Каннабиноидная регуляция в центральной нервной системе виноградной улитки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Лемак, Мария Степановна

• Лемак, Мария Степановна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лемак, Мария Степановна

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1. Эндоканнабиноидная регуляция в ЦНС млекопитающих.

1.1 Эндоканнабиноидные рецепторы, структура и распределение в ЦНС.

1.2 Эффекты анандамида, не связанные с СВ-рецепторами.

1.3 Принципы действия эндоканнабиноидной системы в ЦНС позвоночных животных.

2. Эндоканнабиноиды у беспозвоночных.

ГЛАВА II. Методы, использованные в работе.

Метод радиолигандного исследования связывания с полным насыщением.

Иммунохимическое окрашивание ЦНС улитки.

Вестерн-блот гибридизационный анализ.

Электрофизиологические эксперименты.

Глава III. Результаты и предварительное обсуждение.

Раздел 1. Каннабиноидные рецепторы в центральной нервной системе виноградной улитки.

1.1 Определение специфичности и параметров связывания синтетического агониста каннабиноидных рецепторов в ЦНС улитки.

1.2 Локализация каннабиноидных рецепторов в центральной нервной системе виноградной улитки.

1.3 Проверка специфичности иммуногистохимического окрашивания с помощью вестерн-блот анализа.

Раздел 2. Функциональная роль каннабиноидных рецепторов в ЦНС улитки.

2.1 Влияние анандамида, синтетического агониста каннабиноидных рецепторов, на эффективность синаптической передачи.

2.2 Влияние анандамида на долговременную фасилитацию глутаматергических входов.

2.3 Действие селективного блокатора каннабиноидных рецепторов АМ251 на эффективность синаптической передачи

Раздел 3 Участие эндогенных каннабиноидов в кратковременной пластичности синаптической передачи.

3.1 Вызванное деполяризацией подавление возбуждения.

3.2 Синаптически вызванное подавление возбуждения.

3.3 Сезонная выраженность синаптически вызванного подавления возбуждения в моносинаптических связях механосенсорных и гигантских плевральных нейронов.

3.4 Зависимость выраженности синаптически вызванного подавления возбуждения в моносинаптических связях механосенсорных и гигантских плевральных нейронов от уровня серотонина.

Глава IV. Обсуждение результатов.75'

1. Каннабиноидные рецепторы в центральной нервной системе виноградной улитки.

2. Каннабиноидная регуляция эффективности синаптической передачи.

2.1 Влияние анандамида.

2.2 Влияние антагониста каннабиноидных рецепторов АМ251.

2.3 Роль каннабиноидов в долговременной пластичности связей нейронной сети оборонительного поведения.

2.4 Кратковременная пластичность связей в нейронной сети оборонительного поведения.

2.5 Зависимость кратковременной каннабиноид-зависимой депрессии синаптической передачи от уровня серотонина.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Каннабиноидная регуляция в центральной нервной системе виноградной улитки»

В настоящее время механизмы эндоканнабиноидной регуляции синаптической передачи, обнаруженной относительно недавно в центральной нервной системе млекопитающих, подвергаются активному изучению. Сейчас является общепризнанным, что эндоканнабиноидная система играет важную роль в процессах обучения, памяти, пищевом и оборонительном поведении, нейропротекции (Капо et al., 2009; Хаспеков & Бобров, 2006). Открытие каждой новой медиаторной системы поднимает вопрос о ее эволюционном происхождении. Древность происхождения и распространение среди широкого числа таксонов может свидетельствовать о фундаментальной важности и универсальности данного механизма передачи сигнала в нервной системе. Таким образом, необходимо исследовать составляющие эндоканнабиноидной системы и их структурные и функциональные особенности у различных видов немлекопитающих позвоночных и беспозвоночных животных. Современные генетические исследования показали, что рецепторы, гомологичные каннабиноидным рецепторам (СВ-рецепторам) млекопитающих, найдены у всех классов не-млекопитающих позвоночных и имеют высокую степень сходства с человеческим СВ1 -рецептором (Elphick & Egertova, 2001). Среди беспозвоночных животных элементы эндоканнабиноидной системы описаны у кишечнополостных, иглокожих, двустворчатых моллюсков, плоских и кольчатых червей, но отсутствуют у насекомых и круглых червей (Salzet et al., 2000; McPartland & Glass, 2003). Несмотря на то, что у беспозвоночных найдены эндоканнабиноидные лиганды, ферменты гидролиза каннабиноидов и, в ряде случаев, CBl-подобные рецепторы, а также показано влияние экзогенных каннабиноидов на пищевое поведение гидры и оборонительное поведение планарий, очень мало известно о нейрофизиологических механизмах действия каннабиноидной системы у беспозвоночных животных. С этой точки зрения актуальным является исследование физиологической роли каннабиноидов в регуляции эффективности нервных связей у брюхоногих моллюсков, которые давно используются в качестве модельных объектов в нейрофизиологии для изучения корреляций между целостным поведением и контролирующими его нервными сетями (Gover & Abrams, 2009; Frost & Kandel, 1995). Одним из ярких примеров подобного использования является анализ нейронной сети, обеспечивающей рефлекс отдергивания жабры у морского моллюска аплизии (Frost & Kandel, 1995).

Аналогом отдергивания жабры у аплизии является оборонительная реакция улитки Helix — втягивание головы и щупалец в раковину в ответ на болевой стимул. Сенситизация этого рефлекса коррелирует с длительной фасилитацией входов от кожного нерва на командные нейроны оборонительного поведения — гигантские идентифицированные нейроны париетальных и плевральных ганглиев, спайковые разряды в которых способны вызвать генерализованную оборонительную реакцию улитки (Максимова & Балабан, 1983; Balaban & Bravarenko, 1993; Захаров, 1992). Кроме того, в оборонительной нервной сети улитки идентифицированы механосенсорные нейроны, которые дают моносинаптические входы на командные нейроны оборонительного поведения, являются глутаматергическими и участвуют в формировании оборонительного поведения улитки (Malyshev & Balaban, 2002; Bravarenko et al., 2003), что позволяет детально исследовать регуляцию синаптической передачи в отдельных синаптических контактах, контролируя как пре- так и постсинаптический нейроны.

Таким образом, улитка Helix является очень удобным объектом для исследования роли каннабиноидной системы в регуляции синаптической передачи у беспозвоночных животных.

Цели и задачи исследования

Целью нашей работы являлось подтверждение существования эндогенной каннабиноидной системы в ЦНС брюхоногих моллюсков и ее структурно-функциональное описание. Для достижения данной цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать параметры связывания синтетического агониста CBl-каннабиноидных рецепторов [3Н]СР-55,940 в препарате мембран нервной системы улитки Helix lucorum

2. Методом иммуногистохимии исследовать распределение СВ1-подобных рецепторов в ЦНС двух видов улиток рода Helix

3. Определить влияние агониста СВ1-рецепторов анандамнда и антагониста АМ251 на эффективность возбуждающей синаптической передачи в нейронной сети оборонительного поведения улитки Helix lucorum

4. При использовании анандамида и АМ251 исследовать участие эндоканнабиноидов в регуляции кратковременной и долговременной пластичности связей нейронной сети оборонительного поведения улитки Helix lucorum

Научная новизна

Впервые описано наличие CBl-подобных рецепторов в нервной системе брюхоногих моллюсков, показано участие эндогенных каннабиноидов в регуляции кратковременной и долговременной пластичности синаптической передачи в нейронной сети оборонительного поведения улитки Helix lucorum. Обнаружена новая форма кратковременной пластичности моносинаптической связи между механосенсорными и гигантскими нейронами оборонительного поведения: кратковременное каннабиноид-зависимое подавление возбуждающей передачи в результате низкочастотной стимуляции сенсорных входов (SSE). Показано, что сезонная активность серотонинергической системы является модулирующим фактором при выработке SSE.

Положения, выносимые на защиту

1. В центральной нервной системе наземной улитки Helix lucoriim содержатся белки, гомологичные каннабиноидным рецепторам первого типа млекопитающих.

2. Эндоканнабиноиды участвуют в регуляции пластичности связей в нейронной сети оборонительного поведения, снижая эффективность возбуждающей синаптической передачи.

3. Работа каннабиноидной системы подвержена сезонным изменениям и зависит от активности серотонинергической системы.

Заключение диссертации по теме «Физиология», Лемак, Мария Степановна

Выводы

1. В ЦНС брюхоногого моллюска Helix hicoriim существуют СВ1-подобные рецепторные белки, специфически связывающие каннабиноидные лиганды. По молекулярному весу эти белки соответствуют гликознлированной форме СВ1-рецептора крысы, и специфически узнаются антителами, выработанными против человеческого СВ1 -рецептора.

2. Полученное методом иммуногистохимии распределение СВ1-подобных рецепторов в ЦНС сходно у двух близких видов улиток рода Helix и позволяет предположить участие каннабиноидных рецепторов в регуляции пищевого и оборонительного поведения улитки.

3. Впервые показана возможность функциональных изменений распределения СВ1-подобных рецепторов в ЦНС моллюсков.

4. Агонист каннабиноидных рецепторов анандамид вызывает синапс-специфическое снижение эффективности возбуждающей синаптнческой передачи в нейронной сети, опосредующей оборонительное поведение виноградной улитки.

5. Аппликация блокатора CBl-рецепторов АМ251 не вызывает изменений эффективности синаптической передачи между механосенсорными и гигантскими плевральными нейронами, что свидетельствует об отсутствии тонического выделения эндоканнабиноидов в данных синаптических контактах.

6. Эндоканнабиноиды участвуют в регуляции долговременной пластичности связей в нейронной сети оборонительного поведения.

7. Низкочастотная тетанизация кожного нерва вызывает каннабиноид-зависимую, кратковременную, синапс-специфическую депрессию синаптической передачи от механосенсорных нейронов плеврального ганглия к Пл 1 нейрону.

8. Выработка каннабиноид-зависимой и синапс-специфической депрессии синаптической передачи в нейронной сети оборонительного поведения виноградной улитки возможна только в осенне-зимний период и зависит от уровня активности серотонинергической системы.

Заключение:

1. Низкочастотная тетанизация кожного нерва вызывает каннабиноид-зависимую, кратковременную, синапс-специфическую, депрессию синаптической передачи от механосенсорных нейронов плеврального ганглия к Пл1 нейрону, аналогичную феномену синаптически вызванного подавления возбуждения.

2. Выработка SSE в нейронной сети оборонительного поведения виноградной улитки возможна только в осенне-зимний период и зависит от уровня активности серотонинергической системы.

3. Механизм вызванного деполяризацией подавления возбуждения не участвует в регуляции эффективности синаптических контактов между механосенсорными и Пл1 нейронами плеврального ганглия.

Глава IV. Обсуждение результатов 1. Каннабиноидные рецепторы в центральной нервной системе виноградной улитки

Несмотря на то, что эндоканнабиноидная система является достаточно древней и ее элементы найдены еще у кишечнополостных, некоторые таксономические группы беспозвоночных, в частности, насекомые, по-видимому, лишены эндоканнабиноидной регуляции в ее классическом виде (Е1рЫск & Egertova, 2001; МсРа^кпё, 2004). Таким образом, первой задачей нашего исследования было выяснить, существуют ли в ЦНС брюхоногих моллюсков специфические места связывания каннабиноидов, и, по возможности, охарактеризовать их.

Для оценки наличия специфических мест связывания каннабиноидных лигандов в мозге используется метод радиолигандного связывания с насыщением. В качестве лигандов используются меченые тритием агонисты (анандамид, \\ШчГ-55212, СР-55,940) и антагонисты (8К141716А) каннабиноидных рецепторов. В нашей работе мы оценивали параметры связывания меченого тритием синтетического агониста СР-55,940. Кривая насыщения связывания агониста в препарате мембран имела колоколообразную форму, что подтвердило существование специфического связывания агониста в ЦНС улитки. Оценка параметров связывания с агонистом [3Н]СР-55,940 показала невысокую чувствительность предполагаемых рецепторов, так, константа диссоциации была примерно в 10 раз более высокой, чем в препарате мембран мозга крыс. Тем не менее, чувствительность мест связывания каннабиноидного радиолиганда вполне сравнима с параметрами, полученными на препаратах спермы морских ежей и препаратах тканей гидры. Ранее было показано, что иммуноциты мидий и нервная ткань пиявки содержат высокоаффинные места связывания анандамида (Stefano et al., 1996), однако Egertova (Elphick & Egertova , 2001) считает, что эти параметры могут быть завышены в результате использования нестандартной методики оценки параметров связывания радиолпганда.

Показано, что каннабиноидные рецепторы различных групп беспозвоночных, таких как моллюски (например, Mytilus sp.), кольчатые черви (например, Hirudo medicinalis), кишечнополостные, в частности, Hydra vulgaris, и иглокожие (Echinoidea), несмотря на различия в структуре последовательности, сходны по размерам и условиям функционирования с ферментами и рецепторами, описанными у млекопитающих (Salzet et al., 2000). В этот ряд укладываются и полученные нами результаты. По данным Вестерн-блот анализа специфически узнаваемый СВ1-антителами белок ЦНС улитки имеет молекулярный вес 64 кДа, такой же как и молекулярный вес гликозилированного каннабиноидного рецептора крысы (Song & Bonner, 1996). После обработки эндогликозидазой F молекулярный вес крысиного рецептора снижается до 53 кДа, что согласуется с весом чистого рецепторного белка морского ежа.

Любая медиаторная регуляторная система в ЦНС состоит из ферментов синтеза и деградации медиатора, аппарата транспортировки или освобождения и аппарата рецепции медиатора. Среди беспозвоночных эндоканнабиноидная система была описана у животного с одной из наиболее примитивных нервных систем Hydra vulgaris (De Petrocellis et al., 1999). В нервной ткани гидры содержались эндоканнабиноиды: 2-арахидоноилглицерол (2-АГ) и анандамид, а также предшественник анандамида (NArPE) и фермент деградации анандамида (FAAH, гидролаза амидов жирных кислот). Кроме того, анандамид, 2-АГ и FAAH были найдены в иммуноцитах и нервных ганглиях трех видов пиявок, в частности, Hirudo medicinalis, а также показана колокализация FAAH-подобных ферментов и СВ1 иммунореактивности (Matías et al., 2001). В тканях нескольких видов моллюсков, в частности, Mytilus galloprovincialis, также было показано наличие физиологических количеств анандамида и фермента, подобного FAAH (Sepe et al., 1998). Тем не менее, практически нет данных, касающихся распределения и плотности каннабиноидных рецепторов в центральной нервной системе моллюсков. В нашей работе мы сосредоточились на исследовании локализации каннабиноидных рецепторов с помощью иммуногистохимического окрашивания.

Поскольку каннабиноидные рецепторы моллюсков не описаны, мы опирались на исследования структуры каннабиноидных рецепторов других беспозвоночных: медицинской пиявки и гидры. Было показано, что секвенированный участок рецептора пиявки (153 аминокислоты от N-конца, включающие 3-й трансмембранный домен) сходен на 49% с человеческим и на 47% с крысиным рецептором 1-го типа (Stefano et al., 1996). По другим данным, сходство с человеческим рецептором составляет 58% (McPartland & Glass, 2003). Особенно интересно, что этот участок содержит высококонсервативные последовательности, расположенные между аминокислотами 1-97 и 128-153, гомологичные человеческому каннабиноидному рецептору 1-го типа на 80% и 58% соответственно (Stefano et al., 1996). Кроме того, в ЦНС пиявки присутствуют нейроны, иммунореактивные к антителам, выработанным к N-концу человеческих каннабиноидных рецепторов, что показывает принципиальную возможность использования человеческих антител к каннабиноидным рецепторам для окраски ЦНС беспозвоночных. В нашей работе мы использовали три типа антител, выработанных к разным участкам человеческого каннабиноидного рецептора. Наиболее результативными оказались антитела кролика, выработанные к синтетическому пептиду 3-го цитоплазматического домена СВ1-рецепторов человека, которые выкрашивали в центральных ганглиях наземной улитки определенные группы клеток и области нейропиля, причем распределение этих групп было сходно у двух близких видов улиток рода Helix, что является дополнительным свидетельством в пользу специфичности связывания антител.

В ЦНС улитки Helix lucorum иммунореактивные клетки и нейропиль обнаруживались во всех ганглиях, в основном, представляли собой мелкие неидентифицированные нейроны. Наибольшее количество им муноре активных клеток и волокон содержалось в церебральных и плевральных ганглиях.

В буккальных ганглиях иммуногистохимически выкрашивались по три парные клетки в основании глоточного нерва, а также некоторое количество нервных отростков, уходящих в глоточный нерв и одну из ветвей церебробуккальной коннективы. Часть иммунореактивных волокон оставалась внутри ганглиев. В церебральных ганглиях выкрашивались три группы клеток и большое количество волокон, которые как оставались в церебральных ганглиях, так и уходили в цереброплевральные и церебробуккальную коннективы. Буккальные ганглии в ЦНС виноградной улитки регулируют поедание пищи. В церебральных ганглиях расположены крупные нейроны, модулирующие пищевое поведение, в частности,осуществляющие выбор между пищевой и оборонительной программами поведения. Одним из ярких эффектов, оказываемых каннабиноидами на поведение человека и других млекопитающих, является СВ1-рецептор зависимая стимуляция аппетита (Pagotto et al., 2006; Di Marzo V., 2005). Из беспозвоночных животных на гидре было показано, что агонист СВ-рецепторов вызывает снижение пищевого ответа, заключающегося в открывании и закрывании рта в ответ на непосредственную близость добычи или аппликацию глутатиона (De Petrocellis et al., 1999). Физиологическая активность эндоканнабиноидов была изучена в основном на ГАМК-эргической и, в меньшей степени, глутаматергической, синаптической передаче (Mackie, 2006). Согласно распределению и морфологии большая часть нейронов, иммунореактивных к СВ1-антителам, является ГАМК-ергическими (Капо et al., 2009). Интересно, что полученное нами распределение иммунореактивных к СВ1-антителам нейронов и волокон в ЦНС виноградной улитки частично совпадает с распределением ГАМК-ергических нейронов у вида Н. aspersa (Ierusalimsky & Balaban , 2001). Возможно, что и у моллюсков эндоканнабиноидная система играет определенную роль в регуляции ГАМК-ергической передачи. Так как у Helix ГАМК вовлечена в запуск пищевой активности (Bravarenko et al., 2001), можно предположить участие каннабиноидов в регуляции пищевого поведения улитки, осуществляемого через ГАМК-ергическую медиаторную систему.

Как упоминалось выше, в мозге млекопитающих СВ1 -рецепторы расположены в основном на мембранах тормозных нейронов, однако в мозжечке, гиппокампе, зубчатой извилине, базальных ядрах и церебральной коре СВ1 -рецепторы экспрессируются также глутаматергическими нейронами, хотя и в значительно меньшем количестве (Mackie, 2006; Капо et al., 2009). Для виноградной улитки не существует иммунохимических данных о распределении глутаматсодержащих нейронов, однако функционально было показано, что гигантские оборонительные нейроны несут не-NMDA глутаматные рецепторы (Коршунова, автореферат, 2004, Никитин и др., 2000), а моносинаптические входы от механосенсорных нейронов плеврального ганглия на гигантские нейроны оборонительного поведения плеврального и париетального ганглиев являются глутаматергическими

Bravarenko et al., 2003). По нашим данным, в плевральном ганглии расположен пул мелких CBl-иммунореактивных клеток, который частично перекрывается с областью расположения механосенсорных нейронов. Кроме того, хотя тела идентифицированных нейронов оборонительного поведения не несут мест связывания СВ1-антител,. CBl-иммунореактивные нейриты плеврального ганглия оплетают тело гигантского плеврального оборонительного нейрона. Подобное распределение CBl-иммунореактивности показано в мозжечке и гиппокампе: неокрашенные клетки Пуркинье и пирамиды, соответственно, окутаны массой иммунореактивных волокон (Straiker & Mackie, 2005). Интересно, что в педальных ганглиях выкрашивается пара одиночных клеток и нервные волокна, расположенные в ростромедиальной области, где находится группа серотонинергических нейронов, модулирующих эффективность синаптических связей в сети оборонительного поведения улитки. Таким образом, исходя из распределения CBl-иммунореактивности в плевральных и педальных ганглиях, мы можем предположить, что каннабиноиды вовлечены и в регуляцию работы нейронной сети оборонительного поведения виноградной улитки.

В целом, мы можем заключить, что, во-первых, в ЦНС брюхоногого моллюска Helix lucormn существуют СВ1 -подобные рецепторные белки, специфически связывающие каннабиноидные лиганды, соответствующие по молекулярному весу гликозилированной форме СВ1-рецептора крысы, и специфически узнаваемые антителами, выработанными против человеческого СВ1-рецептора. Во-вторых, полученное методом иммуногистохимии распределение СВ1-подобных рецепторов в ЦНС в сопоставлении с литературными данными позволяет предполагать участие СВ1-подобных рецепторов в регуляции пищевого и оборонительного поведения брюхоногих моллюсков.

2. Каннабиноидная регуляция эффективности синаптической передачи

2.1 Влияние анандамида

Следующей задачей нашей работы была проверка гипотезы о функциональной активности СВ1-подобных рецепторов, найденных в ЦНС виноградной улитки. В качестве агониста каннабиноидных рецепторов мы использовали анандамид, эндогенный каннабиноидный лиганд, который синтезируется в нервной системе как позвоночных, так и беспозвоночных животных (Sugiura et al., 1997; Sepe et al., 1998), и является одним из двух наиболее распространенных и универсальных эндоканнабиноидов.

Как было описано выше, каннабиноиды могут принимать участие в регуляции как пищевого, так и оборонительного поведения. Для исследования функциональной роли СВ1-подобных рецепторов мы выбрали синаптически связанные нейроны, входящие в хорошо изученную нейронную сеть, вовлеченную в реализацию оборонительного поведения. В данной нейронной сети были выделены и морфологически и функционально идентифицированы четыре основные группы нейронов. Это группы сенсорных, моторных, премоторных (гигантстких) интернейронов и модуляторных нейронов (Балабан & Захаров, 1992; Balaban, 2002). На рис.21 схематично обозначены некоторые элементы оборонительной сети. Сенсорные нейроны (обозначены серым и оранжевым цветом) расположены в плевральном ганглии. Эти нейроны были выделены по следующим критериям: латентность их ответа на стимул, вызывающий оборонительную реакцию, приближается к интервалу времени, необходимому для проведения нервного стимула от анализатора в ЦНС; их рецептивное поле ограничено; амплитуда ВПСП в интернейроне линейно зависит от количества потенциалов действия в предполагаемой сенсорной клетке, а спайковый ответ зависит от интенсивности стимула. В таких клетках не наблюдается спонтанной спайковой активности, а разряд этих клеток не коррелирует с движениями животного на полуинтактном препарате. Внутриклеточная стимуляция единичной клетки никогда не вызывает поведенческой реакции (Balaban, 2002). Часть этого нейронного пула образует моносинаптические связи с гигантскими интернейронами (Malyshev & Balaban, 2002). Эти механосенсорные нейроны (обозначены оранжевым цветом), по-видимому, участвуют в осуществлении оборонительного ответа виноградной улитки, активируя интернейроны оборонительного поведения (Пл1, ПаЗ и Па2), и являются глутаматергическими (Bravarenko, 2003).

Анандамид вызывал достоверное, но небольшое по величине снижение амплитуды глутаматергических ВПСП и смешанных возбуждающих ВПСП по сравнению с эффектами, описанными ранее на срезах мозга крыс (Капо et al., 2002). С одной стороны, это согласуется с нашими данными о невысокой плотности и низкой чувствительности CBl-подобных рецептров улитки к каннабиноидным лигандам. С другой стороны, если принять во внимание, что эффект аппликации анандамида растянут во времени (максимальное снижение амплитуды ВПСП достигается только через 15 мин от момента добавления агониста в ванночку), возможно, что анандамид не прямо подавляет выброс медиатора, а увеличивает скорость привыкания ВПСП. Не исключено, что механизм этого эффекта не связан с активацией CBl-подобных рецепторов, а реализуется, например, при прямом кожа механ ос ен сорные нейроны плеврального ганглия канал

Са' каналы mGlii рецепторы (?) не-NMDA тута мятные пторы #

NMDA & рецепторы ^

S? Д?

С В1-подобные рецепторы mGlu рецепторы (7)

5-НТ, рецепторы се рот они н rop^i7) ' NMDA Са w СО М ¡¡Jr

•Г не-NMDA

7 hi J глутаматные рецепторы

Са змвндзмида 2+

5-НТ, рецепторы

Пл1 нейрон У сер сггони нерги ческий проекционный нейрон педального ганглия

Рис. 21 Гипотетическая схема эндоканнабиноидной регуляции между нейронами оборонительной нервной сети улитки Helix lucorum. Пояснения в тексте. взаимодействии анандамида с кальциевыми каналами или калиевыми каналами. Так, показано, что анандамид в субмикромолярных концентрациях прямо блокирует кальциевые каналы Т-типа и калиевые ТАБЮ-каналы (Ьогоуауа, 2009; Мат§ге1 & а1, 2001). Однако, мы обнаружили, что снижение амплитуды суммарных ВПСП является синапс-специфичным, так, при стимуляции одних и тех же входов и одновременной регистрации в Пл1 и ПаЗ нейронах оборонительного поведения, амплитуда ВПСП снижалась только в Пл1 нейроне, что свидетельствует в пользу рецептор-зависимого механизма действия анандамида.

2.2 Влияние антагониста каннабиноидных рецепторов АМ251

АМ251 является высокоэффективным селективным антагонистом СВ1-рецепторов млекопитающих, с К^ около 10"8 М. Соответственно, АМ251 используется для блокады СВ1-рецепторов в наномолярных концентрациях. Тем не менее, при использовании фармакологических агентов, разработанных для млекопитающих, на препаратах моллюсков рекомендуется апплицировать вещества в значительно более высоких дозах из-за возможных различий в строении рецепторов, и, соответственно, чувствительности и эффективности связывания лигандов. Поэтому, мы использовали АМ251 в микромолярном диапазоне. Однако, есть данные, что в микромолярных концентрациях данный антагонист способен подавлять базальную активность ингибиторных в-белков на пресинаптических мембранах за счет перекрестных взаимодействий с аденозиновыми А1 рецепторами, что может ошибочно интерпретироваться как блокада тонического выделения эндоканнабиноидов (Баутатеп а1., 2003).

В наших экспериментах аппликация АМ251 не вызывала достоверных изменений амплитуды ВПСП. Таким образом, в исследуемой нервной сети нет оснований предполагать тоническую активность эндоканнабиноидов, а АМ251 в микромолярных концентрациях не проявляет на препарате улитки ни свойств обратного агониста, ни перекрестных взаимодействий с какими-либо другими медиаторными системами.

2.3 Роль каннабиноидов в долговременной пластичности связей нейронной сети оборонительного поведения

Наиболее простой и хорошо изученной поведенческой моделью обучения улитки Helix luconim является сенситизация - долговременное усиление оборонительного ответа (втягивания омматофоров) на тактильные стимулы после болевого раздражения (электрического шока) (Balaban & Bravarenko, 1993). Нейрональным коррелятом сенситизации в сети оборонительного поведения является долговременная фасилитация суммарных ВПСП в гигантских оборонительных нейронах в ответ на тетанизирующее раздражение сенсорных входов (Захаров, 1992, Malyshev A.Yu., 2002; Zakharov et al., 1995).

В нейронной сети оборонительного поведения виноградной улитки, было описано девять индивидуально идентифицируемых гигантских интернейронов (Иерусалимский и др., 1992) На этих клетках конвергируют стимулы от механорецепторов, хеморецепторов, фоторецепторов и терморецепторов. Внутриклеточная активация этих клеток на полуинтактном препарате и препарате изолированной нервной системы, приводит к активации мотонейронов. Спайковый разряд, вызванный внутриклеточной стимуляцией одного из командных интернейронов, вызывает скоординированную оборонительную реакцию (специфичную для данного нейрона), а спайковый разряд на болевые стимулы неизменно предшествует или совпадает с оборонительной реакцией. Внутриклеточная гиперполяризация одной из этих клеток элиминирует в оборонительной реакции (при предъявлении оборонительного стимула) тот ее компонент, который появлялся при внутриклеточной активации этой клетки. (Балабан & Захаров, 1992; Balaban & Bravarenko, 1993).

Из девяти гигантских интернейронов большинство экспериментаторов выбирали для своих исследований шесть - Па2 и ПаЗ, попарно расположенные в левом и правом париетальном ганглиях и Пл1 - расположенные в левом и правом плевральных ганглиях. Гигантские интернейроны Па2, ПаЗ и Пл1 функционально подобны. На рис.21 ПаЗ нейроны обозначены салатовым цветом, Пл1 нейроны -голубым цветом.

Мы обнаружили, что нанесение серии высокочастотных стимулов по кожному нерву вызывает значительное увеличение ответов на тестирующую стимуляцию по тому же нерву как в плевральных, так и в париетальных оборонительных нейронах. Анандамид вызывал снижение величины и укорочение долговременной фасилитации ВПСП также в обоих нейронах. Возможно, противоречие с изложенными выше данными о синапс-специфическом влиянии анандамида на амплитуду суммарных ВПСП объясняется участием "третьих" нейронов в процессе формирования долговременной фасилитации. В серии работ, выполненных в нашей лаборатории, было показано, что для выработки долговременной фасилитации необходима активация серотонинергических модуляторных нейронов, расположенных в ростромедиальной области педальных ганглиев (Zakharov et al., 1995; Балабан & Захаров, 1992, на рис.21 серотонинергические нейроны обозначены зеленым цветом). Учитывая вышеприведенные иммуногистохимические данные о расположении в ростромедиальной области СВ-иммунореактивного нейропиля и отдельных СВ-иммунореактивных клеток, возможно ослабление фасилитации за счет ингибирующего воздействия анандамида на модуляторные серотонинергические нейроны. Кроме того, анандамид способен прямо ингибировать потенциалзависимые кальциевые и натриевые каналы на мембране пре- и постсинаптических нейронов (Ьогоуауа et а1., 2009).

А.С. Пивоваровым с соавторами был исследован тип рецепторов к серотонину, на мембране командных интернейронов Ра2 и РаЗ (Ргуоуагоу & №Б1:га1;оуа, 2003). Было показано, что антагонисты рецепторов 5-НТ1 типа - КА}Ч-190 и метиотепин уменьшают вызванный ацетилхолином входящий ток в данные командные интернейроны. Тогда как антагонисты рецепторов 5-НТ2, 5-НТЗ и 5-НТ4 типа - ЬУ-53.857, 1С8-205.930 и 802-205.557 соответственно, не оказывают существенного влияния. Поэтому, рецепторы к серотонину на мембране сомы командных интернейронов Ра2 и РаЗ были определены как модуляторные 5-НТ1 серотониновые рецепторы. Анандамид способен снижать способность серотонина связываться со своими рецепторами, в частности, 5-НТ1 типа (Вга1ёа е1 а1., 2007; Оъ е1 а1., 2002). Возможные пути действия анандамида показаны на рис.21 черными стрелками (сплошные линии — эндогенный анандамид, сплошные и пунктирные линии - экзогенный, апплицированный в эксперименте, анандамид).

Долговременную фасилитацию ВПСП в ПаЗ нейронах можно вызвать не только тетанической стимуляцией входов, но и высокочастотной внутриклеточной стимуляцией постсинаптического нейрона (Балабан и др., 1995; Ма1узЬеу et а1, 1997). Мы обнаружили, что внутриклеточная тетанизация Пл1 нейрона не вызывала долговременных изменений амплитуды ВПСП в Пл1 нейроне, одртако после аппликации блокатора каннабиноидных рецепторов АМ251 амплитуда ВПСП возрастала и оставалась выше контрольной в течение более чем 30 мин. По-видимому, внутриклеточная активация плеврального нейрона оборонительного поведения вызывала выделение эндоканнабиноидов, препятствующих развитию долговременной фасилитации ВПСП в этом нейроне.

2.4 Кратковременная пластичность связей в нейронной сети оборонительного поведения

Кратковременная пластичность играет важную роль в анализе сенсорной информации, селекции важности поступающих стимулов, участвует в процессах внимания и кратковременной памяти, локомоторной активности (Zucker & Regehr, 2002; Citri & Malenka, 2008).

Несмотря на то, что различные формы долговременной пластичности связей в нейронной сети оборонительного поведения улитки Helix lucorum изучены довольно подробно, кратковременные изменения синаптической эффективности, длящиеся секунды и минуты, практически не исследованы. Одной из причин является свойственное этим синапсам привыкание ВПСП, скорость которого увеличивается с увеличением частоты тестирующей стимуляции, из-за чего ранее использовали длительные, от 2,5 до 20 мин, межстимульные интервалы, которые сводили привыкание к минимуму, но не позволяли увидеть кратковременные изменения амплитуды ВПСП. Хотя при увеличении частоты стимуляции амплитуда ВПСП падает быстрее (до 60% к 3-4 стимулу), она стабилизируется примерно к 10-му стимулу. Таким образом, если подбирать синапсы с изначально большой амплитудой ВПСП, можно регистрировать ВПСП с достаточно хорошим соотношением сигнал/шум при относительно высокой частоте стимуляции (1/30 с).

Эндоканиабиноидная система участвует в нескольких формах кратковременной депрессии возбуждающей синаптической передачи. В целом по механизму реализации их можно разделить на Са2+-зависимые и рецептор-зависимые. Кальций-зависимой формой кратковременной депрессии является описанное практически во всех отделах мозга, участвующих в эндоканнабиноидной регуляции (в частности, в мозжечке, гиппокампе, стволе мозга, гипоталамусе, миндалине и т.д.), так называемое вызванное деполяризацией подавление возбуждения (DSE: depolarization induced suppression of excitation). DSE заключается в индукции синтеза эндогенных каннабиноидов в постсинаптической терминали в ответ на повышение уровня внутриклеточного Са, вызванного кратковременной (1-10 с) деполяризацией до 0 мВ мембраны постсинаптического нейрона, и затем также кратковременном (порядка нескольких минут) ретроградном подавлении активности возбуждающих, обычно глутаматергических, входов (Kreitzer & Regehr, 2001; Straiker & Mackie, 2005). В наших экспериментах мы использовали в качестве триггера входа кальция в постсинаптический нейрон деполяризующие ступеньки тока длительностью 15 с, которые вызывали высокочастоные спайковые разряды. Как было показано ранее, во время подобных пачек потенциалов действия в нейрон входит значительное количество ионов Са2+. Мы не обнаружили значимых изменений амплитуды ВПСП в ответ на деполяризацию. Возможно, что в исследуемых синапсах одного повышение уровня внутриклеточного кальция может быть недостаточно для инициации синтеза эндоканнабинопдов, либо протокол стимуляции не вызывает достаточного входа кальция непосредственно в области синапса.

Не менее широко распространена в мозге рецептор-зависимая форма DSE, которая включает в себя кратковременную депрессию, вызываемую активацией метаботропных глутаматных рецепторов. Эта форма DSE не требует повышения уровня постсинаптического кальция, однако дополнительной вход ионов Са2+ усиливает величину депрессии по механизму кальций-сопряженного высвобождения ЭК.

Обе вышеописанные формы кратковременной депрессии возбуждающих входов вызываются либо искусственной деполяризацией постсинаптической мембраны, либо аппликацией агонистов соответствующих рецепторов. Возник вопрос, какие физиологические условия необходимы, чтобы вызвать каннабиноид-зависимую кратковременную депрессию? В мозжечке, а позднее и в базальных ядрах и стволе мозга была описана ещё одна форма кратковременной каннабиноидной регуляции синаптической передачи — синаптически вызванное подавление возбуждения (synaptically evoked suppression of excitation, SSE). В мозжечке повторная стимуляция параллельных волокон с различной частотой (от 2 до 50 Гц, 5-50 стимулов) вызвала как гомосинаптическую кратковременную депрессию тех же входов, так и гетеросинаптическую депрессию входов от лазающих волокон, которая блокировалась антагонистами СВ1-рецепторов. В мозжечке механизмом S SE является кальций-ассоциированный mGlu-рецептор-зависимый синтез эндоканнабиноидов (Maejima et al., 2005).

Мы обнаружили, что низкочастотная тетанизация 2-го кожного нерва, содержащего в том числе и отростки механо сенсорных плевральных нейронов, вызывает кратковременное, продолжительностью около 2 мин, снижение амплитуды моносинаптических ВПСП в гигантском плевральном интернейроне, которое дозозависимо блокировалось антагонистом СВ1 -рецепторов

АМ251. Полученные данные свидетельствуют об участии эндогенных каннабиноидов в кратковременной синапс-специфической регуляции глутаматергической моносинаптической связи между механосенсорными нейронами плеврального ганглия и гигантскими интернейронами плеврального и париетального ганглиев. Мы можем предположить, что найденный нами феномен является аналогом обнаруженного в мозжечке крыс синаптически вызванного подавления возбуждения.

2.5 Зависимость кратковременной каннабиноид-зависимой депрессии синаптической передачи от уровня серотонина

Мы обнаружили, что каннабиноид-зависимая SSE в нейронной оборонительной сети улитки вырабатывается в только в осенне-зимний период, а в весеннее-летней серии экспериментов низкочастотная стимуляция кожного нерва вызвала даже тенденцию к потенциации. Было показано, что одним из важных модуляторных факторов в нервной системе улитки, участвующих в том числе и в сезонных изменениях, является серотонин (Hiripi L, Salänki J., 1973; Шевелкин и др., 1997; Малышев и др., 1997; Solntseva & Nikitin, 2008). Кроме того, известно, что модуляторные серотонинергические нейроны как получают афферентные входы через 2-й кожный нерв, тетанизация которого вызывает SSE, так и сами дают отростки в этот нерв. Подтверждением участия серотонина в модуляции SSE являются результаты экспериментов, проведенных в летний период на животных, у которых активность серотонинергической системы подавлена введением нейронотоксина 5,7-ДГТ. У этих животных низкочастотная стимуляция кожного нерва вызывала SSE с теми же параметрами, что и в «осенне-зимних» экспериментах. Кроме того, с этими данными согласуется и т

91 зимний» эксперимент, в котором аппликация экзогенного серотонина подавляло выработку SSE. На препарате мембран мозжечка крыс было показано, что серотонин подавляет связывание некоторых синтетических каннабиномиметиков (агонистов WIN 55,212-2 и HU 210, но не СР-55,940) с СВ1-рецепторами (Devlin & Christopoulos, 2002). Таким образом, при высокой активности серотонинергической системы в весеннее-летний период отсутствие SSE можно объяснить двумя синергическими эффектами серотонина: уменьшением чувствительности СВ1-подобных рецепторов к каннабиноидным лигандам и потенцирующим действием серотонина на механосенсорные входы гигантских нейронов оборонительного поведения (Шевелкин и др., 1997, Zakharov et al., 1995; Balaban et al., 2001).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лемак, Мария Степановна, 2009 год

1. Балабан П.М., Захаров И.С. Обучение и развитие: общая основа двух явлений. М.: Наука, 1992.

2. Балабан Ü.M., Браваренко Н.И., Воронин JI.JL, Гусев П.В. Длительная потенциация в центральной нервной системе виноградной улитки после внутриклеточной тетанизации. Доклады Академии наук. 343(4): 563566, 1995.

3. Захаров И.С. Оборонительное поведение виноградной улитки. ЖВНД 42(6): 1156-70, 1992.

4. Иерусалимский В.Н., Захаров И.С., Палихова Т.А., Балабан

5. П.М. Нервная система и картирование нейронов брюхоногого моллюска Helix lucorum L. Журн. Высш. Нерен. Деят. 42(6): 1075-1089, 1992.

6. Коршунова Т.А. Кальцийзависимые формы пластичности в нейронной сети оборонительного поведения виноградной улитки. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, 2004.

7. Максимова O.A., Балабан П.М. Нейронные механизмы пластичности поведения. М. Наука. 1983. 126 с.

8. Малышев А.Ю., Браваренко Н.И., Пивоваров A.C., Балабан

9. П.М. Влияние уровня серотонина на постсинаптически индуцированную потенциацию ответов нейронов улитки. ЖВНД 47(3): 553-62, 1997.

10. Никитин В.П., Козырев С.А., Шевелкин A.B. Антагонисты NMDA-рецепторов глутамата избирательно влияют на синаптические механизмы ноцицептивной сенситизации у улитки. ЖВНД. 50(3): 686-96, 2000.

11. Хаспеков Л.Г., Бобров М.Ю. Эндогенная каннабиноидная система и ее защитная роль при ишемическом и цитотоксическом повреждении нейронов головного мозга . Нейрохимия 23: 85—105, 2006.

12. Шевелкин А.В., Никитин В.П., Козырев С.А., Самойлов М.О., Шерстнев В.В. Серотонин имитирует некоторые нейрональные эффекты ноцицептивной сенситизации у виноградной улитки. ЖВНД 47(3): 532542, 1997.

13. Adams IB, Martin BR. Cannabis: pharmacology and toxicology in animals and humans. Addiction 91: 1585-1614, 1996.

14. Albrecht MA, Colegrove SL, Friel DD. Differential regulation of ER Ca2+ uptake and release rates accounts for multiple modes of Ca2+-induced Ca2+ release. J Gen Physiol. 119(3): 211-33, 2002.

15. Angarano MB, McMahon RF, Schetz JA. Cannabinoids inhibit zebra mussel (Dreissena polymorpha) byssal attachment: a potentially green antifouling technology. Biofouling. 25(2): 127-38, 2009.

16. Ashton JC, Friberg D, Darlington CL, Smith PF. Expression of the cannabinoid CB2 receptor in the rat cerebellum: an immunohisto-chemical study. Neurosci Lett 396: 113-116, 2006.

17. Acosta-Urquidi J, Chase R. The effects of delta9-tetrahydrocan-nabinol on action potentials in the mollusc Aplysia. Can J Physiol Pharmacol. 53(5): 793-8, 1975

18. Balaban PM. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci Biobehav Rev. 26(5): 597-630, 2002.

19. Balaban P, Bravarenko N. Long-term sensitization and environmental conditioning in terrestrial snails. Exp Brain Res. 96(3): 487-93, 1993.

20. Balaban P.M., Korshunova T.A., Bravarenko N.I. Postsynaptic calcium contributes to reinforcement in a three-neuron network exhibiting associative plasticity. Eur J Neurosci. 19(2):227-33, 2004.

21. Balaban PM, Bravarenko N1, Maksimova OA, Nikitin E, Ierus-alimsky VN, Zakharov IS. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol Learn Mem. 75(1): 30-50, 2001.

22. Berdyshev, E.V. Inhibition of sea urchin fertilization by fatty acid ethanolamides and cannabinoids. Comp. Biochem. Physiol. 122: 327 -30, 1999.

23. Bisogno T, Berrendero F, Ambrosino G, Cebeira M, Ramos JA, Fernaudez-Ruiz JJ, Di Marzo V. Brain regional distribution of en-docannabinoids: implications for their biosynthesis and biological function. Biochem Biophys Res Commun. 256(2): 377-80, 1999.

24. Bisogno T, Maurelli S, Melck D, De Petrocellis L, Di Marzo V.

25. Biosynthesis, uptake, and degradation of anandamide and palmitoyleth-anolamide in leukocytes. J Biol Chem. 272(6): 3315-23, 19976.

26. Bisogno T, Ventriglia M, Milone A, Mosca M, Cimino G, Di Marzo V. Occurrence and metabolism of anandamide and related acyl-ethanolamides in ovaries of the sea urchin Paracentrotus lividus. Biochim Biophys Acta. 1345(3): 338-48, 1997a.

27. Braida D, Limonta V, Malabarba L, Zani A, Sala M. 5-HT1A receptors are involved in the anxiolytic effect of Delta9-tetrahydrocannabinol and AM 404, the anandamide transport inhibitor, in Sprague-Dawley rats. Eur J Pharmacol. 555(2-3): 156-63, 2007.

28. Bravarenko N.I., Korshunova T.A., Malyshev A. Y., P. M. Balaban. Synaptic contact between mechanosensory neuron and withdrawalinterneuron in terrestrial snail is mediated by 1-glutamate-like transmitter. Neuroscience Letters. 341: 237-40, 2003.

29. Brenowitz SD, Best AR, Regehr WG. Sustained elevation of dendritic calcium evokes widespread endocannabinoid release and suppression of synapses onto cerebellar Purkinje cells. J Neurosci 26: 68416850, 2006.

30. Brown SM, Wager-Miller J, Mackie K. Cloning and molecular characterization of the rat CB2 cannabinoid receptor. Biochim Biophys Acta 1576: 255-264, 2002.

31. Caterina MJ, Leffler A, Malmberg AB, Martin WJ, Trafton J, Petersen-Zeitz KR, Koltzenburg M, Basbaum AI, Julius D. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science. 288(5464):306-13, 2000.

32. Chang MC, Berkery D, Schuel R, Laychock SG, Zimmerman AM, Zimmerman S, Schuel H. Evidence for a cannabinoid receptor in sea urchin sperm and its role in blockade of the acrosome reaction. Mol ReprodDev 36(4):507-16, 1993.

33. Chevaleyre V, Castillo PE. Heterosynaptic LTD of hippocampal GABAergic synapses: a novel role of endocannabinoids in regulating excitability. NeuronSS: 461-472, 2003.

34. Dnrszon A, Beiträn C, Felix R, Nishigaki T, Trevino CL. Iontransport in sperm signaling. Dev Biol. 240(1): 1-14 2001.

35. Devane WA, Dysarz FA 3rd, Johnson MR, Melvin LS, Howlett

36. AC. Determination and characterization of a cannabinoid receptor in rat brain. Mol Pharmacol. 34(5): 605-13, 1988.

37. Devane WA, Hanus L, Breuer A, Pertwee RG, Stevenson LA, Griffin G, Gibson D, Mandelbaum A, Etinger A, Mechoulam R. Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor. Science 258: 1946-1949, 1992.

38. De Petrocellis L, Melck D, Bisogno T, Milone A, Di Marzo V.

39. Finding of the endocannabinoid signalling system in Hydra, a very primitive organism: possible role in the feeding response. Neuroscience 92(1): 377-87, 1999.

40. Di Marzo V, De Petrocellis L, Bisogno T, Melck D. Metabolism of anandamide and 2-arachidonoylglycerol: an historical overview and some recent developments. Lipids. 34 Suppl: S319-25? 1999.

41. Di Marzo V, Matias I. Endocannabinoid control of food intake and energy balance. Nat Neurosci 8: 585-589, 2005.

42. Elphick MR, Egertova M. The neurobiology and evolution of cannabinoid signalling. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sei 356: 381— 408, 2001.

43. Felder CC, Joyce KE, Briley EM, Mansouri J, Mackie K, Blond

44. O, Lai Y, Ma AL, Mitchell RL. Comparison of the pharmacology and signal transduction of the human cannabinoid CB1 and CB2 receptors. Mol Pharmacol 48: 443-450, 1995.

45. Frost WN, Kandel ER. Structure of the network mediating siphon-elicited siphon withdrawal in Aplysia. JNeurophysiol. 73(6): 241327, 1995.

46. Freund TF, Katona I, Piomelli D. Role of endogenous cannabin-oids in synaptic signaling. Physiol Rev 83: 1017-1066, 2003.

47. Gaoni Y, Mechoulam R. Isolation, structure and partial synthesis of an active constituent of hashish. J Am Chem Soc 86: 1646-1647, 1964.

48. Gerard C, Mollereau C, Vassart G, Parmentier M. Nucleotide sequence of a human cannabinoid receptor cDNA. Nucleic Acids Res 18: 7142, 1990.

49. Gerdeman GL, Ronesi J, Lovinger DM. Postsynaptic endocan-nabinoid release is critical to long-term depression in the striatum. Nat Neurosci 5: 446-451, 2002.

50. Gover TD, Abrains TW. Insights into a molecular switch that gates sensory neuron synapses during habituation in Aplysia. Neitrobiol Learn Mem. 92(2): 155-65,2009.

51. Herkenham M, Lynn AB, Johnson MR, Melvin LS, de Costa BR, Rice KC. Characterization and localization of cannabinoid receptors in rat brain: a quantitative in vitro autoradiographic study. J Neurosci 11: 563-583, 1991.

52. Hiripi L, Salanki J. Seasonal and activity-dependent changes of the serotonin level in the C.N.S. and heart of the snail (Helix pomatia L.). Comp Gen Pharmacol. 4(15):285-92, 1973.

53. Hohmann AG, Suplita RL, Bolton NM, Neely MH, Fegley D, Mangieri R, Krey JF, Walker JM, Holmes PV, Crystal JD, Duranti A, Toiitini A, Mor M, Tarzia G, Piomelli D. An endocannabinoid mechanism for stress-induced analgesia. Nature 435: 1108-1112, 2005.

54. Howlett AC. Pharmacology of cannabinoid receptors. Annu Rev Pharmacol Toxicol 35: 607-634, 1995.

55. Jimenez-Del-Rio M, Daza-Restrepo A, Velez-Pardo C. The cannabinoid CP55,940 prolongs survival and improves locomotor activity in Dro-sophila melanogaster against paraquat: implications in Parkinson's disease. Neurosci Res. 61(4): 404-11, 2008.

56. Julian MD, Martin AB, Cuellar B, Rodriguez De Fonseca F, Navarro M, Moratalla R, Garcia-Segura LM. Neuroanatomical relationship between type 1 cannabinoid receptors and dopaminergic systems in the rat basal ganglia. Neuroscience 119: 309—318, 2003.

57. Kano M, Ohno-Shosaku T, Hashimotodani Y, Uchigashima M, Watanabe M. Endocannabinoid-mediated control of synaptic transmission. Physiol Rev. 89(1): 309-80, 2009.

58. Katona I, Urban GM, Wallace M, Ledent C, Jung KM, Piomelli D, Mackie K, Freund TF. Molecular composition of the endocannabin-oid system at glutamatergic synapses. JNeurosci 26: 5628-5637, 2006.

59. Kawamura Y, Fukaya M, Maejima T, Yoshida T, Miura E, Watanabe M, Ohno-Shosaku T, Kano M. The CB1 cannabinoid receptor is the major cannabinoid receptor at excitatory presynaptic sites in the hippocampus and cerebellum. J Neurosci 26: 2991-3001, 2006.

60. Kishimoto Y, Kano M, Endogenous cannabinoid signaling through the CBj receptor is essential for cerebellum-dependent discrete motor learning. J Neurosci 26: 8829-8837, 2006.

61. Kreitzer AC, Carter AG, Regehr WG. Inhibition of interneuron firing extends the spread of endocannabinoid signaling in the cerebellum. Neuron 34: 787-796, 2002.

62. Kreitzer AC, Regehr WG. Cerebellar depolarization-induced suppression of inhibition is mediated by endogenous cannabinoids. J Neurosci 21 : RC174, 2001.

63. Lehtonen M, Reisner K, Auriola S, Wong G, Callaway JC.

64. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylgly-cerol in nematodes. Chem Biodivers. 5(11):2431-41, 2008.

65. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1): 265-75, 1951.

66. Lozovaya N, Min R, Tsintsadze V, Burnashev N. Dual modulation of CNS voltage-gated calcium channels by cannabinoids: Focus on CBI receptor-independent effects. Cell CalciumA6(3): 154-62, 2009.

67. Mackie K. Cannabinoid receptor homo- and heterodimeriza-tion. Life Sci 77: 1667-1673, 2005.

68. Mackie K. Mechanisms of CBI receptor signaling: endocannabin-oid modulation of synaptic strength./«/1 J Obes 30 Suppl 1: SI9-23, 2006.

69. Maejima T, Hashimoto K, Yoshida T, Aiba A, Kano M. Presynaptic inhibition caused by retrograde signal from metabotropic glutamate to cannabinoid receptors. Neuron 31: 463-475, 2001.

70. Maingret F, Patel AJ, Lazdunski M, Honore E. The endocan-nabinoid anandamide is a direct and selective blocker of the background K(+) channel TASK-1. EMBO J. 20(1-2): 47-54, 2001

71. Maldonado R, Valverde O, Berrendero F. Involvement of the endocannabinoid system in drug addiction. Trends Neurosci 29: 225-232, 2006.

72. Malyshev A.Y., Balaban P.M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87: 2364-71, 2002.

73. Malyshev A., Bravarenko N., Balaban P. Dependence of synaptic facilitation postsynaptically induced in snail neurones on season and serotonin level. Neuroreport, 8(5): 1179-82, 1997.

74. Marsicano G, Lutz B. Expression of the cannabinoid receptor CB1 in distinct neuronal subpopulations in the adult mouse foreb-rain. Eur J Neurosci 11: 4213-4225, 1999.

75. Marsicano G, Wotjak CT, Azad SC, Bisogno T, Rammes G, Cascio MG, Hermann H, Tang J, Hofmann C, Zieglgansberger W, Di Marzo V, Lutz B. The endogenous cannabinoid system controls extinction of aversive memories. Nature 418: 530-534, 2002.

76. Matsuda LA, Bonner TI, Lolait SJ. Localization of cannabinoid receptor mRNA in rat brain. J Comp Neurol 327: 535-550, 1993.

77. Matsuda LA, Lolait SJ, Brownstein MJ, Young AC, Bonner

78. TI. Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cDNAJVa/wre 346: 561-564, 1990.

79. Matias I, Bisogno T, Melck D, Vandenbulcke F, Verger-Bocquet M, De Petrocellis L, Sergheraert C, Breton C, Di Marzo V, Salzet M.

80. Evidence for an endocannabinoid system in the central nervous system ofthe leech Hirudo medicinalis. Brain Res Mol Brain Res. 87(2): 145-59 2001.

81. Matyas F, Yanovsky Y, Mackie K, Kelsch W, Misgeld U, Freund TF. Subcellular localization of type 1 cannabinoid receptors in the rat basal ganglia. Neuroscience 137: 337-361, 2006.

82. McFarland MJ, Porter AC, Rakhshan FR, Rawat DS, Gibbs RA, Barker EL. A role for caveolae/lipid rafts in the uptake and recycling of the endogenous cannabinoid anandamide. J Biol Chem 279: 41991-41997, 2004.

83. McCIean, D.K., Zimmerman, A.M. Action of delta9-tetrahy-drocannabinol on cell division and macromolecular synthesis in division-synchronized protozoa. Pharmacology 14: 307 21, 1976.

84. McPartland JM, Glass M. Functional mapping of cannabinoid receptor homologs in mammals, other vertebrates, and invertebrates. Gene. 312: 297-303, 2003.

85. McPartland JM. Phylogenomic and chemotaxonomic analysis of the endocannabinoid system. Brain Res Brain Res Rev. 45(1): 18-29, 2004.

86. Munro S, Thomas KL, Abu-Shaar M. Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids. Nature 365: 61—65, 1993.

87. Nunez E, Benito C, Pazos MR, Barbachano A, Fajardo O, Gonzalez S, Tolon RM, Romero J. Cannabinoid CB2 receptors are expressed by perivascular microglial cells in the human brain: an immuno-histochemical study. Synapse 53: 208-213, 2004.

88. Ohno-Shosaku T, Maejima T, Kano M. Endogenous cannabinoids mediate retrograde signals from depolarized postsynaptic neurons to presynaptic terminals. Neuron 29: 729-738, 2001.

89. Onaivi ES. Neuropsychobiological evidence for the functional presence and expression of cannabinoid CB2 receptors in the brain. Neuropsychobiology 54: 231-246, 2006.

90. Osborne NN, Pentreath VW. Effects of 5,7-dihydroxytryptamine on an identified 5-hydroxytryptamine-containing neurone in the central nervous sytem of the snail Helix pomatia. Br J Pharmacol. 56(l):29-38, 1976.

91. Oz M, Zhang L, Morales M. Endogenous cannabinoid, anandam-ide, acts as a noncompetitive inhibitor on 5-HT3 receptor-mediated responses in Xenopus oocytes. Synapse. 46(3): 150-6, 2002.

92. Pagotto U, Marsicano G, Cota D, Lutz B, Pasquali R. The emerging role of the endocannabinoid system in endocrine regulation and energy balance.Endocr Rev 27: 73—100, 2006.

93. Palkovits M, Harvey-White J, Liu J, Kovacs ZS, Bobest M, Lovas G, Bago AG, Kunos G. Regional distribution and effects of postmortal delay on endocannabinoid content of the human brain. Neuroscience 152(4): 1032-9, 2008.

94. Pamplona FA, Takahashi RN. WIN 55212-2 impairs contextual fear conditioning through the activation of CB1 cannabinoid receptors. Neurosci Lett397: 88-92, 2006.

95. Piomelli D. The molecular logic of endocannabinoid signalling. Nat Rev Neurosci. 4(11): 873-84, 2003.

96. Rawls SM, Rodriguez T, Baron DA, Raffa RB. A nitric oxide synthase inhibitor (L-NAME) attenuates abstinence-induced withdrawal from both cocaine and a cannabinoid agonist (WIN 55212-2) in Planaria. Brain Res. 1099(1): 82-7, 2006.

97. Pivovarov A.S., Nistratova V.L. Modulatory serotonin receptors on the soma of command neurons in edible snail. Bull Exp Biol Med. 136(2): 114-6, 2003.

98. Robinson L., McKillop-Smith S., Ross N.L., Pertwee R.G., Hampson R.E., Piatt B., Riedel G. Hippocampal endocannabinoids inhibit spatial learning and limit spatial memory in rats. Psychopharmaco-logy 198: 551-563, 2008.

99. Rodriguez-Martin I., de Velasco E.M., Rodriguez R.E. Characterization of cannabinoid-binding sites in zebrafish brain. Neurosci Lett. 413(3): 249-54, 2007.

100. Rossato M., Ion Popa F., Ferigo M., Clari G., Foresta C. Human sperm express cannabinoid receptor Cbl, the activation of which inhibits motility, acrosome reaction, and mitochondrial function. J Clin Endocrinol Metab. 90(2): 984-91, 2005.

101. Savinainen JR, Saario SM, Niemi R, Jarvinen T, Laitinen JT.

102. An optimized approach to study endocannabinoid signaling: evidence against constitutive activity of rat brain adenosine A1 and cannabinoid CB1 receptors. Br J Pharmacol. 140(8): 1451-9, 2003. .

103. Safo P.K., Regehr W.G. Endocannabinoids control the induction of cerebellar LTD. Neuron 48: 647-659, 2005.

104. Salzet M., Breton C., Bisogno T., Di Marzo V. Comparative biology of the endocannabinoid system possible role in the immune response. Eur J Biochem. 267(16): 4917-27, 2000.

105. Samarova E.I., Bravarenko N.I., Korshunova T.A., Gulyaeva N.V., Palotas A., Balaban P.M. Effect of beta-amyloid peptide on behavior and synaptic plasticity in terrestrial snail. Brain Res Bull. 67(1-2): 40-5, 2005.

106. Sepe N., De Petrocellis L., Montanaro F., Cimino G., Di Marzo

107. V. Bioactive long chain N-acylethanolamines in five species of edible bivalve molluscs: possible implications for mollusc physiology and sea food industry. Biochim. Biophys. Acta 1389: 101 11, 1998.

108. Schuel H., Burkman L.J. A Tale of Two Cells: Endocannabinoid-Signaling Regulates Functions of Neurons and Sperm. Biol Reprod. 73(6): 1078-86, 2005.

109. Schinid HH, Schmid PC, Natarajan V. N-acylated glycerophos-pholipids and their derivatives. Prog Lipid Res. 29(1): 1-43, 1990.

110. Schmid PC, Krebsbach RJ, Perry SR, Dettmer TM, Maasson JL, Schmid HH. Occurrence and postmortem generation of anandamide and other long-chain N-acylethanolamines in mammalian brain. FEBS Lett. 375(1-2): 117-20, 1995.

111. Schuel, H., Chang, M.C., Berkery, D., Schuel, R., Zimmerman, A.M., Zimmerman, S. Cannabinoids inhibit fertilization in sea urchins by reducing the fertilizing capacity of sperm. Pharmacol. Biochem. Be-hav. 40: 609 15, 1991.

112. Song ZH, Bonner TI. A lysine residue of the cannabinoid receptor is critical for receptor recognition by several agonists but not WIN55212-2. Mol Pharmacol 49: 891-896, 1996.

113. Solntseva SV, Nikitin VP. Serotonin and NMDA glutamate receptor antagonists selectively impair the reactivation of associative memory in the common snail. Neurosci Behav Physiol. 38(7):687-936 2008.

114. Starowicz K, Nigam S, Di Marzo V. Biochemistry and pharmacology of endovanilloids. Pharmacol Ther. 114(1): 13-33,2007.

115. Stefano, G.B., Liu, Y. & Goligorsky, M.S. Cannabinoid receptors are coupled to nitric oxide release in invertebrate immunocytes, microglia, and human monocytes. J. Biol. Chem. 271, 19238 42, 1996.

116. Stefano, G.B., Salzet, B. & Salzet, M. Identification and characterization of the leech CNS cannabinoid receptor: coupling to nitric oxide release. Brain Res. 753, 219 24, 1997.

117. Straiker A, Mackie K. Depolarization-induced suppression of excitation in murine autaptic hippocampal neurones. J Physiol 569: 501517, 2005.

118. Straiker A, Mackie K. Metabotropic suppression of excitation in murine autaptic hippocampal neurons. J Physiol 578: 773-785, 2007.

119. Sugiura T, Kondo S, Sukagawa A, Nakane S, Shinoda A, Itoh K, Yamashita A, Waku K. 2-ArachidonoylgIycerol: a possible endogenous cannabinoid receptor ligand in brain. Biochem Biophys Res Commun 215: 89-97, 1995.

120. Tian X, Guo J, Yao F, Yang DP, Makriyannis A. The conformation, location, and dynamic properties of the endocannabinoid ligand anandamide in a membrane bilayer. J Biol Chem 280: 29788-29795, 2005.

121. Tsou K, Brown S, Sanudo-Pena MC, Mackie K, Walker JM. Immunohistochemical distribution of cannabinoid CB1 receptors in the rat central nervous system. Neuroscience 83: 393-411, 1998.

122. Varma N, Carlson GC, Ledent C, Alger BE. Metabotropic glutamate receptors drive the endocannabinoid system in hippocampus. J Neurosci 21: RC188, 2001.

123. Varvel SA, Lichtman AH. Evaluation of CBi receptor knockout mice in the Morris water mazq. J Pharmacol Exp Ther 301: 915-924, 2002.

124. Veale EL, Buswell R, Clarke CE, Mathie A. Identification of a region in the TASK3 two pore domain potassium channel that is criticalfor its blockade by methanandamide. Br J Pharmacol. 152(5): 778-86, 2007.

125. Vehovszky A., Kemenes G., Hiripi L. and Hernadi L. Reversible effect of 5,6-DHT treatment on Helix: a combined behavioral, electrophysiological and biochemical study. Symposia Biologica Hungarica 36: 403-9, 1988.

126. Wager-Miller J, Westenbroek R, Mackie K. Dimerization of G protein-coupled receptors: CB1 cannabinoid receptors as an example. Chem Phys Lipids 121: 83-89, 2002.

127. Wilson RI, Nicoll RA. Endogenous cannabinoids mediate retrograde signalling at hippocampal synapses. Nature 410: 588-592, 2001.

128. Yazulla S, Studholme KM, Mcintosh HH, Deutsch DG. Immuno-cytochemical localization of cannabinoid CB1 receptor and fatty acid amide hydrolase in rat retina. J Comp Neurol. 415(1): 80-906 1999.

129. Zakharov I.S., Ierusalimsky V.N., Balaban P.M. Pedal serotonergic neurons modulate the synaptic input of withdrawal interneurons in Helix. Invertebrate Neurosciencel: 41-52, 1995.

130. Zygmunt PM, Petersson J, Andersson DA, Chuang H, Sorgard M, Di Marzo V, Julius D, Hogestatt ED. Vanilloid receptors on sensoiy nerves mediate the vasodilator action of anandamide. Nature. 400(6743): 452-7, 1999.