Изучение возможности применения рекомбинантного белка HSP70 туберкулезной микобактерии в профилактике туберкулеза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Калюкина, Арина Сергеевна

• Калюкина, Арина Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Калюкина, Арина Сергеевна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1.Туберкулез, сведения о заболевании.

2.1.1. Определение.

2.1.2. Классификация.

2.1.3. Эпидемиология.

2.1.4. Характеристика возбудителя туберкулеза.

2.1.5. Патогенез туберкулеза.

2.1.6. Диагностика туберкулеза.

2.1.7. Профилактика туберкулеза.

2.2. Создание новых противотуберкулезных вакцин.

2.2.1.Модификация штаммов БЦЖ.

2.2.2. Создание ДНК-вакцин.

2.2.3. Субъединичные вакцины.

2.2.4. Предпосылки к созданию субъединичной вакцины на основе белков теплового шока.

2.2.5. Выбор адъюванта.

2.2.6. Теоретические предпосылки для создания конъюгированной противотуберкулезной вакцины на основе белков теплового шока и адъюванта полиоксидония.

3. Материалы и методы исследования.

4. Результаты и их обсуждение.

4.1. Получение рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70.

4.2. Изучение физико-химических свойств рекомбинантного белка HSP70, важных для последующей конъюгации с адъювантом.

4.3. Очистка полученного рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 от эндотоксина.

4.4. Изучение условий хранения белка HSP70.

4.5. Изучение влияния рекомбинантного белка HSP70 на иммунный ответ на мышах.

4.6. Повышение антигенных свойств рекомбинантного белка HSP70 за счет коньюгирования с полиоксидонием.

4.7. Изучение влияния рекомбинантного белка HSP70 и его конъюгата с полиоксидонием на Т-клеточный и гуморальный иммунный ответ на мышах.

4.7.1. Оценка гуморального (антительного) ответа.

4.7.2. Оценка Т-клеточного ответа.

5. Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение возможности применения рекомбинантного белка HSP70 туберкулезной микобактерии в профилактике туберкулеза»

Туберкулез - болезнь, являющаяся одной из самых актуальных проблем мирового здравоохранения, ежегодно уносит жизни более 1 млн. человек (Dye С. et al., 2005). В нашей стране туберкулез продолжает оставаться одной из наиболее распространенных инфекций и представляет огромную опасность для здоровья населения. В последние годы туберкулез стал характеризоваться более тяжелым течением в сочетании с полирезистентностью возбудителя болезни Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным лекарствам (Попович В.К., 2005; Соловьева И.П., 1998).

Следовательно, одной из важнейших задач, стоящих перед современной медициной, является разработка новых методов предупреждения заболевания туберкулезом.

За последние годы был сделан ряд значительных открытий в области изучения патогенеза заболевания, особенностей его возбудителя.

Одним из значимых достижений науки последних двух десятилетий явилось открытие и изучение функций белков теплового шока. Данные несколько групп белков присутствуют в клетках любого организма и являются необходимыми в целом ряде процессов. Так, эти белки исполняют роль молекулярных шаперонов (т.е. являются белками -дуэньями), которые необходимы для приобретения биологически активных конформаций вновь синтезированными белками. У позвоночных белки теплового шока выполняют важные роли в иммунной системе, связываясь с антигенами патогенных микроорганизмов и антигенами, специфическими для злокачественных опухолей (Pierce S.K., 1994). Клетки иммунной системы имеют рецепторы к белкам теплового шока, в результате чего эти комплексы вызывают сильный иммунный ответ (Wang Y. et al., 2001). Кроме этого, сами по себе белки теплового шока патогенных микроорганизмов являются одними из наиболее сильных антигенов (Heikema A. et al., 1997; Zugel U. et al., 2001). Одним из наиболее перспективных направлений создания новых генно-инженерных вакцин является использование белков теплового шока либо как иммуногенов, либо носителей белков-иммуногенов.

Основным средством профилактики является вакцина БЦЖ (BCG -Bacille de Calmette et de Guerin) - живая противотуберкулезная вакцина из аттенуированного штамма микобактерий туберкулеза. Эта вакцина была создана в 1921 году французскими учеными Альбером Кальметом и Камиллом Гереном путем пассирования культуры микобактерий бычьего типа (М tuberculosis typ. bovis). До настоящего времени вакцина БЦЖ является единственным препаратом, применяемым для специфической профилактики туберкулеза. Вакцина вызывает Т-клеточный иммунный ответ. Принцип защитного действия прививки против туберкулеза заключается в ограничении распространения возбудителя из места первичной инфекции гематогенным путем, что снижает риск развития заболевания и реактивации процесса. Вакцина БЦЖ обеспечивает защиту от форм первичного туберкулеза, она наиболее эффективна при введении до момента инфицирования. Эффективность защитного действия вакцины БЦЖ значительно варьирует, от высоких процентов предупреждения развития туберкулеза у детей (92-100%) (Митинская JI.A, 2001), у взрослого населения она не подтверждается (0 - 80%) (Grange J.M., 2000). Определенную проблему при применении вакцины БЦЖ составляет, во-первых, гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ), индуцируемая вакцинацией, которую сложно отличить от ГЗТ, вызванной М. tuberculosis. Следовательно, использование туберкулина (комплекса белков туберкулезной микобактерии) в кожных тестах для диагностических и эпидемиологических целей, влечет за собой сложности, связанные с дифференциальной диагностикой собственно туберкулезной инфекции и поствакцинальной аллергии (Lowrie, D.B. et al., 1995). Во-вторых, поскольку БЦЖ является живой вакциной, ее применение противопоказано при иммунодефицитных состояниях (в т.ч. ВИЧ-инфекции), так как возможно развитие туберкулеза (Mustafa A.S., 2001).

Следовательно, перспективным является поиск новых методов профилактики туберкулеза, основанный на последних достижениях науки в области изучения возбудителя заболевания и его патогенеза.

Основные направления поиска новой противотуберкулезной вакцины лежат в сфере создания субъединичных вакцин в сочетании с разрешенными для применения у человека адъювантами. Субъединичными называют вакцины, которые содержат только отдельные компоненты патогенного микроорганизма - рекомбинантные белки или синтетические пептиды, содержащие основные эпитопы антигенов, активно распознаваемые иммунной системой хозяина. Достоинства субъединичных вакцин заключаются в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызвать нежелательные эффекты в организме-хозяине. В качестве основного компонента для прототипа противотуберкулезной вакцины был выбран белок теплового шока М. tuberculosis, принадлежащий к семейству HSP70 (heat shock protein, молекулярная масса 70 кД).

Исходя из этого, целью данного исследования являлось: изучение возможности применения рекомбинантного белка Mycobacterium tuberculosis HSP70 для профилактики туберкулеза в качестве компонента прототипа противотуберкулезной вакцины.

В соответствии с целью исследования в работе решались следующие экспериментальные задачи:

- разработка методов получения рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70;

- получение рекомбинантного белка HSP70 в форме, пригодной для проведения доклинических исследований (чистота, отсутствие деградации, минимальное содержание эндотоксинов);

- изучение физико-химических свойств рекомбинантного белка HSP70, важных для последующей конъюгации с адъювантом;

- изучение влияния рекомбинантного белка HSP70 на Т-клеточный иммунный ответ на мышах;

- повышение антигенных свойств рекомбинантного белка HSP70 за счет коньюгации с полиоксидонием;

- изучение влияния рекомбинантного белка HSP70 и его конъюгата с полиоксидонием на гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ.

Основными результатами проведенной работы явились: получение рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 в форме, пригодной для дальнейших исследований; изучение его физико-химических свойств, важных для конъюгации с адъювантом; была охарактеризована in vivo способность рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 к стимулирующему влиянию на Т-клеточный иммунный ответ; впервые был получен конъюгат рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 и адъюванта полиоксидония, изучены его параметры; было проведено изучение антигенных свойств прототипа субъединичной противотуберкулезной вакцины на основе конъюгата рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 и полиоксидония на мышах. Обнаруженый потенциал прототипа конъюгированной субъединичной противотуберкулезной вакцины можно охарактеризовать как высокий, что делает возможным развитие этого направления в области создания новых препаратов, предназначенных для профилактики туберкулеза.

Положения, выносимые на защиту.

Получение рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 в форме, пригодной для проведения предклинических испытаний (чистота, отсутствие деградации, отсутствие содержания эндотоксина).

Экспериментально подтвержденные иммуногенные свойства рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 на мышах.

Получение конъюгата рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 и адъюванта полиоксидония.

Экспериментально подтвержденное усиление иммуногенных свойств конъюгата рекомбинантного белка М. tuberculosis HSP70 и адъюванта полиоксидония.

2. Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Калюкина, Арина Сергеевна

Результаты исследования были доложены на клинической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической медицины» (декабрь 2003, Москва), XIII Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (апрель 2005, Москва), Международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (ноябрь 2005, Москва), Международной конференции «Basic Science for Biotechnology and Medicine» (сентябрь 2006, Новосибирск), международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (ноябрь 2006, Москва-Пущино), а также научных семинарах Всероссийского Научного Центра молекулярной диагностики и лечения и семинарах кафедры биологической химии ММА им. И.М. Сеченова.

Апробация работы состоялась на совместном заседании научно-методической конференции кафедры биологической химии ММА им. И.М. Сеченова 6 декабря 2006 г.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Калюкина, Арина Сергеевна, 2007 год

1. Авдеев В.Г. Методы определения концентрации белка // Вопросы медицинской химии. 1977. - Т. 23, №4. - С.562-571.

2. Аксенова В.А., Леви Д.Т., Закирова Н.Р. Современные проблемы вакцинопрофилактики туберкулеза у детей // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 1999. №1. - С.3-6.

3. Барсов Б.В. Туберкулез. Профилактика и методы лечения. М.: Центрполиграф, 2006. - 127 с.

4. Вакцинопрофилактика: Руководство для врачей / Таточенко В.К., Озерецковский Н.А., Соколова А.Ф. М., 1994. - С. 45 - 47.

5. Васильева A.M., Меметов С.С., Назарец О.В. Туберкулез как медико-социальная проблема // Медико-соц. экспертиза и реабилитация. -2003. №4. С.37-40.

6. Глебович О.В. и др. Туберкулез / Глебович О.В., Володин Е.И., Зарецкий В.Ф. Ленинград, 1978. - 192 с.

7. Греймер М.С., Фейгин М.И. Раннее выявление туберкулеза легких. -Ленинград: Медицина, 1986. 144 с.

8. Дворецкий Л.И., Тихонова Г.Н., Дедова И.С. Милиарный туберкулез в старческом возрасте // Русский медицинский журнал. 1999. Т.7, №5.-С. 388-391.

9. Ерохин В.В. Клеточная и субклеточная морфология репаративных процессов при туберкулезе легких // Проблемы Туберкулеза. 1996. №6.-С. 10-14.

10. Коломиец В.М., Евглевский А.А. и др. Перспективность поиска новых биопрепаратов для профилактики туберкулеза // Проблемы туберкулеза. 2002. №10. - С.31 - 33.

11. Литвинов В.И., Мороз A.M., Гергерт В.Я. Достижения и перспективы исследований в области иммунологии и иммуногенетики туберкулеза // Проблемы Туберкулеза. 1996. № 6. -С. 14-18.

12. Ломако М.Н. Руководство по фтизиатрии / Ломако М.Н., Судник С.И., Соболь С.А. Минск: Вышейшая школа. - 1991. - 302 с.

13. Львова Л.В. Альтернатива БЦЖ // Провизор. 2001. № 18.- С. 28 -35.

14. Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование / Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. М.: Мир, 1984. - 480 с.

15. Маркелов Ю.М. Ранняя диагностика и профилактика туберкулеза: Учеб. пособие / Маркелов Ю.М., Федоровых B.C. Петрозаводск: Изд-во ПетрГУ, 2000. - 56 с.

16. Меве Е.Б. Туберкулинодиагностика. Минск, Беларусь, 1970. -152 с.

17. Медведев С.Ю. Из истории селекции вакцинного штамма для БЦЖ-вакцины // Вакцинация — 2002. № 1(19). С. 6- 10.

18. Микробиология: Учебник / Воробьев А.А., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова A.M. М.: Медицина, 1999. - С. 241-243.

19. Митинская J1.A. 80 лет применения вакцины БЦЖ // Проблемы туберкулеза. 2001. №1. - С.51 - 53.

20. Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Жербун А.Б. Возбудитель туберкулеза в современных условиях // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2003. №4. - С. 13-15.

21. Перельман М.И. Туберкулез. М.: Медицина, 1990. - 304 с.

22. Пинегин Б.В., Сараф А.С. Механизм действия и клинического применения отечественного иммуномодулятора полиоксидония. М. 2001. - С.10- 12.

23. Попович В.К. Динамика показателя смертности от туберкулеза в России. // Проблемы социальной гигиены, здравоохранения и истории медицины. 2005. № 3. - С. 14-17.

24. Попович В.К., Соловьева И.П. Эпидемия туберкулеза в морфологическом освещении // Архив патологии. 1998. №1. - С. 30 -34.

25. Путов Н.В и др. Справочник по пульмонологии / Путов Н.В., Федосеев Г.Б., Хоменко А.Г. Ленинград: Медицина, 1987. - 224 с.

26. Свирщевская Е.В., Митрофанов B.C., Шендерова Р.И., Чужова Н.М. Иммунитет при туберкулезе и аспергиллезе (обзор) // Проблемы медицинской микологии.- 2005. Т.7, №1. - С.3-13.

27. Ситников А.Г. и др. JTAJT-тест. Современные подходы к определению пирогенности / Ситников А.Г., Глазова Н.В., Травина Л.А., Багирова В.Л. — СПб., 1994. — 105 с.

28. Соловьева И.П. Эпидемия туберкулеза в морфологическом освещении // Архив патологии. 1998. №1. - С. 30 - 34.

29. Струков А.И. Морфология туберкулеза в современных условиях. -М.: Медицина, 1986. 232 с.

30. Федоровых B.C. и др. Ранняя диагностика и профилактика туберкулеза: Учебное пособие / Федоровых B.C., Маркелов Ю.М. -ПетрГУ. Петрозаводск, 2001. 70 с.

31. Хоменко А.Г. Современные представления о патогенезе туберкулеза // Русский медицинский журнал. 1998. - Т. 6., №17. - С. 810-814.

32. Хоменко А.Г. Туберкулез. М. - 1996.

33. Хоменко А.Г. Туберкулез как глобальная и национальная проблема здравоохранения // Большой целевой журнал о туберкулезе. 1998. №1.-С. 8-11.

34. Хоменко А.Г. и др. Туберкулёз органов дыхания / Хоменко А.Г., Авербах М.М., Александрова А.В. М.: Медицина, 1988. - 456 с.

35. Шилова М.В. Туберкулез в России в 1999. М., 2000. - С.48 - 49. 44.Чучалин, А.Г. Новые данные иммунных реакций при туберкулёзе //

36. Русский медицинский журнал. 2004. №2. - С.88-90.

37. Шлегель Г. Общая микробиология / Пер. с нем. М.: Мир, 1987. -566 с.

38. Щупак Н.Г. Внелегочный туберкулез в клинике внутренних заболеваний. Ленинград: Медгиз, 1962. - 192 с.

39. Abel В., Thieblemont N., Quesniaux V.J. Toll-like receptor 4 expression is required to control chronic Mycobacterium tuberculosis infection in mice // J. Immunol. 2002. - Vol. 169(6): - P. 3155-3162.

40. Allen M.J., Laederach A., Reilly P.J., Mason RJ. Polysaccharide recognition by surfactant protein D: novel interactions of a C-type lectin with nonterminal glucosyl residues // Biochemistry. 2001. - Vol. 40 (26) - P. 7789-7798.

41. Alter-Koltunoff M., Ehrlich S., Dror N. Nrampl-mediated innate resistance to intraphagosomal pathogens is regulated by IRF-8, PU.l, and Miz-1 //J. Biol. Chem.- 2003. Vol. 278(45) - P. 44025-44032.

42. Ashitani J., Mukae H., Hiratsuka T. Elevated levels of alpha-defensins in plasma and BAL fluid of patients with active pulmonary tuberculosis // Chest. 2002. - Vol. 121(2) - P. 519-26.

43. Attanasio R., Pehler K., McClure H.M. Immunogenicity and safety of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins in non-human primates // Clin. Exp. Immunol. 2000. - Vol. 119(1). - P. 84 - 91.

44. Baldwin S.L. Immunogenicity and protective efficacy of DNA vaccines encoding secreted and nonsecreted forms of Mycobacterium tuberculosis Ag85A // Tuber. Lung Dis. 1999. - Vol. 79 (4). - P. 251 - 259.

45. Baldwin S.L., D'Souza С., Roberts A.D., Kelly B.P., Frank A.A., Lui M.A., Ulmer J.B., huygen K., McMurray D.N., Orme I.M. Evaluation of new vaccines in the mouse and guinea pig model of tuberculosis // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 2951 - 2959.

46. Baron S. et al. Medical Microbiology Fourth Edition. / Baron S., Peake R.C., James D.A., Susman M., Kennedy C.A., Singleton M.J.D., Schuenke S. The University of Texas Medical Branch at Galveston, 1996-963 p.

47. Bartow R.A., McMurray D.N. Cellular and humoral immune responses to mycobacterial stress proteins in experimental pulmonary tuberculosis // Tubercle and Lung Disease. 1997. № 3 - 4. - P. 185-193.

48. Baumann S., Eddine A.N., Kaufmann S.H. Progress in tuberculosis vaccine development // Curr Opin Immunol. 2006. - Vol. 18(4). -P. 438-448.

49. Blackwell J.M., Searle S., Mohamed H., White J.K. Divalent cation transport and susceptibility to infectious and autoimmune disease: continuation of the Ity/Lsh/Bcg/Nrampl/Slcl lal gene story // Immunol. Lett. 2003. - Vol. 85(2) - P. 197-203.

50. Brandt L., Elhay M.J., Rosenkrands I., Lindblad E.B., Andersen P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68. - P. 791 -795.

51. Brandt L., Oettinger Т., Holm A., Andersen A.B., Andersen P. Key epitopes on the ESAT-6 antigen recognized in mice during the recall of protective immunity to Mycobacterium tuberculosis // J. Immunol. -1996. Vol. 157(8). - P. 3527 - 3533.

52. Branger J., Leemans J.C., Florquin S. Toll-like receptor 4 plays a protective role in pulmonary tuberculosis in mice // Int. Immunol. 2004. -Vol. 16(3)-P. 509-516.

53. Chakraborty A.K. Epidemiology of tuberculosis: current status in India // Indian J. Med. Res.- 2004. Vol. 120(4). - P. 248-276.

54. Cho S., Mehra V., Thoma-Uszynski S., Stenger S., Serbina N., Mazzaccaro R., Flynn J.L., Barnes P.F., Southwood S., Celis E.

55. Antimicrobial activity of MHC class I restricted CD8+ T cells in human tuberculosis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - P. 12210.

56. Cо D.O., Hogan L.H, Kim S.I., Sandor M. Mycobacterial granulomas: keys to a long-lasting host-pathogen relationship // Clin. Immunol. 2004. -Vol. 113(2)-P. 130- 136.

57. Collins R.N. Rab and ARF GTPase regulation of exocytosis // Mol. Membr. Biol. 2003. - Vol. 20(2) - P. 105 -115.

58. Dannenberg A.M. Pathogenesis of pulmonary Mycobacterium bovis infection: basic principles established by the rabbit model // Tuberculosis. -2001.-Vol. 81: (12).-P. 87-96.

59. Del Giudice G. Hsp70: a carrier molecule with built-in adjuvanticity // Experientia. 1994. № 50. - P. 1061 - 1066.

60. Dye C., Watt C.J., Bleed D.M., Hosseini S.M., Raviglione M.C. Evolution of tuberculosis control and prospects for reducing tuberculosis incidence, prevalence, and deaths globally. // JAMA. 2005. - Vol. 293, №22.-P. 2767-2775.

61. Ellis S.M. The spectrum of tuberculosis and non-tuberculous mycobacterial infection// Eur. Radiol. 2004. - Vol. 14. - Suppl. 3. - P. 34 -42.

62. Flynn, J.L., Goldstein M.M., Triebold K.J., Koller В., Bloom B.R. Major histocompatibility complex class I-restricted T cells are required for resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. // Infect Agents Dis. -1993. №2 (4).-P. 259-262.

63. Flynn, J.L., Chan J. 2001. Immunology of tuberculosis // Curr Opin Immunol. 2003. №15 (4). - P.450-455.

64. Forreiter C. Nover Lutz Heat induced stress proteins and the concept of molecular chaperones // J. Biosci. 1998. № 4. - P. 287-302.

65. Grange J.M. Effective vaccination against tuberculosis a new ray of hope // Clin, and Exp. Immunol. - 2000. № 2. - P. 232 - 234.

66. Granucci F., Zanoni I., Feau S., Ricciardi-Castagnoli P. Dendritic cell regulation of immune responses: a new role for interleukin 2 at the intersection of innate and adaptive immunity // EMBO J. 2003. -Vol. 22(11)-P. 2546-2551.

67. Govoni G., Vidal S., Gauthier S., Skamene E., Malo D., Gros P. The Bcg/Ity/Lsh locus: genetic transfer of resistance to infections in C57BL/6J mice transgenic for the Nrampl Glyl69 allele // Infect. Immunity. 1996. -Vol. 164, №8.-P. 2923-2929.

68. Gottesman S., Wickner S., Maurizi M.R. Protein quality control: Triage by chaperones and proteases // Genes and Dev. 1997. № 7. - P. 815 -823.

69. Guleria I., Teitelbaum R., McAdam R.A., Kalpana G., Jacobs W.R., Bloom B.R. Auxotrophic vaccines for tuberculosis // Nat Med. 1996. №2(3).-P. 334-337.

70. Hayashi F., Means Т.К., Luster A.D. Toll-like receptors stimulate human neutrophil function // Blood. -2003. Vol. 102(7) - P.2660-2669.

71. Heikema A., Agsteribbe E., Wiscjut J., Huckriede A. Generation of heart shock-protein-based vaccines by intracellular loading of gr96 with antigenic peptides // Immunol. Lett. 1997. - Vol. 57. - P. 69-74.

72. Higa A., Mandel M. Actinomycin sensitive mutants of Escherichia coli K-12 // Mol Gen Genet. 1970. -Vol. 108(1). - P.41-46.

73. Hirata Т., Osuga Y., Hirota Y., Koga K. Evidence for the presence of tolllike receptor 4 system in the human endometrium // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2005. - Vol.90 (1). - P.548-556.

74. Horwitz M.A., Lee B.-W. E., Dillon B.J., Harth G. Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination with major extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1995.-Vol. 92.-P. 1530-1534.

75. Jabado N. and Gros P. Tuberculosis: The genetics of vulnerability // Nature. 2005. - Vol. 434. - P. 709-711.

76. Kato Т., Sakamoto E., Kutsuna H. Proteolytic conversion of STAT3alpha to STAT3gamma in human neutrophils: role of granule-derived serine proteases // J. Biol. Chem. 2004. - Vol.279 (30) - P. 31076-3180.

77. Kiang J.G. and Tsokos G.C. Heat shock protein 70 kD: Molecular Biology, Biochemistry and Physiology Pharmacology // Therapy. 1998. -Vol. 80, №2.-P. 183-201.

78. Kobayashi К., Kaneda К., Kasama Т. Immunopathogenesis of delayed-type hypersensitivity // Microsc. Res .Tech. 2001. - Vol. 53(4) - P. 241245.

79. Kulka M., Alexopoulou L., Flavell R.A., Metcalfe D.D. Activation of mast cells by double-stranded RNA: evidence for activation through Tolllike receptor 3 // J. Allergy Clin. Immunol.- 2004. Vol.114 (1) - P. 174182.

80. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol. 227(5259). - P. 680685.

81. Laff S.A., Langolis R.J. Flow cytometry and sorting / ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L. Mendelson. 2nd edn. - New York: Wiley - Liss, 1990.-P. 249-290.

82. Lachmann H.J., Strangeways L., Vyakarmam A. and Evans G. Raising antibodies by coupling peptides PPD and immunizing BCG-sensitized animals // Ciba Found. Symp. 1986. - Vol. 119. - P. 25-27.

83. Lazarevic V., Flynn J. CD8 T cells in tuberculosis // American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2002. - Vol. 166. - P. 11161121.

84. Lewinsohn D., Alderson M., Briden A., Riddell S., Reed S., Grabstein K. Characterization of human CD8+ T cells reactive with Mycobacteriumtuberculosis-infected antigen presenting cells // J. Exp. Med. 1998. -Vol. 187(10).-P. 1633-1640.

85. Li Z. Immunogenicity of DNA vaccines expressing tuberculosis proteins fused to tissue plasminogen activator signal sequences // Infect. Immun. -1999. Vol. 67 (9). - P. 4780 - 4786.

86. Liang L., Sha W.C. The right place at the right time: novel B7 family members regulate effector T cell responses // Curr. Opin. Immunol. -2002.-Vol. 14 (3). P.384 -390.

87. Liu W., Cao W.C., Zhang C.Y. VDR and NRAMP1 gene polymorphisms in susceptibility to pulmonary tuberculosis among the Chinese Han population: a case-control study // Int. J. Tuberc. Lung Dis. -2004.-Vol. 8(4) P.428-434.

88. Lowrie D.B., Teskon R.E., Silva C.L. Vaccination against tuberculosis // Int. Arch. Allergy Immunol. 1995. - Vol. 108(4). - P.309-312.

89. Lowrie D.B. Protection against tuberculosis by a plasmid DNA vaccine // Vaccine. 1997. - Vol. 15 (8). - P. 834 - 838.

90. McCormack F.X., Gibbons R., Ward S.R. Macrophage-independent fungicidal action of the pulmonary collectins // J. Biol. Chem. 2003. -Vol. 278(38) - P. 36250-36256.

91. Mombo L.E., Lu C.Y., Ossari S., Bedjabaga I., Sica L., Krishnamoorthy R., Lapoumeroulie C. Mannose-binding lectin alleles insub-Saharan Africans and relation with susceptibility to infections // Genes Immun. -2003. Vol. 4(5). - P. 362-367.

92. Muller I., Cobbold S.P., Waldmann H., Kaufmann S.H. Impaired resistance to Mycobacterium tuberculosis infection after selective in vivo depletion of L3T4+ and Lyt-2+ T cells // Infect Immun. 2001. -Vol. 55(9).-P. 2037-2041.

93. Mustafa A.S. Biotechnology in the Development of new Vaccines and Diagnostic Reagents Against Tuberculosis // Current Pharmaceutical Biotechnology 2001. - Vol. 2. - P. 157 - 173.

94. Nogee L.M. Genetic mechanisms of surfactant deficiency // Biol. Neonate. 2004. - Vol. 85(4). - P. 314 - 318.

95. North R.J., Jung Y.J. Immunity to tuberculosis // Annu. Rev. Immunol. -2004.-Vol.22.-P. 599-623.

96. Olsen A.W., van Pinxteren L.A.H., Okkels L.M., Rasmussen P.B., Andersen P. Protection of mice with a tuberculosis subunit vaccine based on a fusion protein of antigen 85B and ESAT-6 // Infection and Immunity. 2001. - Vol. 69, №5. - P. 2773 - 2778.

97. Ormerod M.G. (ed.) Flow cytometry; A practical approach / IRL Press. -Oxford.- 1990.-P. 119-135.

98. Pedroza-Gonzalez A, Garcia-Romo G.S., Aguilar-Leon D. In situ analysis of lung antigen-presenting cells during murine pulmonaryinfection with virulent Mycobacterium tuberculosis // Int. J. Exp. Pathol. -2004.-Vol. 85(3)-P. 135-145.

99. Pehler K., Brasky K.M., Butler T.M., Attanasio R. Mycobacterium tuberculosis-secreted protein antigens: immunogenicity in baboons // J. Clin. Immunol. 2000. - Vol. 20(4). - P. 306 - 316.

100. Pierce S.K. Molecular chaperones in the processing and presentation of antigen to helper T cells // Experientia. № 50. - 1994. - P. 1026 - 1030.

101. Philpott D.J., Girardin S.E. The role of Toll-like receptors and Nod proteins in bacterial infection // Mol. Immunol. 2004. - Vol. 41(11) - P. 1099-1108.

102. Proud D., Sanders S.P., Wiehler S. Human rhinovirus infection induces airway epithelial cell production of human beta-defensin 2 both in vitro and in vivo // J. Immunol. 2004. - Vol. 172(7) - P. 4637-4645.

103. Quesniaux V., Fremond C., Jacobs M. Toll-like receptor pathways in the immune responses to mycobacteria // Microbes Infect. 2004. - Vol.6 (10)-P. 946-59.

104. Schaefer T.M., Desouza K., Fahey J.V. Toll-like receptor (TLR) expression and TLR-mediated cytokine/chemokine production by human uterine epithelial cells // Immunology. 2004. - Vol.112 (3) - P. 428-436.

105. Serbina N.V., Liu C.C., Scanga C.A., Flynn J. L. CD8+ cytotoxic T lymphocytes from lungs of Mycobacterium tuberculosis-infected miceexpress perforin in vivo and lyse infected macrophages // J. Immunol. -2000. Vol. 165(1). - P. 353-363.

106. Silva C.L. and Lowrie D.B. A single mycobacterial protein (hsp 65) expressed by a transgenic antigenpresenting cell vaccinates mice against tuberculosis // Immunology. 1994. - Vol. 8 (2). - P. 244 - 248.

107. Soborg C., Madsen H.O., Andersen A.B. Mannose-binding lectin polymorphisms in clinical tuberculosis // J. Infect. Dis. 2003. -Vol. 188(5)-P. 777-782.

108. Srivastava P.K. Interaction of heart shock proteins with peptides and antigen presenting cells: chaperoning of the innate and adaptive immune responses // Ann. Rev. Immunology. 2002. - Vol. 20. - P. 395 - 201.

109. Stenger S., Hanson D.A., Teitelbaum R., Dewan P., Niazi K.R., Froelich C. J., Ganz Т., Thoma-Uszynski S., Melian A., Bogdan C. An antimicrobial activity of cytolytic T cells mediated by granulysin // Science. 1998.-Vol. 282 (5386).-P. 121-125.

110. Tam C.M., Leung C.C., Noertjojo K., Chan S.L., Chan-Yeung M. Tuberculosis in Hong Kong-patient characteristics and treatment outcome // Hong Kong Med. J. 2003. - Vol. 9(2). - P. 83-90.

111. Tascon R.E. Vaccination against tuberculosis by DNA injection // Nat. Med. -1996. Vol. 2 (8). - P. 888 - 892.

112. Vejbaesya S., Chierakul N., Luangtrakool K., Srinak D., Stephens H.A. Associations of HLA class II alleles with pulmonary tuberculosis in Thais // Eur. J. Immunogenet. -2002. Vol. 29(5). - P. 431-434.

113. Vergne I., Chua J., Singh S.B., Deretic V. Cell biology of Mycobacterium tuberculosis phagosome // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. -2004.-Vol.20-P. 367-94.

114. Vordermeier H.M. Increase of tuberculous infection in the organs of В cell deficient mice // Clin Exp Immunol. 1996. - Vol. 106 (2). - P. 312-316.

115. Wesa A.K., Galy A. IL-1 beta induces dendritic cells to produce IL-12 // Int. Immunol. 2001. - Vol.13 (8) - P. 1053-1061.

116. Wisniewski H.G., Vilcek J. Cytokine-induced gene expression at the crossroads of innate immunity, inflammation and fertility: TSG-6 and PTX3/TSG-14 // Cytokine Growth Factor Rev. 2004. - Vol.15 (2-3) - P. 129-146.

117. Yong R. Adjuvant-free hsp70 fusion protein system elicits humoral and cellular immune responses to HIV-1 p24 // The Journal of immunology. -1996.-Vol. 156.-P. 873-879.

118. Zhu X. Functions and specificity of T cells following nucleic acid vaccination of mice against Mycobacterium tuberculosis infection // J Immunol. 1997. - Vol. 158 (12). - P. 5921 - 5926.

119. Zugel U., Sponaas A.M., Neckermann J., Schoel В., Kaufman S.H. Gp 96 peptide vaccination of mice against intracellular bacteria // Infect. Immunol. 2001. - Vol. 69 (6). - P. 4164-4167.

120. Автор выражает признательность сотрудникам кафедры биохимии Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова за содействие в выполнении работы и ценные замечания по содержанию диссертации.