Изучение роли антикогена р53 в механизме устойчивости клеток к трансформации онкогеном ras тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Иванов, Алексей Валентинович

• Иванов, Алексей Валентинович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Иванов, Алексей Валентинович

страница

Содержание.2

Список принятых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.В

1.1 БИОЛОГИЧЕСКИЕ АКТИВНОСТИ АНТИОНКОГЕНА Р53.

1.1.1. Структура белка р53.

1.1.2. Транскрипционные мишени белка р53.:.

1.1.2.1. Гены, активация которых способствует замедлению клеточного цикла.

1.1.2.2. Гены, участвующие в р53-зависимом апоптозе.

1.1.2.3. Гены, кодирующие ингибиторы ангиогенеза и другие секретируемые факторы.

1.1.3. Латентное и активированное состояние белка р53.

1.1.4. Активация р53 в ответ на стрессы.

1.2. ДОМИНАНТНЫЙ ОНКОГЕН RAS.

1.2.1 Структура и биохимические свойства Ras.

1.2.2 Эффекторы Ras.

1.2.3 Эффекторы: МАРК каскад и транскрипционные факторы.

1.2.4 Ras-индуцированная трансформация клеток линий иммортализованных фибробластов грызунов.

1.3. КООПЕРАЦИЯ ОНКОГЕНОВ И АКТИВАЦИЯ Р53 ПРИ ТРАНСФОРМАЦИИ.

1.4. СИСТЕМА ТЕТРАЦИКЛИН-РЕГУЛИРУЕМОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ TET-OFF.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Клеточные линии и их культивирование.

2.2. Лизис клеток и приготовление ядерных экстрактов.

2.3. Измерение концентрации белка по методу Бредфорд.

2.4. Пульсовое мечение белка [358]-метионином и иммунопреципитация.

2.5. Фракционирование белков в полиакриламидном геле.

2.6. Перенос белков из гелей на фильтры и иммунодетекция.

2.7. Получение компетентных клеток Е.соИ и трансформация.

2.8. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК.

2.9. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

2.10. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей.

2.11. Реакция лигирования.

2.12. Конструирование ретровирусных векторов.

2.13. ПЦР при конструировании ретровирусных векторов.

2.14. Трансфекция ретровирусных и плазмидных конструктов методом кальций-фосфатной преципитации.

2.15. Инфекция клеток рекомбинантными ретровирусами и селекция на антибиотике устойчивых культур.

2.16. Анализ распределения клеток по клеточному циклу.

2.17. Выделение РНК из эукариотических клеток, ОТ-ПЦР-анализ и секвенирование кДНК р53.

2.18. Анализ активности хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (САТ-реакция).

2.19. Количественное определение флуоресценции зеленого белка (ЕОБР).

2.20. Хромосомный анализ.

2.21. Изучение способности клеток входить в 8-фазу клеточного цикла по включению ими 5-бромдезоксиуридина.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Анализ способности различных клеточных культур трансформироваться под действием онкогена ras в зависимости от состояния в них сигнального пути, ведущего к активации р53.

3.2. Исследование эффективности трансформации и экспрессии белка р53 в клетках REF52 при введении кооперирующих онкогенов туе и ras.

3.3. Анализ конформационного состояния и функциональной активности белка р53 в контрольных и трансформированных онкогенами туе + ras клетках REF52.

3.4. Генетический анализ изменений в гене р53 в трансформированных онкогенами mye + ras клетках REF52.

3.5. Создание и характеристика высокоэффективной ретровирусной системы для тетрациклин-регулируемой экспрессии трансгенов в клетках млекопитающих.

3.6. Получение различных линий клеток с тетрациклин-регулируемой экспрессией онкогена ras и изучение кинетики активации белка р53 под действием онкогена ras в клетках REF52.

3.7. Изучение влияния онкогена ras на частоту возникновения спонтанных генетических нарушений в клетках с различным состоянием р53-зависимого сигнального пути.

4. ВЫВОДЫ.

5. БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение роли антикогена р53 в механизме устойчивости клеток к трансформации онкогеном ras»

Канцерогенез представляет собой многоступенчатый процесс накопления генетических изменений, в первую очередь в генах, продукты которых вовлечены в регуляцию клеточного цикла, апоптоза и морфогенетических реакций клетки. Так в различных новообразованиях человека наиболее частыми генетическими повреждениями являются инактивирующие мутации антионкогена (опухолевого супрессора) р53 (около половины всех опухолей) [Hollstein, 1996] и INK4a-ARF [Ruas, 1998], а также активирующие мутации протоонкогенов семейства ras (около 30% всех опухолей) [Rodenhius, 1992]. Несмотря на обширное количество генетических данных, накопленных при описании множества различных новообразований, исследование конкретных молекулярных механизмов канцерогенеза стало развиваться начиная с 90-х годов. Это, в первую очередь, связано с идентификацией новых антионкогенов и более детальным выяснением молекулярных механизмов регуляции клеточного цикла.

Согласно современным представлениям для приобретения трансформированного состояния клетка должна избежать выполнения генетической программы ограничения количества клеточных делений (клеточного старения). Иммортальность in vitro эмбриональных фибробластов, полученных из мышей с гомозиготной делецией гена р53, указывает на центральную роль р53 в этом процессе. Вторым необходимым условием раковой трансформации является приобретение клеткой независимости от внешних сигналов, ингибирующих клеточный цикл или необходимых для его стимуляции. Как правило, это достигается за счет приобретения мутаций в протоонкогенах, которые начинают постоянно активировать программу клеточного деления. Ярким примером такого онкогена является ras. Семейство протоонкогенов ras кодирует GTP-связывающие белки, которые амплифицируют и передают митогенные сигналы от тирозин-киназных рецепторов на поверхности клеточной мембраны в цитоплазму и ядро. Онкогенные мутации, как правило, приводят к аминокислотным заменам в 12-ом или 13-ом кодонах белка Ras, в результате которых Ras оказывается «закрытым» в своем активированном состоянии и начинает постоянно подавать митогенные сигналы.

Наиболее простой экспериментальной моделью изучения неопластической трансформации является введение клеточных или вирусных онкогенов в культивируемые in vitro эмбриональные клетки грызунов. Уже в самых ранних экспериментах было установлено, что для трансформации первичных клеток необходимо действие не одного, а двух или более онкогенов. Так для трансформации первичных эмбриональных фибробластов мыши онкогеном ras необходима его кооперация с такими «иммортализующими» онкогенами, как с -туе, доминантно-негативный мутантный р53, El А аденовируса, Т антиген вируса SV40 или Е7 папилломавируса. Однако, вопреки первоначально сложившимся представлениям само по себе иммортализованное состояние не достаточно для трансформации клеток онкогеном ras. В отличие от большинства иммортализованных клеточных культур линия иммортализованных крысиных эмбриональных фибробластов REF52 может быть трансформирована онкогеном ras только в кооперации с другими онкогенами [Franza, 1986].

До последнего времени механизм устойчивости нормальных клеток к трансформации при введении одного онкогена ras также как и роль р53 в этом механизме оставались невыясненными.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Иванов, Алексей Валентинович

4. ВЫВОДЫ.

1. Установлено, что способность многих иммортализованных клеточных культур грызунов трансформироваться при введении одного онкогена ras, по-видимому, связана с произошедшими в них при иммортализации генетическими нарушениями, которые привели к утрате способности клеток индуцировать р53 в ответ на введение активированного ras.

2. Показано, что экспрессия онкогена ras в клетках REF52 приводит к индукции р53 за счет стабилизации белка. При введении кооперирующих онкогенов туе и ras в клетки REF52 инактивация р53 является необходимым условием их стабильной трансформации.

3. Показано, что разработанная высокоэффективная ретровирусная система для тетрациклин-регулируемой экспрессии генов в клетках млекопитающих, на порядок эффективнее плазмидной. Для «дву-векторной» стратегии, использующей стандартный ретровирусный вектор для экспрессии tTA, определяющим фактором является отбор клонов с оптимальной экспрессией tTA, которые составляют примерно 10% от общего числа клонов. Установлено, что ретровирусная система авторегуляторной экспрессии, использующая самоинактивирующиеся векторы pSIT для доставки в клетки и tTA, и трансгена, позволяет получить наиболее эффективную тетрациклин-зависимую регуляцию экспрессии трансгена, не прибегая к трудоемкому скринингу и отбору индивидуальных клонов. Для «одно-векторной» стратегии определена оптимальная конструкция вектора, заключающаяся в ипользовании бицистронной матрицы для кодирования и tTA, и трансгена.

4. На модели тетрациклин-регулируемой экспрессии онкогена ras в клетках REF52 показано, что включение его экспрессии приводит к морфологической трансформации клеток, индукции р53 и р53-зависимой активации p21Wafl. Однако через несколько пассажей в клетках происходит компенсаторное снижение экспрессии онкогена ras на уровне белка и возвращение клеточной морфологии к нормальному фенотипу. Такое компенсаторное снижение уровня экспрессии белка Ras может быть предотвращено путем коэкспрессии кооперирующего онкогена El А, в результате чего происходит стабильная трансформация клеток. Однако подавление активности р53 путем экспрессии доминантно-негативного фрагмента р53 (GSE22) или онкогена Е6 папилломавируса, по-видимому, является необходимым, но не достаточным условием для стабильной трансформации клеток REF52 онкогеном ras.

5. Показано, что экспрессия онкогена ras вызывает генетическую нестабильность, а именно увеличение частоты эндоредупликации, полиплоидии и разрывов хромосом. В основе данной генетической нестабильности лежит ослабление сверочных точек клеточного цикла. Однако эффективность действия онкогена ras на стабильность генома определяется состоянием в клетке р53-зависимых сигнальных путей.

5. БЛАГОДАРНОСТИ.

Данная работа была поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (97-04-49698), ННМ1 (75195-545006) и Центра медицинских исследований в Москве Университета Осло.

Особую благодарность хочу выразить Павлу Копнину (наша лаборатория) и Ларисе Агаповой (лаборатория цитогенетики Института канцерогенеза ОНЦ РАМН) за помощь в проведении этой работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Иванов, Алексей Валентинович, 1999 год

1. Агапова JI.C., Туровец Н.А., Иванов А.В., Ильинская Г.В., Чумаков П.М., Копнин Б.П. Индукция гипердиплоидии и хромосомных разрывов в клетках LIM1212, экспрессирующих экзогенный мутантный р53. Генетика, 1996, т.32, с. 1080-1087.

2. Зайчук Т.А., Кузнецов Н.В., Оссовская B.C., Копнин Б.П., Чумаков П.М. Специфические ДНК-связывающие свойства онкобелка р53 из опухолевых клеток человека. Докл. РАН, 1993, 330, 386-389.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. Москва, "Мир", 1984.

4. Прасолов B.C., Чумаков П.М. Антисмысловая РНК р53 ингибирует пролиферацию нормальных и трансформированных клеток. Мол. биол., 1988, т.22, с. 1371-1380.

5. Addison, С., Jenkins, J. R., and Sturzbecher, H. W. (1990). The p53 nuclear localisation signal is structurally linked to a p34cdc2 kinase motif. Oncogene 5, 423-6.

6. Agapova L.S., Ilyinskaya G.V., Turovets N.A., Ivanov A.V., Chumakov P.M., Kopnin B.P., Chromosome changes caused by alterations of p53 expression. Mut. Res., 1996, 354, 129-138.

7. Agapova LS, Ivanov AV, Sablina AA, Kopnin PB, Sokova OI, Chumakov PM, Kopnin BP. P53-dependent effects of RAS oncogene on chromosome stability and cell cycle checkpoints. Oncogene 1999 May 20;18(20):3135-42

8. Agarwal, M. L., Agarwal, A., Taylor, W. R., Wang, Z. Q., Wagner, E. F., and Stark, G. R. (1997). Defective induction but normal activation and function of p53 in mouse cells lacking poly-ADP-ribose polymerase. Oncogene 15, 1035-41.

9. Agarwal, M. L., Taylor, W. R., Chernov, M. V., Chernova, О. В., and Stark, G. R. (1998). The p53 network. J Biol Chem 273, 1-4.

10. Agoff, S. N., Hou, J., Linzer, D. I., and Wu, B. (1993). Regulation of the human hsp70 promoter by p53. Science 259, 84-7.

11. Albright, C. F., Giddings, B. W., Liu, J., Vito, M., and Weinberg, R. A. (1993). Characterization of a guanine nucleotide dissociation stimulator for a ras-related GTPase. Embo J 12, 339-47.

12. An, W. G., Kanekal, M., Simon, M. C., Maltepe, E., Blagosklonny, M. V., and Neckers, L. M. (1998). Stabilization of wild-type p53 by hypoxia-inducible factor lalpha. Nature 392, 405-8.

13. Banin, S., Moyal, L., Shieh, S., Taya, Y., Anderson, C. W., Chessa, L., Smorodinsky, N. I., Prives, C., Reiss, Y., Shiloh, Y., and Ziv, Y. (1998). Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science 281, 1674-7.

14. Barbacid M. (1987) ras genes. Annu. Rev. Biochem. 56, 779-828.

15. Barbacid M. (1990) ras oncogenes: their role in neoplasia. Eur J Clin Invest 20, 225-35.

16. Bargonetti, J., Chicas, A., White, D., and Prives, C. (1997). p53 represses Spl DNA binding and HIV-LTR directed transcription. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 43, 935-49.

17. Baron, U., Gossen, M., and Bujard, H. (1997). Tetracycline-controlled transcription in eukaryotes: novel transactivators with graded transactivation potential. Nucleic Acids Res 25, 2723-9.

18. Baron, U., Schnappinger, D., Helbl, V., Gossen, M., Hillen, W., Bujard, H., Freundlieb, S., Bonin, A. L., et al. (1999). Generation of conditional mutants in higher eukaryotes by switching between the expression of two genes.

19. Bar-Sagi, D. (1992). Mechanisms of signal transduction by Ras. Semin Cell Biol 3, 93-8.

20. Bennett, M., Macdonald, K., Chan, S. W., Luzio, J. P., Simari, R., and Weissberg, P. (1998). Cell surface trafficking of Fas: a rapid mechanism of p53-mediated apoptosis. Science 282, 290-3.

21. Berger, S. L., Cress, W. D., Cress, A., Triezenberg, S. J., and Guarente, L. (1990). Selective inhibition of activated but not basal transcription by the acidic activation domain of VP 16: evidence for transcriptional adaptors. Cell 61, 1199-208.

22. Berra, E., Diaz-Meco, M. T., Dominguez, I., Municio, M. M., Sanz, L., Lozano, J., Chapkin, R. S., and Moscat, J. (1993). Protein kinase C zeta isoform is critical for mitogenic signal transduction. Cell 74, 555-63.

23. Berra, E., Diaz-Meco, M. T., Lozano, J., Frutos, S., Municio, M. M., Sanchez, P., Sanz, L., and Moscat, J. (1995). Evidence for a role of MEK and MAPK during signal transduction by protein kinase C zeta. Embo J 14, 6157-63.

24. Bhat, M. K., Yu, C., Yap, N., Zhan, Q., Hayashi, Y., Seth, P., and Cheng, S. (1997). Tumor suppressor p53 is a negative regulator in thyroid hormone receptor signaling pathways. J Biol Chem 272, 28989-93.

25. Bishop, J. M., Capobianco, A. J., Doyle, H. J., Finney, R. E., McMahon, M., Robbins, S. M., Samuels, M. L., and Vetter, M. (1994). Proto-oncogenes and plasticity in cell signaling. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 59, 165-71.

26. Blagosklonny, M. V., An, W. G., Romanova, L. Y., Trepel, J., Fojo, T., and Neckers, L. (1998). p53 inhibits hypoxia-inducible factor-stimulated transcription. J Biol Chem 273, 11995-8.

27. Blaydes, J. P., Gire, V., Rowson, J. M., and Wynford-Thomas, D. (1997). Tolerance of high levels of wild-type p53 in transformed epithelial cells dependent on auto-regulation by mdm-2. Oncogene 14, 1859-68.

28. Bohl, D., Naffakh, N., and Heard, J. M. (1997). Long-term control of erythropoietin secretion by doxycycline in mice transplanted with engineered primary myoblasts see comments., Nat Med 3, 299-305.

29. Bos J.L. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res., 1989, 49, 4682-4689.

30. Bottger, A., Bottger, V., Sparks, A., Liu, W. L., Howard, S. F., and Lane, D. P. (1997). Design of a synthetic Mdm2-binding mini protein that activates the p53 response in vivo. Curr Biol 7, 8609.

31. Canman, C. E., Lim, D. S., Cimprich, K. A., Taya, Y., Tamai, K., Sakaguchi, K., Appella, E.,

32. Kastan, M. B., and Siliciano, J. D. (1998). Activation of the ATM kinase by ionizing radiationand phosphorylation of p53. Science 281, 1677-9.

33. Cano, E., and Mahadevan, L. C. (1995). Parallel signal processing among mammalian MAPKs.

34. Trends Biochem Sci 20, 117-22.

35. Cavigelli, M., Dolfi, F., Claret, F. X., and Karin, M. (1995). Induction of c-fos expression through

36. JNK-mediated TCF/Elk-1 phosphorylation. Embo J 14, 5957-64.

37. Chang, H. W., Aoki, M., Fruman, D., Auger, K. R., Bellacosa, A., Tsichlis, P. N., Cantley, L. C., Roberts, T. M., and Vogt, P. K. (1997). Transformation of chicken cells by the gene encoding the catalytic subunit of PI 3-kinase. Science 276, 1848-50.

38. Chellappan SP, Hiebert S, Mudryj M, Horowitz JM, Nevins JR. The E2F transcription factor is a cellular target for the RB protein. Cell 1991 Jun 14;65(6): 1053-61

39. Chen J., Willingham T., Shuford M., Bruce D., Rushing E., Smith Y., Nisen P.D. Effects of ectopic overexpression of p21/wafl/cipl on aneuploidy and the malignant phenotype of human brain tumor cells. Oncogene, 1996, 13, 1395-1403.

40. Chen, C. Y., and Faller, D. V. (1996). Phosphorylation of Bcl-2 protein and association with p21Ras in Ras-induced apoptosis. J Biol Chem 271, 2376-9.

41. Chen, C. Y., Oliner, J. D., Zhan, Q., Fornace, A. J., Jr., Vogelstein, B., and Kastan, M. B. (1994). Interactions between p53 and MDM2 in a mammalian cell cycle checkpoint pathway. Proc Natl Acad SciUS A 91, 2684-8.

42. Chen, C., Nussenzweig, A., Guo, M., Kim, D., Li, G. C., and Ling, C. C. (1996). Down-regulation of gaddl53 by c-myc in rat fibroblasts and its effect on cell growth and radiation-induced apoptosis. Oncogene 13, 1659-65.

43. Chernov MV, Ramana CV, Adler W, Stark GR. (1998) Stabilization and activation of p53 are regulated independently by different phosphorylation events. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 2284-2289.

44. Chin, K. V., Ueda, K., Pastan, I., and Gottesman, M. M. (1992). Modulation of activity of the promoter of the human MDR1 gene by Ras and p53. Science 255, 459-62.

45. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., and Pavletich, N. P. (1994). Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations (see comments. Science 265, 346-55.

46. Chowdary, D. R., Dermody, J. J., Jha, K. K., and Ozer, H. L. (1994). Accumulation of p53 in a mutant cell line defective in the ubiquitin pathway. Mol Cell Biol 14, 1997-2003.

47. Clark, G. J., Westwick, J. K., and Der, C. J. (1997). pl20 GAP modulates Ras activation of Jun kinases and transformation. J Biol Chem 272, 1677-81.

48. Cook, A., and Milner, J. (1990). Evidence for allosteric variants of wild-type p53, a tumour suppressor protein. Br J Cancer 61, 548-52.

49. Cowley S., Paterson H., Kemp P., Marshall C.J. Activation of MAP kinase kinase is necessary and sufficient for PC12 differentiation and for transformation of NIH 3T3 cells. Cell, 1994, 77, 841852.

50. Crespo, P., Mischak, H., and Gutkind, J. S. (1995). Overexpression of mammalian protein kinase C-zeta does not affect the growth characteristics of NIH 3T3 cells. Biochem Biophys Res Commun 213, 266-72.

51. Dameron, K. M., Volpert, O. V., Tainsky, M. A., and Bouck, N. (1994). Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-1. Science 265, 1582-1584.

52. DeClue, J. E., Vass, W. C., Johnson, M. R., Stacey, D. W., and Lowy, D. R. (1993). Functional role of GTPase-activating protein in cell transformation by pp60v-src. Mol Cell Biol 13, 6799-809.

53. Deng, C., Zhang, P., Harper, J. W., Elledge, S. J., and Leder, P. (1995). Mice lacking p21CIPlAVAFl undergo normal development, but are defective in G1 checkpoint control. Cell 82, 675-84.

54. Denhardt D. T.: Signal-transducing protein phosphorylation cascades mediated by Ras/Rho proteins in the mammalian cell: the potential for multiplex signalling. Biochem J 318, 729-747 (1996)

55. Eliyahu D., Raz A., Gruss P., Givol D., Oren M. Participation of p53 cellular tumor antigen in transformation of normal embryonic cells. Nature, 1984, v.312, p.646 649.

56. Ewen, M. E., and Miller, S. J. (1996). p53 and translational control. Biochim Biophys Acta 1242, 181-4.

57. Fan S, el-Deiry WS, Bae I, Freeman J, Jondle D, Bhatia K, Fornace AJ Jr, Magrath I, Kohn KW, O'Connor PM. p53 gene mutations are associated with decreased sensitivity of human lymphoma cells to DNA damaging agents. Cancer Res 1994 Nov 15;54(22):5824-30

58. Finlay, C.A. The mdm-2 oncogene can overcome wild-type p53 suppression of transformed cell growth. Mol.Cell Biol. 13:301-306, 1993.

59. Franza BR Jr, Maruyama K, Garrels JI, Ruley HE. (1986) In vitro establishment is not a sufficient prerequisite for transformation by activated ras oncogenes. Cell 44, 409-418.

60. Freedman, D. A., and Levine, A. J. (1998). Nuclear export is required for degradation of endogenous p53 by MDM2 and human papillomavirus E6 In Process Citation., Mol Cell Biol 18, 7288-93.

61. Fritsche M., Haessler C., Brandner G. Induction of nuclear accumulation of the tumor-suppressor protein p53 by DNA-damaging agents. Oncogene, 1993, 8, 307-318.

62. Fritsche, M., Mundt, M., Merkle, C., Jahne, R., and Groner, B. (1998). p53 suppresses cytokine induced, Stat5 mediated activation of transcription. Mol Cell Endocrinol 143, 143-54.

63. Fuchs, S. Y., Adler, V., Buschmann, T., Yin, Z., Wu, X., Jones, S. N., and Ronai, Z. (1998). JNK targets p53 ubiquitination and degradation in nonstressed cells. Genes Dev 12, 2658-63.

64. Fuchs, S. Y., Adler, V., Pincus, M. R., and Ronai, Z. (1998). MEKK1/JNK signaling stabilizes and activates p53. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 10541-6.

65. Fujita-Yoshigaki, J., Shirouzu, M., Ito, Y., Hattori, S., Furuyama, S., Nishimura, S., and Yokoyama, S. (1995). A constitutive effector region on the C-terminal side of switch I of the Ras protein. J Biol Chem 270, 4661-7.

66. Fukasawa, K., Choi, T., Kuriyama, R., Rulong, S., and Vande Woude, G. F. (1996). Abnormal centrosome amplification in the absence of p53. Science 271, 1744-7.

67. Funk, W. D., Pak, D. T, Karas, R. H., Wright, W. E., and Shay, J. W. (1992). A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes. Mol Cell Biol 12, 2866-71.

68. Galaktionov K., Lee A.K., Eckstein E., Draetta G., Mecklet J, Loda M., Beach D. (1995) CDC25 phosphatases as potential human oncogenes. Science 269, 1575-1577.

69. Gannon, J. V., Greaves, R., Iggo, R., and Lane, D. P. (1990). Activating mutations in p53 produce a common conformational effect. A monoclonal antibody specific for the mutant form. Embo J 9, 1595-602.

70. Giaccia AJ, Kastan MB. The complexity of p53 modulation: emerging patterns from divergent signals. Genes Dev 1998 Oct l;12(19):2973-83

71. Gill, G., and Ptashne, M. (1988). Negative effect of the transcriptional activator GAL4. Nature 334, 721-4.

72. Ginsberg, D., Mechta, F., Yaniv, M., and Oren, M. (1991). Wild-type p53 can down-modulate the activity of various promoters. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 9979-83.

73. Gloushanlcova N, Ossovskaya V, Vasiliev J, Chumakov P, Kopnin B. (1997) Changes in p53 expression can modify cell shape of ras-transformed fibroblasts and epitheliocytes. Oncogene 15, 2985-9.

74. Goga, A., Liu, X., Hambuch, T. M., Senechal, K., Major, E., Berk, A. J., Witte, O. N., and Sawyers, C. L. (1995). p53 dependent growth suppression by the c-Abl nuclear tyrosine kinase. Oncogene 11,791-9.

75. Goodrich DW, Wang NP, Qian YW, Lee EY, Lee WH. The retinoblastoma gene product regulates progression through the G1 phase of the cell cycle. Cell 1991 Oct 18;67(2):293-302

76. Graeber, T. G., Osmanian, C., Jacks, T., Housman, D. E., Koch, C. J., Lowe, S. W., and Giaccia, A. J. (1996). Hypoxia-mediated selection of cells with diminished apoptotic potential in solid tumours. Nature 379, 88-91.

77. Greulich, H., and Hanafiisa, H. (1996). A role for Ras in v-Crk transformation. Cell Growth Differ 7, 1443-51.

78. Grossman, S. R., Perez, M., Kung, A. L., Joseph, M., Mansur, C., Xiao, Z. X., Kumar, S., Howley, P. M., and Livingston, D. M. (1998). p300/MDM2 complexes participate in MDM2-mediated p53 degradation In Process Citation., Mol Cell 2, 405-15.

79. Gu, W., and Roeder, R. G. (1997). Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain. Cell 90, 595-606.

80. Guay, J., Lambert, H., Gingras-Breton, G., Lavoie, J. N., Huot, J., and Landry, J. (1997). Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27. J Cell Sci 110, 357-68.

81. Guenal, I., Risler, Y., and Mignotte, B. (1997). Down-regulation of actin genes precedes microfilament network disruption and actin cleavage during p53-mediated apoptosis. J Cell Sci 110, 489-95.

82. Guild, B.C., Finer, M.H., Housman, D.E., Mulligan, R.C. (1988) Development of retrovirus vectors useful for expressing genes in cultured murine embryonal cells and hematopoietic cells in vivo. J Virol 62, 3795-801.

83. Guyton, K. Z., Liu, Y., Gorospe, M., Xu, Q., and Holbrook, N. J. (1996). Activation of mitogen-activated protein kinase by H202. Role in cell survival following oxidant injury. J Biol Chem 271, 4138-42.

84. Hall A.: Rho GTPases and the actin cytoskeleton. Science 279, 509-514 (1998)

85. Han, J., Lee, J. D., Bibbs, L., and Ulevitch, R. J. (1994). A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells. Science 265, 808-11.

86. Harrington, E. A., Fanidi, A., and Evan, G. I. (1994). Oncogenes and cell death. Curr Opin Genet Dev 4, 120-9.

87. Harvey, D.M., Levine, A.J. (1991) p53 alteration is a common event in the spontaneous immortalization of primary BALB/c murine embryo fibroblasts. Genes Dev 5, 2375-85.

88. Haupt, Y., Maya, R., Kazaz, A., and Oren, M. (1997). Mdm2 promotes the rapid degradation of p53. Nature 387, 296-9.

89. Hawkins P.T., Eguinoa A., Qiu R.G., Stokoe D., Cooke F.T., Walters R., Wennstrom S., Claesson W.L., Evans T., Symons M. PDGF stimulates an increase in GTP-Rac via activation of phosphoinositide 3-kinase. Curr. Biol., 1995, 5, 393-403.

90. Hermeking H, Funk JO, Reichert M, Ellwart JW, Eick D. Abrogation of p53-induced cell cycle arrest by c-Myc: evidence for an inhibitor of p21WAFl/CIPl/SDIl. Oncogene 1995 Oct 5;11(7): 1409-15

91. Hermeking, H., Lengauer, C., Polyak, K., He, T. C., Zhang, L., Thiagalingam, S., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. (1997). 14-3-3 sigma is a p53-regulated inhibitor of G2/M progression. Mol Cell 1,3-11.

92. Hesketh R., (1994), The Oncogene Handbook, Academic Press, 378-413.

93. Hibi, M., Lin, A., Smeal, T., Minden, A., and Karin, M. (1993). Identification of an oncoprotein-and UV-responsive protein kinase that binds and potentiates the c-Jun activation domain. Genes Dev 7, 2135-48.

94. Hicks GG, Egan SE, Greenberg AH, Mowat M. Mutant p53 tumor suppressor alleles release ras-induced cell cycle growth arrest. Mol Cell Biol 1991 Mar;ll(3):1344-52

95. Hill, C. S., Marais, R., John, S., Wynne, J., Dalton, S., and Treisman, R. (1993). Functional analysis of a growth factor-responsive transcription factor complex. Cell 73, 395-406.

96. Hill, C. S., Wynne, J., and Treisman, R. (1995). The Rho family GTPases RhoA, Racl, and CDC42Hs regulate transcriptional activation by SRF. Cell 81, 1159-70.

97. Hirakawa T. and Ruley H.E. Rescue of cells from ras oncogene-induced growth arrest by a second complementing oncogene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 1519-1523.

98. Hofmann, A., Nolan, G. P., and Blau, H. M. (1996). Rapid retroviral delivery of tetracycline-inducible genes in a single autoregulatory cassette see comments., Proc Natl Acad Sci U S A 93, 5185-90.

99. Hu, Q., Klippel, A., Muslin, A. J., Fantl, W. J., and Williams, L. T. (1995). Ras-dependent induction of cellular responses by constitutively active phosphatidylinositol-3 kinase. Science 268, 100-2.

100. Hupp, T. R., Meek, D. W., Midgley, C. A., and Lane, D. P. (1992). Regulation of the specific DNA binding function of p53. Cell 71, 875-86.

101. Jacobs, D., Glossip, D., Xing, H., Muslin, A. J., and Kornfeld, K. (1999). Multiple docking sites on substrate proteins form a modular system that mediates recognition by ERK MAP kinase. Genes Dev 13, 163-75.

102. Jenkins J.R., Rudge K., Redmond S., Wade-Evans A. Cloning and expression analysis of full length mouse cDNA sequences encoding the transformation associated protein p53. Nucl. Acids Res., 1984, 12, 5609-5626.

103. Jiang, W. G. (1995). Membrane ruffling of cancer cells: a parameter of tumour cell motility and invasion. Eur J Surg Oncol 21, 307-9.

104. Johnson DG, Schneider-Broussard R. Role of E2F in cell cycle control and cancer. Front Biosci 1998 Apr 27;3:d447-8

105. Johnson, R., Spiegelman, B., Hanahan, D., and Wisdom, R. (1996). Cellular transformation and malignancy induced by ras require c-jun. Mol Cell Biol 16, 4504-11.

106. Khanna, K. K., and Lavin, M. F. (1993). Ionizing radiation and UV induction of p53 protein bydifferent pathways in ataxia-telangiectasia cells. Oncogene 8, 3307-12.

107. Khosravi-Far R, P. A. Solski, G. J. Clark, M. S. Kinch & C. J. Der: Activation of Racl, RhoA, and mitogen-activated protien kinases is required for Ras transformation. Mol Cell Biol 15, 64436453 (1995)

108. Khosravi-Far, R., and Der, C. J. (1994). The Ras signal transduction pathway. Cancer Metastasis Rev 13, 67-89.

109. Kikuchi, A., and Williams, L. T. (1996). Regulation of interaction of ras p21 with RalGDS and Raf-1 by cyclic AMP-dependent protein kinase. J Biol Chem 271, 588-94.

110. Kistner, A., Gossen, M., Zimmermann, F., Jerecic, J., Ullmer, C., Lubbert, H., and Bujard, H. (1996). Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 10933-8.

111. Klippel, A., Reinhard, C., Kavanaugh, W.M., Apell, G., Escobedo, M.A., Williams, L.T. (1996) Membrane localization of phosphatidylinositol 3-kinase is sufficient to activate multiple signal-transducing kinase pathways. Mol Cell Biol 16, 4117-27.

112. Ko, L J., and Prives, C. (1996). p53: puzzle and paradigm. Genes Dev 10, 1054-72.

113. Kohl N.E., Ruley H.E. (1987) Role of c-myc in the transformation of REF52 cells by viral and cellular oncogenes. Oncogene 2, 41-48.

114. Komarova, E. A., Diatchenko, L., Rokhlin, O. W., Hill, J. E., Wang, Z. J., Krivokrysenko, V. I., Feinstein, E., and Gudkov, A. V. (1998). Stress-induced secretion of growth inhibitors: a novel tumor suppressor function of p53. Oncogene 17, 1089-96.

115. Kortenjann, M., Thomae, O., and Shaw, P. E. (1994). Inhibition of v-raf-dependent c-fos expression and transformation by a kinase-defective mutant of the mitogen-activated protein kinase Erk2. Mol Cell Biol 14, 4815-24.

116. Kubbutat, M. H., Jones, S. N., and Vousden, K. H. (1997). Regulation of p53 stability by Mdm2. Nature 387, 299-303,

117. Madhani, H. D., and Fink, G. R. (1998). The riddle of MAP kinase signaling specificity. Trends Genet 14, 151-5.

118. Maestro R, Dei Tos AP, Hamamori Y, Krasnokutsky S, Sartorelli V, Kedes L, Doglioni C, Beach DH, Hannon GJ. (1999) Twist is a potential oncogene that inhibits apoptosis. Genes Dev 13, 2207-17.

119. Maltzman, W., and Czyzyk, L. (1984). UV irradiation stimulates levels of p53 cellular tumor antigen in nontransformed mouse cells. Mol Cell Biol 4, 1689-94.

120. Malumbres, M., and Pellicer, A. (1998). RAS pathways to cell cycle control and cell transformation. Front Biosci 3, d887-912.

121. Mansour S.J., Matten W.T., Hermann A.S., Candia J.M., Rong S., Fukasawa K., Vande Woud G.F., Ahn N.G. Transformation of mammalian cells by constitutively active MAP kinase kinase. Science, 1994, 265, 966-970.

122. Marais, R., Wynne, J., and Treisman, R. (1993). The SRF accessory protein Elk-1 contains a growth factor-regulated transcriptional activation domain. Cell 73, 381-93.

123. Marshall, C. J. (1994). MAP kinase kinase kinase, MAP kinase kinase and MAP kinase. Curr Opin Genet Dev 4, 82-9.

124. Marshall, M. S. (1993). The effector interactions of p21ras. Trends Biochem Sci 18, 250-4.

125. Mayo, L. D., Turchi, J. J., and Berberich, S. J. (1997). Mdm-2 phosphorylation by DNA-dependent protein kinase prevents interaction with p53. Cancer Res 57, 5013-6.

126. McCormack SJ, Weaver Z, Deming S, Natarajan G, Torri J, Johnson MD, Liyanage M, Ried T, Dickson RB. (1998) Myc/p53 interactions in transgenic mouse mammary development, tumorigenesis and chromosomal instability. Oncogene 16, 2755-2766.

127. McCurrach, M. E., Connor, T. M., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., and Lowe, S. W. (1997). bax-deficiency promotes drug resistance and oncogenic transformation by attenuating p53-dependent apoptosis. Proc Natl Acad Sei U S A 94, 2345-9.

128. McGlade, J., Brunkhorst, B., Anderson, D., Mbamalu, G., Settleman, J., Dedhar, S., Rozakis-Adcock, M., Chen, L. B., and Pawson, T. (1993). The N-terminal region of GAP regulates cytoskeletal structure and cell adhesion. Embo J 12, 3073-81.

129. Mcllroy, J., Chen, D., Wjasow, C., Michaeli, T., and Backer, J. M. (1997). Specific activation of p85-pl 10 phosphatidylinositol 3'-kinase stimulates DNA synthesis by ras- and p70 S6 kinase-dependent pathways. Mol Cell Biol 17, 248-55.

130. McKay I.A., Marshall C.J., Cales C., Hall A. Transformation and stimulation of DNA synthesis in NIH-3T3 cells are a titratable function of normal p21N"ras expression. EMBO J., 1986, v.5, p.2617-2621.

131. Medema, R. H., de Laat, W. L., Martin, G. A., McCormick, F., and Bos, J. L. (1992). GTPase-activating protein SH2-SH3 domains induce gene expression in a Ras-dependent fashion. Mol Cell Biol 12, 3425-30.

132. Meek, D. W. (1998). Multisite phosphorylation and the integration of stress signals at p53. Cell Signal 10, 159-66.

133. Michiels, F., Habets, G. G., Stam, J. C., van der Kämmen, R. A., and Collard, J. G. (1995). A role for Rae in Tiaml-induced membrane ruffling and invasion. Nature 375, 338-40.

134. Milner, J. (1994). Forms and functions ofp53. Semin Cancer Biol 5, 211-9.

135. Milner, J., Cook, A., and Sheldon, M. (1987). A new anti-p53 monoclonal antibody, previously reported to be directed against the large T antigen of simian virus 40. Oncogene 1, 453-5.

136. Minden, A., and Karin, M. (1997). Regulation and function of the JNK subgroup of MAP kinases. Biochim Biophys Acta 1333, F85-104.

137. Minden, A., Lin, A., Claret, F. X., Abo, A., and Karin, M. (1995). Selective activation of the INK signaling cascade and c-Jun transcriptional activity by the small GTPases Rac and Cdc42Hs. Cell 81, 1147-57.

138. Minden, A., Lin, A., McMahon, M., Lange-Carter, C., Derijard, B., Davis, R. J., Johnson, G. L., and Karin, M. (1994). Differential activation of ERK and JNK mitogen-activated protein kinases by Raf-1 andMEKK. Science 266, 1719-23.

139. Missero C., C. F. Di, H. Kiyokawa, A. Koff & G. P. Dotto: The absence of p21Cipl/WAFl alters keratinocyte growth and differentiation and promotes ras-tumor progression. Genes Dev 10, 3065-3075 (1996)

140. Miyashita, T., and Reed, J. C. (1995). Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell 80, 293-9.

141. Miyashita, T., Harigai, M., Hanada, M., and Reed, J. C. (1994). Identification of a p53-dependent negative response element in the bcl- 2 gene. Cancer Res 54, 3131-5.

142. Momand, J., Zambetti, G. P., Olson, D. C., George, D., and Levine, A. J. (1992). The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation. Cell 69, 1237-45.

143. Montaner, S., Ramos, A., Perona, R., Esteve, P., Carnero, A., and Lacal, J. C. (1995). Overexpression of PKC zeta in NIH3T3 cells does not induce cell transformation nor tumorigenicity and does not alter NF kappa B activity. Oncogene 10, 2213-20.

144. Morgan, S. E., and Kastan, M. B. (1997). p53 and ATM: cell cycle, cell death, and cancer. Adv Cancer Res 71, 1-25.

145. Morgenstern, J.P., Land, H. (1990) Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors withmultiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic Acids Res 18, 3587-96.

146. Mosner, J., Mummenbrauer, T., Bauer, C., Sczakiel, G., Grosse, F., and Deppert, W. (1995). Negative feedback regulation of wild-type p53 biosynthesis. Embo J 14, 4442-9.

147. Mumberg D., Haas K., Moroy T., Niedenthal R., Hegemann J.H.H., Funk M., Muller R. Uncoupling of DNA replication and cell cycle progression by human cyclin E. Oncogene, 1996, 13, 2493-2497.

148. Mummenbrauer, T., Janus, F., Muller, B., Wiesmuller, L., Deppert, W., and Grosse, F. (1996). p53 Protein exhibits 3'-to-5' exonuclease activity. Cell 85, 1089-99.

149. Murphy, M., Hinman, A., and Levine, A. J. (1996). Wild-type p53 negatively regulates the expression of a microtubule- associated protein. Genes Dev 10, 2971-80.

150. Nakanishi, H., Brewer, K. A., and Exton, J. H. (1993). Activation of the zeta isozyme of protein kinase C by phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate. J Biol Chem 268, 13-6.

151. Nikiforov, M. A., Hagen, K., Ossovskaya, V. S., Connor, T. M., Lowe, S. W., Deichman, G. I., and Gudkov, A. V. (1996). p53 modulation of anchorage independent growth and experimental metastasis. Oncogene 13, 1709-19.

152. Nimnual A. S., B. A. Yatsula & D. Bar-Sagi: Coupling of Ras and Rac guanosine triphosphatases through the Ras exchanger Sos. Science 279, 560-563 (1998)

153. Notterman D, Young S, Wainger B, Levine AJ. (1998) Prevention of mammalian DNA reduplication, following the release from the mitotic spindle checkpoint, requires p53 protein, but not p53-mediated transcriptional activity. Oncogene 17, 2743-2751.

154. O'Brien, K, Otto, K., and Rao, R. N. (1997). Construction and characterization of a one-plasmid system for the controlled expression of genes in mammalian cells by tetracycline. Gene 184, 115-20.

155. Okamoto, K., and Beach, D. (1994). Cyclin G is a transcriptional target of the p53 tumor suppressor protein. Embo J 13, 4816-22.

156. Okasaki K. and Sagata N. MAP kinase activation is essential for oncogenic transformation of NIH 3T3 cells by Mos. Oncogene, 1995, 10, 1149-1157.

157. Olson M. F. A. Ashworth & A. Hall: An essential role for Rho, Rac and Cdc42 GTPases in cell cycle progression through Gl. Science 269, 1270-1272 (1995)

158. Oltvai, Z. N, and Korsmeyer, S. J. (1994). Checkpoints of dueling dimers foil death wishes (comment. Cell 79, 189-92.

159. Oren, M., Reich, N. C., and Levine, A. J. (1982). Regulation of the cellular p53 tumor antigen in teratocarcinoma cells and their differentiated progeny. Mol Cell Biol 2, 443-9.

160. Ozkinay C., Mitelman F. A simple trypsin-Giemsa technique producing simultaneous G- and C-banding in human chromosomes. Hereditas, 1979, v.90, p. 1-4.

161. Palmero, I., Pantoja, C., and Serrano, M. (1998). pl9ARF links the tumour suppressor p53 to Ras. Nature 395, 125-6.

162. Parada L.F., Land H., Weinberg R.A., Wolf D., Rotter D. Cooperation between gene encoding p53 tumor antigen and ras in cellular transformation. Nature, 1984, v.312, p.649 651.

163. Polyak, K., Xia, Y., Zweier, J. L., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. (1997). A model for p53-induced apoptosis (see comments. Nature 389, 300-5.

164. Prendergast G. C., R. Khosravi-Far, P. A. Solski, H. Kurzawa, P. F. Lebowitz & C. J. Der: Critical role of Rho in cell transformation by oncogenic Ras. Oncogene 10, 2289-2296 (1995)

165. Prisco, M., Hongo, A., Rizzo, M. G, Sacchi, A., and Baserga, R. (1997). The insulin-like growth factor I receptor as a physiologically relevant target of p53 in apoptosis caused by interleukin-3 withdrawal. Mol Cell Biol 17, 1084-92.

166. Prives, C. (1998). Signaling to p53: breaking the MDM2-p53 circuit. Cell 95, 5-8.

167. Pronk, G. J., and Bos, J. L. (1994). The role of p21ras in receptor tyrosine kinase signalling. Biochim Biophys Acta 1198, 131-47.

168. Propst, F., and Vande Woude, G. F. (1985). Expression of c-mos proto-oncogene transcripts in mouse tissues. Nature 315, 516-8.

169. Qiu R. G., J. Chen, D. Kirn, F. McCormick & M. Symons: An essential role for Ras in Ras transformation. Nature 374, 457-459 (1995)

170. Qiu R. G., J. Chen, F. McCormick & M. Symons: A role for Rho in Ras transformation. Proc Natl Acad Sci USA 92, 6443-6453 (1995)

171. Raingeaud, J., Whitmarsh, A. J., Barrett, T., Derijard, B., and Davis, R. J. (1996). MKK3- and MKK6-regulated gene expression is mediated by the p38 mitogen- activated protein kinase signal transduction pathway. Mol Cell Biol 16, 1247-55.

172. Ravi, R., Mookerjee, B., van Hensbergen, Y., Bedi, G. C., Giordano, A., El-Deiry, W. S., Fuchs, E. J., and Bedi, A. (1998). p53-mediated repression of nuclear factor-kappaB RelA via the transcriptional integrator p300. Cancer Res 58, 4531-6.

173. Raycroft, L., Wu, H. Y., and Lozano, G. (1990), Transcriptional activation by wild-type but not transforming mutants of the p53 anti-oncogene. Science 249, 1049-51.

174. Reed, M., Woelker, B., Wang, P., Wang, Y., Anderson, M. E., and Tegtmeyer, P. (1995). The C-terminal domain of p53 recognizes DNA damaged by ionizing radiation. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 9455-9.

175. Reich, N. C., Oren, M., and Levine, A. J. (1983). Two distinct mechanisms regulate the levels of a cellular tumor antigen, p53. Mol Cell Biol 3, 2143-50.

176. Reisman, D., Elkind, N. B., Roy, B., Beamon, J., and Rotter, V. (1993). c-Myc trans-activates the p53 promoter through a required downstream CACGTG motif. Cell Growth Differ 4, 57-65.

177. Reuter, C.W., Catling, A.D., Jelinek, T., Weber, M.J. (1995) Biochemical analysis of MEK activation in NIH3T3 fibroblasts. Identification of B-Raf and other activators. J Biol Chem 270, 7644-55.

178. Ridley, A. J. (1994). Membrane ruffling and signal transduction. Bioessays 16, 321-7.

179. Robertson, K. D., and Jones, P. A. (1998). The human ARF cell cycle regulatory gene promoter is a CpG island which can be silenced by DNA methylation and down-regulated by wild-type p53. Mol Cell Biol 18, 6457-73.

180. Rodenhuis S. Ras and human tumors. Semin. Cancer Biol.,1992, 3, 241 + 247.

181. Rodriguez-Viciana, P., Warne, P. H., Vanhaesebroeck, B., Waterfield, M. D., and Downward, J. (1996). Activation of phosphoinositide 3-kinase by interaction with Ras and by point mutation. Embo J 15, 2442-51.

182. Rotter, V., Friedman, H., Katz, A., Zerivitz, K., and Wolf, D. (1983). Variation in antigenic determinants of p53 transformation-related protein obtained from various species. J Immunol 131, 329-33.

183. Roux P., C. Gauthier-Rouviere, S. Doucet-Brutin & P. Fort. (1997) The small GTPases Cdc42Hs, Racl and RhoG delineate Raf-independent pathways that cooperate to transform NEH3T3 cells. Curr Biol 7, 629-637.

184. Ruas M, Peters G. (1998) The pl6INK4a/CDKN2A tumor suppressor and its relatives. Biochim Biophys Acta 1378, F115-77.

185. Ruley H. E. (1983) Adenovirus early region 1A enables viral and cellular transforming genes to transform primary cells in culture. Nature 304, 602-606.

186. Ruley H.E. (1990) Transforming collaborations between ras and nuclear oncogenes. Cancer Cells 2, 258-268.

187. S, A. M., and Hawkins, R. E. (1998). Efficient transgene regulation from a single tetracycline-controlled positive feedback regulatory system. Gene Ther 5, 76-84.

188. Sabapathy K, Klemm M, Jaenisch R, Wagner EF. (1997) Regulation of ES cell differentiation by functional and conformational modulation of p53. EMBO J 16, 6217-6229.

189. Sabbatini P, Lin J, Levine AJ, White E. (1995) Essential role for p53-mediated transcription in El A-induced apoptosis. Genes Dev 9, 2184-2192.

190. Sablina, A. A., Ilyinskaya, G. V., Rubtsova, S. N, Agapova, L. S., Chumakov, P. M., and Kopnin, B. P. (1998). Activation of p53-mediated cell cycle checkpoint in response to micronuclei formation. J Cell Sci 111, 977-84.

191. Sakaguchi, K., Herrera, J. E., Saito, S., Miki, T., Bustin, M., Vassilev, A., Anderson, C. W., and Appella, E. (1998). DNA damage activates p53 through a phosphorylation-acetylation cascade. Genes Dev 12, 2831-41.

192. Sakamuro, D., Sabbatini, P., White, E., and Prendergast, G. C. (1997). The polyproline region of p53 is required to activate apoptosis but not growth arrest. Oncogene 15, 887-98.

193. Scheele J. S., J. M. Rhee & G. R. Boss: Determination of absolute amounts of GDP and GTP bound to Ras in mammalian cells: comparison of parental and Ras-overproducing NIH 3T3 fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA 92, 1097-1100 (1995)

194. Sedlacek Z, Kodet R, Seemanova E, Vodvarka P, Wilgenbus P, Mares J, Poustka A, Goetz P. (1998) Two Li-Fraumeni syndrome families with novel germline p53 mutations: loss of the wild-type p53 allele in only 50% of tumours. Br J Cancer 77, 1034-1039.

195. Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature 1993 Dec 16;366(6456):704-7

196. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., and Lowe, S. W. (1997). Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and pl6INK4a. Cell 88, 593-602.

197. Seto, E., Usheva, A., Zambetti, G. P., Momand, J., Horikoshi, N, Weinmann, R., Levine, A. J., and Shenk, T. (1992). Wild-type p53 binds to the TATA-binding protein and represses transcription. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 12028-32.

198. Shaulian, E., Haviv, I., Shaul, Y., and Oren, M. (1995). Transcriptional repression by the C-terminal domain of p53. Oncogene 10, 671-80.

199. Shaulsky, G., Ben-Ze'ev, A., and Rotter, V. (1990). Subcellular distribution of the p53 protein during the cell cycle ofBalb/c 3T3 cells. Oncogene 5, 1707-11.

200. Shaw P., Tardy S., Benito E., Obrador A., Costa G. (1991) Occurrence of Ki-ras and p53 mutations in primary colorectal tumors. Oncogene 6, 2121-2128.

201. Shaw, P., Freeman, J., Bovey, R., and Iggo, R. (1996). Regulation of specific DNA binding by p53: evidence for a role for O- glycosylation and charged residues at the carboxy-terminus. Oncogene 12, 921-30.

202. Sherr, C. J. (1998). Tumor surveillance via the ARF-p53 pathway. Genes Dev 12, 2984-91.

203. Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., and Prives, C. (1997). DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell 91, 325-34.

204. Shiloh, Y. (1997). Ataxia-telangiectasia and the Nijmegen breakage syndrome: related disorders but genes apart. Annu Rev Genet 31, 635-62.

205. Shockett, P., Difilippantonio, M., Hellman, N., and Schatz, D. G. (1995). A modified tetracycline-regulated system provides autoregulatory, inducible gene expression in cultured cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 6522-6.

206. Siliciano, J. D., Canman, C. E., Taya, Y., Sakaguchi, K., Appella, E., and Kastan, M. B. (1997). DNA damage induces phosphorylation of the amino terminus of p53. Genes Dev 11, 3471-81.

207. Souyri M, Koehne CF, O'Donnell PV, Aldrich TH, Furth ME, Fleissner E. (1987) Biological effects of a murine retrovirus carrying an activated N-ras gene of human origin. Virology 158, 69-78.

208. Stott, F. J., Bates, S., James, M. C., McConnell, B. B., Starborg, M., Brookes, S., Palmero, I., Ryan, K., Hara, E., Vousden, K. H., and Peters, G. (1998). The alternative product from the human

209. CDKN2A locus, pl4(ARF), participates in a regulatory feedback loop with p53 and MDM2. Embo J 17, 5001-14.

210. Sturzbecher, H. W., Brain, R., Addison, C., Rudge, K., Remm, M., Grimaldi, M., Keenan, E., and Jenkins, J. R. (1992). A C-terminal alpha-helix plus basic region motif is the major structural determinant of p53 tetramerization. Oncogene 7, 1513-23.

211. Su, Y. C., Han, J., Xu, S., Cobb, M., and Skolnik, E. Y. (1997). NIK is a new Ste20-related kinase that binds NCK and MEKK1 and activates the SAPK/JNK cascade via a conserved regulatory domain. Embo J 16, 1279-90.

212. Sun, X., Shimizu, H., and Yamamoto, K. (1995). Identification of a novel p53 promoter element involved in genotoxic stress-inducible p53 gene expression. Mol Cell Biol 15, 4489-96.

213. Tan, Y., Rouse, J., Zhang, A., Cariati, S., Cohen, P., and Comb, M. J. (1996). FGF and stress regulate CREB and ATF-1 via a pathway involving p38 MAP kinase and MAPKAP kinase-2. Embo J 15, 4629-42.

214. Tarunina, M., and Jenkins, J. R. (1993). Human p53 binds DNA as a protein homodimer but monomeric variants retain full transcription transactivation activity. Oncogene 8, 3165-73.

215. Thorburn, J., Frost, J. A., and Thorburn, A. (1994). Mitogen-activated protein kinases mediate changes in gene expression, but not cytoskeletal organization associated with cardiac muscle cell hypertrophy. J Cell Biol 126, 1565-72.

216. Thut, C. J., Chen, J. L., Klemm, R., and Tjian, R. (1995). p53 transcriptional activation mediated by coactivators TAFII40 and TAFII60. Science 267, 100-4.

217. Thut, C. J., Goodrich, J. A., and Tjian, R. (1997). Repression of p53-mediated transcription by MDM2: a dual mechanism. Genes Dev 11, 1974-86.

218. Tishler, R. B., Lamppu, D. M., Park, S., and Price, B. D. (1995). Microtubule-active drugs taxol, vinblastine, and nocodazole increase the levels of transcriptionally active p53. Cancer Res 55, 6021-5.

219. Topol, L. Z., and Blair, D. G. (1995). Activation of the mitogen-activated protein kinase cascade in response to the temperature inducible expression of v-mos kinase. Cell Growth Differ 6, 111927.

220. Truant, R., Xiao, H., Ingles, C. J., and Greenblatt, J. (1993). Direct interaction between the transcriptional activation domain of human p53 and the TATA box-binding protein. J Biol Chem 268, 2284-7.

221. Ulsh L. & T. Y. Shih: Metabolic turnover of human c-rasH p21 protein of EJ bladder carcinoma and its normal cellular and viral homologs. Mol Cell Biol 4, 1647-1652 (1984)

222. Umanoff H., W. Edelmann, A. Pellicer & R. Kucherlapati: The murine N-ras gene is not essential for development. Proc Natl Acad Sci USA 92, 1709-1713 (1995)

223. Urano, T., Emkey, R., and Feig, L. A. (1996). Ral-GTPases mediate a distinct downstream signaling pathway from Ras that facilitates cellular transformation. Embo J 15, 810-6.

224. Utrera, R., Collavin, L., Lazarevic, D., Delia, D., and Schneider, C. (1998). A novel p53-inducible gene coding for a microtubule-localized protein with G2-phase-specific expression. Embo J 17, 5015-25.

225. Van Meir, E. G., Polverini, P. J., Chazin, V. R., Su Huang, H. J., de Tribolet, N., and Cavenee, W. K. (1994). Release of an inhibitor of angiogenesis upon induction of wild type p53 expression in glioblastoma cells. Nat Genet 8, 171-6.

226. Venot, C., Maratrat, M., Sierra, V., Conseiller, E., and Debussche, L. (1999). Definition of a p53 transactivation function-deficient mutant and characterization of two independent p53 transactivation subdomains. Oncogene 18, 2405-10.

227. Waga, S., Hannon, G. J., Beach, D., and Stillman, B. (1994). The p21 inhibitor of cyclin-dependent kinases controls DNA replication by interaction with PCNA (see comments. Nature 369, 5748.

228. Waldman, T., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B. (1995). p21 is necessary for the p53-mediated G1 arrest in human cancer cells. Cancer Res 55, 5187-90.

229. Walker, K. K., and Levine, A. J. (1996). Identification of a novel p53 functional domain that is necessary for efficient growth suppression. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 15335-40.

230. Watsuji, T., Okamoto, Y., Emi, N., Katsuoka, Y., and Hagiwara, M. (1997). Controlled geneexpression with a reverse tetracycline-regulated retroviral vector (RTRV) system. Biochem

231. Biophys Res Commun 234, 769-73.

232. Weaver ZA, McCormack SJ, Liyanage M, du Manoir S, Coleman A, Schrock E, Dickson RB, Ried

233. T. (1999) A recurring pattern of chromosomal aberrations in mammary gland tumors of

234. MMTV-cmyc transgenic mice. Genes Chromosomes Cancer 25, 251-260.

235. Weinberg R.A. Oncogenes, antioncogenes, and the molecular bases of multistep carcinogenesis.

236. Cancer Res., 1989, 49, 3713-3721.

237. Weinberg WC, Azzoli CG, Chapman K, Levine AJ, Yuspa SH. (1995) p53-mediated transcriptionalactivity increases in differentiating epidermal keratinocytes in association with decreased p53protein. Oncogene 10, 2271-2279.

238. Weng, Q. P., Andrabi, K., Klippel, A., Kozlowski, M. T., Williams, L. T., and Avruch, J. (1995).

239. Phosphatidylinositol 3-kinase signals activation of p70 S6 kinase in situ through site-specificp70 phosphorylation. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 5744-8.

240. Westwick, J. K., Lambert, Q. T., Clark, G. J., Symons, M., Van Aelst, L., Pestell, R. G., and Der, C.

241. J. (1997). Rac regulation of transformation, gene expression, and actin organization by multiple,

242. PAK-independent pathways. Mol Cell Biol 17, 1324-35.

243. Whitacre, C. M., Hashimoto, H., Tsai, M. L, Chatterjee, S., Berger, S. J., and Berger, N. A. (1995). Involvement of NAD-poly(ADP-ribose) metabolism in p53 regulation and its consequences. Cancer Res 55, 3697-701.

244. White, M. A., Nicolette, C., Minden, A., Polverino, A., Van Aelst, L., Karin, M., and Wigler, M. H. (1995). Multiple Ras functions can contribute to mammalian cell transformation. Cell 80, 53341.

245. White, M. A., Vale, T., Camonis, J. H., Schaefer, E., and Wigler, M. H. (1996). A role for the Ral guanine nucleotide dissociation stimulator in mediating Ras-induced transformation. J Biol Chem 271, 16439-42.

246. Whitehead R.H., Macrae F.A., St. John D.J.B., Ma J. A colon cancer cell line (LIM1215) derived from a patient with inherited nonpolyposis colorectal cancer. J. Natl. Cancer Inst., 1985, 74, 759-765.

247. Woo, R. A., McLure, K. G., Lees-Miller, S. P., Rancourt, D. E., and Lee, P. W. (1998). DNA-dependent protein kinase acts upstream of p53 in response to DNA damage. Nature 394, 700-4.

248. Wright, J. D., Reuter, C. W., Weber, M. J., Catling, A. D., and Jelinek, T. (1995). An incomplete program of cellular tyrosine phosphorylations induced by kinase-defective epidermal growth factor receptors. J Biol Chem 270, 12085-93.

249. Wu, X., Bayle, J. H., Olson, D., and Levine, A. J. (1993). The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop. Genes Dev 7, 1126-32.

250. Xing J., D. D. Ginty & M. E. Greenberg: Coupling of the Ras-MAPK pathway to gene activation by RSK2, a growth factor-regulated CREB kinase. Science 273, 959-963 (1996)

251. Yan, M., Dai, T., Deak, J. C., Kyriakis, J. M., Zon, L. I., Woodgett, J. R., and Templeton, D. J. (1994). Activation of stress-activated protein kinase by MEKK1 phosphorylation of its activator SEK1. Nature 372, 798-800.

252. Yin, Y., Terauchi, Y., Solomon, G. G., Aizawa, S., Rangarajan, P. N., Yazaki, Y., Kadowaki, T., and Barrett, J. C. (1998). Involvement of p85 in p53-dependent apoptotic response to oxidative stress. Nature 391, 707-10.

253. Yu, C. L., Driggers, P., Barrera-Hernandez, G., Nunez, S. B., Segars, J. H., and Cheng, S. (1997). The tumor suppressor p53 is a negative regulator of estrogen receptor signaling pathways. Biochem Biophys Res Commun 239, 617-20.

254. Yuan, Z. M., Huang, Y., Whang, Y., Sawyers, C., Weichselbaum, R., Kharbanda, S., and Kufe, D. (1996). Role for c-Abl tyrosine kinase in growth arrest response to DNA damage. Nature 382, 272-4.

255. Zambetti G.P., Bargonetti J., Walker K., Prives C., Levine A.J. Wild-type p53 mediates positive regulation of gene expression through a specific DNA-sequence element. Genes Dev., 1992, 6, 1143-1152.

256. Zhan, Q., Antinore, M. J., Wang, X. W., Carrier, F., Smith, M. L., Harris, C. C., and Fornace, A. J., Jr. (1999). Association with Cdc2 and inhibition of Cdc2/Cyclin B1 kinase activity by the p53-regulated protein Gadd45. Oncogene 18, 2892-900.

257. Zhang, K., DeClue, J. E., Vass, W. C., Papageorge, A. G., McCormick, F., and Lowy, D. R. (1990). Suppression of c-ras transformation by GTPase-activating protein see comments. Nature 346, 754-6.