Изучение надмолекулярной организации и нанотехнологическое применение жгутиков Halobacterium salinarum при помощи методов модификации генов флагеллинов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Безносов, Сергей Николаевич

• Безносов, Сергей Николаевич
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Безносов, Сергей Николаевич

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Аппарат подвижности архей

1.1. Морфология и принцип функционирования жгутика архей

1.2. Субъединичный состав жгутиков

1.3. Ультраструктура нити жгутиков

1.4. Гены флагеллинов архей

1.4.1. Генная инженерия архей

1.4.2. Семейства жгутик-ассоциированных генов архей

1.5. Сборка жгутика архей

Глава 2. Использование биополимеров для создания наноматериалов

ЧАСТЬ II. МЕТОДИЧЕСКАЯ

Глава 3. Материалы и методы исследования

3.1. Химические реагенты и ферменты

3.2. Буферы и другие растворы, использованные в работе

3.3. Среды

3.4. Штаммы микроорганизмов

3.5. Плазмиды

3.6. Методы

3.6.1. Выделение плазмидной ДНК

3.6.2. Выделение хромосомной ДНК Н. salinarum

3.6.3. Полимеразная цепная реакция

3.6.4. Рестрикция ДНК

3.6.5. Электрофорез в геле агарозы

3.6.6. Очистка фрагментов ДНК

3.6.7. Дефосфорилирование и кинирование 5' -концов ДНК

3.6.8. Лигирование ДНК

3.6.9. Получение компетентных клеток E.coli

3.6.10. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК

3.6.11. Трансформация клеток Н. яаНпагит

3.6.12. Гибридизация по Саузерну

3.6.13. Выделение жгутиков

3.6.14. Электрофорез белков в ДСН-ПААГ

3.6.15. Иммуноблоттинг

3.6.16. Электронная микроскопия

3.6.17. Иммуно-электронная микроскопия

3.6.18. Эксперименты по связыванию ионов металлов и частиц коллоидного золота

3.6.19. Фрагментация жгутиков ультразвуком

3.6.20. Электрохимическое тестирование минерализованных жгутиков в качестве электродов

ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ М Глава 4. Получение и анализ штаммов Н. БаИпагит с делегированными флагеллиновыми генами

4.1. Плазмидные конструкции, использованные для получения штаммов Н. БаИпагит с делетированными флагеллиновыми генами

4.1.1. Плазмидные конструкции для делеции А- и В-флагеллиновых оперонов

4.1.2. Плазмидные конструкции для делеции по отдельности А1, и А2-флагеллиновых генов

4.1.3. Плазмидные конструкции для внесения отдельных В-флагеллиновых генов и их тандемов в бесфлагеллиновый штамм А^АА^В Н. БаИпагит

4.2. Получение штаммов Н.БаНпагит с делетированными флагеллиновыми генами

4.2.1. Получение штаммов А/?^А, А/7#Д AflgAAflgB, АА%А1А31%В и AflgA2AflgB Н. яаНпагит

4.2.2. Получение штаммов AflgAAjlgBlAflgB2, AflgAAflgB2AJlgBЗ, AflgAAflgBЗ и AflgAAflgB2 Н. БаИпагит

4.3. Анализ штаммов НлаНпагит с делетированными флагеллиновыми

генами

Глава 5. Метод направленной модификации флагеллинов Н. БаИпагит

5.1. Получение генетических конструкций и выбор места модификации

5.1.1. Получение плазмидной конструкции р№СА

5.1.2. Мутагенез плазмиды рЫХА

5.1.3. Получение плазмидной конструкции рК1ХРЪАОА1

5.1.4. Получение плазмидной конструкции рМХТЪАОА2

5.1.5. Получение плазмидной конструкции рЫХСоША2

5.1.6. Получение плазмидной конструкции р]МХВ

5.1.7. Получение плазмидной конструкции р№СРЬАОВ2

5.2. Получение и анализ штаммов с модификациями флагеллинов

5.3. Использование жгутиков архей для создания новых наноматериалов

5.3.1. Получение наноматериала на основе БЬАОА1 -модифицированных жгутиков Н. БаНпагит

5.3.2. Получение наноматериала на основе модифицированных жгутиков Н. БаНпагит и использование его для создания электрода для литий-ионного аккумулятора

5.3.3. Получение наноматериала на основе фрагментированных модифицированных жгутиков Н. ваНпагит и использование его для создания электрода для литий-ионного аккумулятора

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ДМСО - диметилсульфоксид

ДСН -додецилсульфат натрия

МБА->1,Ы - метиленбисакриламид

ПААГ - полиакриламидный гель

ПСА - персульфат аммония

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ТЕМЕД-1\[,]\[,1Ч,Н -тетраметилэтилендиамин

Трис - трис (гидроксиметил) аминометан

ЭДТА - этилендиамин тетраацетат

п.н. -пара нуклеотидов

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение надмолекулярной организации и нанотехнологическое применение жгутиков Halobacterium salinarum при помощи методов модификации генов флагеллинов»

ВВЕДЕНИЕ

Биологическая подвижность клеток - повсеместно распространенное явление среди представителей всех трех доменов живого: эукариот, бактерий, а также архей. Археи были выделены Карлом Вузом в отдельный таксономический домен на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 16S РНК различных организмов (Woese and Fox, 1977; Woese et al, 1990), дальнейшие исследования биохимических и генетических свойств архей подтвердили правильность такого разделения. К археям причисляют экстремальных галофилов, метаногенов, Thermoplasma, серозависимых термофилов и гипертермофилов. Сходство архей по ряду морфологических, биохимических и физиологических свойств с бактериями наблюдается одновременно с наличием таких черт, которые свойственны эукариотам. Вместе с тем археям присущи уникальные свойства, характерные лишь для представителей данной группы (Воробьева, 2007). В частности, работы по изучению жгутиков архей опровергли первоначальное предположение о том, что их аппарат подвижности аналогичен бактериальному. Жгутики архей, как и жгутики бактерий состоят из базального тела (мотора) и выходящего на поверхность длинного вращающегося нитеобразного выроста (филамента). Базальное тело и филамент как правило соединены между собой переходной изогнутой структурой (крюком). В литературе термин «жгутик» часто используется для обозначения только филамента. Первое наиболее существенное отличие жгутиков архей от бактериальных было обнаружено по результатам определения первичной структуры белков жгутика - флагеллинов Halobacterium salinarum (ранее Halobacterium halobium). Было продемонстрировано отсутствие гомологии с флагеллинами бактерий (Gerl and Sumper, 1988). В последующих экспериментах было установлено, что жгутики архей, как правило, являются мультисубъединичными, то есть состоят из нескольких типов флагеллинов. Также у архей сборка жгутика осуществляется по механизму, принципиально отличающемуся от

бактериального, а флагеллины архей имеют сигнальные последовательности и чаще бактериальных подвергаются посттрансляционным модификациям. Нет архейных гомологов и у других белков, участвующих в сборке бактериального жгутика. Кроме того, была обнаружена гомология флагеллинов архей с белками бактериальных пилей 4-го типа, а также белков, предположительно включенных в синтез жгутиков, с белками системы синтеза пилей 4-го типа (Jarrell et al., 1996b; Thomas et al., 2001; Bardy et al., 2004; Jarrell et al., 2013).

Накопленные факты позволяют отнести жгутики архей к уникальной структуре биологической подвижности, отличной от бактериального жгутика (Jarrell et al, 1996b; Thomas et al., 2001; Jarrell and McBride, 2008). Для жгутиков архей даже был предложен отдельный термин «архелла» (archaella) (Jarell and Albers, 2012). Однако полного представления о процессе сборки жгутика архей и механизме образования его спиральной структуры на сегодняшний момент нет, тогда как надмолекулярная организация филамента жгутиков бактерий является хорошо изученной (по крайней мере, для энтеробактерий) и характеризуется тем, что спиральный филамент собирается только из одного флагеллина. Бактериальный флагеллин способен находиться в двух (L- и R-) конформационных состояниях и формировать полимерные нити толщиной в одну молекулу флагеллина -протофиламенты. Такие протофиламенты, построенные из флагеллина только в L- или R-конформации, при одинаковом количестве субъединиц имеют небольшое различие в длине. При объединении таких протофиламентов в филамент жгутика в филаменте возникают силы скручивания, придающие ему спиральную форму (Calladine, 1978). Работы по нокауту генов флагеллицов ограниченного числа видов архей позволили прийти к заключению, что именно мультикомпонентный состав жгутика обеспечивает его спиральную форму. У галофильного археона H. salinarum филамент жгутика состоит из пяти флагеллинов, обозначаемых как Al, А2, В1, В2 и ВЗ (Gerl and Sumper, 1988; Gerl et al, 1989). Им соответствуют 5

генов {flgAl, А2, В1, В2, ВЗ), находящихся в двух локусах flgA и flgB. Путем инактивации генов флагеллинов Н. БаНпагит (Тагаэоу & а1., 2000) было показано, что для формирования спирального филамента необходимо наличие обоих А-флагеллинов. Вопрос о роли В-флагеллинов остался открытым.

Несмотря на перечисленные выше фундаментальные отличия жгутиков архей от бактериальных, и в том, и в другом случае это полимерные структуры спиральной формы и, что особенно удивительно, обладающие способностью совершать полиморфные переходы при изменившихся условиях среды. Очевидно, что принципы формирования надмолекулярных структур в этих двух случаях не могут быть идентичными, и необходимо изучить как это происходит у Н. БаНпагит. На первом этапе необходимо определить каким образом пять типов субъединиц флагеллина Н. БаНпагит распределены в жгутике, что и явилось целью диссертационной работы. Для этого получались и анализировались мутантные штаммы Н. БаНпагит с делециями различных генов флагеллинов для последующего наблюдения за изменениями, произошедшими в надмолекулярной организации филамента жгутика. Полученные данные позволили уточнить роль А-флагеллиновых генов, а также показать возможную роль В-флагеллиновых генов, однако, не позволили составить окончательное представление о формировании надмолекулярной структуры жгутика Н. БаНпагит. Поэтому для помощи в понимании принципов надмолекулярной организации жгутиков Н. БаНпагит мы решили осуществить направленную модификацию флагеллинов, которая позволяла бы идентифицировать и определять расположение отдельных флагеллинов в жгутике с полным набором белков.

Для этого потребовалась разработка метода направленной модификации флагеллинов применительно для Н. БаНпагит. Поскольку данные по пространственной структуре субъединиц жгутиков архей отсутствуют, для определения участков полипептидной цепи, выходящих на поверхность жгутика и пригодных для введения необходимых пептидных вставок,

потребовался другой подход. В ходе данной работы такой подход был найден и проверен экспериментально. На примере трех А1-, А2- и В2-флагеллинов Н. salinarum показано, что метод модификации может быть использован для направленного выведения заданных антигенных детерминант на поверхность жгутика без утраты его функциональности с возможностью последующей локализации метки на поверхности жгутика. Разработанный метод открывает возможности по прямому исследованию состава жгутиков различных архей.

В последние несколько лет стремительно увеличивается количество публикаций по использованию в нанотехнологических целях надмолекулярных белковых структур, таких как жгутики, пили и вирусы бактерий. Данное направление исследований признается очень перспективным и в настоящее время бурно развивается (Nam et al., 2006; Audette and Hazes, 2007; Gazit, 2007; Kumara et al2007a; Yu et al., 2007; Атабеков И.Г. 2008; Lee et al., 2009). В основе этих работ лежит идея использования биополимеров в качестве матриц для выведения на поверхность составляющих биополимер субъединиц некой дополнительной петли пептидной природы, обладающей свойством связывания заданного лиганда. Таким образом достигается упорядоченное размещение заданного лиганда на биополимерной матрице. После проведения необходимых химических реакций могут быть получены наноструктурированные материалы, которые будут обладать заданными (проводящими, полупроводниковыми, магнитными, каталитическими) свойствами. Мы полагаем, что жгутики архей могут иметь определенные преимущества, как перед бактериальными аналогами, так и перед вирусными частицами для использования в данных целях. Это обусловлено, с одной стороны экстремальным характером условий обитания большинства архей, с другой стороны мультикомпонентностью их жгутиков, дающей возможность получения полифункционального материала. Если ранее жгутики архей не использовались в нанотехнологических целях, из-за отсутствия данных по пространственной структуре субъединиц жгутиков, то с разработкой

представленного в диссертации метода модификации открывается возможность направленного выведения заданных связывающих групп на поверхность жгутиков архей и, следовательно, созданию нового класса наноматериалов с различными свойствами. При этом синтез таких материалов может быть осуществлен при невысоких температурах и без использования большого числа стадий, дорогостоящих оборудования и реагентов. Также подобные материалы должны быть более безопасны для окружающей среды.

Метод направленной модификации флагеллинов архей был использован для получения новых наноматериалов, имеющих практическое значение. На основе модифицированных жгутиков Н. яаИпагит был получен наноструктурированный материал для анода литий-ионного аккумулятора, показывающий улучшенные характеристики.

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Аппарат подвижности архей 1.1. Морфология и принцип функционирования жгутика архей

Жгутики архей, как и жгутики бактерий, представляют собой длинные вращающиеся нитеобразные выросты на поверхности клеток (Macnab, 1992; Воробьева, 2007). Для большинства видов архей жгутики собираются на логарифмической стадии роста клеток, при этом их расположение является лофотрихиальным, но возможно и амфитрихиальное расположение, как у Halobacterium salinarum (на стационарной стадии) и Methanospirillum hungatei (на всех стадиях роста (Southam et al., 1990)). Отдельный жгутик Н. salinarum (рис. 1) выглядит как правозакрученная спиральная нить длиной 4 — 10 мкм и толщиной около 10 нм (в сравнении с диаметром 20 нм или больше у изученных жгутиков бактерий (Macnab, 1999)). При согласованном вращении спиральных нитей в пучке создается гидродинамическое усилие, которое толкает клетку вперед, если все нити пучка вращаются по часовой стрелке, и тянет в обратном направлении при вращении против часовой стрелки, что было показано для Н. salinarum (Alam and Oesterhelt, 1984). Скорость движения при этом составляет 2-3 мкм/сек, что заметно уступает скорости E.coli (20 мкм/сек) (Marwan et al., 1991). У Н. salinarum также обнаружено явление полиморфизма жгутиков при изменении рН и наличие в культуральной среде свободных жгутиков, образующих агрегаты из более чем 200 нитей, так называемые "super-flagella" (Alam and Oesterhelt, 1987). При изменении рН от 2,5 (при этом наблюдаются прямые формы "superflagella") до щелочных значений рН (10,5) возникали курчавые и кольцевые формы.

Рис. 1. Электронно-микроскопическое изображение клетки Н. яаИпагит со жгутиками. Негативное контрастирование уранил ацетатом. Масштабная линейка - 300 нм.

Структуры, соответствующие крюку жгутиков бактерий, у архей слабо детерминированы и идентифицируются с помощью электронной микроскопии только как утолщение нити, локализованное вблизи конца жгутика при окрашивании уранилацетатом. Лучшее разрешение было получено при окрашивании фосфовольфрамовой кислотой, что позволило детектировать область крюка у Metanococcus voltae в 2 раза превосходящую по длине крюк бактерии Salmonella typhimurium (55нм) (Thomas et al., 2001). Сообщалось также о вариабельности длины области крюка у Metanococcus thermolithotrophicus от 72 до 265 нм, что не характерно для бактерий (Cruden étal, 1989).

Базальная структура жгутиков архей, подобная бактериальной, была обнаружена при электронно-микроскопических исследованиях образцов, полученных методом разделения фаз с помощью детергента Triton Х-114, солюбилизацией целых клеток или мембранных фракций, несущих жгутики и обработанных детергентом Triton Х-100. Она описывается как структура, представляющая собой (у M. hungatei (Kalmokoff et al, 1988) и y M termolithotrophicus (Cruden et al, 1989)) пару колец, соединенных стержнем, сходная с таковой у Грамположительных бактерий. Кроме того, с использованием тауродиоксихолата были получены жгутки, прикрепленные к так называемой полярной "сар"-структуре у H.salinarum (Kupper et al., 1994). На срезах клеток ей предположительно соответствовала дисковидная пластинчатая структура (ДПС), обнаруженная Бакеевой с сотр. в 1992 году. Детальное исследование срезов клеток четко показывает, что жгутики проходят через цитоплазматическую мембрану (ЦМ) и связываются своими основаниями в сложную структуру (Сперанский и др., 1996; Метлина, 2001, 2004; Киреев и др., 2006). Эта структура выглядит как электронноплотная линия длиной до 250-300 нм и располагается в основании пучка жгутиков параллельно ЦМ на расстоянии 20 нм (рис. 2А). В серии экспериментов по фиксации препаратов клеток перманганатом калия и экстракции липидов метанол-хлороформом была показана мембранная природа ДПС, а обработка

клеток пониженными концентрациями №С1 позволила обнаружить тонкие (3-5 нм) нитевидные структуры, связывающие ДПС с ЦМ. Кроме того, по обе стороны от ДПС наблюдаются так называемые "полярные органеллы", напоминающие по структуре ДПС и имеющие мембранное строение, но не связанные со жгутиковой подвижностью (Метлина, 2004; Сперанский и др., 2008). На основе полученных изображений была составлена общая принципиальная схема организации пучков жгутиков в примембранном пространстве (рис. 2Б). Необходимость ДПС следует из принципиально иного строения клеточных стенок архей (только один белковый слой), толщины которых вместе с ЦМ было бы недостаточно для закрепления сложного комплекса моторов жгутиков, образующих пучок.

Рис. 2. А. Электронно-микроскопическая фотография ультратонкого среза клетки H. salinarium. Жирная стрелка указывает на ДПС, тонкие стрелки - на полярные органеллы (Метлина, 2004). Масштабная линейка -100 nm. Б. Схема полюса клетки Н. salinarium с ДПС. Обозначения: F -жгутик (flagellum), CW - клеточная стенка (cell wall), РМ -цитоплазматическая мембрана (plasma membrane), DLS - ДПС (discoid lamellar structure), PO - полярная органелла (polar organelle).

Усилия ряда лабораторий по выделению жгутиковых базальных структур до настоящего времени кажутся малоуспешными. Эксперименты, проводимые в этом направлении, осложнены высокой нестабильностью данных комплексов вне мембраны, то есть вне специфического окружения, характерного для нормального формирования и функционирования мотора жгутика (Метлина, 2004; Bardy et al., 2004). Детальная структура базального тела по полученным препаратам пока не может быть построена, как и остается неясным механизм функционирования мотора, вращающего жгутик (Bardy et al., 2004). Анализ количественных параметров вращения архейного жгутика в дополнение к данным о полном отсутствии гомологии последовательностей бактериальных моторных белков с архейными строго указывает на фундаментальные различия в принципе функционирования бактериальных и архейных жгутиковых моторов (Nutsch et al., 2005). Показано, что сборка и вращение жгутика археона Sulfolobus acidocaldarius происходит за счет расщепления АТФ белком Fiai — АТФ-азой, функционирующей в виде гексамера (Ghosh et al., 2011; Reindl et al., 2013). Данная АТФ-аза является составной частью мотора жгутика, и у S. acidocaldarius с гексамером Fiai взаимодействет олигомерная кольцеобразная структура из белка FlaX (Banerjee et al., 2013). Предполагается, что данная структура может являться статичной частью мотора жгутика архей и передавать вращательное усилие на филамент жгутика. При сборке и вращении жгутика архей задействованы сходные механизмы для функционирования бактериальных пилей 4 типа (Lassak et al., 2012; Shahapure et al., 2014).

1.2. Субъединичный состав жгутиков

Особенностью жгутиков архей является многокомпонентный состав, причем в состав филамента жгутика входят только флагеллины. Размер флагеллинов у разных архей в большинстве случаев составляет около 200 аминокислотных остатков, что соответствует молекулярной массе около 20

кДа, хотя имеются примеры флагеллинов с массой до 60 кДа. В пределах же одного вида субъединичный состав жгутика часто характеризуется наличием нескольких незначительно различающихся флагеллинов-паралогов, например, как у H. salinarum, пяти флагеллинов, обозначаемых как Al, А2, В1, В2 и ВЗ (Gerl and Sumper, 1988; Gerl et al, 1989). Им соответствуют 5 генов (jlaAl, А2, Bl, В2, ВЗ) с предполагаемыми молекулярными массами их продуктов, согласно нуклеотидным последовательностям, 20,4, 20,4, 20,5, 20,6 и 20,6 кДа. При электрофоретическом разделении в ДСН-ПААГ данные флагеллины мигрируют как белки с большими молекулярными массами, чем это рассчитано по нуклеотидной последовательности, и в геле обнаруживаются три основные полосы, соответствующие молекулярным массам 26, 30 и 36 кДа с «лестницей» минорных подполос (Alam and Oesterhelt, 1984). Низкая электрофоретическая подвижность флагеллинов в геле обусловлена, по-видимому, большим количеством отрицательно заряженных аминокислот и посттрансляционными модификациями. Для Н. salinarum, M. hungatei это гликозилирование по N-типу (N-гликозидная связь с аспарагином через глюкозу), свойственное белкам клеточной стенки (Faguy et al., 1996; Wieland et al., 1985). Такой же тип гликозилирования описан для M. voltae и Methanococcus maripaludis (Voisin et al., 2005; Jones et al., 2012; Ding et al., 2013). Помимо этого, присоединенные олигосахара могут сульфатироваться (Wieland et al., 1985). Флагеллины модифицируются подобно поверхностным белкам S-слоя гликозильными трансферазами -продуктами генов семества agi (archaeal glycosilation). После синтеза трансферазами гликановой цепи у M.voltae олигосахаридтрансферазный гомолог STT3 (aglB) принимает участие в переносе гликана на флагеллины и белки S-слоя (Chaban et al., 2006b). Установлено, что гликозилирование по N-типу флагеллинов M. voltae критически важно для формирования стабильного жгутика (Tripepi et al., 2012). Гликозилирование флагеллинов у H. salinarum происходит на внешней поверхности клеточной стенки и может быть ингибировано отсутствием ионов Mg в питательной среде (Sumper,

1987). Но даже в этом случае молекулярная масса флагеллинов по результатам электрофореза в ПААГ без или в присутствии ДСН не уменьшалась до масс, вычисленных по генам. Это могло быть обусловлено либо наличием дополнительных посттрансляционных модификаций (Gerl and Sumper, 1988), либо пониженной способностью флагеллинов связывать ДСН, характерной для кислых белков (Matagne et al., 1991). Наличие посттрансляционных модификаций, по всей видимости, очень важно в формировании правильной и стабильной структуры жгутика архей при экстремальных значениях солености, температуры, рН (Костюкова и др., 1996; Thomas et al., 2001; Bardy et al., 2004; Chaban et al., 2006a; Logan, 2006; Ng et al., 2006; Jarrel et al., 2010, 2013).

1.3. Ультраструктура нити жгутиков

Понижение концентрации NaCl в образце жгутиков Natrialba magadii и Natronobacterium (Natronomonas) pharaonis в пять раз, т.е. до 5 %, вызывало образование нитевидных структур меньшего диаметра (Fedorov et al., 1994; Пятибратов и др., 1996). Последующая обработка их протеазами приводила к появлению так называемых протофиламентов. В случае Natrialba magadii с помощью иммуно-электронной микроскопии было продемонстрировано наличие двух типов протофиламентов, отличающихся по субъединичному составу (Pyatibratov et al., 2002). Для N. pharaonis уменьшение толщины жгутиков в таком же эксперименте составляло примерную разницу в 2 раза в сравнении с интактными. Электронно-микроскопические исследования свидетельствуют о сохранении нитевидной структуры даже при ограниченном протеолизе (Пятибратов и др., 1996). На жгутиках N. pharaonis, N. magadii и Haloarcula marismortui было показано, что наиболее критичной для формирования полимерной структуры филаментов является часть белка, которая соответствует N-концевой последовательности, а С-концевая и центральная части молекул флагеллина могут быть отделены от полимеров в результате ограниченного протеолиза (Пятибратов и др., 1996;

Pyatibratov et al., 2002; Сюткин и др., 2012; Syutkin et al., 2014). Была продемонстрирована диссоциация жгутиков при добавлении неионного детергента Triton Х-100 (с конечной концентрацией 0,3%) в растворе, содержащем 15% NaCl. Однако третичная структура флагеллинов, исходя из кривых плавления, сохранялась, что позволило сделать вывод об определяющей роли гидрофобных взаимодействий в образовании полимерной нити жгутика (Пятибратов и др., 1996).

Определенные успехи по изучению ультраструктуры жгутиков были достигнуты Трахтенбергом с сотр. при анализе распределения электронных плотностей, полученных с замороженных препаратов жгутиков H. salinarum. Трехмерная картина с разрешением в 19А позволила разглядеть в структуре жгутика 3 протяженных закрученных относительно друг друга ряда субъединиц флагеллина (Cohen-Krausz and Trachtenberg, 2002). Подобное строение сходно с таковым у бактериальных пилей 4-го типа, что вместе с наличием гомологии архейных флагеллинов с пилинами, указывает на общее эволюционное происхождение (Thomas et al., 2001; Bardy et al., 2003; Ng et al., 2006). В дальнейшей работе разрешение этого метода - так называемый "iterative helical real space reconstruction method" было улучшено до 10-15A, что позволило четко подтвердить ранее предполагаемый вариант формирования полимерной структуры жгутика за счет N-концевых гидрофобных спиралей флагеллина аналогично постройке пилей 4-го типа (Trachtenberg et al., 2005; Trachtenberg and Cohen-Krausz, 2006). Аналогичные данные были получены также на жгутиках Sulfolobus shibatae (Cohen-Krausz and Trachtenberg, 2008).

1.4. Гены флагеллинов архей 1.4.1. Генная инженерия архей

Геномы архей, несмотря на специфическую организацию, характеризуется рядом свойств, характерных и для бактерий, и для эукариот (Olsen and Woese, 1997). У архей, также как и у бактерий, имеется

специфический набор экстрахромосомных генетических элементов: плазмид и фагов (Zillig et al., 1996). Существуют подвижные генетические элементы, вызывающие нестабильность генотипа и фенотипа. Вместе с тем, организация генома архей проявляет как множество свойств, переходных между бактериями и эукариотами, так и сугубо специфических (Прангишвили, 1989; Воробьева, 2007). Известно, что у архей хромосомальная ДНК является гистон-ассоциированной и образующей нуклеосомоподобные структуры (Reeve, 2003). Изучение организации хромосомы термофильных архей Sulfolobus acidocaldarius и Sulfolobus solfataricus с помощью фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии показало, что ДНК является высоко организованной на стадии экспоненциального роста клеток, тогда как в стационарной фазе ДНК разупорядочена и распределена по всему объему клетки (Poplawski and Bernander, 1997). При этом клетки стационарной фазы содержали две хромосомы, и авторы относят данное наблюдение еще к одной особенности архей.

Анализ секвенированных геномов различных видов архей (на сегодняшний момент имеются полные последовательности хромосом около 200 видов) и совокупность предварительных биохимических исследований формируют мнение, что вероятно архей используют для удвоения хромосомы репликативный аппарат, подобный упрощенной версии аппарата репликации эукариот (Böhlke et al., 2002). Общее расположение белков репликации в репликационной вилке у архей сходно именно с эукариотами, несмотря на то, что процесс происходит в прокариотической клетке. С эукариотами архей сближает и то, что в их геноме, сопоставимом по размеру с бактериальным, может быть более одной точек начала репликации. Например, в геноме Halobacterium NRC-1 они были обнаружены в двух местах (R. Zhang and С. Zhang, 2003). Несмотря на то, что в ходе транскрипции у архей образуются полицистронные мРНК, изучение этого процесса в археях показало, что их базальный транскрипционный аппарат

соответствует коровым компонентам аппарата эукариотической РНК-полимеразы 2 (Bell and Jackson, 2001). Отсюда следует вывод, что механизмы воспроизведения и реализации генетической информации в клетках архей все-таки значительно ближе к эукариотическим, нежели к бактериальным, хотя и имеют множество существенных отличий от тех и от других. Тем не менее, для архей характерен крайне высокий уровень рекомбинации и непостоянства генома, также отмечен горизонтальный обмен генами архей и бактерий (Морозова, 2005). Это позволяет археям существовать не только в экстремальных условиях, но, по самым последним данным, встречаться в куда более обычных для прокариот местах обитания и конкурировать с бактериальными популяциями (Chaban et al., 2006а).

Ряд особенностей можно отметить и в организации природных плазмид архей на примере галофилов. Показано, что одни виды плазмид крайне неустойчивы и постоянно претерпевают перестройки, изменяющие размер и состав плазмид за счет внедрения мобильных генетических элементов. Другие же плазмиды, наоборот, характеризуются устойчивостью, что связано, по всей видимости, со спецификой организации клеточной ДНК в целом (Каграманова, 1996). Описано уникальное явление сосуществования очень схожих плазмид в пределах одной клетки. Из чего был сделан вывод, что приведенные плазмидные варианты либо являются совместимыми, либо сегрегации препятствуют процессы, направленные на поддержание таких наборов, например, постоянный обмен плазмидами в культуре клеток (Каграманова, 1996).

У архей обнаружены все три типа переноса генетической информации: посредством трансформации, трансдукции и конъюгации (Sowers and Schreier, 1999). Наибольшей практической ценностью для изменения генетических свойств и изучения структуры и экспрессии генов архей обладает метод трансформации. Впервые он был применен Кляйном в 1987 году на Haloferax volcanii и использован далее для трансформации других близкородственных видов (Cline et al., 1989). Использование

высокоэффективных методов трансформации и создание векторных систем архей на основе их природных плазмид методами генной инженерии позволили исследовать генетику и молекулярную биологию архей и направленно получать новые штаммы (Holmes et al., 1991; Каграманова и др., 1992). Однако ограниченный набор селективных маркеров устойчивости к антибиотикам побуждает исследователей к поиску новых систем детекции генетических изменений в клетках архей. В 1997 году в лаборатории Майкла Даял-Смита был клонирован и секвенирован ген галофильной ß-галактозидазы (bgaH) из Haloferax alicantei (Holmes et al. 1997). Была продемонстирована возможность его использования для детекции уровня экспрессии в Н. volcanii (Holmes and Dyall-Smith, 2000; Gregor and Pfeifer, 2001). В 2000 году Патенге с сотр. аналогичным образом использовала ген галофильной ß-галактозидазы для Н. salinarum под различными галобактериальными промоторами. Трансформированные клетки можно было легко отличить по окрашиванию колоний в голубой цвет продуктами распада субстрата (X-gal) галактозидаз. Немаловажно, что при этом транскрипционный уровень гена bgaH соответствовал специфичной ферментативной активности. Поэтому bgaH ген может быть использован в работах по экспрессии генов в Н. salinarum и, возможно, в других галофильных археях.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Безносов, Сергей Николаевич, 2014 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Атабеков И.Г. (2008) Применение вирусных структур в качестве инструментов нанотехнологий. Росс. Нанотехн., 3, с. 132-141.

2. Бакеева Л.Е., Метлина А.Л., Новикова Т.М., Сперанский В.В. (1992) Ультраструктура двигательного аппарата Halobacterium salinarium. Доклады академии наук, 326, с. 914-915.

3. Воробьева Л.И. (2007) Археи: учебное пособие для вузов. Москва: ИКЦ «Академкнига», 447с.

4. Евдокимов Ю.М. (2006) Пространственно упорядоченные формы ДНК и ее комплексов - основа для создания наноконструкций для медицины и биотехнологии. Росс. Нанотехн., 1, с. 256-264.

5. Каграманова В.К., Деркачева Н.И., Манькин A.C. (1992) Трансформация и векторные системы архебактерий. Успехи современной биологии, 112, с. 483497.

6. Каграманова В.К. (1996) Природные плазмиды галофильных архебактерий. Успехи современной биологии, 116, с. 360-368.

7. Киреев И.И., Новикова Т.М., Шеваль Е.В., Метлина А.Л. (2006) О строении внутриклеточной части аппарата подвижности галобактерий. Микробиология, 75, с. 364-370.

8. Костюкова A.C., Пятибратов М.Г., Тарасов В.Ю., Гонгадзе Г.М., Федоров О.В. (1996) Структурные и функциональные особенности аппарата подвижности архей, связанные с экстремальными условиями их обитания. Биофизика, 41, с.164-168.

9. Метлина А.Л. (2001) Жгутики прокариот как система биологической подвижности. Успехи современной биологии, 41, с. 229-282.

10. Метлина А.Л. (2004) Жгутики бактерий и архей как органеллы подвижности прокариот. Биохимия, 69, с. 1203-1212.

11. Морозова О.В. (2006) Загадки архей и их фагов. Вестник ВОГиС, 9, с. 5565.

12. Прангишвили Д.А. (1989) Молекулярная биология архебектерий. Тбилиси: Мецниереба, 170 с.

13. Пятибратов М.Г., Костюкова А.С., Тарасов В.Ю., Федоров О.В. (1996) О некоторых принципах формирования структуры жгутиков галофильных архей. Биохимия, 61, с. 1489-1497.

14. Сперанский В.В., Метлина А.Л., Новикова Т.М., Бакеева JI.E. (1996) Дискообразная пластинчатая структура как часть жгутикового аппарата архей. Биофизика, 41. с. 159-163.

15. Сперанский В.В., Новикова Т.М., Метлина A.JI. (2008) Ультраструктура галобактериальной клетки в области выхода из нее жгутиков. Биологические мембраны, 25, с. 441-445.

16. Сюткин А.С., Пятибратов М.Г., Безносов С.Н., Федоров О.В. (2012) Различные механизмы формирования спиральности галоархейных жгутиков. Микробиология, 81, с. 620-629.

17. Alam М. and Oesterhelt D. (1984) Morphology, function and isolation of halobacterial flagella. J. Mol. Biol., 176, pp. 459-475.

18. Alam M. and Oesterhelt D. (1987) Purification, reconstitution and polymorphic transition of halobacterial flagella. J. Mol. Biol., 194, pp. 495-499.

19. Audette G.F. and Hazes B. (2007) Development of protein nanotubes from a multi-purpose biological structure. J. Nanosci. Nanotechnol., 7, pp. 2222-2229.

20. Banerjee A., Neiner Т., Tripp P., Albers S.V. (2013) Insights into subunit interactions in the Sulfolobus acidocaldarius archaellum cytoplasmic complex. FEBS J., 280, pp. 6141-6149.

21. Bardy S.L., Mori Т., Komoriya K., Aizawa S., Jarrell K.F. (2002) Identification and localization of flagellins FlaA and FlaB3 within flagella of Methanococcus voltae. J Bacteriol., 184, pp. 5223-5233.

22. Bardy S.L., Ng S.Y.M., Jarrell K.F. (2003) Prokaryotic motility structures. Microbiology, 149, pp. 295-304.

23. Bardy S.L., Ng S.Y., Jarrell K.F. (2004) Recent advances in the structure and assembly of the archaeal flagellum. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 7, pp. 41-51.

24. Bell S.D. and Jackson S.P. (2001) Mechanism and regulation of transcription in archaea. Current Opinion in Microbiology, 4, pp. 208-213.

25. Bitan-Banin G., Ortenberg R., Mevarech M. (2003) Development of a gene knockout system for the halophilic archaeon Haloferax volcanii by use of the pyrE gene. J. Bacterid., 185, pp. 722-778.

26. Bohlke K., Pisani F.M., Rossi M., Antranikian G. (2002) Archaeal DNA replication: spotlight on a rapidly moving field. Extremophiles, 6, pp. 1-14.

27. Calladine, C.R. (1978) Change of waveform in bacterial flagella: The role of mechanics at the molecular level. J. Mol. Biol., 118, pp. 457-479.

28. Chaban B., Ng S.Y., Jarrell K.F. (2006a) Archaeal habitats - from the extreme to the ordinary. Can. J. Microbiol., 52, pp. 73-116.

29. Chaban B., Voisin S., Kelly J., Logan S.M., Jarrell K.F. (2006b) Identification of genes involved in the biosynthesis and attachment of Methanococcus voltae N-linked glycans: insight into N-linked glycosylation pathways in Archaea. Mol. Microbiol., 61, pp. 259-268.

30. Chaban B., Ng S.Y., Kanbe M., Saltzman I., Nimmo G., Aizawa S., Jarrell K.F. (2007) Systematic deletion analyses of the fla genes in the flagella operon identify several genes essential for proper assembly and function of flagella in the archaeon, Methanococcus maripaludis. Mol. Microbiol., 66, pp. 596-609.

31. Chen P.-Y., Ladewski R., Miller R., Dang X., Qi J., Liau F., Belcher A.M., Hammond P.T. (2013) Layer-by-layer assembled porous photoanodes for efficient electron collection in dye-sensitized solar cells. J. Mater. Chem. A, 1, pp. 22172224.

32. Cline S.W., Lam W.L., Charlebois RX., Schalkwyk L.C. and Doolitle W.F. (1989) Transformation methods for halophilic archaebacteria. Can. J. Microbiol., 35, pp. 148-152.

33. Cohen-Krausz S. and Trachtenberg S. (2002) The structure of the archeabacterial flagellar filament of the extreme halophile Halobacterium salinarum R1M1 and its relation to eubacterial flagellar filaments and type IV pili. J. Mol. Biol., 321, pp. 383-395.

34. Cohen-Krausz S. and Trachtenberg S. (2008) The flagellar filament structure of the extreme acidothermophile Sulfolobus shibatae B12 suggests that archaeabacterial flagella have a unique and common symmetry and design. J. Mol. Biol., 375, pp. 1113-1124.

35. Cruden D., Sparling R., Markovetz A.J. (1989) Isolation and ultrastructure of the flagella of Methanococcus thermolithotrophicus and Methanospirillum hungatei. Appl. Environ. Microbiol., 55, pp. 1414-1419.

36. Dasgupta N., Arora S., Ramphal R. (2000) fleN, a gene that regulates flagellar number in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacterid., 182, pp. 357—364.

37. Ding Y., Jones G.M., Uchida K., Aizawa S., Robotham A., Logan S.M., Kelly J., Jarrell K.F. (2013) Identification of genes involved in the biosynthesis of the third and fourth sugars of the Methanococcus maripaludis archaellin N-linked tetrasaccharide. J. Bacteriol., 195, pp. 4094-4104.

38. Dong D., Zhang Y., Sutaria S., Konarov A., Chen P. (2013) Binding mechanism and electrochemical properties of M13 phage-sulfur composite. PLoS ONE, 8, pp. e82332

39. Faguy D.M., Bayley D.P., Kostyukova A.S., Thomas N.A., Jarrell K.F. (1996) Isolation and characterization of flagella and flagellin proteins from the thermoacidophilic archaea Thermoplasma volcanium and Sulfolobus shibatae. J. Bacteriol., 178, pp. 902-905.

40. Fedorov O.V. and Efimov A.V. (1990) Flagellin as an object for supramolecular engineering. Prot. Eng., 3, pp. 411-413.

41. Fedorov O.V., Pyatibratov M.G., Kostyukova A.S., Osina N.K., Tarasov V.Y. (1994) Protofilament as a structural element of flagella of haloalkalophilic archaebacteria. Can. J. Microbiol., 40, pp. 45-53.

110

42. Gazit E. (2007) Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS J., 274, pp 317-322.

43. Gerl L. and Sumper M. (1988) Halobacterial flagellins are encoded by a multigene family. J. Biol. Chem., 263, pp. 13246-13251.

44. Gerl L., Deutzmann R., Sumper M. (1989) Halobacterial flagellins are encoded by a multigene family. FEBS Lett., 244, pp. 137-140.

45. Ghosh A., Härtung S., van der Does C., Tainer J.A., Albers S.V. (2011) Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding. Biochem. J., 437, pp. 43-52.

46. Ghosh D., Lee Y., Thomas S., Kohli A.G., Yun D.S., Belcher A.M., Kelly K.A. (2012) M13-templated magnetic nanoparticles for targeted in vivo imaging of prostate cancer. Nat. Nanotechnol., 10, pp. 677-682.

47. Gregor D. and Pfeifer F. (2001) Use of a halobacterial bgaH reporter gene to analyse the regulation of gene expression in halophilic archaea. Microbiology, 147, pp. 1745-1754.

48. Hess G.T., Guimaraes C.P., Spooner E., Ploegh H.L., Belcher A.M. (2013) Orthogonal labeling of M13 minor capsid proteins with DNA to self-assemble end-to-end multi-phage structures. ACS Synth. Biol., 2, pp. 490-496.

49. Holmes M.L., Nuttall S.D., Dyall-Smith M.L. (1991) Construction and use of halobacterial shuttle vectors and further studies on Haloferax DNA gyrase. J. Bacteriol. 173, pp. 3807-3813.

50. Holmes M.L., Pfeifer F., Dyall-Smith M.L. (1994) Improved shuttle vectors for Haloferax volcanii including a dual-resistance plasmid. Gene, 146, pp.117-121.

51. Holmes M.L., Scopes R.K., Moritz R.L., Simpson R.J., Englert C., Pfeifer F., Dyall-Smith M.L. (1997). Purification and analysis of an extremely halophilic beta-galactosidase from Haloferax alicantei. Biochim. Biophys. Acta, 1337, pp. 276-86.

52. Holmes M.L. and Dyall-Smith M.L. (2000). Sequence and expression of a halobacterial beta-galactosidase gene. Molecular Microbiology, 36, pp. 114-122.

Ill

53. Inoue H., Nojima H., Okayama H. (1990) High efficiency transformation of Esherichia coli with plasmids. Gene, 96, pp. 23-28.

54. Jarrell K.F. and Albers S.V. (2012) The archaellum: an old motility structure with a new name. Trends in Microbiology., 20, pp. 307-312.

55. Jarrell K.F., Bayley D.P., Faguy, D.M. (1993) Structure, molecular sequence analysis and genetics of the flagella of the domain Archaea: comparison with bacterial flagella. Curr. Top. Mol. Genet., 1, pp. 15-31.

56. Jarrell K.F., Bayley D.P., Florian V., Klein A. (1996a) Isolation and characterization of insertional mutations in flagellin genes in the archaeon Methanococcus voltae. Mol. Microbiol., 20, pp. 657-666.

57. Jarrell K.F., Bayley D.P., Kostyukova A.S. (1996b) The archaeal flagellum: a unique motility structure. J. Bacteriol., 179, pp. 5057-5064.

58. Jarrell K.F., Ding Y., Nair D.B., Siu S. (2013) Surface appendages of Archaea: structure, function, genetics and assembly. Life, 3, pp. 86-117.

59. Jarrell K.F., Jones G.M., Nair D.B. (2010) Biosynthesis and role of N-linked glycosylation in cell surface structures of archaea with a focus on flagella and s layers. Int. J. Microbiol., 2010, pp. ID470138.

60. Jarrell K.F. and McBride M.J. (2008) The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nat. Rev. Microbiol., 6, pp. 466-476.

61. Jarrell K.F., Stark M., Nair D.B., Chong J.P. (2011) Flagella and pili are both necessary for efficient attachment of Methanococcus maripaludis to surfaces. FEMS Microbiol. Lett., 319, pp. 44-50.

62. Jones G.M., Wu J., Ding Y., Uchida K., Aizawa S., Robotham A., Logan S.M., Kelly J., Jarrell K.F. (2012) Identification of genes involved in the acetamidino group modification of the flagellin N-linked glycan of Methanococcus maripaludis. J. Bacteriol., 194, pp. 2693-2702.

63. Kalmokoff M.L., Jarrell K.F., Koval S.F. (1988) Isolation of flagella from the archaebacterium Methanococcus voltae by phase separation with Triton X-114. J. Bacteriol., 170, pp. 1752-1758.

64. Kalmokoff M.L., Koval S.F., Jarrell K.F. (1992) Relatedness of the flagellins from methanogens. Arch. Microbiol., 157, pp. 481-487.

65. Kovalenko I., Zdyrko B., Magasinski A., Hertzberg B., Milicev Z., Burtovyy R., Luzinov I., Yushin G. (2011) A major constituent of brown algae for use in high-capacity Li-ion batteries. Science, 334, pp. 75-79

66. Kumara M.T., Srividya N., Muralidharan S., Tripp B.C. (2006) Bioengineered flagella protein nanotubes with cysteine loops: self-assembly and manipulation in an optical trap. Nano Lett., 6, pp 2121-2129.

67. Kumara M.T., Tripp B.C., Muralidharan S. (2007a) Self-assembly of metal nanoparticles and nanotubes on bioengineered flagella scaffolds. Chem. Mater., 19, pp. 2056-2064.

68. Kumara M.T., Tripp B.C., Muralidharan S. (2007b) Layer-by-layer assembly of bioengineered flagella protein nanotubes. Biomacromolecules, 8, pp 3718-3722.

69. Kupper J., Marwan W., Typke D., Grunberg H., Uwer U., Gluch M., Oesterhelt D. (1994) The flagellar bundle of Halobacterium salinarium is inserted into a distinct polar cap structure. J. Bacterid., 176, pp. 5184-5187.

70. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, pp. 680-685.

71. Lassak K., Ghosh A., Albers S.V. (2012) Diversity, assembly and regulation of archaeal type IV pili-like and non-type-IV pili-like surface structures. Res. Microbiol., 163, pp. 630-644.

72. Lee Y., Kim J., Yun D.S., Nam Y.S, Shao-Horn Y., Belcher A.M. (2012) Virus-templated Au and Au-Pt core-shell nanowires and their electrocatalytic activities for fuel cell applications. Energy and Environ. Sci., 5, pp. 8328-8334.

73. Lee Y.J., Yi H., Kim W., Kang K., Yun D.S., Strano M.S., Ceder G., Belcher, A.M. (2009) Fabricating genetically engineered high-power lithium ion batteries using multiple virus genes. Science, 324, pp. 1051-1055.

74. Logan S.M. (2006) Flagellar glycosylation - a new component of the motility repertoire? Microbiology, 152, pp. 1249-1262.

113

75. Macnab R.M. (1992) Genetics and biogenesis of bacterial flagella. Annu. Rev. Genet., 26, pp. 131-158.

76. Macnab R.M. (1999). The bacterial flagellum: reversible rotary propellor and type III export apparatus. J. Bacteriol., 181, pp. 7149-7153.

77. Mao C., Solis D.J., Reiss B.D., Kottmann S.T., Sweeney R.Y., Hayhurst A., Georgiou G., Iverson B., Belcher A.M. (2004) Virus-based toolkit for the directed synthesis of magnetic and semiconducting nanowires. Science, 303, pp. 213-217.

78. Maniatis T., Fritsch E.E., Sambrook J. (1982) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 545 p.

79. Marwan W., Alam M., Oesterhelt D. (1991) Rotation and switching of the flagellar motor assembly in Halobacterium halobium. J. Bacteriol., 173, pp. 19711977.

80. Mashaghi S., Jadidi T., Koenderink G., Mashaghi A. (2013) Lipid nanotechnology. Int. J. Mol. Sci., 14, pp. 4242-4282.

81. Matagne A., Joris B., Frere J.-M. (1991) Anomalous behavior of a protein during SDS/PAGE corrected by chemical modification of carboxylic groups. Biochem. J., 280, pp. 533-556.

82. Nam K.T., Kim D., Yoo P.J., Chiang C., Meethong N., Hammond P.T., Chiang Y., Belcher A.M. (2006) Virus-enabled synthesis and assembly of nanowires for lithium ion battery electrodes. Science., 312, pp. 885-888.

83. Nâther D.J., Rachel R., Wanner G., Wirth R. (2006) Flagella of Pyrococcus furiosus: multifunctional organelles, made for swimming, adhesion to various surfaces, and cell-cell contacts. J. Bacteriol., 188, pp. 6915-6923.

84. Ng S.Y., Chaban B., Jarrell K.F. (2006) Archaeal flagella, bacterial flagella and type IV pili: a comparison of genes and posttranslational modifications. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 11, pp. 167-191.

85. Nutsch T., Oesterhelt D., Gilles E.D., Marwan W. (2005) A quantitative model of the switch cycle of an archaeal flagellar motor and its sensory control. Biophys. J., 89, pp. 2307-2323.

86. Oh D., Qi J., Lu Y.C., Zhang Y., Shao-Horn Y., Belcher A.M. (2013) Biologically enhanced cathode design for improved capacity and cycle life for lithium-oxygen batteries. Nat. Commun., 4, pp. 2756.

87. Olsen G.J., Woese C.R. (1997) Archaeal genomics: an overview. Cell., 89, pp. 991-994.

88. Patenge N., Berendes A., Engelhardt H., Schuster S.C., Oesterhelt D. (2001) The fla gene cluster is involved in the biogenesis of flagella in Halobacterium salinarum. Mol. Microbiol., 41, pp. 653-675.

89. Patenge N., Haase A., Bolhuis H., Oesterhelt D. (2000) The gene for a halophilic P-galactosidase (bgaY\) of Haloferax alicantei as a reporter gene for promoter analyses m Halobacterium salinarum. Mol. Microbiol., 36, pp. 105-113.

90. Peng L., Wu C., You M., Han D., Chen Y., Fu T., Ye M., Tan W. (2013) Engineering and applications of DNA-grafting polymer materials. Chem. Sci., 4, pp. 1928-1938.

91. Petrov A., Lombardo S., Audette G.F. (2013) Fibril-mediated oligomerization of pilin-derived protein nanotubes. Journal of Nanobiotechnology, 11, pp. 24.

92. Pfeifer F., Broicher A., Gillich T., Klee K., Mejia J., Rampp M., Oesterhelt D.

(2008) Genome information management and integrated data analysis with HaloLex. Arch. Microbiol., 190, pp. 281-299.

93. Poplawski A. and Bernander R. (1997) Nucleoid structure and distribution in thermophilic Archaea. J. Bacteriol., 179, pp. 7632-7630.

94. Protocols for halobacterial genetics (The Halohandbook), Dyall-Smith M.

(2009), ed. 7.2,144 p., http://www.haloarchaea.com/resources/halohandbook/.

95. Pyatibratov M.G., Beznosov S.N., Tiktopulo E.I., Surin A.K., Syutkin A.S., Fedorov O.V. (2008) Alternative flagellar filament types in haloarchaeon Haloarcula marismortui. Can. J. Microbiol., 54, pp. 835-844.

115

96. Pyatibratov M.G., Leonard K., Tarasov V.Y., Fedorov O.V. (2002) Two immunologically distinct types of protofilaments can be identified in Natrialba magadii flagella. FEMS Microbiol. Lett., 212, pp. 23-27.

97. Reeve J.N. (2003) Archaeal chromatin and transcription. Mol. Microbiol., 48, pp. 587-598.

98. Reindl S., Ghosh A., Williams G.J., Lassak K., Neiner T., Henche A.L., Albers S.V., Tainer J.A. (2013) Insights into Flal functions in archaeal motor assembly and motility from structures, conformations, and genetics. Mol. Cell., 49, pp. 10691082.

99. Rothemund P.W.K. (2006) Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature, 440, pp. 297-302.

100. Shahapure R, Driessen R.P., Haurat M.F., Albers S.V., Dame R.T. (2014) The archaellum: a rotating type IV pilus. Mol. Microbiol., 91, pp. 716-723.

101. Sleytr U.B., Pum D., Sara M. (1997) Advances in S-layer nanotechnology and biomimetics. Adv. Biophys., 34, pp. 71-79.

102. Southam G., Kalmokoff M.L., Jarrell K.F., Koval S.F., Beveridge T.J. (1990) Isolation, characterization and cellular insertion of the flagella from two strains of the archaebacterium Methanospirillum hungatei. J. Bacterid., 172, pp. 3221-3228.

103. Sowers R.K. and Schreier J.H. (1999) Gene transfer for the Archaea. Trends in Microbiology, 7, pp. 212-219.

104. Sumper M. (1987) Halobacterial glycoprotein biosynthesis. Biochim. Biophys. Acta., 906, pp. 69-79.

105. Syutkin A.S., Pyatibratov M.G., Galzitskaya O.V., Rodriguez-Valera F., Fedorov O.V. (2014) Haloarcula marismortui archaellin genes as ecoparalogs. Extremophiles, 18, pp. 341-349.

106. Tarasov V.Y., Pyatibratov M.G., Tang S., Dyall-Smith M., Fedorov O.V. (2000) Role of flagellins from A and B loci in flagella formation of Halobacterium salinarum. Mol. Microbiol., 35, pp. 69-78.

107. Thai C.K., Dai H., Sastry M.S., Sarikaya M., Schwartz D.T., Baneyx F. (2004) Identification and characterization of Cu20- and ZnO-binding polypeptides by Escherichia coli cell surface display: toward an understanding of metal oxide binding. Biotechnol. Bioeng., 87, pp. 129-137.

108. Thomas A.N., Bardy B.L., Jarrell F.K. (2001) The archaeal flagellum: a different kind of prokaryotic motility structure. FEMS Microbiology Reviews, 25, pp. 147-174.

109. Trachtenberg S., Galkin V.E., Egelman E.H. (2005) Refining the structure of the Halobacterium salinarum flagellar filament using the iterative helical real space reconstruction method: insights into polymorphism. J. Mol. Biol., 346, pp. 665-676.

110. Trachtenberg S. and Cohen-Krausz S. (2006) The archaeabacterial flagellar filament: a bacterial propeller with a pilus-like structure. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 11, pp. 208-220.

111. Tripepi M., You J., Temel S., Ônder Ô., Brisson D., Pohlschroder M. (2012) N-glycosylation of Haloferax volcanii flagellins requires known Agi proteins and is essential for biosynthesis of stable flagella. J. Bacterid., 194, pp. 4876-4887.

112. Tripepi M., Esquivel R.N., Wirth R., Pohlschroder M. (2013) Haloferax volcanii cells lacking the flagellin FlgA2 are hypermotile. Microbiology, 159, pp. 2249-2258.

113. Voisin S., Houliston R.S., Kelly J., Brisson J.R., Watson D., Bardy S.L., Jarrell K.F., Logan S.M. (2005) Identification and characterization of the unique N-linked glycan common to the flagellins and S-layer glycoprotein of Methanococcus voltae. J. Biol. Chem., 280, pp. 16586-16593.

114. Westerlund-Wikstrôm B., Tanskanen J., Virkola R., Hacker J., Lindberg M., Skurnik M., Korhonen T.K. (1997) Functional expression of adhesive peptides as fusions to Escherichia coli flagellin. Protein Engineering, 10, pp.1319-1326.

115. Wieland F., Lechner J., Sumper M. (1985) Halobacterial flagellins are sulfated glycoproteins. J. Biol. Chem., 260, pp. 15180-15185.

117

116. Woese C.R. and Fox G.E. (1977) Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: the primary kingdoms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, pp. 5088-5090.

117. Woese C.R., Kandler O., Wheelis M.L. (1990) Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 4576-4579.

118. Wolferen M., Ajon M., Driessen A.J., Albers S.V. (2013) How hyperthermophiles adapt to change their lives: DNA exchange in extreme conditions. Extremophiles, 17, pp. 545-563.

119. Yu B., Giltner C.L., Schaik E J., Bautista D.L., Hodges R.S., Audette G.F., Li D.Y., Irvin R.T. (2007) A novel biometallic interface: high affinity tip-associated binding by pilin-derived protein nanotubes. J. Bionanosci., 1, pp. 73-83.

120. Zhang R. and Zhang C.-T. (2003) Multiple replication origins of the archaeon Halobacterium species NRC-1. Biochemical and Biophesical Research Communications, 302, pp. 728-734.

121. Zillig W., Prangishvilli D., Schleper C., Elferink M., Holz I., Albers S., Janekovic D., Gôtz D. (1996) Viruses, plasmids and other genetic elements of thermophilic and hyperthermophilic Archaea. FEMS Microbiol. Rev., 18, pp. 225236.

122. Xiong X., Wu C., Zhou C., Zhu G., Chen Z, Tan W. (2013) Responsive DNA-based hydrogels and their applications. Macromol. Rapid. Commun., 34, pp.1271-1283.

Выражаю свою искреннюю благодарность:

моему научному руководителю Олегу Васильевичу Федорову за постоянное внимание и помощь при выполнении этой работы;

Михаилу Геннадьевичу Пятибратову за обсуждение работы и помощь в ее выполнении;

Александру Матвеевичу Скуднину и Татьяне Львовне Куловой из Физико-химического института им. Фрумкина РАН, совместно с которыми была проделана часть работы;

всем сотрудникам группы надмолекулярных белковых структур Института белка РАН за дружескую атмосферу и помощь в работе.

Выражаю свою искреннюю благодарность:

моему научному руководителю Олегу Васильевичу Федорову за постоянное внимание и помощь при выполнении этой работы;

Михаилу Геннадьевичу Пятибратову за обсуждение работы и помощь в ее выполнении;

Александру Матвеевичу Скуднину и Татьяне Львовне Куловой из Физико-химического института им. Фрумкина РАН, совместно с которыми была проделана часть работы;

всем сотрудникам группы надмолекулярных белковых структур Института белка РАН за дружескую атмосферу и помощь в работе.