Иммунобиологические свойства рекомбинантного антигена ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Носарева, Олеся Валерьевна

• Носарева, Олеся Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Носарева, Олеся Валерьевна

Список принятых сокращений.

Введение.

Научно-практическая значимость работы.

Положения, выносимые на защиту.

Структура диссертации.

Апробация работы и публикации.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эпидемиология туберкулёза.

1.2. Особенности противотуберкулёзного иммунитета.

1.2.1. Врождённый иммунитет.

1.2.2.Приобретённый иммунитет.

1.2.2.1. Клеточный иммунитет.

1.2.2.2. Гуморальный иммунитет.

1.3. Диагностика туберкулёза.

1.4. Вакцинопрофилактика туберкулёза.

1.4.1. Вакцина BCG.

1.4.2. Новые вакцины.

1.4.3. Системы доставки для рекомбинантных белков и ДНК-вакцин.

1.5. Роль изучения генома в борьбе против туберкулёза.

1.5.1. Область RD1.

1.5.2. Антигены ESAT-6 и CFP10.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Молекулярно-биологические методы.

2.2.2. Иммунологические методы.

2.2.3. Статистическая обработка полученных результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Получение и исследование свойств гибридного белка GST-ESAT-6.

3.1.1. Получение гибридного бежа GST-ESAT-б.

3.1.2. Анализ антигенных свойств гибридного белка GST-ESAT-6.

3.1.2.1. Использование гибридного белка GST-ESAT-6 в ИФА.

3.1.2.2. Использование гибридного белка GST-ESAT-6 в ELISA/HOH-y.9() 3.2. Получение и исследование иммуногенных свойств препарата «КрОЫЕб» на основе рекомбинантной ДНК, кодирующей микобактериальный антиген ESAT-6, и полисахаридного конъюгата.

3.2.1. Клонирование последовательности ДНК, содержащей ген esxA.

3.2.2. Оценка полисахаридного конъюгата в качестве системы доставки на примере МБЧ.

3.2.3. Получение препаратов «КрОЫЕб» и «KpcDNA».

3.2.4. Оценка степени защиты ДНК в составе экспериментального препарата при воздействии нуклеаз.

3.2.5. Схема проведения эксперимента.

3.2.6. Оценка «острой» токсичности экспериментальных препаратов.

3.2.7. Оценка гематологических показателей лабораторных мышей.

3.2.8. Определение концентрации цитокинов в сыворотке крови иммунизированных животных.

3.2.9. Индукция гуморального иммунного ответа иммунизированных мышей на антиген ESAT-6.

3.2.10. Индукция клеточного иммунного ответа иммунизированных мышей на антиген ESAT-6.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммунобиологические свойства рекомбинантного антигена ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis»

С туберкулёзом (ТБ) человечество знакомо очень давно. Однако мы до сих пор очень мало знаем о механизмах, позволяющих микобактериям в обход защитных сил организма длительное время сосуществовать в виде латентной инфекции и поджидать подходящего случая для поражения своего хозяина (Stewart et al., 2003; Tufariello et al., 2003). В настоящее время одна треть мирового населения имеет латентную форму ТБ и сталкивается с риском перехода этой болезни в открытую форму. Несмотря на предпринимаемые мировым сообществом меры неуклонно продолжает возрастать распространение лекарственно-устойчивого ТБ. В октябре 2006 г ВОЗ декларировала появление форм с широкой лекарственной устойчивостью, для лечения которых отсутствуют эффективные лекарственные средства. Поэтому возрастает роль иммунопрофилактики и ранней диагностики заболевания. В настоящее время для вакцинопрофилактики ТБ применяется живой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG), однако, индуцируемый им протективный эффект варьирует от 0 до 80 % (Aronson et al., 2004).

Исторически сложилось так, что для скринингового выявления инфицированных ТБ лиц применяется кожный тест, основанный на использовании грубого экстракта фильтрата культур М. tuberculosis — туберкулина, или PPD (purified protein derivative), для определения реакций клеточного иммунитета, вызываемых микобактериями. Специфичность туберкулиновых тестов ограничена невозможностью дифференцировать заболевание от поствакцинального состояния либо от инфицирования невирулентными микобактериями. Точный диагноз ТБ предусматривает обнаружение М. tuberculosis в материале от пациента, но микроскопические исследования не позволяют выявлять абациллярных больных и больных нелёгочными формами ТБ, а культуральные методы ещё требуют длительного времени для постановки диагноза. В настоящее время активно исследуется возможность использования новых высокоиммуногенных видоспецифичных антигенов в диагностике ТБ. Однако и здесь остаются проблемы, как, например, повышение чувствительности таких диагностических тестов без снижения их специфичности.

С развитием современных методов исследования генома мы приблизились к разгадке проблем вирулентности микобактерий и к возможности создания более эффективных препаратов вакцинопрофилактики ТБ. В 1996 г путём сравнения геномов патогенных микобактерий М. bovis и М. tuberculosis и микобактерий вакцинного штамма BCG были обнаружены области, кодирующие более 100 высокоиммуногенных белков, пригодных для диагностики и создания альтернативных вакцинных конструкций. Наиболее интересная область генома RD1 (region of deletion) присутствует только в патогенных штаммах микобактерий и делетирована из генома вакцинного штаммаМ bovis BCG, значит белки, кодируемые этой областью, могут оказаться ценными для дифференциальной диагностики. Кроме того, эти белки могут стать вакцинными кандидатами, так как отвечают за вирулентность микобактерий и, возможно, будут индуцировать протективный иммунитет.

С их использованием открываются возможности для создания субъединичных и ДНК-вакцин, однако, до сих пор до практики не доведена ни одна альтернатива существующей вакцины BCG, которая бы превосходила её по своим протективным свойствам. Одним из возможных направлений совершенствования субъединичных и ДНК-вакцин является поиск более эффективных способов их доставки в организм. Ранее было показано, что при введении в организм мышей полисахаридных частиц, в оболочке которых находятся суммарные антигены BCG, индуцируется клеточный иммунный ответ, а рибонуклеиновая кислота, находящаяся в их ядре, устойчива к действию рибонуклеаз. Такие конструкции были названы искусственными микобактериальными частицами (МБЧ).

Оставалось неясным, будет ли их введение животным приводить к формированию протективного иммунитета против М. tuberculosis, возможно ли их использование для доставки в организм животных ДНК, обеспечивающих синтез in vivo микобактериальных антигенов, а также будет ли формироваться иммунный ответ на эти антигены и каким он будет - преимущественно гуморальным или клеточным?

Цель настоящей работы заключалась в изучении возможности использования рекомбинантного белка ESAT-6 для диагностики туберкулёза и изучении особенностей иммунного ответа у лабораторных животных, вызываемого ДНК-конструкцией, обеспечивающей синтез in vivo антигена ESAT-6 М. tuberculosis, с применением полисахаридной системы доставки.

Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:

1. Получить рекомбинантный штамм Е. coli, способный продуцировать микобактериальный антиген ESAT-6, и оценить диагностический потенциал рекомбинантного белка ESAT-6.

2. Оценить возможность формирования протективного иммунного ответа к заражению М. bovis морских свинок, иммунизированных искусственными микобактериальными частицами на основе полисахаридной системы доставки.

3. Создать экспериментальный препарат на основе рекомбинантной ДНК, кодирующей антиген ESAT-6, и полисахаридной системы доставки:

• сконструировать рекомбинантную плазмиду, обеспечивающую синтез антигена ESAT-6 в эукариотической системе;

• получить конъюгат полиальдегиддекстран-спермидин;

• получить экспериментальный препарат и проверить его стабильность.

4. Исследовать иммуногенные свойства экспериментального препарата на мышиной модели.

5. Оценить безопасность применения экспериментального препарата для живых организмов.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Впервые получен рекомбинантный штамм Е. coli, продуцировавший микобактериальный рекомбинантный белок GST-ESAT-6, который оказался пригоден для диагностики активного ТБ. Важным результатом выполненной работы явилось определение чувствительности ИФА при выявлении антител класса IgG к антигену ESAT-6 М. tuberculosis, которая составила 60 %, при специфичности - 95 %.

В результате проделанной работы впервые был показан протективный иммунный ответ при заражении М. bovis иммунизированных искусственными микобактериальными частицами морских свинок.

Впервые сконструирована плазмида pONE6, содержащая ген esxA, экспрессирующий микобактериальный антиген ESAT-6, на основе которой создан экспериментальный препарат «КрОЫЕб», окруженный полисахаридной оболочкой из молекул модифицированного полиглюкина и спермидина, способной защищать нуклеотидный материал от деградации нуклеазами.

Впервые показано, что иммунизация экспериментальным препаратом «КрОЫЕб» лабораторных животных приводит к формированию специфического клеточного иммунного ответа, а сам препарат не обладает «острой» токсичностью и является безопасным для применения на животных.

Полученные данные настоящей работы по иммуногенности экспериментального препарата могут лечь в основу дальнейшего исследования его протективных свойств на лабораторных животных.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Плазмидная конструкция, включающая ген esxA M.tuberculosis, обеспечивает синтез рекомбинантного белка GST-ESAT-6 в клетках Е. coli.

2. Использование рекомбинантного бежа GST-ESAT-6 в ИФА позволяет выявлять антитела, специфичные кМ. tuberculosis.

3. Использование рекомбинантного бежа GST-ESAT-6 в ELISA/ИФН-у анализе позволяет проводить дифференциальную диагностику активного туберкулёза и поствакцинального иммунитета.

4. Искусственные микобактериальные частицы на основе пожсахаридного конъюгата и экспонирующие на своей поверхности суммарные белки М. bovis BCG обладают иммуногенностью и протективными свойствами на экспериментальной модели животных.

5. Экспериментальный препарат на основе рекомбинантной ДНК, кодирующей антиген ESAT-6, и полисахаридной системы доставки обладает Т-клеточной иммуногенностью на мышиной модели и безопасен для животных.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка жтературы. Библиография включает 235 работ: 27 - отечественных авторов и 208 - зарубежных. Работа иллюстрирована 18 рисунками и включает 6 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Носарева, Олеся Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. Сконструирована плазмида pGEX-2T/ESAT-6, обеспечивающая синтез рекомбинантного белка GST-ESAT-6 в клетках Е. coli, способного выявлять туберкулезоспецифичные IgG в сыворотках пациентов с уровнем чувствительности 60 % и уровнем специфичности 95 % в ИФА.

2. Показана возможность использования рекомбинантного белка

GST-ESAT-б для дифференциальной диагностики активного туберкулёза и поствакцинального иммунитета с помощью ELISA/ИФН-у анализа. Чувствительность данного метода с использованием в качестве стимулирующего антигена GST-ESAT-6 составила 72±11 % при специфичности более 94 %. При использовании же в качестве антигена PPD чувствительность метода составила 94±6 % при специфичности 33±11 %.

3. Показано, что искусственные микобактериальные частицы на основе полисахаридного конъюгата и экспонирующие на своей поверхности суммарные белки М. bovis BCG, обладают иммуногенностью и протективными свойствами на экспериментальной модели животных. Протективная способность МБЧ составляет 50 %, а для вакцины М. bovis BCG - 30 %. Иммунизация животных МБЧ приводит к достоверному увеличению (р<0,05) СПЖ особей до 135±5 суток по сравнению с контрольной группой (71±7 суток).

4. Создан экспериментальный препарат «КрОЫЕб», содержащий в центральной части плазмидную ДНК pONE6, кодирующую антиген ESAT-6, и окруженный полисахаридной оболочкой из молекул модифицированного полиглюкина и спермидина, способной защищать нуклеотидный материал от деградации под действием нуклеаз.

5. Показано, что трёхкратная внутримышечная иммунизация с интервалом 14 суток препаратом «КрОЫЕб» в дозе 12 мкг на животное приводит к формированию специфического клеточного иммунитета у мышей линии BALB/c. При этом экспериментальный препарат «КрОЫЕб» не оказывает значимого влияния на гематологические показатели иммунизированных животных и не обладает «острой» токсичностью.

Список статей, опубликованных по теме диссертации:

1. Татьков С.И, Туманов Ю.В, Носа ре в а О.В, Болдырев А.Н, Смирнова О.Ю, Лебедев Л.Р, Порываева В. А, Ивлев-Дунтау А.П, Ткаченко С.Б, Стрелис А.К, Новицкий В.В, Уразова О.И, Воронкова О.В. Применение рекомбинантных видоспецифических белков микобактерий туберкулеза для серологической диагностики инфекции. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика.-2006.- №4 (29).-С.42-47.

2. Татьков С.И, Носарева О.В, Болдырев А, Н, Смирнова О.Ю, Туманов Ю.В, Лебедев Л.Р, Порываева В.А, Ивлев-Дунтау А.П, Аутеншлюс А.И,. Ткаченко С.Б, Стрелис А.К, Новицкий В.В, Уразова О.И, Воронкова О.В. Применение рекомбинантных видоспецифических белков M.tuberculosis для серологической диагностики туберкулёза. // Клиническая и лабораторная диагностика.-2006.-№12.-С.23-34.

3. Туманов Ю.В, Смирнова О.Ю, Болдырев А.Н, Носарева О.В., Вараксин Н.А, Татьков С.И. Рекомбинантные белки М.tuberculosis в диагностике туберкулеза легких. // К1ед. иммунология.-2006.-№ 2-3.-С.294-295.

4. Азаев М.Ш, Лебедев Л.Р, Кузьмичёва Г.А, Туманов Ю.В, Донченко Н.А, Татьков С.И, Носарева О.В, Ильичёв А.А. Исследование роли искусственных микобактериальных частиц в реализации иммунологических процессов при экспериментальном туберкулёзе животных. //Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.-2007.-№2.-С.38-48.

Доклады и тезисы конференций:

1. Носарева О.В., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Использование рекомбинантных белков в диагностике туберкулёза. // Сборник трудов Международного симпозиума «Интегративная Медицина в XXI веке», Судак, Украина.-2004.-С.23.

2. Nosareva О., Smirnova О., Boldyrev A., Tumanov Yu. Azaev М., Lebedev L., Tatkov S. Construction of artificial virus-like particles exposing Mycobacterial ESAT-6, and the study of their immunogenic properties. // Abstract book Keystone Symposia "Tuberculosis: Integrating Host and Pathogen Biology". Whistler, British Columbia, Canada.-2005.-P.94.

3. Носарева O.B. Конструирование микрочастиц, содержащих рекомбинантный антиген ESAT-6 для получения экспериментальной вакцины против туберкулёза. Науки о человеке: материалы VI конгресса молодых ученых и специалистов. // Под ред. JI.M. Огородовой, JI.B. Капилевича. - Томск: СибГМУ.-2005.-С.25.

4. Nosareva О., Nesterov A., Ignatyev G., Smirnova О., Boldyrev А., Tumanov Yu., Tatkov S. Investigation of the Virus Like Particles as the delivery system for presenting DNA-vaccine against tuberculosis to immune system". // International Congress "New Approaches to Vaccine Development: From the bench to the field", Berlin, Germany.-2005.

5. Носарева O.B., Нестеров A.E., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Конструирование частиц на основе ПАД и исследование их свойств в качестве системы доставки ДНК-вакцин против туберкулёза. // Международная школа-конференция «Системная биология и биоинженерия», г.Москва.-2005.

6. Туманов Ю.В., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н., Носарева О.В., Татьков С.И., Ивлев-Дунтау А.П, Рекомбинантные белки М.tuberculosis в диагностике туберкулёза лёгких. // «Новые технологии в интегративной медицине и биологии», «Стресс и экстремальные состояния»:

Международный Междисциплинарный семинар, Бангкок-Патайя, Тайланд: Труды Семинара и Научного Дискуссионного Клуба/Под.ред. И.В.Тимофеева, Н.Г. Перминовой - Новосибирск, Типография НИИ Катализа СО РАН.-2006.-С.74-75.

7. Азаев М.Ш, Королёв С.А, Лебедев Л.Р, Кузьмичёва Г.А, Туманов Ю.В, Носарева О.В., Татьков С.И. Микобактериальные частицы как новое средство иммунопрофилактики туберкулёзной инфекции. // «Новые технологии в интегративной медицине и биологии», «Стресс и экстремальные состояния»: Международный Междисциплинарный семинар, Бангкок-Патайя, Тайланд: Труды Семинара и Научного Дискуссионного Клуба/Под.ред. ИВ.Тимофеева, Н.Г. Перминовой - Новосибирск, Типография НИИ Катализа СО РАН.-2006.-С.6-7.

8. O.Nosareva; A.Nesterov; A.Boldyrev; O.Smirnova; Yu.Tumanov; S.Tatkov. Immunological studies DNA-vaccine encoded ESAT6 antigen. The Second International Conference on ТВ Vaccines for the World, The Austrian Industrial Association, Vienna, Austria,19-21 April 2006.

9. Носарева О.В, Нестеров A.E, Болдырев А.Н, Смирнова О.Ю, Туманов Ю.В, Татьков С.И. Исследование экспериментального препарата на основе микобактериального антигена ESAT6. Международная школа-конференция молодых ученых «Биотехнология будущего» в рамках Международного Симпозиума «ЕС—Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной программе», С-П, 5-9 июня 2006г.

10. Носарева О.В, Нестеров А.Е, Татьков С.И. Конструирование экспериментального препарата на основе полиальдегиддекстрана и исследование его свойств в качестве системы доставки ДНК-вакцины против туберкулёза. Проблемы фундаментальной и прикладной медицины:Материалы VI Всероссийской конференции молодых учёных в рамках 13 Международного конгресса по приполярной медицине. 12-16 июня 2006г.- НовосибирскЮОО «РИЦ».-2006.-с.39.

11. Болдырев А.Н., Носарева О.В., Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Применение рекомбинантных видоспецифических белков M.tuberculosis для серологической диагностики туберкулеза. Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера:Ш Российская научная конференция с международным участием (2729 сентября 2006г.,Новосибирск).-Новосибирск:ЦЭРИС,2006.-с.134.

12. Туманов Ю.В., Болдырев А.Н., Смирнова О.Ю., Лебедев Л.Р., Азаев М.Ш., Носарева О.В., Ивлев-Дунтау А.П., Татьков С.И. Выявление маркёров Т-клеточного иммунитета в видоспецифической диагностике туберкулёза. Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера:Ш Российская научная конференция с международным участием.-Новосибирск:ЦЭРИС,2006.-е. 166.

13. Nosareva О., Nesterov A., Boldyrev A., Smirnova О., Tumanov Yu., Tatkov S. Immunological responses after immunization of mice with DNA plasmid encoded ESAT6 antigen with polysaccharide matrix. // Abstract book 16th ERS Annual Congress, Munich, Germany.-2006.-P.342.

14. Nosareva O., Nesterov A., Ignatyev G., Smirnova O., Boldyrev A., Tumanov Yu., Tatkov S. The Mycobacterium antigen ESAT6 as the DNA-vaccine and diagnostic targets. // First Summer School on Infectious diseases - affecting civil societies", Berlin, Germany.-2006.

15. Nosareva O., Nesterov A., Ignatyev G., Smirnova O., Boldyrev A., Tumanov Yu., Tatkov S. Immunological studies DNA-vaccine encoded antigen ESAT6. // Strengthening Human Resources for better lung health. 37th Union World Conference on Lung Health Paris, France, 31 October - 4 November 2006.

16. Nosareva O., Nesterov A., Boldyrev A., Smirnova O., Tumanov Yu., Tatkov S. The Mycobacterium antigen ESAT-6 as the DNA-vaccine and diagnostic targets. // 3rd Vienna Vaccines Conference, «Challenges for Vaccine Development: Medical Need and Social Implications», Baden near Vienna.-2007.-P.72.

17. Туманов Ю.В, Болдырев А.Н, Носарева О.В, Смирнова О.Ю, Татьков С.И. Использование рекомбинантных микобактериальных антигенов в диагностике туберкулёза лёгких. // Туберкулёз, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении: Тезисы II Российско-Германской конференции Форума Коха- Мечникова, Томск.-2007.-С.34.

18. Туманов Ю.В, Болдырев А.Н, Смирнова О.Ю, Лебедев Л.Р, Азаев М.Ш, Носарева О.В, Ивлев-Дунтау А.П, Татьков С.И. Видоспецифическая диагностика туберкулёза по маркёрам Т-клеточного иммунитета. // Туберкулёз, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении: Тезисы II Российско-Германской конференции Форума Коха- Мечникова, Томск.-2007.-С.36.

19. Носарева О.В, Нестеров А.Е, Смирнова О.Ю, Болдырев А.Н, Татьков С.И. Изучение иммунного ответа на противотуберкулёзную ДНК-вакцину, модифицированную полисахаридом. // Туберкулёз, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении: Тезисы II Российско-Германской конференции Форума Коха- Мечникова, Томск.-2007.-С.76.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нарастание угрозы ТБ на фоне недостаточной эффективности вакцины BCG и несовершенной диагностики этого заболевания приводит к очевидной необходимости более глубокого и внимательного изучения микобактерий. Треть населения нашей планеты инфицирована микобактериями ТБ и подвержена опасности развития этого заболевания.

Применение специфических антигенов М. tuberculosis позволяет создать и разработать более эффективные препараты вакцинопрофилактики ТБ и эффективные высокоспецифичные методы диагностики ТБ. Одним из наиболее перспективных является антиген ESAT-6, кодируемый делегированной из вакцинных штаммов BCG, но присутствующей в патогенных микобактериальных штаммах генной областью RD1.

В результате проделанной работы было проведено конструирование рекомбинантной плазмиды, несущей микобактериальный антиген ESAT-6, и клонирование её в штамм Е. coli. С помощью ИФА, используя панели сывороток здоровых и больных ТБ лиц, были изучены антигенные свойства полученного рекомбинантного белка GST-ESAT-6. Показано, что данный рекомбинантный антиген способен выявлять ТБ-специфичные IgG в сыворотках пациентов, с уровнем чувствительности 60 % и уровнем специфичности 95 %. Было так же показано, что рекомбинантный антиген GST-ESAT-6 пригоден для дифференциальной диагностики инфицирования ТБ от поствакцинального иммунитета с использованием проб цельной крови в ELISA/ИФН-у анализе.

Кроме того, антиген ESAT-6 был встроен в эукариотическую экспрессионную плазмиду и клонирован в клетках Е. coli. Полученная рекомбинантная плазмида легла в основу экспериментального препарата «КрОЫЕб» - ДНК-конструкции с использованием полисахаридной системы доставки. В данной работе была проведена предварительная оценка перспективности применения полисахаридной системы доставки экспериментальных препаратов на примере микобактериальных частиц при иммунизации ими морских свинок. Оказалось, что система МБЧ способствует формированию эффективного протективного иммунного ответа у животных против ТБ. В дальнейшем было проведено изучение иммунного ответа у мышей, индуцируемого экспериментальным препаратом «КрОЫЕб», и было показано, что антиген ESAT-6 индуцирует специфичный Т-клеточный иммунный ответ, а используемая полисахаридная система доставки не обладает токсичностью и защищает нуклеотидный материал от нуклеазной деградации.

Таким образом, антиген ESAT-6 является перспективным кандидатом в вакцинопрофилактике ТБ, а рекомбинантный белок GST-ESAT-6 может применяться для дифференциальной диагностики ТБ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Носарева, Олеся Валерьевна, 2007 год

1. Азаев М. Ш., и др. Получение искусственных микобактериальных частиц и исследование их иммунногенных свойств. // Биотехнология.-2004.-№4.-С.34-37.

2. Ашмарин И. П., Воробьёв А. А. // Статистические методы в микробиологических исследованиях.-Л.: Медгиз.-1962.-С.182.

3. Борисов Л.Б. // Медицинская микробиология, вирусология, иммунология.-М.-2002.-С.437-441.

4. Визель А. А., Гурылева М. Э. // Туберкулёз.-М.:ГЭОТАР Медицина.-1999.-С.485.

5. Генес B.C. // Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. М.:Наука.-1967.-С.208,

6. Журавлёв М. В., Арсенина Л. В., Виноградова И. Л., Проваторова Л. В. Эпидемиология и некоторые аспекты лабораторной диагностики туберкулёза. // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней.М.-2002.-Вып.4.-С. 194-197.

7. Ильина Т.Я., и др. Распространенность рецидивов туберкулеза органов дыхания при напряженной эпидемической ситуации. // Проблемы туберкулеза и болезней легких.-2005.-№7.-С.32.

8. Карпенко Л. И. и др. Иммунный ответ при оральной и ректальной иммунизации аттенуированным штаммом сальмонеллы, несущим ВИЧ-1 ДНК вакцину. //Вопр. вирусологии.-2003.-Т.48, №4.-С.16-20.

9. Кетлинский С. А., Калинина Н. М. // Иммунология для врача. С.-Петербург-1998.-С. 142.

10. Козловская Л. В. Николаев А. Ю. // Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования.-М.:Медицина.-1984.-С.138.

11. Комогорова Е. Э. и др. Особенности иммунологических показателей у больных с различными формами туберкулёза лёгких. // Иммунология.-2005.-№1.-С.45-50.

12. Кулаков Ю. К. и др. Высокочувствительная неизотопная система гибридизации ДНК с применением амплификации (ПЦР для идентификации бруцелл). // Молекуляр. генетика, микробиол. и вирусол.-М.-1992.-№7-8,-С.23.

13. Куличенко А.Н. и др. // Методические указания по детекции патогенной микрофлоры в клиническом материале, пищевых продуктах, объектах внешне среды и выполнению генетической идентификации клеток с помощью полимеразной цепной реакции.-М.-199б.-С.11.

14. Ларионова Е. Е, Кузьмин А. В, Васильева И. А. Сравнительная характеристика молекулярных и микробиологических методов контроля химиотерапии у впервые выявленных больных туберкулёзом лёгких. // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.-2004.-№6.-С.31-34.

15. Лебедев Л.Р. и др. Конструирование вирусоподобных частиц, экспонирующих эпитопы ВИЧ-1. // Молекул, биология.-2000.-Т. 34.-N3.-С.480-485.

16. Маниатис Т, Фрич Э, Сэмбрук Дж. // Молекулярное клонирование. М.:Мир.-1984.-С.480.

17. Медведев С. Ю, Перельман М. И. // Туберкулез в России// Туберкулёз и вакцинопрофилактика.-2002.-№1.-С.19.

18. Остерман Л. А. // Методы исследований белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.:Наука.-1981.-С.288.

19. Порядок и методы контроля иммунологической безопасности вакцин. Общие методические принципы. МЗ СССР. РД 42-28-1090. М.:1989.

20. Пшеничнов В. А., Семенов Б. Ф., Зезеров Е. Г. // Стандартизация методов вирусологических исследований.-М.:Медицина.-1974.-С.168.

21. Татьков С. И. и др. Применение рекомбинантных видоспецифических белков M.tuberculosis для серологической диагностики туберкулёза. // Клиническая лабораторная диагностика.-2006.-№12.-С.23-34.

22. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль: Пер. с анг./ Под ред. Барри Р. Блума. М.:Медицина.-2002.С.696.

23. Фролова Ф. Н., Кулаков И. М., Зайнутдинова Н. Г., Фатыхова Р. X. О заболеваемости туберкулёзом в г. Казань. // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней.-2002.-Вып.5.-С.144-14б.

24. Шешуков П. Ф., Готовский Ю. В. Некоторые аспекты современной диагностики туберкулёза. // Материалы 8-й международной конференции «Теоретические и клинические аспекты применения биорезонансной и мультирезонансной терапии».М.-2002.-Ч.1.-С.167-169.

25. Abbas АК, Williams ME, Burstein HJ, Chang TL, Bossu P, Lichtman AH. Activation and functions of CD4+ T-cell subsets. // Immunol Rev.- 1991.-Vol.123.-P.5-22.

26. Abel B, Thieblemont N, Quesniaux VJ et al. Toll-like receptor 4 expression is required to control chronic Mycobacterium tuberculosis infection in mice. // J Immunol.-2002.-Vol.l69.-P.3155-62.

27. Ahmad S, Amoudy HA, Thole JE, Young DB, Mustafa AS. Identification of a novel protein antigen encoded by a Mycobacterium tuberculosis-specific RD1 region gene. // Scand J Immunol.-1999.-Vol.49.-P.515-22.

28. Aleman M, Garcia A, Saab MA et al. Mycobacterium tuberculosis-induced activation accelerates apoptosis in peripheral blood neutrophils from patients with active tuberculosis. // Am J Respir Cell Mol Biol.-2002.-VoI.-27.-P.583-92.

29. Amicosante M, Houde M, Guaraldi G, Saltini C. Sensitivity and specificity of a multi-antigen ELISA test for the serological diagnosis of tuberculosis. // Int J Tuberc Lung Dis.-1999.-Vol.3.-P.736-40.

30. Ando S, Putnam D, Pack DW, Langer R. PLGA microspheres containing plasmid DNA: preservation of supercoiled DNA via cryopreparation and carbohydrate stabilization. // JPharm Sci.-1999.-Vol.88.-P.126-30.

31. Araujo Z, Waard JH, Fernandez dL et al. Study of the antibody response against Mycobacterium tuberculosis antigens in Warao Amerindian children in Venezuela. //Mem Inst Oswaldo Cruz.-2004.-Vol.99.-P.517-24.

32. Aronson NE, Santosham M, Comstock GW et al. Long-term efficacy of BCG vaccine in American Indians and Alaska Natives: A 60-year follow-up study. // JAMA.-2004.-Vol.291 .-P.2086-91.

33. Badak FZ, Goksel S, Sertoz R et al. Use of nucleic acid probes for identification of Mycobacterium tuberculosis directly from MB/BacT bottles. // J Clin Microbiol.-1999.-Vol.37.-P.l 602-5.

34. Barnes PF. Rapid diagnostic tests for tuberculosis: progress but no gold standard. // Am JRespir Crit Care Med.-1997.-Vol.l55.-P.1497-8.

35. Barnes PF, Abrams JS, Lu S, Sieling PA, Rea TH, Modlin RL. Patterns of cytokine production by mycobacterium-reactive human T-cell clones. // Infect Immun.-l993.-Vol. 61 .-P. 197-203.

36. Barnes PF, Chatteijee D, Abrams JS et al. Cytokine production induced by Mycobacterium tuberculosis lipoarabinomannan. Relationship to chemical structure. // J Immunol.-1992.-Vol.l49.-P.541-7.

37. Barry ME, Pinto-Gonzalez D, Orson FM, McKenzie GJ, Petry GR, Barry MA. Role of endogenous endonucleases and tissue site in transfection and CpG-mediated immune activation after naked DNA injection. // Hum Gene Ther.-1999.-Vol.10.-P.2461-80.

38. Bellocchio S, Moretti S, Perruccio К et al. TLRs govern neutrophil activity in aspergillosis. // J Immunol.-2004.-Vol.l73.-P.7406-15.

39. Benoit MA, Baras B, Gillard J. Preparation and characterization of protein-loaded poly(epsilon-caprolactone) microparticles for oral vaccine delivery. // International Journal of Pharmaceutics.-1999.-Vol.l84.-P.73-84.

40. Berthet FX, Rasmussen PB, Rosenkrands I, Andersen P, Gicquel В. A Mycobacterium tuberculosis operon encoding ESAT-6 and a novel low-molecular-mass culture filtrate protein (CFP-10)//Microbiology.-1998.-Vol.l44.-P.3195-203.

41. Bloomfield VA. DNA condensation. // Curr Opin Struct Biol.-1996.-Vol.6.-P.334-41.

42. Boom WH, Canaday DH, Fulton SA, Gehring AJ, Rojas RE, Torres M. Human immunity to M. tuberculosis: T cell subsets and antigen processing. // Tuberculosis (Edinb).-2003.-Vol.83.-P.98-106.

43. Borchard G. Chitosans for gene delivery. // Adv Drug Deliv Rev.-2001.-Vol.52.-P.145-50.

44. Braunlin WH, Strick TJ, Record MT, Jr. Equilibrium dialysis studies of poly amine binding to DNA. // Biopolymers.-1982.-Vol.21.-P.1301-14.

45. Briones M, Singh M, Ugozzoli M et al. The preparation, characterization, and evaluation of cationic microparticles for DNA vaccine delivery. //Pharm Res.-2001.-Vol.l8.-P.709-12.

46. Britton WJ, Palendira U. Improving vaccines against tuberculosis. // Immunol Cell Biol.-2003.-Vol.81.-P.34-45.

47. Brock I, Weldingh K, Lillebaek T, Follmann F, Andersen P. Comparison of tuberculin skin test and new specific blood test in tuberculosis contacts. // Am J Respir Crit Care Med.-2004.-Vol.170.-P.65-9.

48. Brodin P, Rosenkrands I, Andersen P, Cole ST, Brosch R. ESAT-6 proteins: protective antigens and virulence factors?// Trends Microbiol.-2004.-Vol.l2.-P.500-8.

49. Butler WR, O'Connor SP, Yakrus MA, Gross WM. Cross-reactivity of genetic probe for detection of Mycobacterium tuberculosis with newly described species Mycobacterium celatum. // J Clin Microbiol.-1994.-Vol.32.-P.536-8.

50. Caminero JA, Rodriguez dC, Carrillo T, Cabrera P. Antimycobacterial antibodies in tuberculous pleural effusions: reliability of antigen 60. //Chest. -1991.-Vol.99.-P.1315-6.

51. Camus JC, Pryor MJ, Medigue C, Cole ST. Re-annotation of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. // Microbiology.-2002.-Vol.l48.-P.2967-73.

52. Caragol I, Raspall M, Fieschi С et al. Clinical ТВ in 2 of 3 siblings with IL-12 receptor betal deficiency. // Clin Infect Dis.-2003.-Vol.37.-P.302-6.

53. Cha Y, Pitt CG. The biodegradability of polyester blends. // Biomaterials .-1990.-Vol. 11 .-P. 10 8-12.

54. Champion PA, Stanley SA, Champion MM, Brown EJ, Cox JS. C-terminal signal sequence promotes virulence factor secretion in Mycobacterium tuberculosis. // Science.-2006.-Vol.313.-P.1632-6.

55. Chan CM, Woo PC, Leung AS et al. Detection of antibodies specific to an antigenic cell wall galactomannoprotein for serodiagnosis of Aspergillus fiimigatus aspergillosis. // J Clin Microbiol.-2002.-Vol.40.-P.2041-5.

56. Chandrasekhar S, Mukherjee MK. Intracellular tubercle bacilli-alveolar macrophage lysosomal enzymes interaction in experimental tuberculosis. //Clin Immunol Immunopathol.-1990.-Vol.56.-P.185-201.

57. Chapman AL, Munkanta M, Wilkinson KA et al. Rapid detection of active and latent tuberculosis infection in HIV-positive individuals by enumeration of Mycobacterium tuberculosis-specific T cells. // AIDS.-2002.-Vol.l6.-P.2285-93.

58. Clemons KV, Calich VL, Burger E et al. Pathogenesis I: interactions of host cells and fungi. //MedMycol.-2000.-Vol.38, Suppl 1.-P.99-111.

59. Cliff JM, Andrade IN, Mistry R et al. Differential gene expression identifies novel markers of CD4+ and CD8+ T cell activation following stimulation by Mycobacterium tuberculosis//J Immunol.-2004.-Vol.l73.-P.485-93.

60. Co DO, Hogan LH, Kim SI, Sandor M. Mycobacterial granulomas: keys to a long-lasting host-pathogen relationship. // Clin Immunol.-2004.-Vol.ll3.-P.130-6.

61. Cole ST, Barrell BG. Analysis of the genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. //Novartis Found Symp.-1998.-Vol.217.-P. 160-72.

62. Collins FM, Wayne LG, Montalbine. The effect of cultural conditions on the distribution of Mycobacterium tuberculosis in the spleens and lungs of specific pathogen-free mice//Am Rev Respir Dis.-1974.-Vol.ll0.-P.147-56.

63. Cooper AM, Magram J, Ferrante J, Orme IM. Interleukin 12 (IL-12) is crucial to the development of protective immunity in mice intravenously infected with mycobacterium tuberculosis. // J Exp Med.-1997.-Vol.l86.-P,39-45.

64. Cortesi R, Esposito E, Osti M et al. Dextran cross-linked gelatin microspheres as a drug delivery system. //Eur J Pharm Biopharm.-1999.-Vol.47.-P.153-60.

65. Cui Z, Mumper RJ. Microparticles and nanoparticles as delivery systems for DNA vaccines. // Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.-2003.-Vol.20.-P. 103-37.

66. D'Souza S, Rosseels V, Denis О et al. Improved tuberculosis DNA vaccines by formulation in cationic lipids//Infect Immun.-2002.-Vol.70.-P.3681-8.

67. Daniel TM. The history of tuberculosis. // Respir Med.-2006.-Vol.100.-P. 1862-70.

68. Dannenberg AM, Jr. Immune mechanisms in the pathogenesis of pulmonary tuberculosis. //Rev InfectDis.-1989.-Vol.11, Suppl 2.-P.369-378.

69. Denis-Mize KS, Dupuis M, MacKichan ML et al. Plasmid DNA adsorbed onto cationic microparticles mediates target gene expression and antigen presentation by dendritic cells. // Gene Ther.-2000.-Vol.7.-P.2105-12.

70. Derrick SC, Yang AL, Morris SL. A polyvalent DNA vaccine expressing an ESAT6-Ag85B fusion protein protects mice against a primary infection with Mycobacterium tuberculosis and boosts BCG-induced protective immunity. // Vaccine.-2004.-Vol.23.-P.780-8.

71. Dietrich G, Bubert A, Gentschev I et al. Delivery of antigen-encoding plasmid DNA into the cytosol of macrophages by attenuated suicide Listeria monocytogenes.//Nat Biotechnol.-1998.-Vol.l6.-P.181-5.

72. Doe B, Selby M, Barnett S, Baenziger J, Walker CM. Induction of cytotoxic T lymphocytes by intramuscular immunization with plasmid DNA is facilitated by bone marrow-derived cells. // Proc Natl Acad Sci U S A.-1996.-Vol.93.-P.8578-83.

73. Doetsch RN. Benjamin Marten and his "New Theory of Consumptions". //Microbiol Rev.-1978.-Vol.42.-P.521-8.

74. Doffinger R, Dupuis S, Picard С et al. Inherited disorders of IL-12-and IFNgamma-mediated immunity: a molecular genetics update. // Mol Immunol.-2002.-Vol.38.-P.903-9.

75. Dolin PJ, Raviglione MC, Kochi A. Global tuberculosis incidence and mortality during 1990-2000. // Bull World Health Organ.-1994.-Vol.72.-P.213-20.

76. Donnelly JJ, Liu MA, Ulmer JB. Antigen presentation and DNA vaccines. // Am J Respir Crit Care Med.-2000.-Vol.162.-P. 190-193.

77. Donnelly JJ, Wahren B, Liu MA. DNA vaccines: progress and challenges. // JImmunol.-2005.-Vol.l75.-P.633-9.

78. Dunlap DD, Maggi A, Soria MR, Monaco L. Nanoscopic structure of DNA condensed for gene delivery//Nucleic Acids Res.-1997.-Vol.25.-P.3095-101.

79. Dupuis M, Denis-Mize K, Woo С et al. Distribution of DNA vaccines determines their immunogenicity after intramuscular injection in mice. // J Immunol.-2000.-Vol.l65.-P.2850-8.

80. Esser D, Amanuma H, Yoshiki A, Kusakabe M, Rudolph R, Bohm G. A hyperthermostable bacterial histone-like protein as an efficient mediator for transfection of eukaryotic cells. // Nat Biotechnol.-2000.-Vol. 18.-P.1211-3.

81. Feng CG, Demangel C, Kamath AT, Macdonald M, Britton WJ. Dendritic cells infected with Mycobacterium bovis bacillus Calmette Guerin activate CD8(+) T cells with specificity for a novel mycobacterial epitope. // Int Immunol.-2001.-Vol.l3.-P.451-8.

82. Ficapal A, Alonso-Urmeneta B, Velasco J, Moriyon I, Blasco JM. Diagnosis of Brucella ovis infection of rams with an ELISA using protein G as conjugate. // Vet Rec.-1995.-Vol.l37.-P.145-7.

83. Flint JL, Kowalski JC, Karnati PK, Derbyshire KM. The RD1 virulence locus of M. tuberculosis regulates DNA transfer in Mycobacterium smegmatis//Proc Natl Acad Sci USA.-2004.-Vol.l01.-P.12598-603.

84. Flynn JL. Immunology of tuberculosis and implications in vaccine development. //Tuberculosis (Edinb).-2004.-Vol.84.-P.93-101.

85. Flynn JL, Chan J. Tuberculosis: latency and reactivation. // Infect Immun.-2001.-Vol.69.-P.4195-201.

86. Flynn JL, Chan J, Triebold KJ, Dalton DK, Stewart ТА, Bloom BR. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. //JExpMed.-1993.-Vol.l78.-P.2249-54.

87. Foulds J, OBrien R. New tools for the diagnosis of tuberculosis: the perspective of developing countries. //Int J Tuberc Lung Dis.-1998.-V.2.-P.778-83.

88. Fremond CM, Yeremeev V, Nicolle DM, Jacobs M, Quesniaux VF, Ryffel B. Fatal Mycobacterium tuberculosis infection despite adaptive immune response in the absence of MyD88. // J Clin Invest.-2004.-Vol.114.-P. 1790-9.

89. Fynan EF, Webster RG, Fuller DH, Haynes JR, Santoro JC, Robinson HL. DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations. // Proc Natl Acad Sci U S A.-1993.-Vol.90.-P.l 1478-82.

90. Gangadharam PR. BCG vaccination and non-tuberculous Mycobacteria. // Tubercle.-1981.-Vol.62.-P.223-4.

91. Garlanda C, Hirsch E, Bozza S et al. Non-redundant role of the long pentraxin PTX3 in anti-fungal innate immune response. // Nature.-2002.Vol.420.-P. 182-6.

92. Gey Van Pittius NC, Gamieldien J, Hide W, Brown GD, Siezen RJ, Beyers AD. The ESAT-6 gene cluster of Mycobacterium tuberculosis and other high G+C Gram-positive bacteria. // Genome Biol.-2001.-Vol.2.-P.233-245.

93. Gillespie SH, McHugh TD. Monitoring the therapy of pulmonary tuberculosis by nested polymerase chain reaction//J Infect.-1997.-Vol.35.-P.324-5.

94. Global tuberculosis control: WHO Report 2004. WHO/HTM/TB/2004.331.

95. Gonzalez-Juarrero M, Orme IM. Characterization of murine lung dendritic cells infected with Mycobacterium tuberculosis. // Infect Immun.-2001.-Vol.69.-P. 1127-33.

96. Granucci F, Zanoni I, Feau S, Ricciardi-Castagnoli P. Dendritic cell regulation of immune responses: a new role for interleukin 2 at the intersection of innate and adaptive immunity. // EMBO J.-2003.-Vol.22.-P.2546-51.

97. Griese M, Essl R, Schmidt R et al. Pulmonary surfactant, lung function, and endobronchial inflammation in cystic fibrosis. // Am J Respir Crit Care Med.-2004.-Vol. 170.-P. 1000-5.

98. Griffin JP, Harshan KV, Born WK, Onne IM. Kinetics of accumulation of gamma delta receptor-bearing T lymphocytes in mice infected with live mycobacteria. // Infect Immun.-1991.-Vol.59.-P.4263-5.

99. Guinn KM, Hickey MJ, Mathur SK et al. Individual RD1-region genes are required for export of ESAT-6/CFP-10 and for virulence of Mycobacterium tuberculosis. // Mol Microbiol.-2004.-Vol.51.-P.359-70.

100. Gurunathan S, Klinman DM, Seder RA. DNA vaccines: immunology, application, and optimization. //Annu Rev Immunol.- 2000a.-Vol.8.-P.927-74.

101. Gurunathan S, Prussin C, Sacks DL, Seder RA. Vaccine requirements for sustained cellular immunity to an intracellular parasitic infection. // Nat Med.-1998.-Vol.4.-P. 1409-15.

102. Gurunathan S, Stobie L, Prussin С et al. Requirements for the maintenance of Thl immunity in vivo following DNA vaccination: a potential immunoregulatory role for CD8+ T cells. // J Immunol.-2000.-Vol.l65.-P.915-24.

103. Havlir DV, van der KF, Duffy E, Marshall R, Horn D, Ellner JJ. A 19-year follow-up of tuberculin reactors. Assessment of skin test reactivity and in vitro lymphocyte responses. // Chest.-1991.-Vol.99.-P.l 172-6.

104. Hayashi F, Means TK, Luster AD. Toll-like receptors stimulate human neutrophil function. // Blood.-2003.-Vol.l02.-P.2660-9.

105. Hedley ML, Curley J, Urban R. Microspheres containing plasmid-encoded antigens elicit cytotoxic T-cell responses//Nat Med.-1998.-Vol.4.-P.365-8.

106. Hellyer TJ, Fletcher TW, Bates JH et al. Strand displacement amplification and the PCR for monitoring response to treatment in patients with pulmonary tuberculosis. // J Infect Dis.-1996.-Vol.l73.-P.934-41.

107. Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. //Nature.-2000.-Vol.408.-P.740-5.

108. Hernandez-Pando R, Pavon L, Arriaga K, Orozco H, Madrid-Marina V, Rook G. Pathogenesis of tuberculosis in mice exposed to low and high doses of an environmental mycobacterial saprophyte before infection. // Infect Immun.-1997.-Vol.65.-P.3317-27.

109. Hill PC, Fox A, Jeffries DJ et al. Quantitative T cell assay reflects infectious load of Mycobacterium tuberculosis in an endemic case contact model. // Clin Infect Dis.-2005.-Vol.40.-P.273-8.

110. Hirano T, Akira S, Taga T, Kishimoto T. Biological and clinical aspects of interleukin 6. // Immunol Today.-1990.-Vol.ll.-P.443-9.

111. Hoag H. New vaccines enter fray in fight against tuberculosis. // Nat Med.-2004.-Vol. 10.-P.6.

112. Horwitz MA, Harth G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. // Infect Immun.-2003.-Vol.71.-P. 1672-9.

113. Hsu T, Hingley-Wilson SM, Chen В et al. The primary mechanism of attenuation of BCG is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. // Proc Natl Acad Sci USA.-2003.-Vol.l00.-P.12420-5.

114. Huygen К, Content J, Denis О et al. Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine. // Nat Med.-1996.-Vol.2.-P.893-8.

115. Ibanga HB, Brookes RH, Hill PC et al. Early clinical trials with a new tuberculosis vaccine, MVA85A, in tuberculosis-endemic countries: issues in study design. // Lancet Infect Dis.-2006.-Vol.6.-P.522-8.

116. Iwasaki A, Torres CA, Ohashi PS, Robinson HL, Barber ВН. The dominant role of bone marrow-derived cells in CTL induction following plasmid DNA immunization at different sites. // J ImmunoI.-I997.-VoI.159.-P.11-4.

117. Kamath AT, Feng CG, Macdonald M, Briscoe H, Britton WJ. Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis. // Infect Immun.-1999.-Vol.67.-P.1702-7.

118. Karpenko LI, Lebedev LR, Ignatyev GM et al. Construction of artificial virus-like particles exposing HIV epitopes, and the study of their immunogenic properties. // Vaccine.-2003.-Vol.21.-P.386-92.

119. Kato T, Sakamoto E, Kutsuna H, Kimura-Eto A, Hato F, Kitagawa S. Proteolytic conversion of STAT3alpha to STAT3gamma in human neutrophils: role of granule-derived serine proteases//JBiol Chem.-2004.-Vol.279.-P.31076-80.

120. Kaufmann SH. Is the development of a new tuberculosis vaccine possible? // Nat Med.-2000.-Vol.6.-P.955-60.

121. Kaufmann SH. How can immunology contribute to the control of tuberculosis? // Nat Rev Immunol.-2001.-Vol.l.-P.20-30.

122. Kaufmann SH, Hess J. Immune response against M. tuberculosis: implications for vaccine development. // JBiotechnol.-2000.-Vol.83.-P.13-7.

123. Kent L, McHugh TD, Billington O, Dale JW, Gillespie SH. Demonstration of homology between IS6110 of Mycobacterium tuberculosis and DNAs of other Mycobacterium spp.? // J Clin Microbiol.-1995.-Vol.33.-P.2290-3.

124. Krauzewicz N, Stokrova J, Jenkins C, Elliott M, Higgins CF, Griffin BE. Virus-like gene transfer into cells mediated by polyoma virus pseudocapsids. // Gene Ther.-2000.-Vol.7.-P.2122-31.

125. Kurup VP. Immunology of allergic bronchopulmonary aspergillosis. // Indian J Chest Dis Allied Sci.-2000.-Vol.42.-P.225-37.

126. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature.-1970.-Vol.227.-P.680-5.

127. Lalvani A, Pathan AA, Durkan H et al. Enhanced contact tracing and spatial tracking of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells. //Lancet.-2001.-Vol.357.-P.2017-21.

128. Lawn SD, Frimpong EH, Nyarko E. Evaluation of a commercial immunodiagnostic kit incorporating lipoarabinomannan in the serodiagnosis of pulmonary tuberculosis in Ghana. // Trop Med Int Health.-1997.-Vol.2.-P.978-81.

129. Lebedev LR, Azaev MS, Tumanov Y, Sizov AA, Il'ychev AA, Tat'kov SI. Artificial mycobacterial particles for immunization against tuberculosis. // Dokl Biol Sci.-2002.-Vol.387.-P.488-90.

130. Levitz SM, Diamond RD. Mechanisms of resistance of A. fumigatus Conidia to killing by neutrophils in vitro. // J Infect Dis.-1985.-Vol.l52.-P.33-42.

131. Lewis KN, Liao R, Guinn KM et al. Deletion of RD1 from M. tuberculosis mimics BCG attenuation. // J Infect Dis.-2003.-Vol.l87.-P.117-23.

132. Liang L, Sha WC. The right place at the right time: novel B7 family members regulate effector T cell responses//Curr Opin Immunol.-2002.-Vol. 14.-P.3 84-90.

133. Lindemose S, Nielsen PE, Mollegaard NE. Polyamines preferentially interact with bent adenine tracts in double-stranded DNA. // Nucleic Acids Res.-2005.-Vol.33.-P. 1790-803.

134. Livingston BD, Newman M, Crimi C, McKinney D, Chesnut R, Sette A. Optimization of epitope processing enhances immunogenicity of multiepitope DNA vaccines. // Vaccine.-2001.-Vol.l9.-P.4652-60.

135. Lowrie DB, Silva CL, Colston MJ, Ragno S, Tascon RE. Protection against tuberculosis by a plasmid DNA vaccine. //Vaccine.-1997.-Vol.l5.-P.834-8.

136. Maeda J, Ueki N, Ohkawa T et al. Local production and localization of transforming growth factor-beta in tuberculous pleurisy. // Clin Exp Immunol.-1993.-Vol.92.-P.32-8.

137. Maggi E, Parronchi P, Manetti R et al. Reciprocal regulatory effects of IFN-gamma and IL-4 on the in vitro development of human Thl and Th2 clones. // JImmunol.-1992.-Vol.l48.-P.2142-7.

138. Mahairas GG, Sabo PJ, Hickey MJ, Singh DC, Stover CK. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis. // JBacteriol.-1996.-Vol.l78.-P.1274-82.

139. Maloy KJ, Donachie AM, O'Hagan DT, Mowat AM. Induction of mucosal and systemic immune responses by immunization with ovalbumin entrapped in PLL microparticles. // Immunology.-1994.-Vol.81.-P.661-7.

140. Manca C, Reed MB, Freeman S et al. Differential monocyte activation underlies strain-specific Mycobacterium tuberculosis pathogenesis. // Infect hnmun.-2004.-Vol.72.-P.5511-4.

141. Marei A, Ghaemmaghami A, Renshaw P et al. Superior T cell activation by ESAT-6 as compared with the ESAT-6-CFP-10 complex. // Int Immunol.-2005.-Vol. 17.-P. 1439-46.

142. Mastroeni P. Immunity to systemic Salmonella infections. // Curr Mol Med.-2002.-VoL2.-P,393-406.

143. Medina E, North RJ. Evidence inconsistent with a role for the Beg gene (Nrampl) in resistance of mice to infection with virulent Mycobacterium tuberculosis. // J Exp Med.-l996.-Vol. 183.-P. 1045-51.

144. Meher AK, Bal NC, Chary KV, Arora A. Mycobacterium tuberculosis H37Rv ESAT-6-CFP-10 complex formation confers thermodynamic and biochemical stability. //FEBS J.-2006.-Vol.273.-P.1445-62.

145. Minion FC, Menon SA, Mahairas GG, Wannemuehler MJ. Enhanced murine antigen-specific y-IFN and immunoglobulin G2a responses by usingmycobacterial ESAT-6 sequences in DNA vaccines. // Infect Immun.-2003.-Vol.71.-P.2239-43.

146. Mollenkopf HJ, Dietrich G, Fensterle J et al. Enhanced protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine by adsorption onto cationic PLG microparticles. // Vaccine.-2004.-Vol.22.-P.2690-5.

147. Montgomery DL, Huygen K, Yawman AM et al. Induction of humoral and cellular immune responses by vaccination with M. tuberculosis antigen 85 DNA. // Cell Mol Biol (Noisy -le-grand).-1997.-Vol.43.-P.285-92.

148. Moore A, McGuirk P, Adams S et al. Immunization with a soluble recombinant HTV protein entrapped in biodegradable microparticles induces HIV-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes and CD4+ Thl cells. // Vaccine.-1995.-Vol.l3.-P.1741-9.

149. Mori T, Sakatani M, Yamagishi F et al. Specific detection of tuberculosis infection: an interferon-gamma-based assay using new antigens. // Am J Respir Crit Care Med.-2004.-Vol.l70.-P.59-64.

150. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. // J Immunol Methods.-1983.-Vol.65.-P.55-63.

151. Mostov KE. Transepithelial transport of immunoglobulins. // Annu Rev Immunol.-1994.-Vol. 12.-P.63-84.

152. Mustafa AS. Development of new vaccines and diagnostic reagents against tuberculosis. //Mol Immunol.-2002.Vol.39.P.113-9.

153. Mustafa AS, Shaban FA. ProPred analysis and experimental evaluation of promiscuous T-cell epitopes of three major secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis. //Tuberculosis (Edinb).-2006.-Vol.86.-P.115-24.

154. Nicholson LB, Kuchroo VK. T cell recognition of self and altered self antigens. // Crit Rev Immunol.-1997.-Vol.l7.-P.449-62.

155. O'Hagan D, Singh M, Ugozzoli M et al. Induction of potent immune responses by cationic microparticles with adsorbed human immunodeficiency virus DNA vaccines. // J Virol.-2001.-Vol.75.-P.9037-43.

156. O'Hagan DT, Rahman D, McGee JP et al. Biodegradable microparticles as controlled release antigen delivery systems. // Immunology.-1991.-Vol.73.-P.239-42.

157. O'Hagan DT, Rappuoli R. Novel approaches to pediatric vaccine delivery. // Adv Drug Deliv Rev.-2006.-Vol.5 8.-P.29-51.

158. O'Reilly LM, Daborn С J. The epidemiology of M. bovis infections in animals and man: a review. // Tuber Lung Dis.-1995.-Vol.76, Suppl 1.-P.1-46.

159. Ohara N, Yamada T. Recombinant BCG vaccines. // Vaccine.-2001.-Vol.19.-P.4089-98.

160. Osland A, Kleppe K. Polyamine induced aggregation of DNA. // Nucleic Acids Res.-1977.-Vol.4.-P.685-95.

161. Panyam J, Labhasetwar V.-Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. // Adv Drug Deliv Rev.-2003.-Vol.55.-P.329-47.

162. Park TG, Jeong JH, Kim SW. Current status of polymeric gene delivery systems. // Adv Drug Deliv Rev.-2006.-Vol.58.-P.467-86.

163. Parker LC, Whyte MK, Vogel SN, Dower SK, Sabroe I. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 agonists regulate CCR expression in human monocytic cells. // J Immunol.-2004.-Vol.l72.-P.4977-86.

164. Pedroza-Gonzalez A, Garcia-Romo GS, Aguilar-Leon D et al. In situ analysis of lung antigen-presenting cells during murine pulmonary infection with virulent Mycobacterium tuberculosis. // Int J Exp Pathol.-2004.-Vol.85.-P.135-45.

165. Pelta J, Livolant F, Sikorav JL. DNA aggregation induced by polyamines and cobalthexamine. //J Biol Chem.-1996.-Vol.271.-P.5656-62.

166. Proud D, Sanders SP, Wiehler S. Human rhinovirus infection induces airway epithelial cell production of human beta-defensin 2 both in vitro and in vivo. // J Immunol.-2004.-Vol.l72.-P.4637-45.

167. Pym AS, Brodin P, Majlessi L et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against ТВ// Nat Med.-2003.-Vol.9.-P.533-9.

168. Raju PA, McSloy N, Truong NK, Kendall MA. Assessment of epidermal cell viability by near infrared multi-photon microscopy following ballistic delivery of gold micro-particles. //Vaccine.-2006.-Vol.24.-P.4644-7.

169. Raspaud E, Olvera dlC, Sikorav JL, Livolant F. Precipitation of DNA by polyamines: a polyelectrolyte behavior. // Biophys J.-1998.-Vol.74.-P.381-93.

170. Raviglione MC, Snider DE, Jr., Kochi A. Global epidemiology of ТВ. Morbidity and mortality of a worldwide epidemic//JAMA.-1995.-V.273.-P.220-6.

171. Reed SG, Alderson MR, Dalemans W, Lobet Y, Skeiky YA. Prospects for a better vaccine against tuberculosis. // Tuberculosis (Edinb).-2003.-Vol.83.-P.213-9.

172. Renshaw PS, Lightbody KL, Veverka V et al. Structure and function of the complex formed by the tuberculosis virulence factors CFP-10 and ESAT-6. //EMBO J.-2005.-Vol.24.-P.2491-8.

173. Rook GA, al Attiyah R. Cytokines and the Koch phenomenon. // Tubercle.-1991.-Vol.72.-P. 13-20.

174. Rook GA, Seah G, Ustianowski A. M. tuberculosis: immunology and vaccination. // Eur Respir J.-2001.-Vol.l7.-P.537-57.

175. Saporito-Irwin SM, Geist RT, Gutmann DH. Ammonium acetate protocol for the preparation of plasmid DNA suitable for mammalian cell transfections. // Biotechniques.-1997.-Vol.23.-P.424-7.

176. Sato T, Ishii T, Okahata Y. In vitro gene delivery mediated by chitosan. effect of pH, serum, and molecular mass of chitosan on the transfection efficiency. //Biomaterials.-2001.-Vol.22.-P.2075-80.

177. Sato Y, Roman M, Tighe H et al. Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective i/d gene immunization. // Science.-1996.-Vol.273.-P.352-4.

178. Schaible UE, Kaufmann SH. CD1 molecules and CDl-dependent T cells in bacterial infections: a link from innate to acquired immunity? // Semin Immunol.-2000.-Vol.l2.-P.527-35.

179. Scheerlinck JY. Genetic adjuvants for DNA vaccines. // Vaccine.-2001 .-Vol. 19.-P.2647-56.

180. Schwendeman SP, Costantino HR, Gupta RK et al. Strategies for stabilising tetanus toxoid towards the development of a single-dose tetanus vaccine. // Dev Biol Stand.-1996.-Vol.87.-P.293-306.

181. Seaman MS, Peyerl FW, Jackson SS et al. Subsets of memory cytotoxic T lymphocytes elicited by vaccination influence the efficiency of secondary expansion in vivo. // J Virol.-2004.-Vol.78.-P.206-15.

182. Shams H, Klucar P, Weis SE et al. Characterization of a M. tuberculosis peptide that is recognized by human CD4+ and CD8+ T cells in the context of multiple HLA alleles. // J Immunol.-2004.-Vol.l73.-P.1966-77.

183. Shata MT, Anthony DD, Carlson NL et al. Characterization of the immune response against hepatitis С infection in recovered, and chronically infected chimpanzees. // J Viral Hepat.-2002.-Vol.9.-P.400-10.

184. Sirinavin S, Chotpitayasunondh T, Suwanjutha S, Sunakorn P, Chantarojanasiri T. Protective efficacy of neonatal Bacillus Calmette-Guerin vaccination against tuberculosis. // Pediatr Infect Dis J.-1991.-Vol.l0.-P.359-65.

185. Sizemore DR, Branstrom AA, Sadoff JC. Attenuated bacteria as a DNA delivery vehicle for DNA-mediated immunization. // Vaccine.-1997.-Vol.l5.-P.804-7.

186. Skinner MA, Yuan S, Prestidge R, Chuk D, Watson JD, Tan PL. Immunization with heat-killed M. vaccae stimulates CD8+ cytotoxic T cells specific for macrophages infected with M. tuberculosis. I I Infect Immun.-1997.-Vol.65.-P.4525-30.

187. Skjot RL, Oettinger T, Rosenkrands I et al. Comparative evaluation of low-molecular-mass proteins from M. tuberculosis identifies members of the ESAT-6 family as immunodominant T-cell antigens. // Infect Immun.-2000.-Vol.68.-P.214-20.

188. Smith I. Mycobacterium tuberculosis pathogenesis and molecular determinants of virulence. // Clin Microbiol Rev.-2003.-Vol.l6.-P.463-96.

189. Sodhi A, Gong J, Silva C, Qian D, Barnes PF. Clinical correlates of interferon gamma production in patients with tuberculosis. // Clin Infect Dis.-1997.-Vol.25 .-P. 617-20.

190. Somoskovi A, Hotaling JE, Fitzgerald M et al. False-positive results for M. celatum with the AccuProbe M. tuberculosis complex assay. //J Clin Microbiol.-2000.-Vol.38.-P.2743-5.

191. Steingart KR, Ramsay A, Pai M. Commercial serological tests for the diagnosis of tuberculosis: do they work? // Future Microbiol.-2007.-Vol.2.-P.55-9.

192. Stenger S, Mazzaccaro RJ, Uyemura К et al. Differential effects of cytolytic Tcell subsets on intracellular infection//Science.-1997.-V.276.-P.1684-7.

193. Stewart GR, Robertson BD, Young DB. Tuberculosis: a problem with persistence. // Nat Rev Microbiol.-2003.-Vol.l.-P.97-105.

194. Strieter RM, Belperio JA, Keane MP. Cytokines in innate host defense in the lung. // J Clin Invest.-2002.-Vol.l09.-P.699-705.

195. Sugawara I, Udagawa T, Yamada H. Rat neutrophils prevent the development of tuberculosis. // Infect Immun.-2004.-Vol.72.-P. 1804-6.

196. Tabata Y, Ikada Y. Drug delivery systems for antitumor activation of macrophages. // Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.-1990.-Vol.7.-P.121-48.

197. Tanghe A, D'Souza S, Rosseels V et al. Improved immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding Ag85 by protein boosting. //Infect Immun.-2001.-Vol.69.-P.3041-7.

198. Tascon RE, Colston MJ, Ragno S, Stavropoulos E, Gregory D, Lowrie DB. Vaccination against ТВ by DNA injection.// Nat Med.-1996.-Vol.2.-P.888-92.

199. Tasneem S, Islam N, Ali R. Crossreactivity of SLE autoantibodies with 70 kDa hsp of M. tuberculosis. //Microbiol Immunol.-2001.-Vol.45.-P.841-6.

200. Theilmann L, Meyer U, Kommerell B, Dierkesmann R, Moller A. Alpha tumor necrosis factor in the serum of patients with sarcoidosis, tuberculosis or bronchial cancer. //Pneumologie.-1990.-Vol.44.-P.735-8.

201. Towbin H, Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding— current status and outlook. // J Immunol Methods.-1984.-Vol.72.-P.313-40.

202. Tsuchiya HM, Jeanes A, Bricker HM, Wilham CA. Dextran-degrading enzymes from molds. // JBacteriol.-1952.-Vol.64.-P.513-9.

203. Tsuyuguchi I, Kawasumi H, Ueta C, Yano I, Kishimoto S. Increase of TCR y/8-bearing Tcells in cord blood of newborn babies obtained by in vitro stimulation with mycobacterial cord factor//Infect Immun.-1991.-V.59.-P.3053-9.

204. Tufariello JM, Chan J, Flynn JL. Latent tuberculosis: mechanisms of host and bacillus that contribute to persistent infection. // Lancet Infect Dis.-2003.-Vol.3.-P. 578-90.

205. Ulmer JB. Tuberculosis DNA vaccines. // Scand J Infect Dis.-2001.-Vol.33.-P.246-8.

206. Ulmer JB, Deck RR, DeWitt CM, Donnhly Л, Liu MA. Generation of MHC class I-restricted cytotoxic T lymphocytes by expression of a viral protein in muscle cells: antigen presentation by non-muscle cells. // Immunology.-1996.-Vol.89.-P.59-67.

207. Vassallo R, Thomas CF, Jr., Vuk-Pavlovic Z, Limper AH. Mechanisms of defence in the lung: lessons from Pneumocystis carinii pneumonia. // Sarcoidosis Vase Diffuse Lung Dis.-2000.-Vol.17.-P. 130-9.

208. Verbon A, Juffennans N, Van Deventer SJ, Speelman P, Van Deutekom H, Van Der PT. Serum concentrations of cytokines in patients with active ТВ and after treatment. // Clin Exp Immunol.-1999.-Vol.ll5.-P.110-3.

209. Verbon A, Kuijper S, Jansen HM, Speelman P, Kolk AH. Antigens in culture supernatant of Mycobacterium tuberculosis: epitopes defined by monoclonal and human antibodies. // J Gen Microbiol.-1990.-Vol.l36.-P.955-64.

210. Wang J, Takeuchi T, Tanaka S et al. A mutation in the insulin 2 gene induces diabetes with severe pancreatic beta-cell dysfunction in the Mody mouse. // J Clin Invest.-1999.-Vol.l03.-P.27-37.

211. Weintraub H, Cheng PF, Conrad K. Expression of tiansfected DNA depends on DNA topology. // Cell.-1986.-Vol.46.-P.l 15-22.

212. Wesa AK, Galy A. IL-1 beta induces dendritic cells to produce IL-12. // Int Immunol.-2001 .-Vol. 13.-P. 1053-61.

213. Wise R, Andrews JM, Bedford KA. LY127935, a novel oxa-beta-lactam: an in vitro comparison with other beta-lactam antibiotics. // Antimicrob Agents Chemother.-1979.-Vol,16.-P.341-5.

214. Wolff JA, Ludtke JJ, Acsadi G, Williams P, Jani A. Long-term persistence of plasmid DNA and foreign gene expression in mouse muscle. // Hum Mol Genet.-1992.-Vol. 1 .-P.363-9.

215. Zinkemagel RM. Immunity, immunopathology and vaccines against HIV? // Vaccine.-2002.-Vol.20.-P. 1913-7.