Расположение кодонов мРНК в А-, Р- и Е-участках по данным аффинной модификации рибосом человека аналогами мРНК - производными олигорибонуклеотидов с фотоактивируемой группой на остатке гетероциклического основания тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат биологических наук Демешкина, Наталья Александровна

• Демешкина, Наталья Александровна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Демешкина, Наталья Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Структурно-функциональная организация рибосомы в процессе элонгации (Обзор литературы)

1.1. Структурно-функциональная организация бактериальной рибосомы

1.1.1. Общее строение рибосомы

1.1.2. мРНК-связывающий центр

1.1.3. Расположение молекул тРНК в A-, Р- и E-участках рибосомы

1.1.4. Декодирование мРНК

1.1.4.1. Структурные основы взаимодействия кодон-специфичной тРНК в А-участке

1.1.4.2. Роль фактора элонгации Tu

1.1.5. Образование пептидной связи

1.1.6. Транслокация

1.1.6.1. Модели транслокации

1.1.6.2. Роль фактора G

1.1.7. Механизмы действия некоторых антибиотиков

1.1.8. Сравнение данных по структурной организации активных центров, полученных методом аффинной модификации и РСА

1.1.8.1. мРНК-связывающий центр

1.1.8.2. тРНК-связывающие участки

1.2. Некоторые аспекты структурно-функциональной организации рибосом эукариот

1.2.1. Структурно-функциональная организация рибосом дрожжей

1.2.2. Структурно-функциональная организация рибосом высших эукариот

1.2.3. мРНК-связывающий центр рибосом человека

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Расположение кодонов мРНК в А-, Р- и Е-участках по данным аффинной модификации рибосом человека аналогами мРНК - производными олигорибонуклеотидов с фотоактивируемой группой на остатке гетероциклического основания»

Изучение структурно-функциональной топографии рибосом важно не только для понимания молекулярных механизмов биосинтеза белка, но и для разработки подходов к m регуляции этого процесса. К настоящему времени достигнуты значительные успехи в изучении структурно-функциональной организации рибосом бактерий [1,2], вместе с тем наблюдается отставание в изучении рибосом эукариот. По-видимому, это связано не только с меньшей доступностью рибосом эукариот (и, в частности, человека), но и с тем, что многие из методов, успешно применяемых для изучения бактериальных рибосом, пока что не могут быть использованы для исследования рибосом высших организмов. Прежде всего это касается метода РСА, так как кристаллы эукариотических рибосом пока не получены, и методов, основанных на реконструкции рибосомных субчастиц из белков и рРНК, поскольку до сих пор не найдено подходов к сборке активных субчастиц рибосом эукариот in vitro. В связи с этим, пожалуй, единственным на сегодняшний день методом, с помощью которого может бьггь получена детальная информация о структурной организации рибосом эукариот, является метод аффинной модификации (или, как теперь принято называть, метод аффинного химического сшивания), основанный на использовании реакционноспособных аналогов компонентов аппарата трансляции (мРНК, тРНК и т.п.), который оказался в свое время очень продуктивным при изучении бактериальных рибосом (см. обзоры [3,4]).

Лаборатория Структуры и Функции Рибосом НИБХ СО РАН является единственным в мире научным коллективом, где на протяжении ряда лет проводится систематическое исследование мРНК-связывающего центра рибосом человека с помощью метода аффинной модификации. К моменту начала настоящей работы были выявлены существенные отличия во взаимодействии мРНК с рибосомами про- и эукариот. Так, с помощью синтетических матриц, несущих остатки 4-тиоуридина, было показано, что взаимодействие мРНК с эукариотической рибосомой осуществляется за счет меньшего числа контактов с рРНК малой субчастицы. С помощью коротких аналогов мРНК -производных олигорибонуклеотидов было установлено с какими нуклеотидами 18S рРНК сближены первые нуклеотиды ко донов матрицы в Р- и Е-участках (положения +1 и -3, соответственно) и нуклеотиды, расположенные с 3'-стороны от ко дона в А-участке (положения от +7 до +13) и с 5'-стороны от кодона в Е-участке (положение -6). Было также известно, с каким нуклеотидом 18S рРНК соседствует нуклеотид мРНК, примыкающий с З'-стороны к ко дону в Р-участке. Кроме того, было изучено белковое окружение первых нуклеотидов кодонов матрицы в А-, Р- и Е-участках и нуклеотидов, расположенных с 5'- и З'-сторон от этих участков (см. обзоры [5,6]).

Целью настоящей работы являлось изучение окружения на 80S рибосоме человека первого нуклеотида кодона в A-участке (положение +4 относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке) и каждого из нуклеотидов кодонов матрицы в Р- и Е-участках (положения от +3 до -3) с помощью метода аффинного химического сшивания с использованием коротких аналогов мРНК, производных олигорибонуклеотидов с фотоактивируемой группой на остатке гетероциклического основания, в составе комплексов, имитирующих различные состояния рибосомы в процессе элонгации.

Основными задачами являлись: определение нуклеотидов 18S рРНК и рибосомных белков, сшивающихся с производными гексарибонуклеотида pUUUGUU, несущими перфторфенилазидогруппу на атоме С5 первого, второго или третьего остатка урацила, в рибосомных комплексах, где модифицированный остаток находился в положениях от +3 до -3; определение нуклеотидов 18S рРНК, сшивающихся с производным гексарибонуклеотида pUUUGUU, несущим перфторфенилазидогруппу на атоме N7 остатка гуанина, в рибосомных комплексах, где модифицированный остаток находился в положениях +4 и +1; определение нуклеотидов 18S рРНК, сшивающихся с производным додекарибонуклеотида pUUAGUAUUUAUU, несущим перфторфенилазидогруппу на атоме N7 остатка гуанина, в рибосомном комплексе, где модифицированный остаток находился в положении -3, и изучение влияния наличия и природы тРНК в E-участке на сшивку с 18S рРНК в этом комплексе; сопоставление данных по фотоаффинной модификации рибосом человека производными олигорибонуклеотидов pUUUGUU и pUUAGUAUUUAUU с данными, полученными с помощью РСА, по расположению матрицы на бактериальных рибосомах.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Демешкина, Наталья Александровна

выводы

1. Изучено окружение на 80S рибосоме кодонов мРНК в A-, Р- и E-участках с помощью аффинной модификации рибосом человека аналогами мРНК — фотоактивируемыми производными олигорибонуклеотидов, несущими перфторфенилазидогруппу на остатке гетероциклического основания. а) Определены нуклеотиды 18S рРНК и рибосомные белки, сшивающиеся с производными гексарибонуклеотида pUUUGUU с перфторфенилазидогруппой на атоме С5 первого, второго или третьего остатка урацила в модельных комплексах, где модифицированный остаток находился в положениях от +3 до -3 относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке: показано, что модификации во всех случаях подвергается исключительно 40S субчастица, а в её составе - как 18S рРНК, так и белки; установлено, что модифицированный остаток урацила в положениях от -1 до +3 сшивается с нуклеотидом G1207 18S рРНК, а в положениях -2 и -3 - с G961; обнаружено, что • во всех изученных комплексах производные pUUUGUU модифицируют белки S2 и S3, сшивка с которыми происходит и в отсутствие тРНК; установлено, что модифицированный остаток урацила в положении +1 сшивается с белком S26 и в незначительной степени с белком S23, а в положении -3 - также с белком S26 и в незначительной степени с белком S5/S7. б) Определены нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с производным гексарибонуклеотида pUUUGUU с перфторфенилазидогруппой на атоме N7 остатка гуанина в модельных комплексах, где модифицированный остаток находился в положениях +4 и +1. Показано, что модифицированный остаток в положении +4 сшивается с нуклеотидами Al 823, Al 824 и Al 825 18S рРНК, а в положении +1 - с G1702. в) Определены нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с производным додекарибонуклеотида pUUAGUAUUUAUU с перфторфенилазидогруппой на атоме N7 остатка гуанина в модельных комплексах, где модифицированный остаток находился в положении -3, и в бинарном комплексе (т.е. в отсутствие тРНК). Показано, что модифицированный остаток в положении -3 сшивается с нуклеотидом G1207 18S рРНК независимо от наличия и природы тРНК в E-участке, а в бинарном комплексе — с 3'-концевым участком 1840-1849.

2. Сопоставление результатов по фотоаффинной модификации рибосом человека с данными рентгеноструктурного анализа рибосом бактерий позволило выявить: а) новые универсальные элементы структуры рРНК малой субчастицы, сближенные с ко донами в А- (нуклеотиды Al 823 и Al 824 18S рРНК и соответствующие им нуклеотиды А1492 и А1493 16S рРНК Е. coli) и Е- (нуклеотид G961 18S рРНК и соответствующий ему нуклеотид G693 16S рРНК Е. coli) участках; б) универсальную черту расположения матрицы на рибосоме - резкий изгиб между кодонами в Р- и Е-участках; в) отличие в белковом окружении матрицы на рибосомах млекопитающих и бактерий, а именно, белок S26, не имеющий гомолога среди бактериальных рибосомных белков, соседствует с кодонами в Р- и E-участках 80S рибосомы.

2.3. Заключение.

Таким образом, использование производных олигорибонуклеотидов с перфторфенилазидогруппой на одном из остатков гетероциклических оснований позволило получить детальную информацию об окружении каждого из нуклеотидов кодонов мРНК в Р- и E-участках, а также данные о нуклеотидных остатках 18S рРНК, сближенных с первым нуклеотидом кодона вА-участке. Результаты настоящей работы подтвердили сделанный ранее вывод о том, что кодоны матрицы в A-, Р- и Е-участках соседствуют с нуклеотидами, занимающими одинаковое положение во вторичной структуре рРНК малых субчастиц рибосом бактерий и млекопитающих. Кроме того, с использованием данных производных найдены новые структурные элементы в 3'-концевом (нуклеотиды А1823, А1824 и А1825) и центральном (нуклеотид G961) доменах 18S рРНК, сближенные с кодонами матрицы в А- и E-участках, соответственно, а также выявлено сходство в расположении матрицы на рибосомах бактерий и млекопитающих, а именно, наличие резкого изгиба между кодонами в Р- и E-участках. Наряду со сходством обнаружены отличия в расположении матрицы на рибосомах прокариот и высших эукариот. Одно из отличий вызвано появлением дополнительного (по сравнению с 16S рРНК) нуклеотида Al 825 18S рРНК, сближенного с ко доном мРНК в A-участке рибосом человека. Другое отличие касается белкового окружения матрицы в A-, Р- и Е-участках. Белок S26, не имеющий гомолога среди бактериальных рибосомных белков, сближен с кодонами матрицы в Р- и Е-участках 80S рибосомы; а белок S23 соседствует с 5'-стороной ко дона в Р-участке, в отличие от гомологичного ему белка S12, вблизи которого располагается кодон в A-участке 70S рибосомы.

На основании полученных результатов, а также принимая во внимание предыдущие данные [147, 150-153,159], предложена схема расположения матрицы в A-, Р- и Е-участках 80S рибосом человека (рис. 24). Согласно этой схеме, между кодонами в А- и Р-участках матрица делает изгиб, в результате чего эти кодоны оказываются сближенными с нуклеотидом G1702 18S рРНК и белком S15, в то время как нуклеотиды Al 823, Al 824 и Al 825 соседствуют только с кодоном в A-участке, а первый нуклеотид ко дона в Р-участке - с С1057. Другой более резкий изгиб делает матрица между кодонами в Р- и Е-участках, благодаря которому нуклеотид Gl207 18S рРНК и белок S26 располагаются вблизи этих ко донов, при этом остаток G961 соседствует только с первым и вторым нуклеотидами кодона в Е-участке.

40S субчастица

Рис. 24. Схема расположения матрицы в A-, Р- и Е-участках 80S рибосом человека.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы

В работе использовали дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты и АТР фирмы «Sigma» (США); акриламид, дезоксихолат натрия, DMSO, DTT, HEPES, LÍCIO4, N-N'-метиленбисакриламид, пуромицин, PIPES, спермин, SDS, Трис, циклогексимид и краситель «Stains all» фирмы «Fluka» (Швейцария); 2-меркаптоэтанол и сорбент Nucleosil 5С18 фирмы «Macherey-Nagel» (Германия); кумасси бриллиантовый голубой - «Ferak» (Германия); TEMED, спермидин и поли(и) - «Reanal» (Венгрия); ферменты: AMV-ревертазу фирмы «Life Science» (США), РНКазу А и протеиназу К фирмы «Sigma» (США), РНКазу U2, РНКазу Т1 и щелочную фосфатазу фирмы «Boehringer Mannheim» (Германия), РНКазу Н фирмы «Biopol» (Россия), Т4 полинуклеотидкиназу фирмы «Сибэнзим» (Россия), Т4 РНК-лигазу фирмы «Promega» (США). тРНКУа1 (1800 пмоль/ ОЕ26о), тРНКРНе (1300 пмоль/ОЕ26о), [14С]РЬе-тРНКРЬе (800 dpm/пмоль, 1300 пмоль/ОЕгбо), Уа1-тРНКУа1 (1800 пмоль/ОЕгбо) Е. coli любезно предоставлены Т.Г. Шапкиной (Санкт-Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова, г. Гатчина) и tPHKAsp (1300 пмоль/ ОЕгбо), любезно предоставленную H.A. Моор (Лаборатория биоорганической химии ферментов, НИБХ СО РАН); олигорибонуклеотиды UUUGUU, UUUGUU3 0Me, UUAGUAUUUAUU и производные олигорибонуклеотида UUUGUU с перфторфенилазидогруппой на атоме С5 первого, второго или третьего остатка урацила синтезированы и охарактеризованы в Группе химии олигорибонуклеотидов (Лаборатория химии нуклеиновых кислот, НИБХ СО РАН); [у-32Р]АТР (1000 Ки/ммоль) и [5'-32Р]рСр (450 Ки/ммоль) синтезированы Д.В. Семёновым (Лаборатория радиохимии, НИБХ СО РАН); олигодезоксирибонуклеотиды, комплементарные нуклеотидным последовательностям 821-840, 950-969,1081-1100, 11811200, 1197-1216, 1821-1840, 1835-1849, 1830-1849 и 1851-1869 18S рРНК человека, синтезированы в НИБХ СО РАН, а олигомеры, комплементарные последовательностям 655-674, 1222-1241, 1396-1417, 1621-1640 и 1812-1831, любезно предоставлены П. Воллензиеном (Университет штата Северная Каролина, г. Роли, США). CIRCH2NH2 и N

100 гидроксисукцинимидный эфир л-азидотетрафторбензойной кислоты синтезированы Т.М. Ивановой (Лаборатория исследования модификации биополимеров, НИБХ СО РАН).

Прочие неназванные реактивы были марки «хч», «чда» или «осч». Для приготовления всех растворов использовали бидистиллированную воду (прибор для очистки воды VHQ-PS фирмы «SITA», Великобритания). Для фильтрования растворов и анализа связывания меченых лигандов с 80S рибосомами использовали нитроцеллюлозную мембрану фирмы «Millipore» (США) с диаметром пор 0,45 мкм.

Оптическую плотность регистрировали с помощью микроспектрофотометра «Милихром» (НПО «Научприбор», г. Орёл). Фотоаффинную модификацию 80S рибосом проводили, используя УФ-лампу фирмы «SpotCure» (Великобритания). Препараты сушили на вакуумном испарителе «UNIYAPO 100Н» (Германия). Измерение pH проводили на рН-метре ОР-264/1 «Radelkis» (Венгрия). Радиоактивность просчитывали на счётчиках «Rackbeta» и «Minibeta» фирмы «LKB-Pharmacia» (Швеция). Пробы, меченные 14С, просчитывали в 5 мл толуольного сцинтиллятора (5 л толуола, 20 г РРО, 1 г РОРОР), меченные 32Р, — в 1 мл воды по Черенкову. Гели радиоавтографировали с использованием рентгеновской плёнки фирмы «Cónica» (США). В работе использовали ультрацентрифугу «Beckman L8M», а также центрифуги «Beckman J2-21M», «Eppendorf 5403» и «Eppendorf 5415С» (Германия).

3.2. Выделение рибосомных 40S и 60S субчастиц из плаценты человека.

Рибосомные 40S и 60S субчастицы с интактной рРНК выделяли из нормальной послеродовой плаценты. Промежуток времени между родами и гомогенизацией ткани не превышал 30 мин. Плаценту немедленно погружали в 500 мл буфера I (20 мМ Трис-НС1, pH 7.5, 125 мМ KCl, 10 мМ MgCb, 0.5 мМ EDTA, 4 мМ 2-меркаптоэтанол), который предварительно охлаждали до 4°С. Не позже, чем через 20 мин после родов, плаценту резали на кусочки по 25-30 г, освобождаясь при этом от мембран и соединительной ткани, отмывали от крови в буфере I и суспендировали при 4°С в равном по весу количестве буфера I, содержащего 250 мМ сахарозу, 1 г/л гепарина и 0.05 г/л циклогексимида. Полученный гомогенат центрифугировали на центрифуге «Beckman J2-21M» (ротор JA-14) при 4°С и 13000 об/мин в течение 30 мин. К постмитохондриальному супернатанту

101 добавляли дезоксихолат натрия до концентрации 1% и перемешивали в течение 30 мин при 4°С. Постмитохондриальный супернатант, обработанный дезоксихолатом, наносили на сахарозную подушку (35%-ный раствор сахарозы в буфере 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, содержащем 100 мМ NH4CI, 3 мМ MgCh, 0.15 мМ EDTA, 5 мМ 2-меркаптоэтанол) и центрифугировали при 4°С 20 ч (центрифуга «Beckman L8M», ротор SW-28, 26000 об/мин). По окончании центрифугирования супернатант осторожно сливали. Осадок полисом растворяли при 4°С в 10 мл буфера 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, содержащего 100 мМ NH4CI, 3 мМ MgCh, 0.125 мМ EDTA и 10 мМ 2-меркаптоэтанол; нерастворившийся материал удаляли центрифугированием (центрифуга «Beckman J2-21M», ротор JA-20, 17000 об/мин, 15 мин, 4°С). Раствор полисом обрабатывали 0.5 мМ пуромицином 10 мин при 0°С, затем к раствору добавляли по каплям при постоянном помешивании 3 М КС1 до концентрации 0.5 М и инкубировали 20 мин при 37°С, после чего раствор наносили на линейный градиент плотности сахарозы (10 - 30%) в буфере 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, содержащем 500 мМ КС1, 3 мМ MgCh, 0.125 мМ EDTA и 10 мМ 2-меркаптоэтанол, и центрифугировали 18 ч при 4°С (ультрацентрифуга «Beckman L8M», ротор SW-28, 20000 об/мин). Фракции, соответствующие 40S и 60S субчастицам, осаждали центрифугированием (центрифуга «Beckman L8M», ротор SW-28, 24000 об/мин, 22 ч, 4°С), предварительно повысив концентрацию Mg2+ до 20 мМ и снизив концентрацию КС1 до 120 мМ. Осадки растворяли в воде до концентрации 80-120 ОЕгбо/мл и хранили в жидком азоте порциями по 25 мкл. Перед использованием к 40S и 60S субчастицам добавляли '/4 объема пятикратного буфера А (однократный буфер А: 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 120 мМ КС1, 13 мМ MgCl2, 0.65 мМ EDTA) или буфера Б (однократный буфер Б: 20 мМ HEPES-NaOH, рН 7.5, 100 мМ NH4CI, 4 мМ MgCl2, 0.15 мМ EDTA, 0.6 мМ спермидин, 0.8 мМ спермин) до концентрации субчастиц 15-20 ОЕгбо/мл, реактивировали в течение 10 мин при 37°С, осветляли центрифугированием в течение 1 мин при комнатной температуре при 14000 об/мин и замеряли оптическую плотность, полагая, что 1 ОЕгбо соответствует 50 пмоль 40S или 25 пмоль 60S субчастиц по данным [171]. Для получения 80S рибосом субчастицы смешивали в мольном соотношении 40S:60S = 1:1.3, при этом, как показал анализ 80S рибосом в линейном градиенте плотности сахарозы (10

30%) в буфере А (центрифуга «Beckman L8M», ротор SW-40, 24000 об/мин, 19 ч, 4°С), практически все 40S субчастицы ассоциируют с 60S субчастицами. Конечная концентрация реактивированного препарата 80S рибосом составляла примерно 10"6 М. Активность 80S рибосом в поли(Ц)-зависимом связывании [14C]Phe-TPHKPhe измеряли по методике, описанной в работе [172], она составляла примерно 70% (т.е. около 1.4 моль [14C]Phe-TPHKPhe связывалось с 1 моль 80S рибосом).

3.3. Синтез фотоактивируемых производных олигорибонуклеотидов, несущих перфторфенилазидогруппу на атоме N7 остатка гуанина.

Присоединение перфторфенилазидогруппы по атому N7 остатка гуанина олигорибонуклеотидов UUUGUU (UUUGUU3>oMe) и UUAGUAUUUAUU проводили в две стадии. Вначале олигорибонуклеотиды алкилировали, инкубируя 0.5 ОЕ2бо UUUGUU (UUUGUU3 oMe) с 400 нмоль C1RCH2NH2 в 160 мкл 8 мМ Трис-HCl, рН 7.5, в течение 5 ч при 37°С или 0.66 ОЕгео UUAGUAUUUAUU с 24 нмоль C1RCH2NH2 в 120 мкл 8 мМ Трис-HCl, рН 7.5, в течение 2 ч при 47°С. Продукты алкилирования выделяли с помощью офВЭЖХ на микроколонке объёмом 200 мкл со смолой Nucleosil 5С18 (элюция ступенчатым градиентом концентрации 10, 20, 30, 40 и 90%-ного метанола в 50 мМ ТЭА-ацетате, рН 7.5, 24 мин, скорость элюции 100 мкл/мин). Элюция алкилированных олигорибонуклеотидов происходила при несколько более высокой концентрации метанола (54%-ной в случае UUUGUU и 60%-ной в случае UUAGUAUUUAUU), чем элюция исходных олигорибонуклеотидов. Степень модификации олигорибонуклеотидов составляла 90%. Фракцию, содержащую алкилированный олигорибонуклеотид, упаривали досуха в вакууме, растворяли в 5 мкл Н20, затем к этому раствору добавляли 10 мкл DMSO и обрабатывали N-гидроксисукцинимидным эфиром «-азидотетрафторбензойной кислоты (NSu-Az), как описано в [152]. Для этого отдельно растворяли 1.8 мг NSu-Az в 20 мкл DMSO и полученный раствор порциями добавляли к раствору алкилированного олигорибонуклеотида при комнатной температуре через каждые полчаса (сначала 10 мкл, затем два раза по 5 мкл). После окончания реакции к смеси в качестве носителя добавляли 1 мкл 0.1 М АТР и нуклеотидный материал осаждали 10 объёмами 2%-ного LiClQ» в ацетоне. Осадок отделяли центрифугированием при 14000 об/мин в течение 3-5 мин при комнатной температуре, высушивали в течение 10-15 мин и растворяли в 40 мкл НгО. Затем проводили повторное переосаждение, как указано выше. Осадок сушили на воздухе в течение 15-20 мин, растворяли в 20 мкл Н2О. Фотоактивируемые производные олигорибонуклеотидов выделяли с помощью офВЭЖХ, как описано выше. Элюция фотоактивируемых производных происходила при несколько большей концентрации метанола (72%-ной в случае ииШШ и 76%-ной в случае ШАСиАЦЦиАШ), чем элюция алкилированных олигорибонуклеотидов, из-за наличия гидрофобной перфторфенилазидогруппы. Выход продуктов, содержащих перфторфенилазидогруппу, по отношению к алкилированным олигорибонуклеотидам составлял около 90%. При расчете молярной экстинкции фотоактивируемых производных олигорибонуклеотидов полагали, что молярная экстинкция перфторфенилазидной части реагента равна 8.6» 103 моль"1 см"1 [173].

3.4. Введение радиоактивной метки на 5'-конец.

Введение метки 32Р на 5'-конец олигорибонуклеотидов и их производных, тРНК и ОДЫ проводили с помощью [у-32Р]АТР и Т4 полинуклеотидкиназы. Для этого реакционную смесь объемом 20 мкл, содержащую 100 мМ Трис-НС1, рН 7.5, 60 мМ МдСЬ, 1 мМ ЕБТА, 0.5-1.5 нмоль олигорибонуклеотида (0.2 нмоль ОДЫ или 0.4 нмоль тРНК), 10-20 МБк [у-32Р]АТР и 15 ед. акт. Т4 полинуклеотидкиназы, инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Затем в случае олигорибонуклеотидов и их производных к смеси добавляли примерно 1 мкмоль нерадиоактивного АТР и дополнительно инкубировали 15 мин при 37°С. Во всех случаях нуклеотидный материал осаждали 10 объёмами 2%-ного ПСЮ4 в ацетоне и выделяли офВЭЖХ, как описано в разделе 3.3. Удельная активность меченых олигорибонуклеотидов и их производных была (50-100)* 103 имп/мин на пмоль, тРНК - (30-50)-103 имп/мин на пмоль, а ОДН - (5-10)*105 имп/мин на пмоль по Черенкову.

3.5. Гидролиз РНКазой Т1.

Примерно 100 пмоль меченного 32Р исходного или алкилированного ф олигорибонуклеотида (рЦиивии или рЦиАСиАЦЦилии) (см. раздел 3.4) инкубировали в 15 мкл 20 мМ цитрата натрия, рН 5.0, содержащего 250 мкг/мл суммарной тРНК Е. соН, в течение 15 мин при 55°С. Затем к смеси добавляли 0.5 ед. акт. РНКазы Т1 и дополнительно инкубировали 15 мин при 55°С. Продукты гидролиза осаждали 10 объемами 2%-ного ЫСЮ4 в ацетоне (см. раздел 3.3), осадок растворяли в 4 мкл деионизованного формамида, содержащего 0.01%-ный бромфеноловый синий и 0.01%-ный ксиленцианол. Полученный раствор инкубировали в течение 1 мин при 90°С, охлаждали во льду до 0°С и анализировали с помощью электрофореза в 20%-ном ПААГ, содержащем 0.4%-ный бис-акриламид и 8 М мочевину в буфере ТБЕ (89 мМ Трис-борат, рН 8.3, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЕОТА). По окончании электрофореза гель высушивали в вакууме и радиоавтографировали на рентгеновскую пленку.

3.6. Дефосфорилирование тРНК. тРНКУа| или тРНКА;ф (0.4 - 0.6 нмоль) инкубировали в 10 мкл буфера 10 мМ Трис

НС1, рН 7.5, содержащего 0.5 ед. акт. щелочной фосфатазы, при 37°С в течение 30 мин. Затем к реакционной смеси добавляли 40 мкл НгО и выделяли тРНК двухкратной экстракцией равным объёмом водонасьпценного фенола. Следы фенола экстрагировали из водного раствора тРНК трехкратным объёмом серного эфира. Затем к водной фазе добавляли 0.1 объёма 3 М ЫаАс, рН 5.2, 3 объёма охлажденного этанола, после чего пробы выдерживали в течение 3-5 ч при -20°С. Осадок тРНК отделяли центрифугированием (12500 об/мин, 5 мин, 2°С), промывали 200 мкл 70%-ного охлажденного этанола, высушивали на воздухе (20 - 30 мин), растворяли в краске и анализировали с помощью электрофореза в 10%-ном ПААГ в денатурирующих условиях (см. раздел 3.5). Гель окрашивали в растворе бромистого этидия (10"6 г/мл); полосы геля, содержащие тРНК, вырезали. Дефосфорилированную тРНК элюировали из геля 300 мкл буфера 300 мМ КаАс, рН 5.2, содержащего 1 мМ ЕОТА и 0.5%-ный БЭЭ, в течение 4-8 ч при 4°С. После элюции тРНК из раствора осаждали этанолом, как описано выше, осадок тРНК растворяли в 10 мкл НгО и вводили Р на 5'-конец тРНК (см. раздел 3.4). Меченую тРНК выделяли с помощью электрофореза в 8%-иом ПААГ в денатурирующих условиях, как описано в разделе 3.5. Полосы, содержащие меченую тРНК, вырезали; тРНК элюировали из геля и осаждали, как описано выше, после чего осадок тРНК растворяли в НгО до конечной концентрации 15 пмоль/мкл. Выход меченой тРНК составил 70-75% (около 300 пмоль) от исходного количества тРНК, взятого в реакцию дефосфорилирования.

3.7. Получение комплексов 80S рибосом с аналогами мРНК в присутствии тРНК.

Рибосомы реактивировали в буфере А (20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 120 мМ КС1, 13 мМ MgCl2) 0.65 мМ EDTA) или Б (20 мМ HEPES-NaOH, рН 7.5, 100 мМ NH4CI, 4 мМ MgCl2, 0.15 мМ EDTA, 0.6 мМ спермидин, 0.8 мМ спермин) при 37°С в течение 10 мин, после чего осветляли центрифугированием при 14000 об/мин в течение 1 мин при комнатной температуре. Препараты тРНК перед использованием переводили в буфер А или Б, реактивировали при 37°С в течение 5 мин и помещали в лед. Связывание 80S рибосом с меченными Р аналогами мРНК в присутствии тРНК проводили, инкубируя смесь соответствующих компонентов в буфере А или Б при 22°С в течение 50 мин.

Для получения комплексов 1 и 6 80S рибосомы инкубировали с соответствующим аналогом мРНК и РЬе-тРНКРЬе (или тРНКРЬе) (табл. 7). Комплексы 3 и 4 получали аналогично, инкубируя 80S рибосомы с соответствующим аналогом мРНК и Val-TPHKVal (или тРНКУЫ) (табл. 7). Комплексы 2 и 5 получали инкубированием комплексов 1 и 4 с Val-TPHKVal и РЬе-тРНК , соответственно, а комплексы 7 и 8 - инкубированием комплекса 6 с тРНКУа1 и тРНК^15, соответственно (табл. 7). Бинарные комплексы получали, инкубируя 80S рибосом с соответствующим аналогом мРНК.

Степень связывания меченных Р аналогов мРНК с 80S рибосомами в составе комплексов, образованных в присутствии тРНК, и в бинарных комплексах, и меченных 32Р тРНКУа1 и TpHKAsp с комплексом 6 (табл. 7), образованным в присутствии немеченого аналога V, анализировали с помощью фильтрования комплексов через нитроцеллюлозные фильтры. Для этого нитроцеллюлозные фильтры предварительно обрабатывали 0.6 М NaOH при 28°С в течение 20 мин, затем фильтры промывали не менее 7 раз бидистиллированной водой и вымачивали в буфере А или Б в течение 30 мин. По окончании инкубации комплексы фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры, промывали два раза соответствующим буфером (А или Б) порциями по 1 мл и связанную на фильтрах радиоактивность просчитывали во флаконах в воде по Черенкову.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Демешкина, Наталья Александровна, 2003 год

1. Carter А.Р., Clemons W.M., Brodersen D.E., Morgan-Warren R.J., Wimberly B.T., Ramakrishnan V. Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interaction with antibiotics // Nature. 2000. V. 407. P. 340-348.

2. Yusupov M.M., Yusupova G.Zh, BaucomA., Lieberman K., Earnest T.N., Cate J.H.D., Noller H. Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution // Science. 2001. V. 292. P. 883-896.

3. Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г. Структурно-функциональная топография рибосом Е. coli по данным аффинной модификации реакционноспособными аналогами мРНК и тРНК // Успехи биологической химии. 1991. Т. 32. С. 3-49.

4. Сергиев П.В., Лаврик И.Н., Докудовская С.С., Донцова О.А., Богданов А.А. Строение декодирующего центра рибосомы // Биохимия. 1998. Т. 63. С. 1129-1143.

5. Грайфер Д.М., Карпова Г.Г., Кнорре ДГ. Расположение матрицы на рибосоме человека по данным аффинной модификации реакционноспособными аналогами мРНК // Биохимия. 2001. Т. 66. С. 725-744.

6. Грайфер ДМ., Карпова Г.Г. Структурно-функциональная топография рибосом человека по данным сшивок с аналогами мРНК — производными олигорибонуклеотидов // Молекуляр. биология. 2001. Т. 35. С. 584-596.

7. Stoffler G., Stoffler-Meilicke М. Immuno electron microscopy on E. coli ribosomes // Structure, function and genetics of ribosomes / Eds B. Hardesty, G. Kramer. New York: Springer-Verlag, 1986. P. 28-46.

8. Frank J., Zhu J., Penczek P., Li Y., Srivastava S., Verschoor A., Radermacher M., Grassucci R., Lata K.R., Agrawal R.K. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome //Nature. 1995. V. 376. P. 441-444.

9. Frank J. The ribosome — structure and functional ligand-binding experiments using cryo-electron microscopy // J. Struct. Biol. 1998. V. 124. P. 142-150.

10. Frank J. Ribosomal dynamics explored by cryo-electron microscopy // Methods. 2001. V. 25. P. 309-315.

11. Gabashvili I.S., Agrawal R.K., Spahn C.M.T., Grassucci R.A., Svergun D.I., Frank J., Penczek P. Solution structure of the E. coli 70S ribosome at 11.5 Ä resolution // Cell. 2000. V. 100. P. 537-549.

12. Clemons W.M., Jr., MayJ.L.C., Wimberly B. T., McCutcheon J.P., Capel M.S., Ramakrishnan R. Structure of bacterial 30S ribosomal subunit at 5.5 A resolution // Nature. 1999. V. 400. P. 833-840.

13. Wimberly B.T., Brodersen D.E., Clemons W.M., Jr., Morgan-Warren R.J., Carter A.P., Vonrhein C., Hartsch T., Ramakrishnan V. Structure of the 30S ribosomal subunit // Nature. 2000. V. 407. P. 327-339.

14. Schlüenzen F., Tocilj A., Zarivach R., Harms J., Gluehmann M„ Janell £>., Bashan A., Agmond I., Franceschi F., Yonath A. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 angstroms resolution // Cell. 2000. V. 102. P. 615-623.

15. Ban N., Nissen P., Hansen J., Moore P.B., Steitz T.A. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution // Science. 2000. V. 289. P. 905-920.

16. Harms J., Schlüenzen F., Zarivach R., Bashan A., Gat S„ Agmon I., Bartels H., Franceschi F., Yonath A. High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium // Cell. 2001. V. 107. P. 679-688.

17. CateJ.H., Yusupov M.M., Yusupova G.Zh, Earnest T.N., Noller H.F. X-ray crystal structures of 70S ribosome functional complexes // Science. 1999. V. 285. P. 2095-2104.

18. Yusupova G.Zh., Yusupov M.M., Cate J.H.D., Noller H.F. The path of messenger RNA through the ribosome // Cell. 2001. V. 106. P. 233-241.

19. Nissen P., Ippolito J.A., Ban N., Moore P.B., Steitz T.A. RNA tertiary interactions in the large ribosomal subunit: The A-minor motif// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2001. V. 98. P. 4899-4903.

20. Ramakrishnan V. Ribosome structure and the mechanism of translation // Cell. 2002. V. 108. P. 557-572.

21. Guteil R.R. Collection of small subunit (16S- and 16S-like) ribosomal RNA structures // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 3051-3054.

22. Steitz T.A. Polypeptide chain initiation: nucleotide sequences of the three ribosomal binding sites in bacteriophage R17 RNA //Nature. 1969. V. 224. P. 957-964.

23. Hüttenhofer A., Noller H.F. Footprinting mRNA-ribosome complexes with chemical probes // EMBO J. 1994. V. 13. P. 3892-3901.

24. Beyer D., Shripkin E., Wadzack J., Nierhaus K.H. How the ribosome moves along the mRNA during protein synthesis // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 30713- 30717.

25. Shatsky I.N., Bakin A. V., Bogdanov A.A., Vasiliev V.D. How does the mRNA pass through the ribosome // Biochimie. 1991. V. 73. P. 937-945.

26. Stark H., Orlova E. V., Rinke-Appel J., Jünke N., Mueller F., Rodnina M., Wintermeyer W„ Brimacombe R., van Heel M. Arrangment of tRNAs in pre- and posttranslocational ribosomes revealed by electron cryomicroscopy // Cell. 1997. V. 88. P. 19-28.

27. Agrawal R.K., Spahn C.M.T., Penczek P., Grassucci R.A., Nierhaus K.H., Frank J. Visualization of tRNA movements on the Escherichia coli 70S ribosome during the elongation cycle // J. Cell Biol. 2000. V. 150. P. 447-459.

28. Olge J.M., Brodersen D.E., Clemons ¡V.M., Tarry M.J., Carter A.P., Ramakrishnan V. Recognition by cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit // Science. 2001. V. 292. P. 897-902.

29. Jovine L., Djordjevic S., Rhodes D. The crystal structure of yeast phenylalanine tRNA at 2.0 Ä resolution: cleavage by Mg2+ in 15-year old crystals // J. Mol. Biol. 2000. V. 301. P. 401-414.

30. Dabrowski M., Spahn C.M.T., Schäfer A., Patzke S., Nierhaus K.H. Protection patterns of tRNAs do not change during ribosomal translocation // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 3279332800.

31. Noller F.H., Yusupov M.M., Yusupova G.Z., BaucomA., Cate J.H.D. Translocation of tRNA during protein synthesis // FEBS Lett. 2002. V. 514. P. 11-16.

32. Pape T., Wintermeyer W., Rodnina M. V. Induced fit in initial selection and proofreading of aminoacyl-tRNA on the ribosome // EMBO J. 1999. V. 18. P. 3800-3807.

33. Pape 71, Wintermeyer W., Rodnina M.V. Conformational switch in the decoding region of 16S rRNA during aminoacyl-tRNA selection on the ribosome // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P.m 104-107.

34. Rodnina M.V., Wintermeyer W. Fidelity of aminoacyl-tRNA selection on the ribosome: kinetic and structural mechanisms // Annu. Rev. Biochem. 2001. V. 70. P. 415-435.

35. Olge J.M., Murphy IVF. V., Tarry M.J., Ramakrishnan V. Selection of tRNA by the ribosome requires a transition from an open to a closed form // Cell. 2002. V. 111. P. 721-732.

36. Olge J.M., Carter A.P., Ramakrishnan V. Insights into the decoding mechanism from recent ribosome structure // Trends Biochem. Sci. 2003. V. 28. P. 259-266.

37. Moazed D., Noiler H. Transfer RNA shields specific nucleotides in 16S ribosomal RNAfrom attack by chemical probes // Cell. 1986. V. 47. P. 985-994.

38. Moazed D., Noller H. Binding of the tRNA to the ribosomal A and P sites protects two distinct sets of nucleotides in 16S rRNA // J. Mol. Biol. 1990. V. 211. P. 135-145.

39. Yoshizawa S., Fourmy D., Puglisi J.D. Recognition of the codon-anticodon helix by ribosomal RNA // Science. 1999. V. 285. P. 1722-1725.

40. VanLoock M.S., Easterwood T.R., Harvey S.C. Major groove binding of the tRNA/mRNA• complex to the 16S ribosomal RNA decoding site // J. Mol. Biol. 1999. V. 285. P. 2069-2078.

41. Puglisi J.D., Blanchard S.C., Green R. Approaching translation at atomic resolution // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P. 855-861.

42. Fourmy D„ Recht M.I., Blanchard S.C., Puglisi J.D. Structure of the A site Escherichia coli 16S ribosomal RNA complexed with aminoglycoside antibiotic // Science. 1996. V. 274. P. 1367-1371.

43. Gavrilova L.P., Kostiashkina O.E., Koteliansky V.E., Rutkevich N.M., SpirinA.S. Factor-free ("non-enzymic") and factor-dependent systems of translation of polyuridylic acid by Escherichiacoli ribosomes // J. Mol. Biol. 1976. V. 101. P. 537-552.

44. SpirinAS. Ribosome as a molecular machine // FEBS Lett. 2002. V. 514. P. 2-10.

45. Stark H., Rodnina M. V., Rinke-Appel J., Brimacombe R, Wintermeyer W., van Heel M. Visualization of elongation factor Tu on the Escherichia coli ribosome // Nature. 1997. V. 389. P. 403-406.

46. Moazed D., Robertson J.M., Noller H.F. Interaction of elongation factors EF-Tu and EF-G with a conserved loop in 23S RNA // Nature. 1988. V. 334. P. 362-364.

47. Agrawal R.K., Penczek P., Grassucci R.A., Li Y„ Leith A., Nierhaus K.H., Frank J. Direct visualization of A-, P-, and E-site transfer RNAs in the Escherichia coli ribosome // Science. 1996. V. 271. P. 1000-1002.

48. Piepenburg O., Pape T., Pleiss J.A., Wintermeyer W„ Uhlenbeck O.C., Rodnina M. V. Intact aminoacyl-tRNA is required to trigger GTP hydrolysis by elongation factor Tu on the ribosome // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 1734-1738.

49. Valle M., Sengupta J., Swami N.K., Grassucci R.A., Burkhardt N., Nierhaus K.H., Agrawal R.K., Frank J. Cryo-EM reveals an active role for aminoacyl-tRNA in the accommodation process//EMBO J. 2002. V. 21. P. 3557-3567.

50. Yarus M., Valle M., Frank J. A twisted tRNA intermediate sets the threshold for decoding // RNA. 2003. V. 9. P. 984-985.

51. Lodmell J.S., Dahlberg A.E. A conformational switch in Escherichia coli 16S ribosomal RNA during decoding of messenger RNA // Science. 1997. V. 277. P. 1262-1267.

52. Pape T., Wintermeyer W., Rodnina M. V. Complete kinetic mechanism of elongation factor Tu-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A-site of the E. coli ribosome // EMBO J. 1998. V. 17. P. 7490-7497.

53. Noller H.F., Hoffarth V., Zimniak L. Unusual resistance of peptidyl transferase to proteinmextraction procedures // Science. 1992. V. 256. P. 1416-1419.

54. Green R., Noller H.F. Ribosomes and translation // Annu. Rev. Biochem. 1997. V. 66. P. 679-716.

55. Nissen P., Hansen J., Ban N., Moore P.B., Steitz T.A. The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis // Science. 2000. V. 289. P. 920-930.

56. Hansen J.L., Schmeing T.M., Moore P.B., Steitz T.A. Structural insights into peptide bond formation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 11670-11675.

57. Jenni S., Ban N. The chemistry of protein synthesis and voyage through the ribosomal tunnel // Curr. Opin. Struct. Biol. 2003. V. 13. P. 212-219.

58. Green R., Switzer C., Noller H.F. Ribosome-catalyzed peptide-bond formation with an A-site substrate covalently linked to 23S ribosomal RNA // Science. 1998. V. 280. P. 286-289.

59. BayfieldM.A., DahlbergA.ESchulmeister U., Dorner S., Barta A. A conformational change in the ribosomal peptidyl transferase center upon active/inactive transition // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 10096-100101.

60. PolacekN., GaynorM., YassinA., MankinA.S. Ribosomal peptidyltransferase can withstand mutations at the putative catalytic nucleotide // Nature. 2001. V. 411. P. 498-501.

61. Moazed D., Noller H.F. Interaction of tRNA with 23S rRNA in the ribosomal A, P, and E sites // Cell. 1989. V. 57. P. 585-597.

62. Moazed D., Noller H. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome // Nature. 1989. V. 342. P. 142-148.

63. Semen/cov Y.P., Shapkina T.G., Kirillov S. Puromycin reaction of the A-site bound peptidyl-tRNA // Biochimie. 1992. V. 25. P. 411-417.

64. Роднина M.B., Семенное Ю.П., Завельсберг А., Катунин В.К, Песке Ф., Вильден Б., Винтермайер В. Механизм транслокации тРНК на рибосоме // Молекуляр. биология. 2001. Т. 35. С. 655-665.

65. Макаров Е.М., Катунин B.JI., Одинцов В.Б., Семенков Ю.П., Кириллов С.В. Как участки связывания рибосом различают функциональные формы тРНК? // Молекуляр. биология. 1984. Т. 18. С. 1342-1347.

66. Fienberg J.S., Joseph S. Identification of molecular interaction between P-site tRNA and the ribosome essential for translocation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 11120-11125.

67. Zavialov A., Ehrenberg M. Peptidyl-tRNA regulates the GTPase activity of translation factors//Cell. 2003. V. 114. P. 113-122.

68. Robertson J.M., Paulsen H., Wintermeyer W. Pre-steady-state kinetics of ribosomal traslocation // J. Mol. Biol. 1986. V. 192. P. 351-360.

69. Agrawal R.K., Heagle A.B., Penczek P., Grassucci R.A., Frank J. EF-G-dependent GTP hydrolysis induces translocation accompanied by large conformational changes in the 70S ribosome // Nat. Struct. Biol. 1999. V. 6. P. 643-647.

70. Frank J., Agrawal R.K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation //Nature. 2000. V. 406. P. 319-322.

71. Frank J. Electron microscopy of functional ribosome complexes // Biopolymers. 2003. V. 68. P. 223-233.

72. Valle M., Zavialov A., Sengupta J., Rawat U., Ehrenberg M„ Frank J. Locking and unlocking of ribosomal motions // Cell. 2003. V. 114. P. 123-134.

73. Spahn C.M., Nierhaus K.H. Models of the elongation cycles: an evaluation // Biol. Chem. 1998. V. 379. P. 753-772.

74. Gnirke A., Geigenmuller U., Rheinberger H.J., Nierhaus K.H. The allosteric three-site model for ribosomal elongation cycle. Analysis with a heteropolymeric mRNA // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 7291-7301.

75. VanLoock M.S., Agrawal R.K., Gabashvili I.S., Qi L„ Frank J., Harvey S.C. Movement of the decoding region of the 16S ribosomal RNA accompanies tRNA translocation // J. Mol. Biol. 2000. V. 304. P. 507-515.

76. Гудков A.T. Структура и функции фактора элонгации G прокариот // Молекуляр. биология. 2001. Т. 35. С. 647-654.

77. Rodnina M.V., Savelsbergh A., Katunin V.I., Wintermeyer W. Hydrolysis of GTP by elongation factor G drives the tRNA movement on the ribosome // Nature. 1997. V. 385. P. 3741.

78. Rodnina M. V., Savelsbergh A., Matassova N.B., Katunin V.I., Semenkov Y.P., Wintermeyer W. Thiostrepton inhibits the turnover but not the GTPase of elongation factor G on the ribosome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 9586-9590.

79. Czworkowski J., Wang J., Steitz T.A., Moore P.B. The crystal structure of elongation factor G complexed with GTP, at 2.7 A resolution // EMBO J. 1994. V. 13. P. 3661-3668.

80. Nissen P., Kjeldgaard M., Thirup S., Polekhina G., Reshetnikova L., Clark B.F., Nyborg J. Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu and a GTP analog // Science. 1995. V. 270. P. 1464-1472.

81. Wilson K.S., Noller H.F. Mapping of position of translational elongation factor EF-G in the ribosome by direct hydroxyl radical probing // Cell. 1998. V. 92. P. 131-139.

82. Agrawal R.K., Penczek P., Grassucci R.A., Frank J. Visualization of elongation factor G on the Escherichia coli ribosome: the mechanism of translocation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 6134-6138.

83. Stark H., Rodnina M.V., Weiden H.-J., van Heel M., Wintermeyer W. Large-scale movement of elongation factor G and extensive conformational change of the ribosome during translocation // Cell. 2000. V. 100. P. 301-309.

84. Porse B.T., Leviev I., Mankin A.S., Garrett R.A. The antibiotic thiostrepton inhibits a functional transition within protein LI 1 at the ribosomal GTPase center // J. Mol. Biol. 1998. V. 276. P. 391-404.

85. Peske F., Matassova N.B., Savelsbergh A., Rodnina M.V., Wintermeyer W. Conformationally restricted elongation factor G retains GTPase activity but is inactive in translocation on the ribosome // Mol. Cell. 2000. V. 6. P. 501-505.

86. Savelsbergh A., Mohr D., Wilden В., Wintermeyer W., Rodnina M. Stimulation of the GTPase activity of translational elongation factor by ribosomal protein L7/12 // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 890-894.

87. Schluenzen F., Zarivach R, Harms J., Bashan A., Tocilj A., Albrecht R, Yonath A., Franceschi F. Structural basis for the interaction of antibiotics with the peptidyl transferase center in eubacteria//Nature. 2001. V. 413. P. 814-821.

88. Schluenzen F., Harms J.M., Franceschi F., Hansen H.A.S., Bartels H, Zarivach R., Yonath A. Structural basis for the antibiotic activity of ketolides and azalides // Structure. 2003. V. 11. P. 329-338.

89. Hansen J.L., Moore P.В., Steitz T.A. Structures of five antibiotics bound at the peptidyl transferase center of the large ribosomal subunit // J. Mol. Biol. 2003. V. 330. P. 1061-1075.

90. Будкер В.Г., Гиршович A.C., Гринева Н.И., Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г., Кобец Н.Д. Специфическая химическая модификация рибосом вблизи мРНК-связывающего центра // Докл. АН СССР. 1973. Т.211. С.725-728.

91. Кнорре Д.Г., Карпова Г.Г., Кобец Н.Д. Аффинная модификация рибосом Е. coli вблизи мРНК- и тРНК-связывающих центров // Итоги Науки и Техники. М.: ВИНИТИ,1985. Т. 4. С. 87-143.

92. Bhangu R., Wollenzien P. The mRNA binding track in the Escherichia coli ribosome for mRNA of different sequences // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 5937-5944.

93. Bhangu R., Juzumiene D., Wollenzien P. Arrangement of messenger RNA on Escherichia coli ribosomes with respect to 10 16S rRNA cross-linking sites // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 3063-3070.

94. Сергиев П.В., Донцова O.A., Богданов A.A. Изучение структуры прокариотической рибосомы биохимическими методами: судный день // Молекуляр. биология. 2001. Т. 35. С.559.583.

95. Neefs J.-M., Van de Peer К, Hendriks L., De Wacher R. Compilation of small ribosomal subunit RNA sequences // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18 (Supplement). P. 2237-2317.

96. С.В., Макаров Е.М., Махно В.И., Семенков Ю.П. Фотоаффинная модификация Е-сайта рибосом Escherichia coli II Биополимеры и клетка. 1989.Т. 5. С. 35-40.

97. Döring Т., Mitchell Р., Osswald М., Bochkariov D., Brimacombe R. The decoding region of 16S rRNA; a cross-linking study of the ribosomal A, P and E sites using tRNA derivatized at position 32 in the anticodon loop // EMBO J. 1994. V. 13. P. 2677-2685.

98. Rinke-Appel J., Junke N., Osswald M., Brimacombe R. The ribosomal environment of tRNA: crosslinks to rRNA from positions 8 and 20 in the central fold of tRNA located at the A,m P, or E sites // RNA. 1995. V. 1. P. 1018-1028.

99. Rosen K.V., Alexander R.V., Wower J., Zimmermann R.A. Mapping the central fold of tRNA2(fMet) in the P site of the Escherichia coli ribosome // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 12802-12811.

100. Rosen К. V., Zimmermann R.A. Photoaffini ty labeling of 3 OS subunit proteins S7 and Sil by 4-thiouridine-substituted tRNA(Phe) situated at the P site of Escherichia coli ribosomes // RNA. 1997. V. 3. P. 1028-1036.

101. Abdurashidova G.G., Tsvetkova E.A., Budowsky E.I. Determination of tRNA nucleotide residues directly interacting with proteins in the post- and pretranslocated ribosomal complexes // FEBS Lett. 1990. V. 269. P. 398-401.

102. Osswald M., Doring T., Brimacombe R. The ribosomal neighbourhood of the central fold of tRNA: cross-links from position 47 of tRNA located at the A, P, or E sites // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 4635-4641.

103. WowerJ., Malloy T.A., Hixson S.S., Zimmermann R.A. Probing tRNA binding sites on the £ Escherichia coli 30S ribosomal subunit with photoreactive analogs of the anticodon arm //

104. Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1050. P. 38-44.

105. Verschoor A., Srivastava S., Grassucci R., Frank J. Native 3D structure of the eukaryotic 80S ribosome: morphological homology with the E. coli 70S ribosome // J. Cell Biol. 1996. V. 133. P. 495-505.

106. Verschoor A., Warner J.R., Srivastava S., Grassucci R.A., Frank J. Three-dimensional structure of the yeast ribosome // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 655-661.

107. Dube P., Weiske M., Stark H., Schatz M., Stahl J., Zemlin F., Lutsch G., van Heel M. The 80S rat liver ribosome at 25 A resolution by electron cryomicroscopy and angular reconstitution // Stucture. 1998. V. 6. P. 389-399.

108. Spahn C.M., Beckmann R., EswarN., Penczek P.A., SaliA., Blobel G„ Frank J. Structure of the 80S ribosome from Saccharomyces cerevisiae tRNA-robosome and subunit-subunit interactions // Cell. 2001. V. 107. P. 373-386.

109. Spahn C.M., Kieft J.S., Grassucci R.A., Penczek P., Zhou K„ Doudna J.A., Frank J. Hepatitis C virus IRES RNA-induced changes in the conformation of the 40S ribosomal subunit I I Science. 2001. V. 291. P. 1959-1962.

110. Doudna J. A., Rath V.L. Structure and function of the eukaryotic ribosome: the next frontier //Cell. 2002. V. 109. P. 153-156.

111. Uchiumi T., Nomura H.K., Hachimori A. Replacement of L7/L12.L10 protein complex in Escherichia coli ribosomes with the eukaryotic counterpart changes the specificity of elongation factor binding // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 27578-27582.

112. Hingerty B., Brown R.S., Jack A. Further refinement of the structure of yeast tRNAphe // J. Mol. Biol. 1978. V. 124. P. 523-534.

113. Beckmann R., Spahn C.M.T., Eswar N., Helmers J., Penczek P.A., SaliA., Frank J., Blobel G. Architecture of the protein-conducting channel associated with the translating 80S ribosome // Cell. 2001. V. 107. P. 361-372.

114. Morgan D.G., Menetret J.-F., Neuhof A., Rapoport T.A., Akey Ch.W. Structure of the mammalian ribosome channel complex at 17 A resolution // J. Mol. Biol. 2002. V. 324. P. 871886.

115. Mueller F., Brimacombe R. A new model for the three-dimensional folding of Escherichia coli 16S ribosomal RNA. I. Fitting the RNA to a 3D electron microscopic map at 20 A // J. Mol. Biol. 1997. V. 271. P. 524-544.

116. Graifer D.M., Juzumiene D.I., Karpova G.G., Wollenzien P. mRNA binding track in the human 80S ribosome for mRNA analogues randomly substituted with 4-thiouridine residues // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 6201-6206.

117. Matassova N.B., Venjaminova A.G., Karpova G.G. Nucleotides of 18S rRNA surrounding mRNA at the decoding site of translating human ribosome as revealed from the cross-linking data // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1397. P. 231-239.

118. Bulygin K.N., Graifer D.M., Repkova M.N., Smolenskaya I.A., Veniyaminova A.G., Karpova G.G. Nucleotide G-1207 of 18S rRNA is an essential component of the human 80S ribosomal decoding center//RNA. 1997. V. 3. P. 1480-1485.

119. Mundus D., Wollenzien P. Neighbourhood of 16S rRNA nucleotides U788/U789 in the 30S ribosomal subunit determined by site-directed crosslinking // RNA. 1998. V. 4. P. 1373-1385.

120. Stahl J., Kobets N.D. Affinity labeling of rat liver ribosomal protein S26 by heptauridylate containing a 5'-terminal alkylating group //Molec. Biol. Rep. 1984. V.9. P.219-222.

121. Rodnina M. V., El'skaya A. К, Semenkov Yu.P., Kirillov S. V. Interaction of tRNA with the A and P sites of rabbit-liver ribosomes and their 40S subunits // Eur. J. Biochem. 1989. V. 185. P.563.568.

122. Graifer D.M., Nekhai S.Yu., Mundus D.A., Fedorova O.S., Karpova G.G. Interaction of human and Escherichia coli tRNA with human 80S ribosomes in the presence of oligo- and polyuridylate template // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1171. P. 56-64.

123. Maden B.E.H., Dent C.L., Farrel Т.Е., Garde J., McCallum F.S., Wakeman J.A. Clones of human ribosomal DNA containing the complete 18S-rRNA and 28S-rRNA genes // Biochem. J. 1987. V. 246. P. 519-522.

124. Малыгин A.A., Шауло Д.Д., Карпова Г.П Диссоциация белков из 40S белков рибосомчеловека в градиенте концентрации хлористого лития // Молекуляр. биология. 2000. Т. 34. С. 887-893.

125. Грайфер Д.М., Зенкова М.А., Карпова Г.Г., Малыгин А.А., Матасова Н.Б. Особенности неэнзиматического связывания олигорибонуклеотидов аналогов мРНК и РЬе-тРНКРЬе с 80S рибосомами из плаценты человека // Молекуляр. биология. 1990. Т. 24. С. 1076-1082.

126. Tranque Р., Ни M.C.-Y., Edelman G.M., Mauro V.P. rRNA complementarity within mRNAs: a possible basis for mRNA-ribosome interactions and translational control // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. V. 95. P. 12238-12243.

127. Cunningham P.R., Nurse K., Weitzmann C.J., Negre D., Ofengand J. G1401: a keystone nucleotide at the decoding site of Escherichia coli 30S ribosomes // Biochemistry. 1992. V. 31.1. P. 7629-7637.

128. Lynch S.R., Puglisi J.D. Structure of a eukaryotic decoding region A-site RNA // J. Mol. Biol. 2001. V. 306. P. 1023-1035.

129. Lynch S.R., Puglisi J.D. Structural origins of aminoglycoside specificity for prokaryotic ribosomes//J. Mol. Biol. 2001. V. 306. P. 1037-1058.

130. Semenkov Yu.P., Kirillov S. V., Stahl J. 40S subunits from rat liver do contain two codon-dependent sites for transfer RNA // FEBS Lett. 1985. V. 193. P. 105-108.

131. Levina A.S., Tabatadze D.R., Khalimskaya L.M., Prihodko N.A., Shishkin G.V., Alexandrova L.A., Zarytova V.F. Oligonucleotide derivatives bearing reactive and stabilizing groups attached to C5 of deoxyuridine // Bioconjugate Chem. 1993. V.4. P.319-325.

132. Wollenzien P. Isolation and identification of RNA cross-links // Methods Enzymol. 1988. V. 164. P. 319-329.

133. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 277. P. 680-685.

134. Madjar J.-J., Arpin M., Buisson M., Reboud J.-P. Spot position of rat liver ribosomal proteins by four different two-dimentional electrophoresis in polyacrylamide gel // Mol. Gen. Genet. 1979. V.171. P.121-134.1. БЛАГОДАРНОСТИ

135. Автор признателен Алие Гусейновне Веньяминовой, Марине Николаевне Репковой, Марие Мещаниновой, Тамаре Михайловне Ивановой за предоставление материалов, необходимых для выполнения настоящей работы.

136. Автор благодарит всех сотрудников Лаборатории Структуры и Функции Рибосом, чьи постоянные помощь, поддержку и заботу автор испытывает на протяжении всего времени работы в этом коллективе.

137. Автор признателен рецензенту Марине Аркадьевне Зенковой за внимательное прочтение работы и ценные советы по оформлению полученных результатов.

138. Огромную благодарность автор выражает своему научному руководителю Галине Георгиевне Карповой за неоценимую помощь в • критическом осмыслении полученных результатов, за великое терпение и большой труд, вложенные в написание данной работы.