Технология изготовления белково-целлюлозных комплексов из микобактерий и их иммуногенные свойства тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат биологических наук Шамов, Владимир Васильевич

• Шамов, Владимир Васильевич
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шамов, Владимир Васильевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Микобактерии и их свойства.

1.2. Химическая структура микобактерий туберкулеза.

1.2.1. Белки микобактерий.

1.2.2. Полисахариды микобактерий.

1.2.3. Липиды микобактерий.

1.3. Строение клетки микобактерий.

1.3.1. Клеточные оболочки микобактерий.

1.3.2. Цитоплазма микобактерий.

1.3.3. Рибосомы микобактерий.

1.4. Механизм иммунного ответа при туберкулезе.

1.4.1. Гиперчувствительность замедленного типа в противотуберкулезном иммунитете.

1.5. В акцины из убитых микобактерий и иммуногенные фракции.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Технология изготовления белково-целлюлозных комплексов из микобактерий и их иммуногенные свойства»

Актуальность темы. В 1998 году в России была принята Федеральная программа по борьбе с туберкулезом. Это было связано с серьезной угрозой распространения туберкулеза человека и животных, вызванной ухудшением экономического положения страны в последние годы. Одно из направлений, которое многие эксперты определяют как наиболее перспективный путь к победе над туберкулезом - это именно создание эффективных вакцин (С. Сухая, 1999).

Проблема оздоровления ферм от туберкулеза крупного рогатого скота остается сложной. Применение вакцины БЦЖ в общем комплексе противотуберкулезных мероприятий позволяет сократить сроки оздоровления ферм с меньшими материальными затратами, однако при этом создаются определенные трудности: длительные поствакцинальные реакции на взрослом скоте и, как следствие, - использование вакцины только на новорожденных телятах; отсутствие перманентного противотуберкулезного иммунитета в стадах крупного рогатого скота осложняет профилактику и оздоровления ферм, а также увеличивает материальные затраты (С.И. Кованда, В.Н. Василевский, 1977; С.Р. Дидовец с соавт., 1980; В.П. Урбан, 1980, 1981, 1985; М.А. Сафин, 1983, 1985, 1987, 2001; Ю.Я. Кассич, 1990; А.С. Донченко, 1993, 1984, 1990, 1995 и др.).

Открытие генов иммунного ответа и механизмов генетического контроля иммунного ответа определили необходимость фенотипической коррекции иммунного ответа, изыскание препаратов, способных перевести животных с генетически низкой реактивностью в высокореагирующие (Р.В. Петров с соавт., 1983).

В последние годы на основании сформированного принципа создания бесклеточных вакцинирующих препаратов в нашей стране и за рубежом с использованием современных методов биотехнологии создаются новые вакцины для человека и животных (G. Mulcahy, P. Quinn, 1986; D. Rowlands, 1986; V. Hubscher, 1987; Н. Liebermaan, 1987; P. Neveu, 1987; J. Van Breent, 1987; P. Desmettu, 1987).

Разрабатываются, созданы и испытываются ряд искусственных препаратов, осуществляющих фенотипичную коррекцию иммунного ответа (Р.В. Петров, P.M. Хаитов, 1972, 1977, 1979; A.M. Нажмитдинов с соавт., 1980; Р.В. Петров с соавт., 1981, 1983, 1984, 1985, 1988). Созданием и изучением искусственных антигенов заняты также ученые МГУ им. М.В. Ломоносова (И.Н. Пончиева с соавт., 1986), НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (П.Е. Игнатов, 1983; П.А. Вершилова с соавт., 1976, 1985), ветеринарные учреждения (Н.П. Овдиенко с соавт., 1987; А.А. Новицкий, B.C. Бронников, 1990, 1991; В.В. Сочнев, 1996 и др.) и другие НИИ и ВУЗы страны.

В лаборатории иммунологии Всероссийского НИИ бруцеллеза и туберкулеза разработана биотехнология изготовления бесклеточных вакцины против бруцеллеза (М.А. Бажин, С.К. Переходова с соавт., 1995), в основе которой использована конъюгация антигенов бруцелл с целлюлозной матрицей. Целлюлоза представляет собой широко распространенный природный нераз-ветвленный линейный полимер Д-глюкозной цепочки, состоящей из 30001000 остатков Д-глюкозы, которые образуют макромолекулу целлюлозы. Наличие многочисленных водородных связей между цепями, образующими микрофибриллы, делают целлюлозу нерастворимой в условиях, необходимых для иммобилизации на ней антигенов. Перспективная область применения целлюлозных матриц открылась после того, как была показана возможность получения большого количества антител, иммунизируя животных белками, присоединенными ковалентно к этим матрицам (А.А. Корукова с соавт., 1985, 1986, 1987; Э.И. Рубакова с соавт., 1987; Е.И. Титова с соавт, 1987; А.Е. Гурвич, 1987). Анализируя природу этого феномена, авторы рассматривают вводимый комплекс как источник постепенно отщепляющего ферментами или макрофагами антигена с последующим развитием сложного комплекса иммунологических реакций.

Доступность и сравнительная простота химического моделирования целлюлозы позволяет оценить ее как матрицу для иммобилизации антигенов микобактерий. В научных источниках отсутствуют данные о получении туберкулезных белково-целлюлозных комплексов, нет сведений о их способности вызывать клеточные иммунологические реакции, вот почему изучение подобных препаратов является актуальным.

Цель настоящего исследования - разработать технологию изготовления белково-целлюлозных комплексов из микобактерий и изучить их реактоген-ные, иммуногенные и протективные свойства.

Научная новизна. Впервые разработаны условия иммобилизации антигенов микобактерий на целлюлозной матрице и дана оценка иммуногенных и протективных свойств белково-целлюлозных комплексов (ТБЦ). Определен уровень антител у белых мышей под влиянием белково-целлюлозных комплексов их микобактерий. Изучена способность белково-целлюлозных комплексов индуцировать ГЗТ к ППД-туберулину. Изучена выживаемость белых мышей, иммунизированных белково-целлюлозными комплексами с ППД-туберкулином, после заражения вирулентным штаммом. Определены: показатель интенсивности поражений, индекс защиты у морских свинок, вакцинированных различными белково-целлюлозными комплексами из микобактерий. У молодняка крупного рогатого скота, ревакцинированного БЦЖ и ТБЦ, определены иммунологические параметры (Е-рок, ЕАС-рок, ЕА-рок, ЕТ-рок, нейтрофилы). Проведен анализ взаимосвязей этих иммунологических параметров.

Практическая ценность. По результатам работы получена приоритетная справка на изобретение «Способ получения вакцины против туберкулеза» № 2001129597 от 12.11.2001 г. Разработаны рекомендации «Белко-во-целлюлозные комплексы из микобактерий: перспектива использования в 7 ветеринарии», утверждены Ученым советом ВНИИБТЖ, протокол № 12 от 30.11.2001 г. и подсекцией «Инфекционная патология животных региона Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины СО РАСХН, протокол № 13 от 13.12.2001 г. На защиту выносятся:

1. Технология изготовления белково-целлюлозных комплексов из ми-кобактерий.

2. Оценка иммуногенных и протективных свойств белково-целлюлозных комплексов на лабораторных животных и молодняке крупного рогатого скота.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1Л. Микобактерии и их свойства

Возбудитель туберкулеза - внутримакрофагальный паразит, использующий организм животного как источник питания и место обитания, был открыт Р. Кохом (1882) и в последствии получил название Mycobacterium tuberculosis.

Микобактерии - микроорганизмы, которые по своим морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам отнесены к порядку Actinomycetales, семейству Mycobacteriaceae, к роду Mycobacterium (А.А. Авакян с соавт., 1976). Род микобактерий включает 30 самостоятельных видов, кроме того, имеются несистематизированные виды (P.O. Драбкина, 1963; М.П. Зыков, 1976; С.О. Thoen, A.G. Karlson, Е.М. Himes, 1981, 1995).

По определителю D. Bergey (1974) микобактерии туберкулеза теплокровных животных и человека по вирулентности, культурально-биологиче-ским и биохимическим свойствам разделены на 4 вида:

М. tuberculosis - возбудитель туберкулеза человека;

М. bovis - возбудитель туберкулеза рогатого скота;

М. avium - возбудитель туберкулеза птиц;

М. microti - возбудитель туберкулеза полевых мышей.

Характерной особенностью микроорганизмов рода Mycobacterium является их кислотоустойчивость, они способны прочно удерживать окраску фуксином или другими анилиновыми красителями при последующем воздействии растворами минеральных кислот. На этом свойстве основана дифференциальная окраска микобактерий по Цилю-Нильсену. Возбудитель туберкулеза в биоматериале имеет вид тонких, слегка изогнутых сплошных или зернистых палочек, длина палочек колеблется в пределах 0,8-5,5 мкм, а поперечный диаметр 0,2-0,6 мкм.

Для выращивания возбудителя туберкулеза применяют плотные, жидкие, синтетические и полусинтетические среды, более экономичные и удобные в работе - плотные яичные среды. В ветеринарной практике широкое распространение нашли среды Левенштейна-Йенсена, Гельберга, Петранья-ни, безаспарагиновая среда Финн-2, а также среда ФАСТ-3 JI (ВНИИБТЖ).

При бактериологическом исследовании рост микобактерий туберкулеза бычьего вида регистрируется через 20-60 суток в виде сплошных или отдельных непигментированных, мелких колоний (белых, кремовых, сероватых).

Культуры микобактерий туберкулеза птичьего вида - серовато-белые, мелкие, слизистые и растут быстрее - на 10-15 сутки (Б.Я. Хайкин, 1983, 1988). Оптимальной температурой для выращивания M.tuberculosis является 37-38°С, для M.bovis - 38-39°С, для M.avium- 39-41 °С.

Микобактерии являются аэробами, неподвижны, окрашиваются по Граму положительно. Возбудитель туберкулеза и другие микобактерии отличаются плео- и полиморфизмом. Изменения морфологических, культураль-ных и биологических свойств могут носить как временный, так и постоянный характер. Полиморфизм проявляется в образовании различных форм: нитевидных, актиномикотических, зернистых, кокковидных и некислотоустойчивых вариантов (К.Д. Пяткин, Ю.С. Кривошеин, 1981, L.F. Affronti, 1990). В химический состав микобактерий туберкулеза входит вода (80,9 %), зольные (2,6 %) и органические вещества (11,6 %), в том числе липиды, белки, полисахариды и др. Из зольных веществ в микобактериях обнаружены фосфор, кальций, магний, натрий, калий, железо, цинк и марганец. Все вышеназванные вещества находятся в сложных соединениях, поэтому проявление их биологических свойств не тождественно проявлению свойств отдельных компонентов (М.П. Зыков, 1976; А.П. Лысенко, 1984, 1987; N. Acharya, D. Goldman, 1970).

В структурном отношении микобактерии состоят из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны и внутриплазматических мембранных структур, цитоплазмы и нуклеоида. Многие авторы на поверхности микобактерий выявляют слой, определяемый как микрокапсула (К.А. Гулевская, М.Н. Нем-садзе, 1974; Ortalo-Magne Annick, Marie-Ange Dupont, 1995), причем интенсивность ее развития и строения находится в прямой зависимости от количества экстрагируемого корд-фактора. Клеточная стенка имеет трехслойное строение и выполняет структурную и защитную функции. Цитоплазматиче-ская мембрана также имеет трехслойное строение, и инвагинируясь в цитоплазму формирует внутриплазматическую мембранную систему (мезосомы). Цитоплазма микобактерий представляет собой основную массу клеточного содержимого, представленную сложной коллоидной системой. Цитоплазма содержит гранулы, представленные в основном рибосомами, вакуоли и другие включения. Нуклеоид микобактерий представлен ДНК-содержащим материалом в виде фибрилл, гранул и конгломератов, располагающимся в ос-миофобной зоне в центральной части клетки (В.В. Ерохин, 1982; А.П. Лысенко, 1984, 1987, 1991, 1992; Ortalo-Magne Annick, Marie-Ange Dupont, 1995).

Микобактерии различных видов имеют близкую антигенную структуру и обладают общим набором антигенов.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Шамов, Владимир Васильевич

5. ВЫВОДЫ

1. Доступность и сравнительная простота химического моделирования суспензии целлюлозы из хлопковой ваты позволяет использовать ее как матрицу для иммобилизации антигенов микобактерий и служит основой технологии изготовления белково-целлюлозных комплексов, представляющих новый тип бесклеточных (молекулярных) вакцин, которые могут быть использованы в системе специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота.

2. Белково-целлюлозные комплексы, приготовленные с использованием неактивированной целлюлозы с помощью треххлористого хрома, отличаются большим содержанием белка на 1 г целлюлозы, по сравнению с белко-во-целлюлозными комплексами, приготовленными на окисленной периодатом натрия целлюлозе.

3. ППД-туберкулины являются слабыми иммуногенами, и их использование, для изготовления бесклеточных (молекулярных) противотуберкулезных препаратов, нецелесообразно.

4. Белково-целлюлозные комплексы, полученные из антигенов разрушенной культуры вакцинного штамма БЦЖ, в опытах на морских свинках показали высокие иммуногенные и протективные свойства, но ниже, чем у вакцины БЦЖ (индекс защиты - 85,5% и 94,7% соответственно).

5. У животных, привитых вакциной БЦЖ в раннем возрасте и реимму-низированных ТБЦ для продления противотуберкулезного иммунитета, поствакцинальные аллергические реакции исчезают через 4-6 мес, что дает возможность проводить диагностические исследования в стаде 2 раза в год.

6. Дискретно-динамическим анализом установлено (различия достоверны), что у телят, привитых БЦЖ в раннем возрасте, к 12-месячному возрасту у части животных еще сохраняется иммунитет (выявлено 7 сочетаний иммунологических параметров). Ревакцинация усиливает напряженность

113 иммунитета: у ревакцинированных вакциной БЦЖ выявлено 13 пар сочетаний параметров и несколько меньше (11 пар) у животных, реиммунизирован-ных белково-целлюлозным комплексом.

114

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. На разработанный «Способ получения вакцины против туберкулеза» получена приоритетная справка на изобретение № 2001129597 от 12.11.2001 г.

2. Рекомендации «Белково-целлюлозные комплексы из микобактерий: перспектива использования в ветеринарии», утверждены Ученым советом ВНИИБТЖ, протокол № 12 от 30.11.2001 г. и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины СО РАСХН, протокол № 13 от 13.12.2001 г.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итог вышесказанного, следует отметить, что борьба с туберкулезом сельскохозяйственных животных основана на обнаружении возбудителя, уничтожении источников и обезвреживании микобактерий туберкулеза в объектах окружающей среды. Хотя применение таких методов обеспечивает успех борьбы с этим заболеванием, необходимость дальнейшего совершенствование принятых практикой противотуберкулезных мероприятий неоспоримо. Перспективно в этом отношении использование специфических средств борьбы, в частности противотуберкулезных вакцин. Многочисленные и трудоемкие попытки понять фундаментальные механизмы протектив-ного иммунитета при микобактериальной инфекции привели лишь к осознанию его сложности и не позволили установить надежные иммунологические корреляты протекции.

Разработанный нами способ получения на основе антигенов микобактерий БЦЖ белково-целлюлозных комплексов позволяет надеяться на оптимизацию стратегии дальнейшего поиска создания новой противотуберкулезной вакцины. Положительные результаты по изучению аллергенных, имму-ногенных и протективных свойств подтвердили данные о том, что бактериальные антигены, иммобилизированные на целлюлозном носителе, высокоэффективны в индукции специфического клеточного иммунитета против антигенов микобактерий, а также вызывают выраженный протективный эффект. Оболочки микобактерий БЦЖ индуцируют ГЗТ, как и целые микобак-терии БЦЖ. Иммунизация телят ТБЦ дает кожную туберкулиновую реакцию на непродолжительный период времени, что не затрудняет дальнейшее проведение диагностических исследований.

Представленный материал дает основание в последующем продолжить разработку условий применения ТБЦ в системе мероприятий специфической профилактики туберкулеза сельскохозяйственных животных, включая изуче

Ill ние оптимальной дозы и повышение иммунологических свойств туберкулезной бесклеточной вакцины.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шамов, Владимир Васильевич, 2001 год

1. Авакян, А.А. Атлас анатомии бактерий патогенных для человека и животных / А.А. Авакян, JI.H. Кац, И.Б. Павлова. М.: Медицина, 1976. -182 с.

2. Авербах, М.М. Повышенная чувствительность замедленного типа, реактивность иммунокомпетентных клеток и противотуберкулезный иммунитет / М.М. Авербах, В.И. Литвинов // Тр. XXI Международной конференции по туберкулезу. М.: Медицина, 1972. - С. 380-383.

3. Авербах, М.М. Действие антилимфоцитарной сыворотки на повышенную чувствительность замедленного типа при туберкулеза / М.М. Авербах, В.И. Литвинов, А.И. Мороз // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1973. - № 3. -С. 79-83.

4. Авербах, М.М. Повышенная чувствительность замедленного типа и инфекционный процесс / М.М. Авербах, В.Я. Гергерт, В.И. Литвинов. М.: Медицина, 1974. - 247 с.

5. Авербах, М.М. Иммунология и иммунопатология туберкулеза / М.М. Авербах. М.: Медицина, 1976. - 312 с.

6. Авербах, М.М. Иммунология и иммунодиагностика туберкулеза / М.М. Авербах, В.Я. Гергерт. В кн.: Иммунологические аспекты легочной патологии. - М., Медицина, 1980. - С. 36-49.

7. Авилов, В.М. Эпизоотическое состояние животноводства по туберкулезу РСФСР и меры борьбы с болезнью / В.М. Авилов, В.Ф. Пылинин // Ветеринария. 1992. - № 12. - 39 с.

8. Алимов, A.M. Теоретические и экспериментальные подходы к конструированию нового поколения вакцин / A.M. Алимов // Материалы Рес-публ. науч.-произв. конф. по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии. Казань, 1996. - С. 5.

9. Альджамбаев, М.Ю. Экспериментальное изучение роли Т- и Влимфоцитов в противотуберкулезном иммунитете /М.Ю. Альджамбаев, Л.Ф. Лейкина, В.Л. Морозов и др. // Пробл. туберкулеза. 1983. - № 1. - С. 60-63.

10. Бажин, М.А. Взаимосвязь иммунологических параметров у молодняка крупного рогатого скота при бруцеллезе / М.А. Бажин, Н.И. Финько, Р.Б. Обосния // Сб. науч. тр. / ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. Новосибирск, 1987. -С. 42-51.

11. Бажин, М.А. Реакции иммунологической памяти и толерантности у животных при бруцеллезе и туберкулезе / М.А. Бажин: Автореф. дис. . д-ра вет. наук. Новосибирск, 1995. - 34 с.

12. Базарбаев, М. Иммуногенность противотуберкулезной жидкой вакцины / М. Базарбаев // Меры борьбы с туберкулезом и бруцеллезом с.-х. животных в Казахстане: Сб. науч. тр. Алма-Ата, 1986. - С. 36-40.

13. Батрак, Г.Е. Дозирование лекарственных средств экспериментальным животным / Г.Е. Батрак, А.Н. Кудрин. М.: Медицина, 1979. - С. 158— 159.

14. Беклемешев, Н.Д. Аллергия к микробам в клинике и эксперименте / Н.Д. Беклемешев, Г.С. Сухоедова. -М., Медицина, 1979. 262 с.

15. Билько, И.П. Современные представления об ультраструктуре и функции клеточной стенки микобактерий туберкулеза / И.П. Билько, В.Г. Матусевич // Пробл. туберкулеза. 1986. - № 9. - С. 65-70.

16. Брондэ, Б.Д. Молекулярные и клеточные основы иммунологического распознавания / Б.Д. Брондэ, О.В. Рохлин. М.: Наука, 1978. - 230 с.

17. Вершилова, П.А. Бруцеллезный протективный антиген, его химическая и иммунобиологическая характеристика / П.А. Вершилова, Е.А. Дранов-ская // Бюл. эксперим. биол. мед. -1976. Т. 81. - № 2. - С. 333-335.

18. Вершилова, П.А. Сравнительное изучеие безвредности и реактивности различных дозировок бруцеллезной химической вакцины при ревакцинации людей / П.А. Вершилова, Г.А. Елыпина, Е.А. Драновская и др. // ЖМЭИ. 1985. - № 11. - С. 56-60.

19. Власенко, B.C. Дискретно-динамический анализ в оценке иммунного статуса крупного рогатого скота / B.C. Власенко, М.А. Бажин // Материалы Всерос. Наут. Конф. По проблемам хронических инфекций. Омск, 2001. -С. 179.

20. Воробьев, А.А. Антигенные и иммуногенные субстанции микобактерий и проблема создания молекулярной вакцины / А.А. Воробьев, Н.М. Бадукшанова, Н.И. Фадеева // ЖМЭИ. 1989. - № 12. - С. 87-93.

21. Воробьев, А.А. Иммунобиологические препараты: настоящее и будущее / А.А. Воробьев, В.А. Ляшенко // ЖЭМИ. 1995. - № 6. - С. 105111.

22. Востряков, А.П. Персистенция оболочек вакцинных и вирулентных штаммов микобактерий туберкулеза в организме животных / А.П. Востряков // Бюл. ВИЭВ. Вып. 61: Теоретич. разработки молодых уч. - М., 1987. - С. 10-12.

23. Гельберг, С.И. К методике экспериментального изучения иммуно-генных свойств противотуберкулезных вакцин и эффективности методов их применения / С.И. Гельберг, Е.А. Финкель // Пробл. туберкулеза. 1959. - № 2. - С. 80-84.

24. Гизатулин, Х.Г. Изучение иммунитета у иммунизированного БЦЖ скота / Х.Г. Гизатулин, М.А. Сафин // Ветеринария. 1979. - № 11. - С. 2830.

25. Голубинский, Е.П. Некоторые аспекты конструирования конъюги-рованных противобруцеллезных вакцин / Е.П. Голубинский // Соврем, аспекты профилактики зоонозных инфекций. Иркутск, 1984. - Ч. 2. - С. 91-93.

26. Григороьева, Г.И. Факторы патогенности как протективные антигены при конструировании вакцин / Г.И. Григорьева, П.Е. Игнатов // Сельскохозяйственная биология. 1987. - № 12. - С. 100-104.

27. Грин, М.И. Реакция гиперчуствительности замедленного типа / Под ред. У. Пола / М.И. Грин, С. Шаттен, Д.С. Бромберг // Иммунология. М.г

28. Мир, 1988. Т. 2. - С. 362-395.

29. Гулевская, С.А. К вопросу о микрокапсуле микобактерий туберкулеза и корд-факторе / С.А. Гулевская, М.Н. Немсадзе // Пробл. туберкулеза-1974. -№3.- С. 71-76.

30. Гурвич, А.Е. Усиление иммуногенности белков путем их присоединения к целлюлозной матрице / А.Е. Гурвич, А.А. Корукова, Д.А. Эльгорт // Сб. науч. тр. ЦНИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова / Иммуномоду-ляторы. М., 1987. - С. 67-76.

31. Гурвич, А.Е. Использование целлюлозных матриц в иммунохимии / А.Е. Гурвич // Сб. науч. тр. НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи / Иммуносорбенты и их использование в биотехнологии. М., 1987. - С. 5-22.

32. Гуткин, B.C. Изученность иммунитета при туберкулезе крупного рогатого скота / B.C. Гуткин, Н.П. Овдиенко, В.А. Горбатов // Пути ликвидации инфекционных и инвазионных болезней с.-х. животных. Новосибирск, 1985.-С. 9-11.

33. Донченко, А.С. Причины рецидивов туберкулеза крупного рогатого скота в ранее оздоровленных хозяйствах / А.С. Донченко, P.M. Сыртланов, П.А. Дорожанский // Науч.-техн. бюл. / Сиб. отд-ние ВАСХНИЛ. -Новосибирск, 1980.- Вып. 19.-С. 17-19.

34. Донченко, А.С. Принципы организации и проведения мер борьбы ипрофилактики туберкулеза крупного рогатого скота / А.С. Донченко // Сибирский вестник с.-х. науки. 1983. - №1. - С. 67-71.

35. Донченко, А.С. Основные научные положения организации мероприятий по профилактике и борьбе с туберкулезом крупного рогатого скота в регионе Сибири и их практическое значение / А.С. Донченко // Тез.докл. НПК Новосибирск, 1995. - С. 6-7.

36. Донченко, А.С. Повышение протективных свойств вакцины БЦЖ // Вестн. Российской академии с.-х. наук. 1995. - № 5. - С. 58-61.

37. Донченко, В.Н. Теория и практика повышения протективных свойств противотуберкулезной вакцины БЦЖ с помощью иммуномодулято-ров/В.Н. Донченко и др. //Тез. докл. Новосибирск, 1991. - С. 131.

38. Драбкина, P.O. Микробиология туберкулеза / P.O. Драбкина. М.: Медгиз, 1963.-255 с.

39. Егоров, A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа /

40. A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилов- М.: Высшая школа, 1991.-288 с.

41. Еремеев, В.В. Экспериментальный анализ Micobacterium stegmatis в качестве возможного вектора для конструирования новой противотуберкулезной вакцины / В.В. Еремеев и др. // Пробл. туберкулеза. 1996. - № 1. - С. 49-51.

42. Еремеев, В.В. Новая противотуберкулезная вакцина: мечта или реальность? / В.В. Еремеев // Пробл. туберкулеза. 2001. - № 1. - С. 53-55.

43. Ерохин, В.В. Строение микобактерий туберкулеза по данным электронной микроскопии / В.В. Ерохин // Пробл. туберкулеза. 1982. - № 3. - С. 55-59.

44. Золотов, B.C. Дезинтеграция микобактерий ультразвуком как метод приготовления туберкулезных антигенов для серологических реакций: Авто-реф. дис. канд. вет. наук / B.C. Золотов. Фрунзе, 1969. - 16 с.

45. Зыков, М.П. Микробиология туберкулеза / М.П. Зыков. Л.: Медицина, 1976.- 160 с.

46. ИФА для диагностики туберкулеза животных: Приготовление реагентов тест-системы и методика постановки реакции: Метод, рекомендации / ВНИИБТЖ / Министерство здравоохранения РСФСР. Моск. НИИ туберкулеза.-Омск, 1990.- 11 с.

47. Кассич, Ю.Я. Иммунизация животных против туберкулеза с применением различных вакцин / Ю.Я. Кассич // Вестн. с.-х. науки. 1981. - № 3. -С.113-116.

48. Кассич, Ю.Я. Научные основы борьбы с туберкулезом сельскохозяйственных животных в Украинской ССР / Ю.Я. Кассич и др. // Мат. конф. Юж. отд-ния. ВАСХНИЛ. Киев, 1982. - С. 16-22.

49. Кассич, Ю.Я. Результаты иммунизации крупного рогатого скота и вакцинации против туберкулеза / Ю.Я. Кассич и др. // Тр. ВИЭВ, 1984. — Т. 61.-С. 45-49.

50. Кассич, Ю.Я. Туберкулез животных и меры борьбы с ним / Ю.Я. Кассич и др. Киев: Урожай, 1990. - 230 с.

51. Князев, Р.З. Современная вакцинология / Р.З. Князев, П.М. Лузин. -Пермь, 1998.-С. 61-62.

52. Коваленко, A.M. Изучение некоторых физико-химических свойств вакцинных препаратов против туберкулеза / A.M. Коваленко, В.М. Гнатов-ская//Информац. бюл. ИЭКВМ. / -Харьков, 1995. С. 17-19.

53. Кованда, С.И. Заболеваемость телят туберкулезом / С.И. Кованда, В.Н. Василевский // Ветеринария. 1977. - № 7. - С. 51-53.

54. Коромыслов, Г.Ф. Достижения, проблемы и перспективы ветеринарной иммунологии / Г.Ф. Коромыслов // Тр. ВИЭВ. 1980. - Т. 57. - С. 314.

55. Коромыслов, Г.Ф. ППД-туберкулин, изготовленный из микробных клеток микобактерий туберкулеза / Г.Ф. Коромыслов и др. // Тр. ВИЭВ. -1980.-Т. 52.-С. 3-8.

56. Коромыслов, Г.Ф. Состояние Т- и В-лимфоцитов при туберкулезе / Г.Ф. Коромыслов, В.Л. Солодовников // Ветеринария. 1982. - № 7. - С. 2730.

57. Корукова, А.А. Использование белково-целлюлозного комплекса для индукции у мышей интенсивного антителообразования / А.А. Корукова, О.С. Григорьева, А.Е. Гурвич // Бюл. экспер. биол. 1985. - № 7. - С. 44-46.

58. Корукова, А.А. Вторичный иммунный ответ у мышей при иммунизации белково-целлюлозным комплексом / А.А. Корукова, Д.А. Эльгорт, А.Е. Гурвич // Бюл. экспер. биол. и мед. 1986. - № 12. - С. 736738.

59. Лапыко, В.Н. Новое в изыскании штаммов, пригодных для изготовления туберкулезных антигенов / В.Н. Лапыко и др. // Сб. науч. тр. Каз. НИВИ. Казань, 1976.-Т. 16. С. 176-177.

60. Лебедев, К.А. Иммунная система при ремиссиях простого хронического бронхита (дискретный анализ взаимосвязи показателей Т-, В-, А-систем иммунитета) / К.А. Лебедев, И.Д. Понякина, И.С. Петрухин // Иммунология. 1984. - № 1. - С. 61-65.

61. Лебедев, К.А. Дискретно-динамический анализ новый подход к оценке иммунного статуса человека / К.А. Лебедев, И.Д. Понякина // Итоги науки и техники. - ВИНИТИ. - Иммунология. - 1986. - Т. 15. - С. 64-91.

62. Лехтцинд, Е.В. Синтез высокоемкого иммуносорбента на основе суспензии целлюлозы / Е.В. Лехтцинд, А.Е. Гурвич // Бюл. эксп. биол. и мед.- 1981. -№ 7. С. 68-70.

63. Лехтцинд, Е.В. Приготовление иммуносорбентов на основе суспензии диальдегидцеллюлозы / Е.В. Лехтцинд, Д.А. Эльгорт // Сб. науч. тр. НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи / Иммуносорбенты и их использование в биотехнологии. М., 1987. - С. 92-95.

64. Линникова, М.А. Биологические свойства белковых фракций очищенного туберкулина / М.А. Линникова, З.И. Жукова // Микробиология.- 1976. -№ 10.-С. 10-11.

65. Лысенко, А.П. Антигенные комплексы M.bovis и их значение в диагностике туберкулеза: Автореф. дис. канд. вет. наук / А.П. Лысенко. -Минск, 1984.-23 с.

66. Лысенко, А.П. Иммунохимический анализ хроматографическихфракций M.bovis и M.tuberculosis / А.П. Лысенко // Ветеринария. 1987. - № 12.-С. 32-36.

67. Лысенко, А.П. Выявление антигенов Mycobacterium bovis / А.П. Лысенко // Ветеринария. 1991. - № 1. - С. 26-27.

68. Лысенко, А.П. Специфичность антигенов Mycobacterium bovis при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота в ИФА / А.П. Лысенко, Г.А. Карпова, Т.Н. Агеева // Ветеринария. 1992. - № 3. - С. 22-24.

69. Лямперт, И.М. Некоторые новые подходы и перспективы создания эффективных и безвредных вакцин в будущем / И.М. Лямперт // Иммунология. 1983. - № 3. - С. 11-16.

70. Марчук, Г.И. Математическое моделирование в иммунологии / Г.И. Марчук, Р.В. Петров // Журнал Всесоюзного хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. 1982. - Т. 27. - № 4. - С. 371-379.

71. Марчук, Г.И. Математические модели в иммунологии и медицине / Г.И. Марчук, Л.Н. Белых. М.: Мир, 1986. - 310 с.

72. Медуницын, Н.В. Медиаторы клеточного иммунитета и межклеточное взаимодействие / Н.В. Медуницын, В.И. Литвинов, A.M. Мороз. М.: Медицина. - 1980. - 264 с.

73. Медуницын, Н.В. Повышенная чувствительность замедленного типа / Н.В. Медуницын. М.: Медицина, 1983. - 132 с.

74. Медуницин, Н.В. Побочное действие вакцин / Н.В. Медуницын // Пробл. туберкулеза. 1991. - № 2. - С. 42-46.

75. Медуницын, Н.В. Иммунный ответ на сложные анигены и комбинированные вакцины / Н.В. Медуницын // Иммунология. 2001. - № 1. - С. 46.

76. Мертвецов, И.П. Современные подходы к конструированию молекулярных вакцин / И.П. Мертвецов, А.Б. Беклемишев, И.М. Савич. -Новосибирск: Наука, 1987. 210 с.

77. Методические основы лабораторной диагностики туберкулеза крупкрупного рогатого скота // Ветеринария. № 12. - 1987. - С. 62-64.

78. Методические рекомендации по проведению лабораторных исследований при туберкулезе животных. М., ВНИИЭВ, 1992. - С. 18.

79. Модель, JI.M. Биология туберкулезных микобактерий и иммунология туберкулеза / JI.M. Модель. М.: Медгиз, 1958. - 316 с.

80. Нажмитдинов, A.M. Компенсация Т-хелперов сополимером акриловой кислоты и N-винилпирролидона при иммунном ответе у мышей с искусственным и генетическим Т-дефицитом / A.M. Нажмитдинов, И.П. Дишкант, P.M. Хаитов // Иммунология. 1980. - № 2. - С. 50-52.

81. Новак, Д.Д. Туберкулез крупного рогатого скота / Д.Д. Новак. -Алма-Ата: Кайнар, 1984- 158 с.

82. Новак, Д.Д. Механизм и критерии оценки поствакцинального иммунитета при туберкулезе животных / Д.Д. Новак, Б.П. Суюбаева. В кн.: Проблемы вет. иммунологии-М.: Агропромиздат, 1985. - С. 83-86.

83. Объедков, Г.А. Механизм иммунного ответа при экспериментальном туберкулезе животных / Г.А. Объедков, В.А. Сюсюкин, Г.А. Карлова // Ветеринария. 1983. - № 12. - С. 24-25.

84. Объедков, Г.А. Иммунитет и биотехнология животноводства / Г.А. Объедков // Ветеринарная наука производству: Межвед. сб. Вып. 31. -Минск, 1993.-С. 64-70.

85. Овдиенко, Н.П. Противотуберкулезная резистентность, индуцированная микобактериями БЦЖ и фракцией их оболочек / Н.П. Овдиенко и др. // Труды ВИЭВ. 1984. - Т. 61. - С. 41-44.

86. Овдиенко, Н.П. Профилактика и ликвидация туберкулеза крупногорогатого скота / Н.П. Овдиенко // Ветеринария. 1986. - № 9. - С. 15-20.

87. Овдиенко, Н.П. О кратности введения туберкулина крупному рогатому скоту / Н.П. Овдиенко, В.Е. Щуревский, А.Х. Найманов, О.В Якушева // Ветеринария. 1987. - № 8. - С. 29-33.

88. Овдиенко, Н.П. Эпизоотология туберкулеза крупного рогатого скота за рубежом: обзор иностранной литературы / Н.П. Овдиенко // Ветеринария. 1989. -№ 8. - С. 65-69.

89. Овдиенко, Н.П. Мировое распространение туберкулеза крупного рогатого скота и основные принципы профилактических и противоэпизооти-ческих мероприятий / Н.П. Овдиенко, В.А. Ведерников, А.Х. Найманов // Бюлл. ВИЭВ. 1990. - Вып. 73/74. - С. 3-23.

90. Петров, Р.В. Взаимодействие и кооперация клеток при иммунном ответе / Р.В. Петров, А.Н. Чередеев, А.А. Михайлова, И.Т. Сидорович. В кн.: Общие вопросы патологии. -М.: ВИНИТИ, 1972. - Т. 3. - С. 106-153.

91. Петров, Р.В. Полиэлектролиты новые биологически активные соединения, влияющие на иммуногенез / Р.В. Петров, P.M. Хаитов // МРЖ. -1977.-Вып. 21.-Т. 7.-С. 18-27.

92. Петров, Р.В. Иммунный ответ и искусственные антигены / Р.В. Петров, P.M. Хаитов // Успехи совр. биол. 1979. - Т. 88. - В. 6. - С. 307-321.

93. Петров, Р.В. Контроль и регуляция иммунного ответа / Р.В. Петров, P.M. Хаитов, В.М. Манько, А.А. Михайлова. М.: Медицина, 1981. - 311 с.

94. Петров, Р.В. Иммуногенетика и искусственные антигены / Р.В. Петров и др. М.: Медицина, 1983. - 256 с.

95. Петров, Р.В. Способность конъюгатов бактериального полисахарида с синтетическими полиэлектролитами давать иммунизирующий эффект / Р.В. Петров, В.А. Кабанов, P.M. Хаитов // Иммунология. 1983. - № 5. - С. 40-43.

96. Петров, Р.В. Диагностика иммунопатологических состояний на основании оценки баланса в функционировании компонентров иммунной системы / Р.В. Петров, К.А. Лебедев // Иммунология. 1984. - № 6. - С. 3843.

97. Петров, Р.В. Оценка иммунологического статуса человека с учетом корреляционных взаимодействий между отдельными показателями / Р.В. Петров, Л.В. Ковальчук, Н.А. Константинов // ЖМЭИ. 1985. - № 3. - С. 6167.

98. Петров, Р.В. Искусственные антигены и вакцины / Р.В. Петров, P.M. Хаитов. М.: Медицина, 1988. - 288 с.

99. Пончиева, И.Н. Искусственные антигены на основе полиэтиленок-сида / И.Н. Пончиева, Л.И. Хаустова, Г.Н. Пименова // Иммунология. 1986. -№ 1.-С. 38-43.

100. Пяткин, К.Д. Микробиология / К.Д. Пяткин, Ю.С. Кривошеин. -М.: Медицина, 1981. 512 с.

101. Романова, Р.Ю. Иммунологическое значение фракций микобактерий, полученных с помощью ультрацентрифугирования /Р.Ю. Романова, В.П. Павлова. В кн.: Основные направления повышения борьбы с туберкулезом. - М.: Медицина, 1975. - С. 318-325.

102. Романова, Р.Ю. Использование дифференциального ультрацентрифугирования для выделения субклеточных компонентов микобактерий туберкулеза / Р.Ю. Романова // Пробл. туберкулеза. 1981. - № 7. - С. 54-56.

103. Романова, Р.Ю. Искусственные иммунизирующие комплексы на модели экспериментального туберкулеза /Р.Ю. Романова, A.M. Норимов // Всесоюзн. иммунол. съезд, Сочи 15-17 ноября 1989: Тез. секц. и стенд.сообщ. Т. 1 - М., 1989. - С. 244.

104. Романова, Р.Ю. Использование антигена клеточных стенок микобактерий БЦЖ для определения противотуберкулезных антител / Р.Ю. Романова и др. // Материалы докл. Всерос. науч.-практ. конф. Пермь, 1993. -С. 104-105.

105. Сафин, М.А. Совершенствование диагностики, профилактики и мер ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота / М.А. Сафин: Авто-реф. дис. . д-ра вет. наук. Казань, 1981.-31 с.

106. Сафин, М.А. Вакцинация БЦЖ и противотуберкулезные мероприятия / М.А. Сафин // Ветеринария. 1982. - № 11. - С. 39-40.

107. Сафин, М.А. Проблема специфической профилактики туберкулеза у крупного рогатого скота / М.А. Сафин // Актуальные вопросы эпизоотологии.-Казань, 1983.-С. 14-15.

108. Сафин, М.А. Состояние и перспективы научных исследований по специфической профилактике туберкулеза крупного рогатого скота / М.А. Сафин // Сб. науч. тр. Казанского Гос. вет. ин-та. 1985. - С. 17-19.

109. Сафин, М.А. Вакцина БЦЖ и ее эффективность в общем комплексе противотуберкулезных мероприятий / М.А. Сафин // Совершенствование систем и методов в борьбе с бруцеллезом и туберкулезом животных / ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние . Новосибирск, 1987. -С.142-148.

110. Смолянинов, Ю.И. Эффективность мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота / Ю.И. Смолянинов, В.Ф. Мартынов // Ветеринария.- 1982.-№7. с. 50-51.

111. Солодовников, B.JL Т- и В-системы при туберкулезе крупного рогатого скота и у овец / B.JI. Солодовников: Автореф. дис. . канд. биол. наук. -М., 1983.-23 с.

112. Солодовников, В.Л. Иммунологический контроль туберкулеза у крупного рогатого скота / В.Л. Солодовников // Ветеринария. 1992. - № 5. -С. 23-27.

113. Станиславский, Е.С. Перспективы развития исследований по бактериальным вакцинам / Е.С. Станиславский // Матер. Всесоюз. науч. конф. Проблемы медицинской иммунобиотехнологии, октябрь 1988. Л., 1990. - С. 105-107.

114. Степанченок-Рудник, Г.И. Применение ультразвука в микробиологии и биохимии / Г.И. Степанченок-Рудник, В.А. Благовещенский // ЖМЭИ.- 1960.-№3.-С. 44.

115. Степанченок-Рудник, Г.И. Липиды микобактерий туберкулеза и их биологические свойства (обзор) / Г.И. Степанченок-Рудник // Пробл. туберкулеза. 1967. -№ 1. - С. 83-86.

116. Сухая, С. Палочка Коха грозит миру / С. Сухая // Труд. -11.11.1999.

117. Титова, Е.И. Получение гипериммунных сывороток путем иммунизации кроликов белково-целлюлозным комплексом / Е.И. Титова,

118. А.А. Корукова, Д.А. Эльгорт // Сб. науч. тр. НИИЭМ АМН им. Н.Ф. Гамалеи / Иммуносорбенты и их использование в биотехнологии. М., 1987. - С. 7882.

119. Тюрикова, Р.П. К вопросу узнавания «свой-чужой» в процессе иммунной защиты / Р.П. Тюрикова // Материалы науч. конф., посвящ. 125-летию академии. Казань, 1998. -Ч. 1. - С. 88-90.

120. Урбан, В.П. Эпизоотическая вспышка туберкулеза крупного рогатого скота / В.П. Урбан, М.М. Широбокова, Ю.Ю. Донко / Инфекционные и паразитарные болезни сельскохозяйственных животных. Л., 1981. - С. 131135.

121. Урбан, В.П. Иммунопрофилактика инфекционных болезней животных / В.П. Урбан // В сб.: Проблемы ветеринарной иммунологии. М., 1985.-С. 13-17.

122. Урбах, В.Ю. Биометрические методы (статистическая обработка опытных данных в биологии, селском хозяйстве и медицине) /В.Ю. Урбах. -М.: Наука, 1964.-416 с.

123. Усович, А.Т. Применение математической статистики при обработке экспериментальных данных в ветеринарии / А.Т. Усович, П.Т. Лебедев. -Омск, 1970.-44 с.

124. Хаитов, P.M. Итоги и перспективы исследований по созданию искусственных вакцин / P.M. Хаитов // Иммунология. 1982. - № 6. - С. 35-40.

125. Хайкин, Б.Я. Иммунохимические и морфологические реакции у телят, иммунизированных вакциной БЦЖ / Б.Я. Хайкин // Ветеринария. -1983. -№ 12. С.25-27.

126. Хайкин, Б.Я. Профилактическая эффективность вакцины БЦЖ приразных схемах ее применения / Б .Я. Хайкин, В.А. Зубакин // Методы диагностики и профилактики бруцеллеза и туберкулеза животных: Сб. науч. тр. -Омск, 1988.-С. 69-78.

127. Хайкин, Б.Я. Лабораторная диагностика туберкулеза / Б.Я. Хайкин, М.М. Колычев и др. // Метод, рекомендации / ВНИИБТЖ. Омск, 1988. -15 с.

128. Ходун, Л.М. Н.И. Тест-система ELISA для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота и критерии оценки результатов метода / Л.М. Ходун, Н.И. Цунская. В кн.: Разработка средств и методов борьбы с туберкулезом животных. - Новосибирск, 1990. - С. 18.

129. Цапко, Р.А. Кожная туберкулиновая проба при иммунизации животных БЦЖ и фракцией их оболочек / Р.А. Цапко // Бюл. ВИЭВ. 1985. -Вып. 57.-С. 19-20.

130. Цапко, Р.А. Аллергенные и иммуногенные свойства фракции клеточных оболочек M.bovis: Автореф. дис. канд. вет. наук / Р.А. Цапко. М., 1986.-23 с.

131. Шаров, А.Н. Комплексный аллерген из клеточных микобактерий / А.Н. Шаров, Э.С. Плотников // Ветеринария. 1980. - № 5. - С. 41-43.

132. Шаров, А.Н. Антигены для реакции агглютинации при диагностике туберкулеза / А.Н. Шаров, М.А. Лукава, Э.Д. Лакман // Ветеринария. -1996.-№ 1.-С. 15-17.

133. Шишков, В.П. Современная биотехнология в ветеринарной медицине / В.П. Шишков, В.П. Карелин, С.П. Качанова. М.: Госагропром СССР, 1988.-55 с.

134. Яблокова, Т.Б. Иммуногенные и аллергенные антигены микобактерий / Т.Б. Яблокова, Т.П. Кожевникова, Д.Т. Леви // Микробиология. -1970.-№2.-С. 8-12.

135. Яблокова, Т.Б. Характеристика качества советской вакцины БЦЖ / Т.Б. Яблокова, A.M. Розенберг, Н.П. Писаренко // Пробл. туберкулеза.1973.-№3.-С. 69-72.

136. Яблокова, Т.Б. Противотуберкулезная вакцинация / Т.Б. Яблокова. В кн.: Иммунология и иммунопатология туберкулеза. - М.: Медицина, 1976.-С. 246-266.

137. Acharya, N. Chemical composition of the cell wall of the H37Ra strain of Mycobacterium tuberculosis / N. Acharya, D. Goldman // J. Bact. 1970. - V. 102.-P. 733-736.

138. Affronti, L. F. Trace elements incorporated into thje culture medium of M. tuberculosis promote the presense of tuberculoprotein С in the preparation of purified protein derivatives / L. F. Affronti // Microbiol. 1990. - 63. - № 255. -P. 101-107.

139. Bengardg, A.A. M. tuberculosis proteins: Structure, function, and im-munogical relevance / A.A. Bengardg // Dan Med. Bull. 1994. - 41, № 2. - P. 205-215.

140. Asherson, G.L. Selective and specific inhibition of 24 hour skin reactions in the guinea pig / G.L. Asherson, S.H. Stone // Immunology. 1965. - V. 9. -P. 205-217.

141. Asselineau, I. Recherches recenter sur la chimie der lipids du bacille tuberculeux /1. Asselineau, E. Lederer // Experimentia/ 1951.-V. 7.-P. 281287.

142. Azuma, J. Isolation of tuberculin active peptides from cell wall fraction of human tubercle bacillus strain / J. Azuma, Y. Yamamura, T. Tahara, K. Onoue, K. Fukushi // Japan. J. Microbiol. 1969. - V. 13. - P. 220-222.

143. Azuma, J. Immunoadjuvants for vaccine / J. Azuma, Y. Yamamura // Adv. Immunopharmocol. 4: Proc. 4 th Inf. Conf. Osaca. 16-19 May, 1988. Oxford. Efc, 1989.-P. 149-158.

144. Birnbaum, S.E. Chemical and serological relationships between the heteropolysaccarides of mycobacterium tuberculosis and M. kansassi / S.E. Birnbaum, L.F. Affronti // J. Bact. 1968. -V. 95. - P. 559-564.

145. Bloch, H. A toxic lipid component of the tubercle bacillus (cord factor). Isolation from petroleum other extracts of young bacterial cultures / H. Bloch, E. Sorkin, P. Slenmeyer // Amer. Rev. Tubercl. 1953. - V. 67. - P. 629-633.

146. Boyden, S.V. The effect of previous injections of tuberculoprotein on the development of tyberculin sensitivity following BCG. Vaccination in guinea pigs / S.V. Boyden // Brit. J. Exptl. Path. 1957. - V. 38. - P. 611-617.

147. Chapparas, S.D. Specificity of tuberculins and antigens from variour species of Mycobacteria / S.D. Chapparas, G. Mallomu, S. Medrik // Amer. Rew. resp. Dis. 1970. - V. 101. - P. 74-83.

148. Chatterjee, D. Phenolic glycolipids ofMycobacterium bovis: new structures and syntesis of a corresponding seroreactive neoglicoprotein / D. Chatterjee, C. Bozic, C. Knisley // Infec. and Immum. 1989. - V. 57. - № 2. - P. 322-330.

149. Choucroun, N. Tubercle bacillus antigens. Biological properties of two substances isolated fron paraffin oil extract of dead tubercle bacilli / N. Choucroun // Am. Rev. Tuberc. 1947. - V. 56. - P. 203-226.

150. Collins, F.M. Antituberculosis immunity: new solutions to an old problem / F.M. Collins // Rev. Infec. Diseases. 1991. - 13, № 5. - C. 940-950.

151. Collins, F.M. The immune response to mycobacterial infection. Development of new vaccines / F.M. Collins // Vet. Microbiol. 1994. - 40, № 1-2. -P. 95-110.

152. Cooper, A.M. The protective immune response to M. tuberculosis /

153. A.M. Cooper, I.L. Flynn // Curr. Opinion Immunol. 1995.-7, № 4. - P. 512516.

154. Crowle, A.J. The role of immunologic toberance in immunologic response / A.J. Crowle // Ann, Allergy. 1966. - 24, № 6. - P. 195-214.

155. Crowle, A.J. Studies on the induction and time course of repression of delayed hypersensitivity in the mouse by law and high doses antigen / A.J. Crowle, C.C. Hsu // Clin. exp. Immunol. 1970. - V. 6. - P. 363-374.

156. Daniel, M. Spesificiti of tuberculins and antigens from various species of mycobacteria / M. Daniel, F. Van Der-Knyp, P. Anderson // Amer. Rev. Resp. Dis. 1981. - V. 123.-P. 517-520.

157. Elberg, S.S. Immunity to brucella infection / S.S. Elberg // Medicine. -1973.-V. 52.-P. 339-356.

158. Ellner, I.J. Immunologic aspects of mycobacterial infections / I.J. Ellner, R.S. Wallis // Rev. Infec. Diaseases. 1989. -V. 11. - Suppl. - № 2. - P. 455-459.

159. Hirschfleld, G.R. Peptidoglycan associated polypeptides of Mycobacterium tuberculosis / G.R. Hirschfield, M. McNeil, P.J. Brennan // J. Bacteriol. -1990. - 172, № 2. - P. 1005-1013.

160. Hosckmeyer, W.T. Futher characterization of M.bovis toxin / W.T. Hosckmeyer, M. Reich // Infect, and Immunol. 1988. - V. 21. - № 1. - P. 124128.

161. Jriffin, J. Vaccination against tuberculosis is BCJ more sinned against than sinner? / J. Jriffin, T. Frank, S. Buchan Jlenn // Immunol, and Cell. Biol. -1993.-71, №5.-P. 431-442.

162. Kaiser, R. Chemische und immunologische differenzierung des kulturfiltrates humanes mycobakterien / R. Kaiser // Z. Immun.-Forsch., 1969. Bd. 137.-S. 144-150.

163. Koike, S. / S. Koike, T. Kurata et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1991.-V. 88.-P. 951-955.

164. Kollins, G.V. Evaluation of comparative cervical tuberculin Skin testing in gervids naturally exposed to micobacteria / G.V. Kollins, C.O. Thoen, M.E. Fowler//Am. Med. Assoc. 1982.-V. 181.-№ 11.-P. 1257-1262.

165. Kubin, N. Antigenic characteristics of avian and intrasellularae mico-bacterial antigens / N. Kubin, E. Wisingerova // Amer. Rev. resp. Dis. 1965. - V. 92.-P. 54-82.

166. Larson, C. Plaque-forming cells in the spleens of rabbits immunized with viable BCG bacilli or oil cell wall vaccine from Mycobacterium bovis / C. Larson, M.B. Baker, D. Smith // Am. Rev. Resp. Dis. 1968. - V. 97. - P. 715718.

167. Lefford, M.J. Properties of lymphocytes with confer adoptive immunity to tuberculosis in rats / M.J. Lefford, D.D. McGregor, G.B. Mackaness // Immunology. 1973. - V. 25. - P. 703-715.

168. Lenzini, L. Effetti del siero antilinfocitario sulla risposta mediata da cellula nell'infezione e nelle reinfezione tubercolare sperimentall / L. Lenzini, R. Barnabe // Arch. Monaldi. tisiol. e malat. appar. respir., 1972. V. 27. - P. 280283.

169. Lightbody, K.A. Mycobacterial antigen-spesific antibody responses in bevine tuberculosis / K.A. Lightbody, R.A. Skuct, S.D. Neill, J.M. Pollock // Veter. Rev. 1998. V. 142. - № 2. - P. 295-300.

170. Lind, A. Immunolohical analysis of mycobacterial antigens / A. Lind //

171. Amer. Rev. Resp. Dis. 1965. -V. 92. - P. 54-62.

172. Mackaness, G.B. Cellular immunity / G.B. Mackaness // Ann. Inst. Pasteur. 1971.-V. 120.-P. 428-437.

173. Mackaness, G.B. Resistance to intracellular infection / G.B.Mackaness // J. Infect. Dis. 1971. -V. 123. - P. 439-445.

174. Mattman, L.M. Cell wall-defficient from of mycobacteria / L.M. Matt-man // Am. N.-Y. Acad. Sci. 1970. - V. 174. - P. 852-862.

175. Meyer, T.J. Effects of pretreatment of mice with BCG cell walls in saline of subsequent vaccination with BCG oil droplet vaccine / T.J. Meyer, R.L. Anacker, E. Ribi // Cell. Immunol. 1974. - V. 14. - P. 52.

176. Meyers, D. Tuberculosis eradicathin veterinariens Lead the way / D. Meyers, D. Stelle // Sixty-first Annual Proceedinge., U.S. 1980. - P. 207.

177. North, R.F. The histogenesis of immunologically commited lymphocytes / R.F. North, G.B. Mackaness, R.W. Elliott // Cell. Immunol. 1972. - V. 5. - P.680-694.

178. Ortalo-Magne Annick, Marie-Ange Dupont. Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus // Microbiology. 1995. -141, №7.-P. 1609-1620.

179. Ortiz-Ortiz, L. Delayed hypersensitivity to ribosomal protein from BCG / L. Ortiz-Ortiz, E.B. Solarolo, L.F. Bojalil // J. Immunol. 1971. - V. 107. -P. 1022-1026.

180. Horwitz, M.A. Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination with major extracellulor proteins of Mycobacterium tuberculosis / M.A. Horwitz, B.E. Lee, B.J. Dillon // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1995. - 92, № 5.-P. 1530-1534.

181. Postlethwaite, A.E. Characterization of quinea pig lymphocyte-derived chemotactic factor for monocytes. Its activation by thyphsin and a soluble factor from macrophages / A.E. Postlethwaite, A.H. Kang // J. Immunol. 1979. - V. 123.-P. 561-567.

182. Ping, X. Cooking and applying BCG-OBF of a vaccine / X. Ping, W. Gouzhi, Z. Yazhen et al. // Weishengwuxue tonbao Microbiology. 1993. - 20, №2.-P. 97-101.

183. Raffel, S. The relationship of acquired resistance, allergy, antibodies and tissue reactivities to the components of the tubercle bacillus / S. Raffel // Am. Rev. Tuberc. 1946. - 54. - P. 564-566.

184. Ribi, E. Structure and biologic function of mycobacteria / E. Ribi, R.L. Anacker et al. // Immun.-Forsch. 1969. - 137, 1-3. - P. 60-61.

185. Roche, P.W. BCG vaccination against tuberculosis: Past disappointments and future hopes / P.W. Roche, J.A. Triccas, N. Winter // Trends Microbiol. 1995.-3,№ 10.-P. 397-401.

186. Schopfer, K. Tuberkulose: Quo vadis? / K. Schopfer, U. Boschung // Schweiz. med. Wochenschr. 1995. - 125, № 37. - P. 1709-1714.

187. Seibert, F.B. The significanse of antibodies to tuberculoprotein and polysaccharide in resistanse to tuberculosis. Interferense with antibodies by there antigens / F.B. Seibert, E.E. Miller, U. Buseman // Am. Rev. Tuberc. 1956. - V. 73.-P. 547-562.

188. Sieva, C.L. New vaccines against tuberculosis / C.L. Sieva // Braz. J. Med. And Biol. Res. 1995. -28, № 8.-P. 843-851.

189. Smith, D. Nonliving immunogenic substances of Mecobacteria / D. Smith, A. Grover, E. Wiegeshaus // Adv. Tuberc. Res. 1968. - V. 16. - P. 191— 227.

190. Stotmeier, K.D. Purified protoplasmic peptides of mycobacteria: chemical composition of a tuberculin-active glycopeptide / K.D. Stotmeier, R.E. Beam//J. Bacteriol. 1971. - V. 105.-P. 172-177.

191. Tanaka, A. Biological reactions induced by a lipopoly-saccharide (wax D) of mycobacteria with special reference to adjuvant activity / A. Tanaka // Kek-kaku. 1971. - V. 46. - P. 41-47.

192. Thoen, C.O. Mycobucterium bovis infection in animals and humans / C.O. Thoen, J.H. Steele // Lowa State univ. press. 1995. - XXVII. - P. 335.

193. Thoen, C.O. Use of enzyme-linked immunosorbent assay for detecting mycobacterial antigens in tissues of Mycobacterium bovis infected cattle / C.O. Thoen, C. Malstrom, E.M. Himes, К Mills // Am. J. Vet. Res. 1981. - Vol. 42. -p. 1814-1815

194. Tizard, I. Risk associated with use of live vaccines /1. Tizard // J.Amer. Vet. Med. Assoc. 1990. - 196, № 11.-P. 1851-1858.

195. Wilhelm, G. Bericht iiber intracutanteste mit einem aus tuberkelbak-terien gewonnenen nucleoprotein / G. Wilhelm // Z. Immun.-Forsch. 1969. - Bd 137.-S. 116-120.

196. ЗАЯВЛЕНИЕ о вьшане патента Российской Федерации на изобретение

197. Представляя указанные ниже документы, прошу (просим) выдать патент Российской Федерации на имя заявителя (ей)17I | Заявитель (и)

198. Всероссийский научно-исследователъский институт бруцеллеза и туберкулеза животных (ВНИИБТЖ)

199. В Государственное патентное ведомство

200. Российской Федерации I21858, Москва, Бережковская наб., 30, к. ! НИИГПЭ

201. Дата испрашиваемого приоритета33 | Код страны подачи по СТ. 3при испрашииаиии конвенционного приоритета)3.1. И | Название изобретения

202. Присутствовали: доктора ветеринарных наук: А.С.Донченко (председатель), Н.А.Шкиль, С.К.Димов, С.И.Прудников, А.Г.Хлыстунов (секретарь),

203. B.В.Храмцов, А.А.Самоловов, А.Г.Глотов; кандидаты вет.наук: В.И.Шайкин,

204. C.В.Лопатин, Е.Ю.Смертина, Ю.Г.К)шков, Н.А.Донченко.1. Повестка дня

205. Рассмотрение методических рекомендаций «Белково-целлюлезные комплексы из микобактерий: перспектива использования в ветеринарии». Авторы: В.Г.Ощепков, М.А.Бажин, В.В.Шамов.

206. Докладчик: Шамов В.В. кратко изложил материалы методических рекомендаций по получению белково-целлюлозных комплексов из микобактерий, дальнейшее их использование может войти в систему специфической профилактики туберкулеза. . г,

207. Рецензент: Н.А.Шкиль, доктор вет.наук, зав.лабораторией Н.А.Донченко, канд.вет.наук, с.н.с., зав.лабораторией по разработке мер борьбы с туберкулезом ГНУ ИЭВСиДВ.1. Постановили

208. Решили предложенные методические рекомендации утвердить и рекомендовать ученому совету ВНИИБТЖ рассмотреть вопрос о расширении работ по начатой тематике, результаты которой в дальнейшем представить для утверждения в Департамент ветеринарии МСХ РФ.

209. Председатель, член-корр РАСХН

210. Секретарь, д.в.н., профессор1. УТВЕРЖДАЮ

211. Временны! по изготовлению лабораторных образцов ТБЦ (туберкулезной бесклеточной вакцины на целлюлозной матрице)1. ТЖ, д.в.н,, профессор1. В.Г. Ощепков 2000 г.1. Приготовление антигена.

212. Антиген выделяется из вакцинного штамма БЦЖ.

213. Вакцинный штамм культивируется на жидких средах ВКЛ или Сотона, в конических колбах емкостью 0,5-1,0 л при температуре 37°С в течение 2-3-х недель.

214. Выросшею бактериальную массу собирают и трижды отмывают стерильным физиологическим раствором, центрифугируют в течение 20 мин при 3 тыс. об/мин.

215. Отмытую бактериальную массу ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе из расчета 1:5 (1,0 г бактериальной массы и 5 мл физиологического раствора).

216. Флаконы с суспензией бактериальных клеток помещают на 24 часа на шуттель-аппарат при комнатной температуре.

217. Бактериальные клетки подвергают ультразвуковой дезинтеграции в режиме 22-35 кГц в течение 8-10 мин.

218. Полученную взвесь центрифугируют 30 мин при р00 об/мин. Надоса-дочную жидкость собирают и используют в качестве антигена цитоплазматиче-ской фракции.

219. Осадок ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе 1:4 и подвергают ультразвуковой дезинтеграции в режиме 22-35 кГц в течение 301. МИН.

220. Полученную взвесь центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость собирают и используют в качестве антигена фракции клеточных оболочек для конъюгации.

221. Приготовление целлюлозной матрицы.

222. Мелко нарезают 5 г хлопковой ваты и замачивают в 100 мл 25%-ного раствора аммиака.

223. Свежеприготовленную гидроокись меди и 50 мл 25%-ного раствора аммиака добавляют к замоченной вате и тщательно перемешивают. Через час к полученной смеси добавляют еще 50 мл 25%-ного раствора аммиака, вновь тщательно перемешивают и оставляют на ночь.

224. Выпавшую суспензию целлюлозы отмывают на капроновом сите № 76 или при центрифугировании (5 мин при 2000 об/мин) дистиллированной водойдо исчезновения ионов S042" в промывной жидкости.

225. Отмывной осадок переносят во флакон емкостью 500 мл и доводят водой объем суспензии до 400 мл. Хранят при 4°С, используя по мере необходимости.

226. Приготовление вакцины ТБЦ.

227. В образце антигена определяют белок по окрашиванию бромфеноло-вым синим на фотоэлектроколориметре при длине волны 590 нм и чувствительности 3.

228. Антиген фракции клеточных оболочек смешивают с суспензией целлюлозы в соотношении 100 мг белка на 1 г целлюлозы при одновременном добавлении 25 |iM СгС13. После тщательного перемешивания смесь ставят на магнитную мешалку при температуре 4°С на 3 суток.

229. Реакционную смесь осаждают и 4-5 раз отмывают физиологическим раствором, центрифугируя 15 мин при 2000 об/мин. Осадок конъюгата разводят физиологическим раствором до первоначального объема.

230. Присоединившийся белок определяют по окрашиванию бромфеноло-вым синим.

231. В полученный конъюгат добавляют антиген цитоплазматической фракции до концентрации 1,5-2 мг белка в 1 мл вакцины.

232. Определение количества белка связавшегося с матрицей.

233. На кружок фильтровальной бумаги, помещенный на пористый фильтр, вставленный в колбу с отсосом, наносят пробу отмытого от несвязавшегося белка иммуносорбента, содержащую 1 мг целлюлозы.

234. Осадок иммуносорбента на фильтре промывают 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, затем дистиллированной водой.

235. Фильтр с осадком помещают в чашку Петри с 0,05%-ным раствором бромфенолового синего в 2%-ной уксусной кислоте и инкубируют 30 мин, затем в течение 30 мин отмывают от несвязавшегося красителя в трех сменах 2%го раствора уксусной кислоты.

236. Отмытый фильтр переносят в пробирку, содержащую 5 мл 0,025 Н NaOH, инкубируют 30 мин и синий элюат колориметрируют на любом колориметре при 590 нм. Количество белка в пробе определяют по калибровочной кривой.

237. Хранение лабораторных образцов вакцины.

238. Приготовленные образцы иммуносорбентов подвергают стерилизации. На этикетке следует указать наименование компонентов, количество целлюлозы и количество белка в 1 мл суспензии, дату приготовления.

239. Лиофильное высушивание вакцины следует проводить в пеницилли-новых флаконах в объеме 1-2 мл. Для этого к вакцине добавляют глюкозу в количестве 1 мкг на 1 г целлюлозы (по сухому веществу).

240. Лаборатория иммунитета и специфической профилактики туберкулеза ВНИИБТЖ

241. ТУБЕРКУЛЕЗНАЯ БЕСКЛЕТОЧНАЯ ВАКЦИНА НА ЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ МАТРИЦЕ (ТБЦ)1. ТЕХНИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ ТУ

242. Вводятся на опытную партию в количестве Срок введения с Срок действия с

243. Директор Всероссийского научно-исследовательского института бр>а£лдеза и туберкулеза живот1. JP1. Ощепков 2000 г.ии иммунитета и спецпрофилактики туберкулеза ВНИИБТЖ, д.в.н.1. М.А. Бажин

244. Настоящие технические условия распространяются на туберкулезную бесклеточную вакцину на целлюлозной матрице (ТБЦ), предназначенную для профилактической иммунизации крупного рогатого скота, ранее привитого вакциной БЦЖ.

245. Вакцина представляет собой густую жидкость белого цвета, состоящую из взвеси в физиологическом растворе частиц целлюлозы с прикрепленным химическим путем на ее поверхности белковым антигеном микобактерий.1. ТЕХНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ

246. Вакцина против туберкулеза должна соответствовать требованиям настоящих технических условий и изготовляться согласно временного регламента, утвержденного в установленном порядке.

247. По физико-химическим и биологическим свойствам вакцина должна удовлетворять требованиям и нормам, указанным в табл.1. Наименование показателя1. Характеристика и нормы1. Методы испытаний1. Внешний вид и цвет

248. Наличие посторонних примесей Стерильность1. Безвредность1. Иммуногенность

249. Содержание целлюлозы Содержание белка

250. Однородная взвесь частиц целлюлозы белого цвета.

251. При лиофилизации белая пористая таблетка. по п.3.1.

252. Определяют методом высушивания по п.3.5.

253. Определяют с помощью фотоэлектроколориметра и красителя БФСпо п.3.6.

254. Вакцину расфасовывают в стерильные флаконы по ГОСТ 10782-85,которые закрывают резиновыми пробками по ТУ 38-006-108-84 и обкатывают алюминиевыми колпачками по ОСТ 64-009-86.

255. На флаконы наклеивают этикетки, на которых обозначают: наименование предприятия-изготовителя, наименование препарата, количество его во флаконе, № серии, дату изготовления, срок годности.

256. Каждая серия вакцины должна быть принята контролером предприятия-изготовителя .

257. Серией вакцины считают определенное количество препарата, наработанное за один технологический цикл, в одних и тех же производственных условиях, смешанное в одной емкости, получившее свой номер, номер контроля и оформленное одним документом о качестве.

258. Для контроля препарата от каждой серии отбирают 8-10 флаконов, половину из них используют для проведения испытаний, другую половину хранят в архиве предприятия-изготовителя.

259. Определение внешнего вида.

260. Для определения внешнего вида, цвета, наличия посторонних примесей флаконы просматривают визуально.

261. Стерильность вакцины определяют по ГОСТ 28085-89.

262. Вакцину считают иммуногенной, если в результате патологоанатомиче-ских исследований показатели индекса защиты в опытной группе мышей будут равны этим же показателям в группе мышей, обработанных вакциной БЦЖ.

263. При показателях индекса защиты опытной группы животных, статистически достоверно уменьшенных таковых в группе контроля вакцины БЦЖ, серию вакцины ТБЦ бракуют, производство приостанавливают и проводят проверку технологии ее изготовления.

264. Определение содержания целлюлозы.

265. Определение количества иммобилизированного белка.36.1. Количество антигенного белка, связавшегося с матрицей, определяют на фотоэлектроколориметре с использованием красителя бромфенолового синего (БФС).

266. Вакцину хранят в сухом прохладном месте при температуре от 4 до 10°С в пределах срока годности.5. Указания по применению.8

267. Вакцину применяют в соответствии с Временным наставлением по применений ТБЦ, утвержденным в установленном порядке.6. Гарантия изготовителя.

268. Предприятие-изготовитель гарантирует соответствие качества вакцины ТБЦ требованиям настоящих ТУ при соблюдении требований к хранению и применению препарата.

269. Срок годности вакцины 1 год. Датой изготовления считают день определения количества белка в препарате или его лиофилизации.