 235 с.

7. Розанов Ю. М., Кудрявцев Б. Н. Метод флуоресцентной цитофо-тометрии для количественного определения ДНК // Цитология. 1967. Т. IX. № 3. Стр. 361-367.

8. Степанова А. А. и Васильев А. Е. Ультраструктурные основы морфогенеза шляпочных грибов. А.: Ылым, 1994. 264 с.

9. Allen J. J., Moore D., Elliott T. J. Persistent meiotic arrest in basidia of Agaricus bisporus II Mycol. Res. 1992. № 96. P. 125-127.

10.Beelman R. В., Royse D., Chikthimmah N. Bioactive components in Agaricus bisporus (J. Lge) Imbach of nutritional, medicinal, or biological importance (Review) // Proceedings of the XVI th International Congress on the Science and Cultivation of Edible and Medicinal Fungi Eds Romaine, Keil, Rinker and Royse. March 14-17, 2004. Miami, FL. U.S.A.

1 l.Bresinsky A., Fischer M., Meixner В., Paulus W. Speciation in Pleuro-tus II Mycologia. 1987. V. 79. № 2. P. 234-245.

12.Butt Т. M., Hoch H. C., Staples R. C., and Legef R. J. St. Use of fluorochromes in the study of fungal cytology and differentiation // Exp. Mycology. 1989. V. 13. P. 303-320.

13.Callac P. Breeding of edible fungi with emphasis on the variability among French genetic resources of Agaricus bisporus II Can. J. Bot. 1995. V. 73 (Suppl. 1). P. S980-S986.

14.Callac P., Billette C., Imbernon M., and Kerrigan R.W. Morphological, genetic, and interfertility analyses reveal a novel, tetrasporic variety of Agaricus bisporus from the Sonoran desert of California // Mycologia. 1993. V. 85. №5. P. 835-851.

15.Callac P., Imbernon M., Kerrigan R. W., and Olivier J.-M. The two life cycles of Agaricus bisporus II Mushroom Biology and Mushroom Products, Royse (ed.); Perm. State Univ. 1996. P. 57-66.

16.Callac P., Desmerger C., Kerrigan R. W., and Imbernon M. Conservation of genetic linkage with map expansion in distantly related crosses of Agaricus bisporus// FEMS Microbiol. Letters. 1997. V. 146. P. 235240.

17.Callac P., Hoquart S., Imbernon M., Desmerger C., and Olivier J.-M. Bsn-t alleles from French field strains of Agaricus bisporus И Appl. Env. Microbiol. 1998. P. 2105-2110.

18.Callac P., Jacobe de Haut I., Imbernon M., Guinberteau J., Theochari I. A novel homothallic variety of Agaricus bisporus comprises rare tetrasporic isolates from Europe // Mycologia. 2003. V. 95. P. 222-231.

19.Chang S. Т. Nuclear behavior utilizing light microscopy // The biology and cultivation of edible mushrooms / Eds Chang S. Т., Nayes W. A. New York: Acad. Press. 1978. P. 35-51.

20.Couture C., Michel A., Imbernon M., Callac P. Inheritance of the hap-loid fruiting ability in Agaricus bisporus II Mushroom Science. 2004. V. 16. P. 45-52.

21.Dickhardt R. Homokaryotisation of Agaricus bitorquis (Quel.) Sacc. and Agaricus bisporus (Lange) Imb. // Theor. Appl. Genet. 1985. V. 70. P. 52-56.

22.Elliott T. J. Basidiospore number in Agaricus bisporus (Lange) Imbach // J. Bacterid. 1977. V. 129. № 1. P. 525-526.

23.Elliott T. J. and Challen M. P. Effects of temperature on spore number in cultivated mushroom, Agaricus bisporus И Trans. Brit, mycol. Soc. 1984. V. 82. №2. P. 293-296.

24.Esser K. and Meinhardt F. A common genetic control of dikaryotic and monokaryotic fruiting in the basidiomycete Agrocybe aegerita И Molec. gen. Genet. 1977. V. 155. P. 113-115.

25.Esser K., Semerdzieva M., and Stahl U. Investigations on the genetics of the basidiomycete Agrocybe aegerita. I. A correlation between the time of fruiting body production and monokaryotic fruiting and its importance for breeding and morphogenesis // Theoretical and Applied Genetics. 1974. V. 45. P. 77-85.

26.Evans H. J. Chromosomes of the cultivated mushroom // Nature. 1956. V. 178. № 4540. P. 1005-1006.

27.Evans H. J. Nuclear behaviour in the cultivated mushroom // Chromo-soma. 1959. V. 10. P. 115-135.

28.Heath M. C., Li A., Horgen P. A., Tam P. L. Hyphal morphology associated with strain instability in the commercial mushroom Agaricus bisporus II Mycologia. 1995. V. 87. № 4. 1995. P. 442-450.

29.Hoch H. С., Tucker В. Е., and Staples R. С. An intact microtubule cy-tosceleton is necessary for mediation of the signal for cell differentiation in Uromyces II 1987. Eur. J. Cell. Biol. V. 45. P. 209-218.

30.Нои H. H., Elliott T. J. Comparative cytology in the genus Agaricus II Mushroom Science. 1978. V. X (Part I). P. 51-62.

31.Imbernon M., Callac P., Gasqui P., Kerrigan R. W., and Velcko A. J., Jr. BS N, the primary determinant of basidial spore number and reproductive mode in Agaricus bisporus, maps to chromosome I // Mycologia. 1996. V. 88. № 5. P. 749-761.

32. Johnson G. D. and Araujo G. M. A simple method of reducing the fading of immunofluorescence during microscopy //J. Immunol. Methods. 1981. V. 43. P. 349-350

33.Kennedy M. E. and Burnett J. H. Amphithallism in fungi // Nature. 1956. V. 177. № 4541. P. 882-883.

34.Kerrigan R. W. Global genetic resources for Agaricus breeding and cultivation//Can. J. Bot. 1995. V. 73 (Suppl. 1). P. S973-S979.

35.Kerrigan R. V. and Ross I. K. Dynamic aspects of basidiospore number in Agaricus II Mycologia. 1987. V. 79. № 2. P. 204-215.

36.Kerrigan R. W., Royer J. C., Bailer L. M., Kohli Y., Horgen P. A., and Anderson J. B. Meiotic behavior and linkage relationships in the secondarily homothallic fungus Agaricus bisporus II Genetics. 1993. V. 133. P. 225-236.

37.Kerrigan R. W., Carvalcho D. В., Horgen P. A., and Anderson J. B. Indigenous and introduced populations of Agaricus bisporus, the cultivated button mushroom, in eastern and western Canada: implications for population biology, resource management, and conservation of genetic diversity // Can. J. Bot. 1995. V. 73. P. 1925-1938.

38.Kilmartin J. V. and Adams A. E. M. Structural rearrangements of tubulin and actin during the cell cycle of the yeast Saccharomyces II J. Cell. Biol. 1984. V. 98. P. 922-933.

39.Kligman A. M. Some structural and genetic problems in the cultivation of the mushroom Agaricus campestris Fr. //Am. J. Bot. 1943. V. 30. № 10. P. 745-761.

40.Kiihner R. Variation of nuclear behaviour in the Homobasidiomycetes // Trans. Br. mycol. Soc. 1977. V. 68. № 1. P. 1-16.

41.Kulik M. M. and Dery P. D. Use of DAPI for anastomosis group typing of strains of the fungus Rhizoctonia solani I I Biotechnic & Histochemistry. 1995. V. 70 (2). P. 95-98.

42.Lu В. C. Meiosis in Coprinus lagopus. A comparative study with light and electron microscopy // J. cell Sci. 1967. № 2.

43.Manocha M. S. Fine structure of the Agaricus carpophore // Can. J. Bot. 1965. V. 43. P. 1329-1333.

44.Masotti L., Cavatorta P., Avitabile M., Barsellona M. L., von Berger J., Ragusa N. Characterization of 4'-6 diamidino-2 phenylindole (DAPI) as a fluorescent probe of DNA structure // Ital. J. Biochem. 1982. V. 31 (2). P. 90-99.

45.McLaughlin D. J. Ultrastructure and cytochemistry of basidial and ba-sidiospore development // Basidium and basidiocarp / Eds Wells K. and Wells E. K. New York: Springer, 1982.

46.Meinhardt F. and Esser K. Genetic aspects of sexual differentiation in fungi // Fungal differentiation - A contemporary synthesis / Ed. John E. Smith. Marcel Dekker Inc. New York. 1983. P. 537-557.

47.Meixner В., Bresinsky A. Cytofluorometric determination of relative DNA content in nuclei of Conioforaceae (Boletales) using DAPI // Trans. Brit, mycol. Soc. 1988. V. 90. № 2. P. 175-180.

48.Moquet F., Guedes-Lafargue M. R., Mamoun M., and Olivier J.-M. Selfreproduction induced variability in agronomic traits for a wild Agaricus bisporus II Mycologia. 1998. V. 90. № 5. P. 806-812.

49.Motta J.J. Quantitative differences in nuclear DNA content between Armillaria mellea and Armillaria bulbosa II Mycologia. 1986. V. 78. № 6. P. 963-965.

50.0ta Y., Fukuda K., and Suzuki K. The nonheterothallic life cycle of Japanese Armillaria mellea II Mycologia. 1998. V. 90. № 3. P. 396405.

51.Panwar R., Singh U. S., and Singh R. S. Fluorescent staining of nuclei in filamentous fungi // Stain Technology: notes on technic. 1987. P. 205-208.

52.Raper C. A., Kaye G. Sexual and other relationships in the genus Agaricus II J. Gen. Microbiol. 1978. V. 105. P. 135-151.

53.Raper C. A., Raper J. R., and Miller R. E. Genetic analysis of the life cycle of Agaricus bisporus II Mycologia. 1972. V. 64. № 5. P. 10881117.

54.Reynolds E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy // J. Biophys. Biochem. Cytol. 1963. V. 17. P. 208.

55.Roeder G. S. Meiotic chromosomes: it takes two to tango // Gen. Dev. 1997. V. 11. P. 2600-2621.

56.Ross I. K. and Margalith P. Nuclear behavior in the basidia of the secondarily homothallic Coprinus bilanatus II Mycologia. 1987. V. 79. № 4. P. 595-602.

57.Saksena K. N., Marino R., Haller M. N., and Lemke P. A. Study on development of Agaricus bisporus by fluorescent microscopy and scanning electron microscopy // J. Bacteriol. 1976. V. 126. № 1. P. 417428.

58.Sass J. E. The cytological basis for homothallism and heterothallism in Agaricaceae II Am. J. Bot. 1929. V. 16. P. 663-701.

59.Schnedl W., Mikelsaar A.-V., Breitenbach M., Dann O. DIPI and DAPI: fluorescence banding with only negligible fading // Human Genetics. 1977. V. 36. P. 167-172.

60.Sonnenberg S. M., Fritsche G. Cytological observation in Agaricus ar-vensis И Mushroom Science. 1989. V. XII (Part I).

61.Stahl U. and Esser K. Genetics of fruit body production in higher Basidiomycetes. I. Monokaryotic fruiting and its correlation with di-karyotic fruiting in Polyporus ciliatus II Molec. gen. Genet. 1976. V. 148. P. 183-197.

62. Taga M. and Murata M. Visualization of mitotic chromosomes in filamentous fungi by fluorescence staining and fluorescence in situ hybridization // Chromosoma. 1994. V. 103. P. 408-413.

63.Thielke C. Die Feinstruktur der Basidien des Kulturchampignons // Arch. Mikrobiol. 1967. V. 59. P. 405-407.

64.Thielke C. Membransysteme in meiotischen Basidien // Ber. Dtsch. Bot. Ges. 1968. V. 81. P. 183-186.

65.Thielke C. Meiotic divisions in the basidium // Basidium and basidio-carp / Eds Wells K. and Wells E. K. New York : Springer, 1982.

66.Toda Т., Yamamoto M., and Yanagida M. Sequential alterations in the nuclear chromatin region during mitosis of the fission yeast Schizosac-charomyces pombe: Video fluorescence microscopy of synchronously growing wild type and cold-sensitive cdc mutants by using DNA- binding fluorescence probes // J. Cell. Sci. 1981. V. 52. P. 271 -287.

67.Ullrich R. C. and Raper J. R. Primary homothallism - relation to heterothallism in the regulation of sexual morphogenesis in Sistotrema II Genetics. 1975. V. 80. P. 311-321.

68.Wood D. A., Craig G. D., Atkey P. Т., Newsam R. J., and Gull K. Ul-trastructural studies on the cultivation processes and growth and development of the cultivated mushroom Agaricus bisporus II Food Micro-structure. 1985. V. 4. P. 143-164.

69.Xu J. Analysis of inbreeding depression in Agaricus bisporus И Genetics. 1995. V. 141. P. 137-145.

70.Xu J., Horgen P. A., and Anderson J. B. Somatic recombination in the cultivated mushroom Agaricus bisporus II Mycol. Res. 1996. V. 100. №2. P. 188-192.

71.Xu J., Kerrigan R. W., Callac P., Horgen P. A., and Anderson J. B. Genetic structure of natural populations of Agaricus bisporus, the commercial button mushroom // J. Hered. 1997. V. 88. № 6. P. 482-488.

72.Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. Chapter 8 -Nucleic Acid Detection and Genomics Technology. Invitrogen Corporation, online, <http://www.probes.com/handbook/index.html>, 1 декабря 2004 г.