Разработка репортерных систем в клетках Helicobacter pylori для создания модели микрофлюидного биосенсора тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Белова Александра Михайловна

• Белова Александра Михайловна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Белова Александра Михайловна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1. Характеристика объекта исследования

1.1.1. Подвижность H. pylori

1.1.2. Кислотная устойчивость H. pylori

1.1.3.Роль H. pylori в вакуолизации эпителиальных клеток СОЖ

1.1.4. Гетерогенность H. pylori

1.1.5. Природные плазмиды H. pylori

1.2. Методы генетической модификации бактерии H. pylori

1.3. Современная концепция биосенсоров. Сенсоры на основе модифицированных бактериальных клеток

1.4. Микрофлюидные устройства и их роль в создании биосенсорных систем нового поколения

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования

2.1. Материалы

2.2. Методы

2.2.1. Полимеразная цепная реакция

2.2.2. Выделение кольцевой ДНК

2.2.3. Препаративное и аналитическое электрофоретическое разделение ДНК

2.2.4. Рестрикция

2.2.5. Лигирование

2.2.6. Определение нуклеотидной последовательности кольцевых ДНК

2.2.7. Биоинформатический анализ последовательностей кольцевых ДНК

2.2.8. Культивирование бактериальных клеток

2.2.9. Получение компетентных клеток и трансформация E. coli

2.2.10. Природная трансформация клеток H. pylori

2.2.11. Определение эффективности трансформации клеток H. pylori

2.2.12. Определение стабильности челночных векторов в клетках H. pylori

2.2.13. Выделение РНК, синтез кДНК

2.2.14. ПЦР в реальном времени

2.2.15. Изготовление микрофлюидного чипа

2.2.16. Флуоресцентная микроскопия

2.2.17. Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. Результаты

3.1. Поиск и характеристика природных плазмид H.pylroi

3.2. Получение Е. coli/H.pylori челночных плазмидных векторов

3.3. Сравнительная характеристика Е. coli/H.pylori челночных векторов

3.3.1. Эффективность трансформации

3.3.2. Копийность

3.3.3. Стабильность

3.4. Получение репортерных конструкций на основе челночных векторов и их сравнительный анализ в клетках H. pylori

3.5. Разработка микрофлюидной платформы для иммобилизации единичных

бактериальных клеток

3.5.1. Топология микрофлюидного чипа

3.5.2. Иммобилизация модифицированных клеток E. coli в канале МФЧ

3.5.3. Иммобилизация модифицированных клеток H. pylori в канале МФЧ

ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Благодарности

Список сокращений

Список литературы

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка репортерных систем в клетках Helicobacter pylori для создания модели микрофлюидного биосенсора»

Актуальность темы исследования

Helicobacter pylori - это грамотрицательная патогенная бактерия, которая признана канцерогеном 1 класса. Она ассоциирована с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, атрофическими гастритами, аденокарциномой и экстраиодальной В-клеточной MALT-лимфомой [1, 5]. H. pylori привлекает внимание исследователей рядом особенностей. Это микроорганизм, которым инфицировано более половины человеческой популяции, однако более чем у 80% заражённых инфекция никак себя не проявляет [2-4]. Кроме того, на данный момент это единственный известный патоген, способный длительное время выживать в чрезвычайно кислой среде желудка. Такая устойчивость инфекции обеспечивается большим набором различных факторов вирулентности, а также метаболической и транскрипционной гибкостью, которые позволяют H. pylori быстро адаптироваться к иммунному ответу организма [6-9, 22].

Изучение того, как именно H. pylori осуществляет регуляцию экспрессии вирулентных генов в ответ на стрессовые факторы, имеет решающее значение для понимания патогенеза заболеваний, вызываемых данной бактерией [1, 5].

В молекулярной биологии распространенным подходом к исследованию регуляции экспрессии генов является использование репортерных систем. В одном из вариантов они представляют собой челночный плазмидный вектор, содержащий ген-репортер, экспрессия которого находится под контролем изучаемой промоторной последовательности. [10, 11]. Выбор таких промоторов из ряда бактериальных генов вирулентности позволяет создавать уникальные репортерные конструкции с различной чувствительностью и высокой специфичностью. Изменение экспрессии генов вирулентности H. pylori может служить индикатором ответа клеток на воздействие внешней среды. В тоже время, помимо непосредственного исследования регуляции экспресии генов в клетке, подобные репортерные системы могут быть успешно использованы для получения биосеонсоров. Биосенсор, использующий микроорганизмы и эукариотические клетки в качестве чувствительного элемента, позволяет детектировать результаты воздействия стрессовых факторов на метаболизм и транскрипционную активность данных клеток. В настоящее время в мире идёт разработка одновременно простых в использовании и высокочувствительных способов обнаружения химических веществ различной природы в образце. Сенсоры на основе живых клеток представляются наиболее многообещающими кандидатами для этих целей [12-16]. H. pylori, обладающий высокой адаптивностью, может стать перспективным объектом в качестве чувствительного элемента биологического сенсора. А специфическая ниша, которую

колонизирует патоген, делает его потенциальным монитором состояния слизистой оболочки желудка.

Помимо чувствительности и специфичности, немаловажной характеристикой биологического сенсора является его компактность. На сегодняшний день, в мировой науке происходит переход к малым и сверхмалым размерам устройств, которые используются как для изучения единичных клеток, клеточных структур, геномов, так и для клинической лабораторной диагностики. В частности, для этих целей используются микро/нанофлюидные системы [17-20]. С фундаментальной точки зрения, миниатюризация инструментов исследования с помощью микрофлюидных технологий позволяет значительно усовершенствовать технику исследования единичных клеток, а в биомедицинской сфере - поднять на новый уровень технологии разработки диагностических систем [21].

Разработка многоканального микрофлюидного чипа, в котором проведена модификация поверхности стенок каждого канала для обеспечения иммобилизации сенсорных клеток и поддержания их жизнеспособности, позволит в рамках эксперимента тонко моделировать внешние воздействия на клетку, а также проводить наблюдения в режиме реального времени. Данный подход значительно облегчит изучение фундаментальных процессов, происходящих в единичной клетке. Кроме того, такой чип может являться частью микрофлюидного биосенсора для регистрации различных факторов, оказывающих влияние на транскрипционную активность единичных генетически-модифицированных клеток.

Цель работы: разработать на основе штаммов Helicobacter pylori, содержащих репортерные конструкции, прототип микрофлюидного биосенсора оптического типа. Задачи:

• выделить природные плазмиды бактерии Helicobacter pylori в качестве основы для конструирования новых челночных векторов и изучить их структуру ;

• получить репортерные конструкции на основе челночных векторов, содержащих gfp и промоторные области генов вирулентности Helicobacter pylori;

• разработать топологию и методику модификации поверхности оригинального микрофлюидного чипа для иммобилизации единичных модифицированных клеток Helicobacter pylori, способных детектировать присутствие стрессовых факторов в аналите.

Научная новизна

Диссертация имеет фундаментальное значение для расширения инструментария генно-инженерных методов модификации бактерии H. pylori, а также вносит вклад в развитие биосенсорных технологий.

В ходе работы на основе природных плазмид были получены новые челночные векторы для модификации бактерии H. pylori. При этом общие характеристики новых челночных векторов выгодно отличаются от уже существующих для H. pylori систем модификации. Кроме того в нашей работе данный патоген впервые использовался в качестве основы для получения репортерных систем.

В целом, работа является комплексным исследованием, направленным на разработку модели микрофлюидного биосенсора оптического типа, использующего генетически модифицированные клетки H. pylori в качестве чувствительного элемента. Для этого на основе экструзионного полиметилметакрилата был разработан оригинальный микрофлюидный чип (МФЧ) и методика иммобилизации клеток E. coli и H. pylori в канале МФЧ. С помощью разработанной микрофлюидной платформы впервые в режиме реального времени оценивалась динамика изменения флуоресценции модифицированных клеток E.coli и H. pylori. Было показано, что данный подход позволяет успешно работать с широким спектром микроорганизмов, в том числе и с микроаэрофильными бактериями, чувствительными к длительному воздействию кислорода. Анализ флуоресценции иммобилизированных клеток H. pylori в канале МФЧ показала, что такая платформа успешно детектирует повышение кислотности среды, осмотический стресс, а также изменение концентрации ионов никеля и железа в аналите и является прототипом микрофлюидного биосенсора оптического типа.

Теоретическая и практическая значимость

Понимание уникальных механизмов колонизации, адаптации и длительной персистенции инфекции H.pylori по сей день является актуальной задачей для научного сообщества. Новые челночные векторы, полученные в ходе работы, позволяют расширить спектр экспериментальных подходов при работе с H. pylori. Векторы отличаются рядом преимуществ, по сравнению с уже существующими, и вносят значимый вклад в методологию изучения процессов метаболической и транскрипционной активности H. pylori.

Микрофлюидный чип, полученный в ходе работы, может быть успешно использован для иммобилизации прокариотических клеток и наблюдения за ними в режиме реального времени. Промоторные области генов вирулентности H. pylori в составе челночных векторов, обеспечивают чувствительность клеток, модифицированных такими

векторами, к повышению кислотности среды, осмотическому стрессу, изменению концентрации ионов никеля и железа в аналите. Модель микрофлюидного биосенсора оптического типа, полученная в работе на основе модифицированных клеток H. pylori, является перспективной для применения в таких областях, как фармакология, биотехнология и медицина. С фундаментальной точки зрения подход, предложенный в рамках работы, позволяет в дальнейшем получать более сложные генетические конструкции в клетках H. pylori, содержащие целый ряд различных промоторных последовательностей, активирующих экспрессию как репортерных, так и регуляторных генов. В области диагностики использование многоканальных чипов, где в каждом канале иммобилизованы клетки, чувствительные к определённому фактору в аналите, позволит увеличить избирательность такой системы и сферы её применения.

Методология и методы исследования В ходе исследования использовались общие микробиологические методы (культивирование штаммов и их трансформация), генно-инженерные методы (выделение геномной и плазмидной ДНК, методы рестрикционного анализа, отбор рекомбинантных клонов и другие методы молекулярного клонирования), методы геномного секвенирования, биоинформатические методы, биофизические подходы для разработки топологии и конструирования микрофлюидной платформы, флуоресцентная микроскопия.

Основные положения, выносимые на защиту

• На основе природных плазмид бактерии Helicobacter pylori получены новые челночные векторы для трансформации данной бактерии.

• Получены репортерные штаммы Helicobacter pylori, содержащие ген-репортер gfp под контролем промоторов генов вирулентности данной бактерии .

• Разработан прототип микрофлюидного биосенсора оптического типа, на основе генетически модифицированных клеток Helicobacter pylori, иммобилизированных в канале МФЧ, способных детектировать изменение кислотности среды, осмотический стресс, и изменение концентрации ионов железа и никеля в аналите.

Личный вклад автора

Автором был выполнен поиск и анализ литературы по теме исследования и планирование экспериментов. Автором осуществлялась работа с штаммами H. pylori, выделение и характеристика природных плазмид, получение и характеристика челночных векторов. Также автором проводились модификация микрофлюидных чипов, иммобилизация бактериальных клеток в каналах, анализ данных флуоресцентной микроскопии, интерпретация результатов, подготовка публикаций. Работа была

выполнена в лаборатории генной инженерии при участии лаборатории медицинских нанотехнологий ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России в период с 2013 по 2019 год.

Степень достоверности и апробация результатов

Решение задач, поставленных в работе, осуществлялось с использованием современных инструментальных методик. Обсуждение результатов проведено с учётом современных данных биологических наук. Научные положения и выводы, изложенные в диссертации, обоснованы и подтверждены фактическим материалом.

Материалы диссертации были представлены на VI Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике "Геномика и системная биология" (г. Звенигород, 2014г.); на Конференции молодых ученых ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России (г. Москва, 2015 г., диплом конкурса 2-й степени); на XXII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2015» (г. Москва, 2015 г., диплом конкурса 1-й степени); на 20-й Международной Пущинская школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (г. Пущино, 2016 г.); на XVI Всероссийской конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (г. Пущино, 2016 г., диплом конкурса 1-й степени); на научной конференции молодых ученых по медицинской биологии ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России (г. Москва, 2017 г., диплом конкурса 2-й степени); на VI Международной научно-практической конференции «Биотехнология: наука и практика» (г. Ялта, Республика Крым, 2018 г.); на V Международной конференции Постгеном'2018 «В поисках моделей персонализированной медицины» (г. Казань, 2018 г.); на Международной конференции The 43rd FEBS Congress 2018 (Чехия, Прага); на итоговой научно-практической конференции ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России (г. Москва, 2018); на научной конференции молодых ученых по медицинской биологии ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России 2019 (Москва, Россия); на VII Международной научно-практической конференции «Биотехнология: наука и практика» (г. Севастополь, 2019 г., диплом конкурса 1-й степени).

Публикации по теме

Результаты исследований опубликованы в 15 печатных работах, из них 3 статьи в журналах из перечня рецензируемых научных журналов ВАК Минобрнауки РФ, 12 тезисов в материалах российских и международных конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 105 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов, списка сокращений и условных обозначений, благодарностей и списка литературы. Диссертационная работа содержит 6 таблиц и 29 рисунков. Библиографический указатель включает 303 литературных источника.

ГЛАВА 1

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Характеристика объекта исследования.

Helicobacter pylori - грамотрицательная, спиралевидная, микроаэрофильная бактерия около 3 мкм в длину и диаметром около 0,5 мкм. Она колонизирует слизистую оболочку желудка (СОЖ) и ассоциирована с такими заболеваниями, как язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, атрофический гастрит, аденокарцинома желудка и экстраиодальная В-клеточная MALT-лимфома [1- 5]. H. pylori (Рисунок 1) стал объектом интенсивных исследований начиная с 1982 года, когда австралийским патологам Р. Уоррену и Б. Маршаллу впервые удалось изолировать эту бактерию из образцов биопсии желудка человека. Кроме того, именно они впервые разработали методику культивирования данного микроорганизма в лабораторных условиях на искусственных питательных средах [1, 23]. С самого начала H. pylori вызывал интерес у бактериологов, гастроэнтерологов, специалистов по инфекционным заболеваниям, эпидемиологов, патологов и фармацевтов. Но именно Барри Маршалл провёл один из наиболее убедительных экспериментов, подтверждающий взаимосвязь появления язвенной болезни желудка и гастрита с инфицированием H. pylori. Он сознательно выпил культуру H. pylori, после чего у него было зафиксировано развитие острого гастрита [24]. В 1994 году Национальный институт здравоохранения США официально утвердил взаимосвязь хронической язвенной болезни и гастрита с инфицированием H. pylori. А в 2005 году Р. Уоррен и Б. Маршалл были удостоены Нобелевской премии по медицине за исследование клинического значения бактерии H. pylori [25].

Рисунок 1. Морфология бактерий рода Helicobacter. (A) S-форма H. pylori с 5-7 полярными жгутиками. Масштаб поля 0.5 мкм. (B) Детализация жгутикового крючка. Негативное окрашивание, масштаб 0.05 ^m.

(C) Спиралевидный H. felis с переплазматическими волокнами и биполярными жгутиками. Масштаб 0.5 цш.

(D) Детализация переплазматического волокна. Негативное окрашивание, масштаб 0.05 цш. Адаптировано

из [40].

Данным микроорганизмом инфицировано более половины человеческой популяции, однако 80% являются лишь бессимптомными носителями. Современные исследования в области филогеографии H. pylori позволили установить, что сосуществование этого патогена и человека имеет длительную историю [26, 27,28, 303]. Анализ показал, что генетическое разнообразие штаммов H. pylori снижается по мере удаления от Восточной Африки, что согласуется с данными об аналогичном снижении генетического разнообразия среди людей [27]. В совокупности эти данные показывают, что бактерия сосуществует с человеческой популяцией, по крайней мере, с момента начала миграции людей из Африки около 60 тыс. лет назад [303]. Кроме того, инфицирование H. pylori отражает такие демографические события человеческой истории, как миграция народов банту, колонизация Южной Америки и Полинезии [28, 303].

Безусловно, такое длительное взаимодействие человеческого организма и H. pylori способствует развитию у патогена узкоспециализированных механизмов адаптации. Инфицирование человека данной бактерией в детском возрасте часто приводит к персистенции инфекции на протяжении всей жизни [4, 5].

На сегодняшний день, бактерии рода Helicobacter являются единственными известными микроорганизмами, способными колонизировать СОЖ и длительное время выживать в условиях низких значений pH желудочно-кишечного тракта [22, 29]. Эпидемиологические и серологические исследования показали, что клинические проявления заболеваний, вызываемых Н. pylori, во многом зависят от наличия или отсутствия бактериальных факторов вирулентности. Они представлены белками CagA, VacA, UreAB, IceA, BabA, FlaAB. [6-9, 22, 302]. Эти белки определяют подвижность бактерии, способность выживать в кислой желудочной среде, индуцировать синтез про -воспалительных цитокинов, активировать макрофаги и нейтрофилы, а также нарушать структуру плотных контактов эпителиальных клеток.

1.1.1. Подвижность H. pylori

Для всех бактерий рода Helicobacter характерно наличие 4-6 жгутиков на одном из полюсов, а также способность быстро передвигаться в густой слизи или агаре (Рисунок 2). Каждый жгутик окружен оболочкой, защищающей флагеллярную нить от кислого содержимого желудка [30]. В экспериментах с поросятами-гнотобионтами было продемонстрировано, что колонизация желудочного эпителия клетками H. pylori и

длительность персистенции в желудке напрямую зависят от уровня их подвижности [31]. Как и в случае Campylobacter jejuni [32], для H. pylori характерен более высокий уровень подвижности в вязкой среде по сравнению с другими бактериями, например такими, как сальмонеллы или E. coli [33].

Рисунок 2. Электронная микроскопия «дикого» штамма N6 H. pylori окрашенного фосфовольфраматом калия (pH 7.0). На изображении отчётливо видны жгутики на одном из полюсов бактерии. Масштаб (А) 0.05 цш и (С) 0.1 цш. Адаптировано из [39].

Жгутиковый аппарат H. pylori активно изучается. Так, Гейз с соавторами [34] выделили и очистили основной компонент флагеллярной нити H. pylori - белок флагеллин FlaA [35, 36]. Костшинская с коллегами [37] продемонстрировала наличие в нити небольшого количества второй субъединицы флагеллина FlaB [38], которая расположена в проксимальной области жгутика. Оба флагеллина имеют одинаковую молекулярную массу (53 кДа) и значительную аминокислотную гомологию (58% идентичности), однако гены flaA (HP0601) и flaB (HP0115), кодирующие соответствующие белки, локализованы в разных участках хромосомы, не принадлежат к одному оперону и регулируются различными промоторами [38]. Исследования изогенных мутантов H. pylori показали, что оба гена необходимы для полной подвижности клетки и развития персистирующей инфекции [31, 38].

Helicobacter pylori Сборка секреторной

--системы

-L

fliFGH flaB

flgH-flaG flgE

mutAB flKDE'

flhB flgBC

flgl flg*

fltG'

flit

flN flgl-

flgü flgü

flaA flaG'-flil)

Рисунок 3. Иерархия регуляции промоторной активности генов синтеза жгутика в H. pylori.

Гены и опероны H. pylori, промоторы которых были определены на основе анализа нуклеотидных последовательностей выделены серым. Обозначения: ^ промотор, ^ активация, L репрессия.

Адаптировано из [40].

Транскрипция генаflaB регулируется а54- фактором (Рисунок 3). Принимая во внимание расположение этого гена на хромосоме, было предположено, что, в отличие от flaA (транскрипция гена, кодирующего основной флагеллин, находится под контролем а28- фактора [36, 44]), он принадлежит к классу жгутиковых генов, экспрессия которых координировано регулируется в ответ на воздействие факторов окружающей среды и/или сигналов клеточного цикла [41, 42]. Транскрипция а54-зависимых генов находится под контролем энхансерных последовательностей, c которыми связываются трансактивирующие белки, относящиеся к семейству NtrC (NR-1) [41]. У H. pylori представителем этого класса белков является регулятор FlgR, кодируемый соответствующим геном flgR (HP0703) [42]. Делеционные мутанты по flgR

54

характеризовались отсутствием транскрипции всех а -зависимых генов, принадлежащих к комплексу филаментов, и отсутствием подвижности самих клеток [38, 39].

Для близкородственного микроорганизма Campilobacter coli также было продемонстрировано влияние различных факторов на экспрессию а54-зависимых жгутиковых генов. Уровень экспрессии flaB меняется в ответ на вариации значений pH, температуры и концентраций солей в среде [43]. Возможно, что накопление FlaB и других а54-зависимых жгутиковых белков в ответ на стимулы окружающей среды позволяет H. pylori адаптировать жгутиковый аппарат к различным стрессовым воздействиями. 1.1.2. Кислотная устойчивость H. pylori

Помимо подвижности, к основным факторам, позволяющим H. pylori длительно персистировать в условиях кислого pH желудка, относится уреаза. В природе этот фермент продуцируется различными видами бактерий [45]. В случае H. pylori уреаза играет основную роль в механизме кислотной устойчивости клетки и необходима для успешной колонизации СОЖ [46]. На её долю приходится более 10% массы всех белков бактериальной клетки. Фермент является мажорным поверхностным белком, одним из основных маркеров колонизации H. pylori, и часто используется при диагностики инфекции у пациентов [46].

Уреаза представляет собой №2+-содержащий гексадимер. Генный кластер уреазы содержит 7 генов: 2 структурных гена ureA и ureB (кодируют структурные субъединицы уреазы А и B); 4 добавочных гена ureE, ureF, ureG и ureH кодируют дополнительные белки, необходимые для сборки и включения ионов Ni2+ в состав субъединицы В для образования активного фермента [47, 299]. Добавочный ген ureI кодирует белок, образующий канал для мочевины, который активируется низким значением рН и регулирует активность уреазы через варьирование уровня импорта мочевины в клетку

(Рисунки 4, 5) [48, 49]. При высоких значениях pH канал закрывается, препятствуя доступу фермента к субстрату [299].

Уреаза H. pylori является несекретируемым цитоплазматическим белком, регулирующим внутреннюю концентрацию протонов посредством повышения рН в периплазме и увеличения мембранного потенциала [299]. Фермент катализирует гидролиз мочевины, которая содержится в слизи и импортируется в клетку, с образованием аммиака и углекислого газа. Аммиак, экспортируемый во внешнее пространство, нейтрализует соляную кислоту желудка и обеспечивает бактериальной клетке локальное поддержание комфортного значения pH (около 6-7), которое необходимо для роста и размножения микроорганизма (Рисунок 4) [50, 51].

Рисунок 4. Схематическое изображение механизма кислотной устойчивости H. pylori.

Цитоплазматическая уреаза катализирует гидролиз мочевины с образованием аммиака и углекислого газа. Продукты реакции нейтрализуют соляную кислоту, защелачивая среду СОЖ вблизи клетки [50]. UreI формирует pH-зависимые поры в цитоплазматической мембране, обеспечивающие импорт мочевины. Небольшое количество мочевины эндогенно доставляется в клетку в результате опосредованного гидролиза l-аргинина аргиназой RocF до l-орнитина. Адаптировано из [51].

Одновременно с этим, аммиак может проникать через фосфолипидные мембраны эпителиоцитов, при этом его проникающая способность растёт пропорционально повышению рН. В цитозоле аммиак превращается в NH4+ и ОН-, что повышает внутриклеточный и митохондриальный рН, нарушая митохондриальное и клеточное дыхание, энергетический метаболизм, а в конечном счёте и жизнеспособность клеток СОЖ [53, 299].

Экспрессия генов ureAB регулируется через процесс неравномерного распада части первичного транскрипта urelEFGH в ответ на изменение уровня pH и варьирование концентраций ионов Ni2+ . Известно, что для регуляции транскрипции, а70-фактор

взаимодействует с последовательностями промотора, расположенными на расстоянии 10 (-10 мотив) и 35 (-35 мотив) п.н. выше точки начала транскрипции. Дэвис с соавторами продемонстрировали, что транскрипция гена H. pylori ureA регулируется а54"фактором, который взаимодействует с -10 мотивом (TACAAT), аналогичным последовательности, узнаваемой а70"фактором в клетках E. coli. В то же время -35 мотив (TTAATC) промотора гена ureA в геноме H. pylori, является уникальным по своему нуклеотидному составу [54]. Было показано, что никель-зависимая регуляция транскрипции уреазных генов обусловлена белком NikR (Рисунок 5) [55]. Это глобальный авторегулятор, который управляет экспрессией никель-индуцируемых и никель-репрессируемых генов, включая гены утилизации ионов никеля и трехвалентного железа, подвижности клетки и ответа на факторы стресса, а также регулирует экспрессию генов, кодирующих белки внешней мембраны [55, 56].

fured

Рисунок 5. Схематическое изображение уреазного оперона. Показаны гены, кодирующие уреазу и ген HP0074 липопротеиновой сигнальной пептидазы [52]; направление их транскрипции изображено стрелками. Указаны промоторные области PUreA и Purel. Показан оператор транскрипционного фактора NikR в начале промоторной области PureA. Черным цветом показаны области связывания регулятора ArsR. Стрелки в виде точек отображают транскрипты, синтез которых регулируется промоторами PureA and Purel, соответственно; в дальнейшем они подвергаются расщеплению . Размеры транскриптов указаны справа.

Адаптировано из [52].

Ещё одним фактором, влияющим на экспрессию уреазных генов ureAB, urelEFGH, а также нескольких генов, кодирующих компоненты альтернативных путей синтеза аммиака, является понижение pH среды [56, 57]. Было высказано предположение о том, что NikR является также и главным регулятором кислотной адаптации H. pylori, обуславливая pH-зависимую транскрипцию ureAB и других рН-индуцируемых генов через регуляторный каскад при участии Fur репрессора [55]. Однако, впоследствии было продемонстрировано, что регуляция экспрессии гена ureA и некоторых других генов [58, 59, 60] в ответ на снижение pH среды, обусловлена действием двухкомпонентной системы ArsRS (acid responsive signaling) (HP0166-HP0165) [52]. Она представлена в клетке двумя белками: OmpR-подобным регулятором и гистидиновой киназой. Таким образом, в клетке H. pylori происходит делегирование процессов регуляции экспрессии одних и тех же

иге/

игеАВ (2.7 kbp)

■» ureABIEFGH 6.4 kbp -> urelEFGH 3.5 kbp

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Белова Александра Михайловна, 2022 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Marshall BJ, Warren JR. Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration // Lancet. 1984. Vol. 1(8390). P. 1311-5.

2. Ивашкин В.Т. Helicobacter pylori: биологические характеристики, патогенез, перспективы эрадикации // Рос.журн. гастроэнтерол. гепатол., колопроктол. 1997. Том 7. С. 21-23.

3. Goodman K.J., et al. Helicobacter pylori infection in the Colombian Andes: a population-based study of transmission pathways // Am J Epidemiol.1996. Vol. 144. P. 290-299.

4. Kosunen T.U., Aromaa A., Knekt P., Salomaa A., Rautelin H., Lohi P., Heinonen O.P. Helicobacter antibodies in 1973 and 1994 in the adult population of Vammala, Finland. // Epidemiol Infect. 1997. Vol. 119. P. 29-34.

5. Ji-Hyun Seo, et al. Helicobacter pylori Infection and Duodenal Gastric Metaplasia in Healthy Young Adults // Korean J. Gastroenterol. 2013. Vol. 61(4). P. 191-195.

6. Atherton J.C., Sharp P.M., Cover T.L., Gonzalez-Valencia G., Peek R.M. Jr, Thompson S.A., Hawkey C.J., Blaser M.J. Vacuolating cytotoxin (vacA) alleles of Helicobacter pylori comprise two geographically widespread types, ml and m2, and have evolved through limited recombination // Curr Microbiol. 1999. Vol. 39. P. 211-218.

7. Atherton J.C., Cao P., Peek R.M. Jr, Tummuru M.K., Blaser M.J., Cover T.L. Mosacism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori. Association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration // Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 17771-17777.

8. Blaser M.J. Role of vacA and the cagA locus of Helicobacter pylori in human disease Aliment // Pharmacol. Ther. 1996. Vol. 10. P. 73-77.

9. Alm R.A., Ling L.S., Moir D.T., et al. . Genomic sequence comparison of two unrelated isolates of the human gastric pathogen Helicobacter pylori // Nature 1999. Vol. 397. P. 17680.

10. Debnath, Mousumi; Prasad, Godavarthi B.K.S.; Bisen, Prakash S., Debnath, Mousumi. Molecular Diagnostics: Promises and Possibilities // Springer 2010. P. 71-84.

11. Carroll J.A., Stewart P.E., Rosa P., Elias A.F., Garon C.F. An enhanced GFP reporter system to monitor gene expression in Borrelia burgdorferi // Microbiology 2003. V. 149. №7. P. 1819.

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

А.Н. Решетилов и др. Биоснсоры. Медицинские, биотехнологические и экологические аспекты // Вестник новых медицинских тезнологий. 1999. T.VI, № 3-4. С. 44-49

D'Souza S.F. Microbial biosensors. Review // Biosens. Bioelectron. 2001. V. 16. P. 337353. Baeumner A.J. Biosensors for environmental pollutants and food contaminants. Review // Anal. Bioanal. Chem. 2003. V. 377. P. 434445.

R.A. Bullen et. al. Biofuel cells and their development. Review // Biosens. Bioelectron. 2006. V. 21. P. 20152045.

Rodriguez-Mozaz S., Lopez de Alda M.J., Barcelo D. Biosensors as useful tools for environmental analysis and monitoring. Review // Anal Bioanal Chem. 2006. V. 386, N 4. P. 10251041.

Wieder K.J., King K.R., Thompson D.M., Zia C., Yarmush M.L., Jayaraman A. Optimization of reporter cells for expression profiling in a microfluidic device // Biomedical Microdevices. 2005. V.7. №3. P. 213.

Poulsen C. R., Culbertson C. T., Jacobson S. J. and Ramsey J. M. Static and Dynamic Acute Cytotoxicity Assays on Microfluidic Devices // Anal. Chem. 2005. V. 77. P. 667. Balagadde F.K., You L., Hansen C.L., Arnold F.H., Quake S.R Long-Term. Monitoring of Bacteria Undergoing Programmed Population Control in a Microchemostat // Science. 2005. V. 309. №.5731, P. 137.

Manz A., Graber N., Widmer H.M. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing // Sensors and Actuators B: Chemical. 1990.Vol 1. P. 244-248. Verpoorte E. Microfluidic chips for clinical and forensic analysis // Electrophoresis. 2002. V. 23, №5. P. 677-712.

Behnam Kalali, Raquel Mejias-Luque, Anahita Javaheri, and Markus Gerhard Hindawi. H. pylori Virulence Factors: Influence on Immune System and Pathology // Mediators of Inflammation 2014. V. 2014.

Marshall B. J., McGechie D. B., Rogers P. A., Glancy R. J. Pyloric Campylobacter

infection and gastroduodenal disease // Med. J. Aust. 1985. Vol. 142. P. 439-444

Barry J. Marshall. Autobiography. Nobel Foundation 2005.

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2005. Nobel Foundation 2005.

Falush D. et al. Traces of human migrations in Helicobacter pylori populations // Science.

2003. Vol. 299. P. 1582— 1585.

Linz В. et al. An African origin for the intimate association between humans and Helicobacter pylori // Nature. 2007. Vol. 445. P. 915-918.

28. Suerbaum S., Josenhans C. Helicobacter pylori evolution and phenotypic diversification in a changing host // Nat Rev Microbiol. 2007. Vol. 5. P. 441-452.

29. Blaser M.J. An Endangered Species in the Stomach // Scientific American. Springer Nature. 2005. Vol. 292 № 2. P. 38—45.

30. Depamphilis M. L., Adler J. Attachment of flagellar basal bodies to the cell envelope: specific attachment to the outer, lipopolysaccharide membrane and the cytoplasmic membrane // J. Bacteriol. 1971. Vol. 105. P. 396-407.

31. Eaton K. A., Suerbaum S., Josenhans C., Krakowka S. Colonization of gnotobiotic piglets by Helicobacter pylori deficient in two flagellin genes // Infect. Immun. 1996. Vol. 64. P. 2445-2448.

32. Eaton K. A., Morgan D. R., Krakowka S. Campylobacter pylori virulence factors in gnotobiotic piglets // Infect. Immun. 1989. Vol. 57. P. 1119-1125.

33. Macnab, R. M. Flagella and motility // In F. C. Neidhardt et al. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 2nd ed. ASM Press, Washington, D.C.1996. P. 123-145.

34. Geis G., Suerbaum S., Forsthoff B., Leying H., Opferkuch W. Ultrastructure and biochemical studies of the flagellar sheath of Helicobacter pylori // J. Med. Microbiol. 1993. Vol. 38. P. 371-377.

35. Haas R., Meyer T. F., van Putten J. P. M. A flagellated mutants of Helicobacter pylori generated by genetic transformation of naturally competent strains using shuttle mutagenesis // Mol. Microbiol. 1993. Vol. 8. P. 753-760.

36. Leying H., Suerbaum S., Geis G., Haas R. Cloning and genetic characterization of a Helicobacter pylori flagellin gene // Mol. Microbiol. 1992. Vol. 6. P. 2863-2874.

37. Kostrzynska M., Betts J. D., Austin J. W., Trust T. J. Identification, characterization, and spatial localization of two flagellin species in Helicobacter pylori flagella // J. Bacteriol. 1991. Vol. 173. P. 937-946.

38. Suerbaum S., Josenbaus C., Labigne A. Cloning and genetic characterization of the Helicobacter pylori and Helicobacter mustelae flagellin genes and construction of H. pylori flaA- and flaB-negative mutants by electroporation-mediated allelic exchange // J. Bacteriol. 1993. Vol. 175. P. 3278-3288.

39. C. Josenhans, A. Labigne, and S. Suerbaum. Comparative Ultrastructural and Functional Studies of Helicobacter pylori and Helicobacter mustelae Flagellin Mutants: Both Flagellin Subunits, FlaA and FlaB, Are Necessary for Full Motility in Helicobacter Species // J Bacteriol. 1995. Vol. 177(11). P. 3010-3020.

40. Mobley HLT, Mendz GL, Hazell SL. Helicobacter pylori: Physiology and Genetics // Washington (DC): ASM Press; 2001.

41. Homma M., Kutsukake K., Hasebe M., Iino T., Macnab R. M. FlgB, FlgC, FlgF and FlgG. A family of structurally related proteins in the flagellar basal body of Salmonella typhimurium // J. Mol. Biol. 1990. Vol. 211. P. 465-477.

42. Spohn G., Scarlato V. Motility of Helicobacter pylori is coordinately regulated by the transcriptional activator FlgR, an NtrC homolog // J. Bacteriol. 1999. Vol. 181. P. 593-599.

43. Alm R. A., Guerry P., Trust T. J. The Campylobacter o54 flaB flagellin promoter is subject to environmental regulation // J. Bacteriol. 1993. Vol. 175. P. 4448-4455.

44. Kim J. S., Chang J. H., Chung S. I., Yum J. S. Molecular cloning and characterization of the Helicobacter pylori fliD gene, an essential factor in flagellar structure and motility // J. Bacteriol. 1999. Vol. 181. P. 6969-6976.

45. Mobley H. L. T., Island M. D., Hausinger R. P. Molecular biology of microbial ureases // Microbiol. Rev. 1995. Vol. 59. P. 451-480.

46. Eaton K. A., Brooks C. L., Morgan D. R., Krakowka S. Essential role of urease in pathogenesis of gastritis induced by Helicobacter pylori in gnotobiotic piglets // Infect. Immun. 1991. Vol. 59. P. 2470-2475.

47. Dunn B. E., Campbell G. P., Perez-Perez G. I., Blaser M. J. Purification and characterization of urease from Helicobacter pylori // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 9464-9469.

48. Weeks D. L., Eskandara S., Scott D. R., Sachs G. A H+-gated urea channel: the link between Helicobacter pylori urease and gastric colonization // Science. 2000. Vol. 287. P. 482-485.

49. Mobley H. L. T., Garner R. E., Bauerfeind P. Helicobacter pylori nickel transport gene nixA: synthesis of catalytically active urease in E. coli independent of growth conditions // Mol. Microbiol. 1995. Vol. 16. P. 97-109.

50. Ferrero R. L., Cussac V., Courcoux P., Labigne A. Construction of isogenic urease-negative mutants of Helicobacter pylori by allelic exchange // J. Bacteriol. 1992. Vol. 174. P. 42124217.

51. Foxall P. A., Hu L.-T., Mobley H. L. T. Amplification of the complete urease structural genes from Helicobacter pylori clinical isolates and cosmid gene bank clones // Rev. Esp. Enf. Dig. 1990. Vol. 78(Suppl. 1). P. 128-129.

52. Michael Pflock, Simone Kennard, Isabel Delany, Vincenzo Scarlato,and Dagmar Beier. Acid-Induced Activation of the Urease Promoters Is Mediated Directly by the ArsRS Two-Component System of Helicobacter pylori // Infect Immun. 2005. Vol. 73(10). P. 64376445.

53. Baldwin D. N., Shepherd B., Kraemer P., Hall M. K., Sycuro L. K., Pinto-Santini D. M., Salama N. R. Identification of Helicobacter pylori Genes That Contribute to Stomach Colonization // Infection and Immunity 2007. Vol. 75, № 2. P. 1005—1016.

54. J. Davies Nicolette de Vries Sjoerd G. Rijpkema Arnoud H.M. van Vliet Charles W. Penn First. Transcriptional and mutational analysis of the Helicobacter pylori urease promoter // FEMS Microbiology Letters 2002. Vol. 213 (1). P. 27-32

55. van Vliet, A.H.M., Poppelaars, S.W., Davies, B.J., Stoof, J.,Bereswill, S., Kist, M., Penn, C.W., Kuipers, E.J. and Kusters, J.G. NikR mediates nickel-responsive transcriptional induction of urease expression in Helicobacter pylori // Infect. Immun. 2002. Vol. 70. P. 2846-2852.

56. Beth M. Carpenter, Henan Gancz, Stephanie L. Servetas, Daniel R. Hallinger. Crosstalk between the HpArsRS two-component system and HpNikR is necessary for maximal activation of urease transcription // Front. Microbiol. 2015. Vol. 6.

57. Merrell, D Scott, Maria L Goodrich, Glen Otto, S Lucy, Stanley Falkow, and Lucy S Tompkins. PH-Regulated Gene Expression of the Gastric Pathogen Helicobacter Pylori // Infection and Immunity 2003. Vol. 71 (6). P. 3529-3539.

58. Bury-Mone, S., J.-M. Thiberge, M. Contreras, A. Maitournam, A. Labigne and H. de Reuse. Responsiveness to acidity via metal ion regulators mediates virulence in the gastric pathogen Helicobacter pylori // Mol. Microbiol. 2004. Vol. 53. P. 623-638.

59. Merrell, D. S., M. L. Goodrich, G. Otto, L. S. Tompkins, and S. Falkow. pH-regulated gene expression of the gastric pathogen Helicobacter pylori // Infect. Immun. 2003. Vol. 71. P. 3529-3539.

60. Wen, Y., E. A. Marcus, U. Matrubutham, M. A. Gleeson, D. R. Scott, and G. Sachs. Acid-adaptive genes of Helicobacter pylori // Infect. Immun. 2003. Vol. 71. P. 5921-5939.

61. John T. Loh, Shobhana S. Gupta, David B. Friedman, Andrzej M. Krezel, and Timothy L. Cover. Analysis of Protein Expression Regulated by the Helicobacter pylori ArsRS Two-Component Signal Transduction System // J. Bacteriol. 2010 Vol. 192 (8). P. 2034-2043.

62. Cover T. L., Reddy L. Y., Blaser M. J. Effects of ATPase inhibitors on the response of HeLa cells to Helicobacter pylori vacuolating toxin // Infect. Immun. 1993. Vol. 61. P. 1427-1431.

63. Cover T. L., Vaughn S. G., Cao P., Blaser M. J. Potentiation of Helicobacter pylori vacuolating toxin activity by nicotine and other weak bases // J. Infect. Dis. 1992. Vol. 166. P. 1073-1078.

64. Ricci V., Sommi P., Fiocca R., Romano M., Solcia E., Ventura U. Helicobacter pylori vacuolating toxin accumulates within the endosomal-vacuolar compartment of cultured

gastric cells and potentiates the vacuolating activity of ammonia // J. Pathol. 1997. Vol. 183. P. 453-459.

65. Ricci V., Sommi P., Fiocca R., Romano M., Solcia E., Ventura U. Helicobacter pylori vacuolating toxin accumulates within the endosomal-vacuolar compartment of cultured gastric cells and potentiates the vacuolating activity of ammonia // J. Pathol. 1997. Vol. 183. P. 453-459.

66. Atherton J. C., Cao P., Peek, Jr R. M., Tummuru M. K., Blaser M. J., Cover T. L. Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori. Association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P.17771-17777.

67. Cover T. L., Tummuru M. K., Cao P., Thompson S. A., Blaser M. J. Divergence of genetic sequences for the vacuolating cytotoxin among Helicobacter pylori strains // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 10566-10573.

68. Ito Y., Azuma T., Ito S., Miyaji H., Hirai M., Yamazaki Y., Sato F., Kato T., Kohli Y., Kuriyama M. Analysis and typing of the vacA gene from cagA-positive strains of Helicobacter pylori isolated in Japan // J. Clin. Microbiol. 1997. Vol. 35. P. 1710-1714.

69. Pagliaccia C., de Bernard M., Lupetti P., Ji X., Burroni D., Cover T. L., Papini E., Rappuoli R., Telford J. L., Reyrat J. M. The m2 form of the Helicobacter pylori cytotoxin has cell type-specific vacuolating activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 1021210217.

70. Phadais S. H., Ilver D., Janzon L., Normark S., Westblom T. U. Pathological significance and molecular characterization of the vacuolating toxin gene of Helicobacter pylori // Infect. Immun. 1994. Vol. 62. P. 1557-1565.

71. Schmitt W., Haas R. Genetic analysis of the Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin: structural similarities with the IgA protease type of exported protein // Mol. Microbiol. 1994. Vol. 12. P. 307-319.

72. Telford J. L., Ghiara P., Dell'Orco M., Comanducci M., Burroni D., Bugnoli M., Tecce M. F., Censini S., Covacci A., Xiang Z., Papini E., Montecucco C., Parente L., Rappuoli R. Gene structure of the Helicobacter pylori cytotoxin and evidence of its key role in gastric disease // J. Exp. Med. 1994. Vol. 179. P. 1653-1658.

73. Kenny Chitcholtan, Mark B Hampton, Jacqueline I Keenan. Outer membrane vesicles enhance the carcinogenic potential of Helicobacter pylori // Carcinogenesis. 2008. Vol. 29(12). P. 2400-5.

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

M H Forsyth, J C Atherton, M J Blaser, T L. Cover Heterogeneity in Levels of Vacuolating Cytotoxin Gene (vacA) Transcription among Helicobacter pylori Strains // Infect Immun. 1998. Vol. 66(7). P. 3088-94.

Gancz H, Jones KR, Merrell DS. Sodium chloride affects Helicobacter pylori growth and gene expression // J Bacteriol. 2008. Vol. 190. P. 4100-4105

Nayoung Kim et al. Genes of Helicobacter pylori Regulated by Attachment to AGS Cells // Infect. Immun. 2001 Vol. 72 (40). P. 23582368.

Blackwell Science Ltd Nicolette de Vries et al. Identification of Environmental StressRegulated Genes in Helicobacter pylori by a lacZ Reporter Gene Fusion System // Helicobacter. 2001. Vol. 6(4). P. 300-9.

Chun-Hao Huang, Shyh-Horng Chiou. Proteomic analysis of upregulated proteins in Helicobacter pylori under oxidative stress induced by hydrogen peroxide // Kaohsiung J Med Sci. 2011. Vol. 27(12). P. 544-53.

Collins, H. L.. The role of iron in infections with intracellular bacteria // Immunol. Lett. 2003. Vol. 85. P. 193-195.

Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации корине- и нокардиоподобных бактерий // МГУ 1991. Головлев Е.Л. Метастабильность фенотипа у бактерий // Микробиология 1998. Т. 67 №2. С. 149-155.

Achtman M. et al. Recombination and clonal groupings within Helicobacter pylori from different geographic regions // Mol. Microbiol. 1999. Vol. 32. P. 459-470. Akopyants N. S., Bukanov T. U., Westblom T. U., Kresovich S., Berg D. E. DNA diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori detected by PCR-based RAPD profile // Nucleic Acids Res. 1992. Vol. 20. P. S137-S142.

Kansau I. et al. Genoryping of Helicobacter pylori isolates by sequencing of PCR products and comparison with the RAPD technique // Res Microbiol. 1996. Vol. 147. P. 661-669. Akopyanz N., Bukanov N. O., Westblom T. U., Berg D. E. PCR-based RFLP analysis of DNA sequence diversity in the gastric pathogen Helicobacter pylori // Nucleic Acids Res. 1992. Vol. 20. P. 6221-6225.

Langenberg W., Rauws E. A., Widjojokusumo A., Tytgat G. N., Zanen H. C. Identification of Campylobacter pyloridis isolates by restriction endonuclease DNA analysis // J. Clin. Microbiol. 1986. Vol. 24. P. 414-417.

Evans Jr. D.J, Queiroz D.M., Mendes E,N., Evans D.G. Diversity in the variable region of Helicobacter pylori cagA gene involves more than simple repetition of a 102-nucleotide sequence // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. Vol. 245. P. 780-784.

88. Garner J.A., Cover T.L. Analysis of genetic diversity in cytotoxin-producing and noncytotoxin-producing Helicobacter pylori strains // J. Infect. Dis. 1995. Vol. 172. P. 290293.

89. Hook-Nikanne J. et al. DNA sequence conservation and diversity in transposable element IS605 of Helicobacter pylori // Helicobacter 1998. Vol. 3. P. 79-85.

90. Suerbaum S. et al. Free recombination within Helicobacter pylori // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. Vol. 95. P. 12619-12624.

91. Пасечников В.Д., Чуков С.З. Значение геномной гетерогенности штаммов Helicobacter pylori в развитии ассоциированной патологии гастродуоденальной зоны // Рос. Журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии 2000. № 3. С. 7-11.

92. Akopyants N., Bukanov N.O., Westblom T.U., Berg D.E. PCR-based RFLP analysis of DNA sequence diversity in the gastric pathogen Helicobacter pylori // Nucleic Acids Res. 1992. Vol. 20. P. 6221-6225.

93. Akopyants N.S., Fradkov A., Diatchenko L., Hill J.E., Siebert P.D., Lukyanov S.A., Sverdlov E.D., Berg D.E. PCR-based subtractive hybridization and differences in gene content among strains of Helicobacter pylori // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. Vol. 95. P. 13108-13113.

94. Marshall D.G., Coleman D.C., Sullivan D.J., Xia H., O'Morain C.A., Smyth C.J. Genomic DNA fingerprinting of clinical isolates of Helicobacter pylori using short oligonucleotide probes containing repetitive sequences // J. Appl. Bacteriol. 1996. Vol. 81. P. 509-517.

95. Marshall D.G., Dundon W.G., Beesley S.M. Smyth C.J. Helicobacter pylori - a conundrum of genetic diversity // Microbiology 1998. Vol. 144. P. 2925-2939.

96. Taylor D.E., Eaton M., Chang N., Salama S.M. Construction of a Helicobacter pylori genome map and demonstration of diversity at the genome level // J. Bacteriol. 1992. Vol. 174. P. 6800-6806.

97. van Doom L.J. et al. Clinical relevance of the cagA, vacA, and iceA status of Helicobacter pylori // Gastroenterol. 1998. Vol. 115. P. 58-66.

98. Wang, G, M Z Humayun, and D E Taylor. Mutation as an Origin of Genetic Variability in Helicobacter Pylori // Trends in Microbiology 1999. Vol. 7 (12). P. 488-93.

99. J F Tomb et al. The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori // Nature 1997. Vol. 388(6642). P. 539-47.

100.Arno Karnholz et al. Functional and Topological Characterization of Novel Components of the comB DNA Transformation Competence System in Helicobacter pylori // J. Bacteriol. 2006. Vol. 188(3). P. 882-893

101. Johannes G. Kusters, Arnoud H. M. van Vliet, and Ernst J. Kuipers. Pathogenesis and Host Response in Helicobacter pylori Infections // Clin Microbiol Rev. 2006. Vol. 19(3). P. 449490.

102. Berg D E, Hoffman P S, Appelmelk BJ, Kusters JG. The Helicobacter pylori genome sequence: genetic factors for long life in the gastric mucosa // Trends in Microbiology 1997. Vol. 5(12). P. 468-474.

103.Alexvan Belkum. The role of short sequence repeats in epidemiologic typing // Current Opinion in Microbiology 1999. Vol. 2(3). P. 306-311.

104.N S Akopyants, K A Eaton, and D E Berg. Adaptive mutation and cocolonization during Helicobacter pylori infection of gnotobiotic piglets // Infect Immun. 1995. Vol. 63(1). P. 116-121.

105.Nedenskov-Sorensen et al. Natural competence for genetic transformation in Campylobacter pylori // J. Infect. Dis. 1990. Vol. 161. P. 365-366.

106. Hofreuter et al., 1998 D. Hofreuter, S. Odenbreit, G. Henke, R. Haas. Natural competence for DNA transformation in Helicobacter pylori: identification and genetic characterization of the comB locus // Mol. Microbiol.1998. Vol. 28, P. 1027-1038.

107.Hofreuter et al., 2001 D. Hofreuter, S. Odenbreit, R. Haas. Natural transformation competence in Helicobacter pylori is mediated by the basic components of a type IV secretion system // Mol. Microbiol. 2001. Vol. 41. P. 379-391.

108.D. Dubnau. DNA uptake in bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 1999. Vol. 53. P. 217-244.

109. E J Kuipers. Review article: Relationship between Helicobacter pylori, atrophic gastritis and gastric cancer // Aliment. Pharmacol. Ther. 1998. Vol. 12(1). P. 25-36.

110.Penfold, S.S., Lastovica, A.J., Elisha, B.G. Demonstration of plasmids in Campylobacter pylori // J. Infect. Dis. 1988. Vol. 157. P. 850-851.

111.De Ungria, M. C. A., Tillett, D., Neilan, B. A., Cox, P. T., & Lee, A. A Novel Method of Extracting Plasmid DNA from Helicobacter Species // Helicobacter 2001. Vol. 3(4). P. 269277.

112. Heuermann, Dorothee, and Rainer Haas. Genetic Organization of a Small Cryptic Plasmid of Helicobacter Pylori // Gene 1995. Vol. 165(1). P. 17-24.

113.de Ungria, M.C., Kolesnikow, T., Cox, P.T., and Lee, A. Molecular characterization and interstrain variability of pHPS1, a plasmid isolated from the Sydney strain (SS1) of Helicobacter pylori // Plasmid 1999. Vol. 41. P. 97-109.

114. Quinones, M., Knesek, J.E., and McIntire, S.A. Sequence and gene expression analyses of plasmid pHPM8 from Helicobacter pylori reveal the presence of two operons with putative roles in plasmid replication and antibiotic activity // Plasmid 2001. Vol. 46. P. 223-228.

115. Jung-Soo Joo et al. Genetic organization and conjugal plasmid DNA transfer of pHP69, a plasmid from a Korean isolate of Helicobacter pylori // J. Microb. 2012. Vol. 50. P. 955961.

116.Kleanthous H., C. L. Clayton, and S. Tabaqchali. Characterization of a plasmid from Helicobacter pylori encoding a replication protein common to plasmids in gram-positive bacteria // Mol. Microbiol. 1991. Vol. 5. P. 2377-2389.

117. Minnis, J. A., T. E. Taylor, J. E. Knesek, W. L. Peterson, and S. A. McIntire. Characterization of a 3.5-kbp plasmid from Helicobacter pylori // Plasmid 1995. Vol. 34. P. 22-36.

118. Dirk Hofreuter and Rainer Haas. Characterization of Two Cryptic Helicobacter pylori Plasmids: a Putative Source for Horizontal Gene Transfer and Gene Shuffling // J. Bacteriol. 2002. Vol. 184(10). P. 2755-2766.

119. Wolfgang Fischer Dirk Hofreuter Rainer Haas Claudia Höfler. Cryptic plasmids in Helicobacter pylori: Putative functions in conjugative transfer and microcin production // International Journal of Medical Microbiology 2004. Vol. 294(2-3). P. 141-8.

120. Kuipers. E.J., Israel, D.A., Kusters, J.G., and Blaser, M.J. Evidence for a conjugation-like mechanism of DNA transfer in Helicobacter pylori // J. Bacteriol. 1998. Vol. 180. P. 29012905.

121.Backert, S., Kwok, T., and Konig, W. Conjugative plasmid DNA transfer in Helicobacter pylori mediated by chromosomally encoded relaxase and TraG-like proteins // Microbiology 2005. Vol. 151. P. 3493- 3503.

122.John P. Donahue, Dawn A. Israel, Richard M. Peek Jr, Martin J. Blaser, Geraldine G. Miller. Overcoming the restriction barrier to plasmid transformation of Helicobacter pylori // Molecular Microbiology 2000. Vol. 37(5). P. 1066-1074.

123.Kuipers Johannes G. Kusters, Arnoud H. M. van Vliet and Ernst J. Pathogenesis of Helicobacter pylori Infection // Clin. Microbiol. Rev. 2006. Vol. 19(3). P. 449.

124.Jenks, P. J., C. Chevalier, C. Ecobichon, and A. Labigne. Identification of nonessential Helicobacter pylori genes using random mutagenesis and loop amplification // Res. Microbiol. 2001. Vol. 152. P. 725-734.

125. Kavermann, H., B. P. Burns, K. Angermuller, S. Odenbreit, W. Fischer, K. Melchers, and R. Haas. Identification and characterization of Helicobacter pylori genes essential for gastric colonization // J. Exp. Med. 2003. 197:813- 822.

126. Salama, N. R., B. Shepherd, and S. Falkow. Global transposon mutagenesis and essential gene analysis of Helicobacter pylori // J. Bacteriol. 2004. Vol. 186. P. 7926-7935.

127. Baik S.C. et al. Proteomic analysis of the sarcosine-insoluble outer membrane fraction of Helicobacter pylori strain 26695 // J. Bacteriol. 2004. Vol. 186. P. 949-955.

128. Bumann DS. et al. Proteome analysis of secreted pro- teins of the gastric pathogen Helicobacter pylori // Infect. Immun. 2002. Vol. 70. P. 3396- 3403.

129. Rain, J. C. et al. The protein-protein interaction map of Helicobacter pylori // Nature 2001. Vol. 409. P. 211-215.

130.Sabarth, N., S. Lamer, U. Zimny-Arndt, P. R. Jungblut, T. F. Meyer, and D. Bumann. Identification of surface proteins of Helicobacter pylori by selective biotinylation, affinity purification, and two-dimensional gel electrophoresis // J. Biol. Chem 2002. Vol. 277. P. 27896-27902.

131.Bury-Mone, S., J. M. Thiberge, M. Contreras, A. Maitournam, A. Labigne, and H. De Reuse. Responsiveness to acidity via metal ion regulators mediates virulence in the gastric pathogen Helicobacter pylori // Mol. Micro- biol. 2004. Vol. 53. P. 623-638.

132. Merrell, D. S., L. J. Thompson, C. C. Kim, H. Mitchell, L. S. Tompkins, A. Lee, and S. Falkow. Growth phase-dependent response of Helicobacter pylori to iron starvation // Infect. Immun. 2003. Vol. 71. P. 6510-6525.

133. Niehus E. H. et al. Genome-wide analysis of transcriptional hierarchy and feedback regulation in the flagellar system of Helicobacter pylori // Mol. Microbiol. 2004. Vol. 52. P. 947-961.

134.Thompson, L. J., D. S. Merrell, B. A. Neilan, H. Mitchell, A. Lee, and S. Falkow. Gene expression profiling of Helicobacter pylori reveals a growth-phase-dependent switch in virulence gene expression // Infect. Immun. 2003. Vol. 71. P. 2643-2655.

135. Boneca, I. G., H. de Reuse, J. C. Epinat, M. Pupin, A. Labigne, and I. Moszer. A revised annotation and comparative analysis of Helicobacter pylori genomes // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31. P. 1704-1714.

136.Bauerfeind, P., R. M. Garner, and L. T. Mobley. Allelic exchange mutagenesis of nixA in Helicobacter pylori results in reduced nickel transport and urease activity // Infect. Immun. 1996. Vol. 64. P. 2877-2880.

137.Bereswill, S., R. Schonenberger, A. H. van Vliet, J. G. Kusters, and M. Kist. Novel plasmids for gene expression analysis and for genetic manipulation in the gastric pathogen Helicobacter pylori // FEMS Immunol. Med. Microbiol.2005. Vol. 44. P. 157-162.

138. de Vries, N., E. J. et al. Identification of environmental stress-regulated genes in Helicobacter pylori by a lacZ reporter gene fusion system // Helicobacter 2001. Vol. 6. P. 300-309.

139. Guo, B. P., and J. J. Mekalanos. Rapid genetic analysis of Helicobacter pylori gastric mucosal colonization in suckling mice. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 2002. Vol. 99. P. 83548359.

140. Josenhans, C, S Friedrich, and S Suerbaum. Green Fluorescent Protein as a Novel Marker and Reporter System in Helicobacter Sp. // FEMS Microbiology Letters 1998. Vol. 161(2). P. 263-73.

141. Betty P. Guo, John J. Mekalanos. Helicobacter pylori mutagenesis by mariner in vitro transposition // FEMS Immunology and Medical Microbiology 2001. Vol. 30. P. 87-93.

142. Heuermann, D., and R. Haas. A stable shuttle vector system for efficient genetic complementation of Helicobacter pylori strains by transformation and conjugation // Mol. Gen. Genet. 1998. Vol. 257. P. 519-528.

143. Lee, W. K. et al. Construction of a Helicobacter pylori-Escherichia coli shuttle vector for gene transfer in Helicobacter pylori // Appl. Environ Microbiol. 1997. Vol. 63. P. 48664871.

144.Ando T., Xu Q., Torres M., Kusugami K., Israel D. A., Blaser M. J. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer // Mol. Microbiol.2000. Vol. 37. P. 1052-1065.

145. Beth M Carpenter et al. Expanding the Helicobacter pylori Genetic Toolbox: Modification of an Endogenous Plasmid for Use as a Transcriptional Reporter and Complementation Vector // Appl Environ Microbiol. 2007. Vol. 73(23). P. 7506-14.

146. Jung-Soo Joo et al. Genetic Organization and Conjugal Plasmid DNA Transfer of pHP69, a Plasmid from a Korean Isolate of Helicobacter pylori // The Journal of Microbiology 2012. Vol. 50(6). P. 955-961.

147.Chalce, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W.W. and Prasher, D.C. Green £uorescent protein as a marker for gene expression // Science 1994. Vol. 263. P. 802-805.

148.Dhandayuthapani, S., Via, L.E., Thomas, C.A., Horowitz, P.M., Deretic, D. and Deretic, V. Green £uorescent protein as a marker for gene expression and cell biology of mycobacterial interactions with macrophages // Mol. Microbiol. 1995. Vol. 17. P. 901-912.

149.Valdivia, R.H., Hromockyj, A.E., Monack, D., Rama- krishnan, L. and Falkow, S. Applications for green £uorescent protein (GFP) in the study of host-pathogen inter- actions // Gene 1996. Vol. 173. P. 47-52.

150. Cody, C.W., Prasher, D.C., Westler, W.M., Prendergast, F.G. and Ward, W.W. Chemical structure of the hexapep- tide chromophore of the Aequorea green fuorescent protein // Biochemistry 1993. Vol. 32. P. 1212-1218.

151. Ormoe, M., Cubitt, A.B., Kallio, K., Gross, L.A., Tsien, R.Y. and Remington, S.J. Crystal structure of the Aequorea victoria green £uorescent protein // Science 1996. Vol. 273. P. 1392-1395.

152. D'Souza S.F. Microbial biosensors // Biosens. Bioelectron. 2001. Vol.16. P.337-353.

153. Lei Y., Chen W., Mulchandani A. Microbial biosensors. Review // Anal Chim Acta. 2006. Vol.568. P.200-210.

154. Gu M.B., Mitchell R.J., Kim B.C. Whole-cell-based biosensors for environmental biomonitoring and application // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004. Vol. 87.P. 269-305.

155. Компанец О.Н. Портативные оптические биосенсоры для определения биологически активных и токсичных соединений // Успехи физических наук 2004.

156. Cammann K. Biosensors based on ion-selective electrodes // Anal Chem. 1977. Vol. 287. P. 1-9.

157.Thevenot D.R., Toth K., Durst R.A., Wilson G.S. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification // Pure Appl Chem. 1999. Vol. 71. P. 23332348.

158. Thevenot D.R., Toth K., Durst R.A., Wilson G.S. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification // Biosens Bioelectron. 2001. Vol. 16. P. 121131.

159.Thevenot D.R., Toth K., Durst R.A., Wilson G.S. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification // Anal Lett. 2001. Vol. 34. P. 635-659.

160. Van der meer JR and Belkin S. Where microbiology meets microengineering: Design and applications of reporter bacteria // Nature Reviews Microbiology 2010. Vol. 8(7). P. 511522.

161. Harms H, Wells MC, Van Der Meer JR. Whole-cell living biosensors - Are they ready for environmental application? // Appl. Microbiol. & Biotechnol. 2006. Vol. 70. P. 273-280.

162.Wang J. Electrochemical glucose biosensors // Chem Rev. 2008.Vol. 108. P. 814-825.

163.Akyilmaz E., Yorganci E., Asav E. Do copper ions activate tyrosinase enzyme? A biosensor model for the solution // Bioelectrochemistry 2010. Vol. 78. P. 155-160.

164.Venugopal V. Biosensors in fish production and quality control // Biosens Bioelectron. 2002. Vol. 17. P. 147-157.

165. Fariba Mollarasouli, Sevinc Kurbanoglu, and Sibel A. Ozkan. The Role of Electrochemical Immunosensors in Clinical Analysis Biosensors // Basel. 2019. Vol. 9(3). P. 86.

166. Wang J. DNA biosensors based on peptide nucleic acid (PNA) recognition layers. A review // Biosens Bioelectron. 1998. Vol. 13. P. 757-762.

167.Rechnitz G.A. Biochemical electrodes uses tissues slice. Chem Eng News. 1978. Vol. 56. P. 16-21.

168.Parikha Mehrotra. Biosensors and their applications - A review // J. Oral. Biol. Craniofac. Res. 2016. Vol. 6(2). P. 153-159.

169. Divies C. Remarks on ethanol oxidation by an "Acetobacter xylinum" microbial electrode // Ann Microbiol (Paris) 1975. Vol. 126(2). P. 175-86.

170.Ramanathan S, Ensor M, Daunert S Bacterial biosensors for monitoring toxic metals // Trends in Biotechnol. 1997. Vol. 15. P. 500-506.

171.Power, M., van der Meer, J.R., Tchelet, R., et al. Molecular-based methods can contribute to assessments of toxicological risks and bioremediation strategies // Journal of Microbiological Methods 1998. Vol. 32. P. 107-119.

172.Rodriguez-Mozaz, S., Marco, M.P., Lopez de Alda et al. Biosensors for environmental monitoring of endocrine disruptors: a review article // Anal Bioanal Chem. 2004. Vol. 378. P. 588-598.

173. Köhler, S., Belkin, S. and Schmid, R. Reporter genes bioassays in environmental analysis // Journal of Anal. Chem. 2000. Vol. 366. P. 769-779.

174.Purohit HJ. Biosensors as molecular tools for use in bioremediation // J. of Clean. Prod. 2003. Vol. 11. P. 293-301.

175.He W, Yuan S, Zhong WH, Siddikee, MA et al. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosebsors for combined chemosensing // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016. Vol. 100. P. 1109-1119.

176. Rogers K.R. Chip-based biosensors for environmental monitoring. Review // in Handbook of Biosensors and Biochips 2007. Vol. 2. Part six, chap. 75. P. 1-7.

177. D'Souza S.F. Microbial biosensors // Biosens. Bioelectron. 2001. Vol.16. P.337-353.3.

178. Lei Y., Chen W., Mulchandani A. Microbial biosensors. Review // Anal Chim Acta. 2006. Vol. 568. P.200-210.

179.Van Hamme J.D., Ajay S., Owen P.W. Recent advances in petroleum microbiology // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. Vol.67(4). P. 503-549.

180.Gu M.B., Mitchell R.J., Kim B.C. Whole-cell-based biosensors for environmental biomonitoring and application // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004. Vol 87. P. 269-305.

181.A. Keane et al. Exposing culprit organic pollutants: a review /// J. Microbiol. Methods 2002. Vol.49(2). P. 103-119.

182. О.Н. Понаморева. Бактериальные биосенсоры для экологического мониторинга углеводородов нефти: мини-обзор // Естественные науки 2010. Вып. 2. С. 273-280.

183. Ulitzur S. Natural Luminescent Whole-Cell Bioreporters // in Handbook of Biosensors and Biochips 2007. Vol. 2. Part six, chap. 9. P.1-10.

184. Скачков В.Б., Ревазова Ю.А., Данилов В.С. и др. Оценка токсичности по интенсивности биолюминесценции бактерий. Методические указания. // М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России 2000. C. 24.

185.Hyung, C. S. A portable toxicity biosensor using freeze-dried recombinant bioluminescent bacteria // Biosens. Bioelectron. 2002. Vol. 17. P. 433-440.

186. Pellinen, T. Detection of traces of tetracyclines from fsh with a bioluminescent sensor strain incorporating bacterial luciferase reporter genes // J. Agr. Food Chem. 2002. Vol. 17(50). P. 4812-4815.

187. Dzyadevych, S. V. Early-warning electrochemical biosensor system for environmental monitoring based on enzyme inhibition // Sensors and Actuators chemical. 2005. Vol. 10. P. 581-587.

188. Kovats, N. Assesment of soil contaminaition using ToxAlert test // Journal of Hungarian Geomathematics 2004.Vol. 2. P. 1-15.

189.Keane A, Phoenix P, Ghoshal S et al. Exposing culprit organic pollutants: A review // J. of Microbiol. Methods 2002. Vol. 49. P. 103-119.

190.Sorensen S.J., Burmolle M., Hansen L.H. Making bio-sense of toxicity: new developments in whole-cell biosensors // Curr. Opin. Biotechnol. 2006. Vol.17(1). P. 11-16.

191. Hansen L.H., S0rensen S.J. The use of whole-cell biosensors to detect and quantify compounds or conditions affecting biological systems // Microbial Ecol. 2001. Vol. 42. P. 483-494.

192.Vollmer A.C., Van Dyk T.K. Stress responsive bacteria: biosensors as environmentalmonitors // Adv. Microbial Physiol. 2004. Vol.49. P. 131-174.

193.Harms H., Wells M.C., van der Meer J.R. Wholecell living biosensors — are they ready for environmental application? // Appl Microbiol Biotech. 2006. Vol.70. P. 273-280.

194.Belkin S. Microbial whole-cell sensing systems of environmental pollutants // Curr Opin Microbiol. 2003. Vol. 6(3). P. 206-212.

195. S.P. Rupani et al. Characterization of the Stress Response of a Bioluminescent Biological Sensor in Batch and Continuous Cultures // Biotechnology Progress 2008. Vol. 12(3). P. 387-92.

196.T. K. Van Dyk et al. Responses to Toxicants of an Escherichia coli Strain Carrying a uspA9::lux Genetic Fusion and an E. coli Strain Carrying a grpE9::lux Fusion Are Similar // Appl. Environ. Microbiol. 1995. Vol. 61(11). P. 4124-4127.

197. Li Y.F., Li F.Y., Ho C.L., Liao V.H. Construction and comparison of fluorescence and bioluminescence bacterial biosensors for the detection of bioavailable toluene and related compounds // Environ Pollut. 2008. Vol.152(1). P. 123-132.

198. Hani A. Alhadrami. Biosensors: Classifications, Medical Applications and Future Prospective // Biotechnol. Appl. Biochem. 2018. Vol. 65(3). P. 497-508.

199.Bruus H. Theoretical microfluidics // Lecture notes third edition. MIC Department of Micro and Nanotechnology Technical University of Denmark 2006.

200. Chen J.M., Horng T.L., Tanet W.Y. et al. Analysis and measurements of mixing in pressure-driven microchannel flow // Microfluidics and Nanofluidics 2006. P. 455-69.

201.Reyes D., Iossifidis D., Auroux P., Manz A. Ibid. Micro total analysis systems. 2. Analytical standard operations and applications // Anal. Chem. 2002 Vol.74(12). P. 2637-2636.

202. Maamar H & Dubnau D. Bistability in the Bacillus subtilis K-state (competence) system requires a positive feedback loop // Mol. Microbiol. 2005. Vol. 56. P. 615-624.

203.Hilde de Reuse. & Stefan Bereswill. Ten years after the Helicobacter pylori genome: comparative and functional genomics provide new insights in the variabilityand adaptability of a persistent pathogen // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2007. Vol. 50. P. 165-176.

204. Francia, M.V., Varsaki, A., Garcillan-Barcia, M.P., Latorre, A., Drainas, C., and de la Cruz,

F. A classification scheme for mobilization regions of bacterial plasmids // FEMS Microbiol. Rev. 2004. Vol. 28. P. 79-100.

205. González-Pastor, J.E., San Millán, J.L., Castilla, M.A., and Moreno, F. Structure and organization of plasmid genes required to produce the translation inhibitor microcin C7 // J. Bacteriol. 1995. Vol. 177. P. 7131-7140.

206.Kyung-Doo Han, et al. Identification of chromosomal HP0892-HP0893 toxin-antitoxin proteins in Helicobacter pylori and structural elucidation of their protein-protein Interaction // The Jorn.of Biol. Chem. 2013. Vol. 288(8). P. 6004-6013.

207. Cárdenas-Mondragón M.G., et al. Transcriptional profiling of type II toxin-antitoxin genes of Helicobacter pylori under different environmental conditions: Identification of HP0967-HP0968 // System. Front. Microbiol. 2016. Vol. 7. P. 1872.

208.Song J.Y., Park S.G., Kang H.L., Lee W.K., Cho M.J., Park J.U., Baik S.C., Youn H.S., Ko

G.H., Rhee K.H pHP489, a Helicobacter pylori small cryptic plasmid, harbors a novel gene coding for a replication initiation protein // Plasmid 2003. Vol. 50(3). P. 236-41.

209.Sutcliffe, J. G. Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322 // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1979. Vol. 43(1). P. 77-90.

210.Frances Tran, James Q. Boedicker. Plasmid Characteristics Modulate the Propensity of Gene Exchange in Bacterial Vesicles // J. Bacteriol. 2019. Vol. 201(7).

211.Anindyajati, Artarini A.A., Riani C., Retnoningrum D.S. Plasmid copy number determination by quantitative polymerase chain reaction // Sci Pharm. 2016. Vol. 84(1). P. 89-101.

212. Skulj M, Okrslar V, Jalen S, Jevsevar S, Slanc P, Strukelj B, Menart V. Improved Determination of Plasmid Copy Number Using Quantitative Real-time PCR for Monitoring Fermentation Processes // Microb Cell Fact. 2008. Vol. 7. P. 6.

213. Peter M. P. Lanigan et al. A microfluidic platform for probing single cell plasma membranes using optically trapped Smart Droplet Microtools (SDMs) // Lab on a Chip 2009. Vol. 9(8). P. 1096-101.

214.Michael B. Elowitz et al. Stochastic Gene Expression in a Single Cell // Science 2002. Vol. 297(5584). P. 1183-1186.

215. Pribnow, D. Bacteriophage T7 Early Promoters: Nucleotide Sequences of Two RNA Polymerase Binding Sites // Journal of Molecular Biology 1975. Vol. 99. P. 419-443.

216.Cookson S., Ostroff N., Pang W.L., Volfson D., Hasty J. Monitoring dynamics of single-cell expression over multiple cell cycles //Mol. Syst. Biol. 2005. Vol. 1.

217..Balagadde F.K., You L., Hansen C.L., Arnold F.H., Quake S.R . Long-Term Monitoring of Bacteria Undergoing Programmed Population Control in a Microchemostat // Science 2005. Vol. 309(5731). P. 137.

218.O. Tatarinova et al. Comparison of the ' Chemical ' and ' Structural ' Approaches to the Optimization of the Thrombin- Binding Aptamer // PLoS One 2014. Vol. 9(2).

219.M. Prokofjeva et al. Anti-HIV Activities of Intramolecular G4 and Non-G4 Oligonucleotides // Nucleic Acid Ther. 2017. Vol. 27(1).

220.Hsu J, Bramhill D & Thompson CM. Open complex formation by DnaA initiator protein at the Escherichia coli chromosomal origin requires the 13-mer precisely spaced relative to the 9-mers // Mol Microbiol. 1994. Vol. 11. P. 903-911.

221.Park K & Chattoraj DK. DnaA boxes in the P1 plasmid origin: the effect of their position on the directionality of replication and plasmid copy number // J. Mol. Biol. 2001. Vol. 310. P. 69-81.

222.McEachern MJ, Filutowicz M & Helinski DR. Mutations in direct repeat sequences and in a conserved sequence adjacent to the repeats result in a defective replication origin in plasmid R6K // P. Natl. Acad. Sci. USA 1985. Vol. 82. P. 1480-1484.

223.Cover, T. L., P. Cao, C. D. Lind, K. T. Tham, and M. J. Blaser. Correlation between vacuolating cytotoxin production by Helicobacter pylori isolates in vitro and in vivo // Infect. Immun. 1993. Vol. 61. P. 5008-5012.

224. Doran KS, Helinski DR & Konieczny I. Hostdependent requirement for specific DnaA boxes for plasmid RK2 replication // Mol. Microbiol. 1999b. Vol. 33. P. 490-498.

225.Bernander R, Dasgupta S & Nordstrom K. The E. coli cell cycle and the plasmid R1 replication cycle in the absence of the DnaA protein // Cell 1991. Vol. 64. P. 1145-1153.

226.Thorsten Bischler, Hock Siew Tan, Kay Nieselt, Cynthia M. Sharma. RNA-seq (dRNA-seq) for annotation of transcriptional start sites and small RNAs in Helicobacter pylori // Methods 2015. Vol. 86.

227.Westermann A.J., Förstner K.U., Amman F., Barquist L., Chao Y., Schulte L.N. et al. Dual RNA-seq unveils noncoding RNA functions in host-pathogen interactions // Nature 2016. Vol. 529. P. 496-501.

228. Martine A. Collart, H.Th.Marc Timmers. The eukaryotic Ccr4-Not complex: a regulatory platform integrating mRNA metabolism with cellular signaling pathways? // Prog. Nucleic. Acid Res. Mol. Biol. 2004. Vol. 77. P. 289-322.

229. Junko K. Akada, Mutsunori Shirai,Hiroaki Takeuchi,Masataka Tsuda and Teruko Nakazawa. Identification of the urease operon in Helicobacter pylori and its control by mRNA decay in response to pH // Mol Microbiol. 2000. Vol. 36(5). P. 1071-84.

230. Seng-Kee Chuah, Feng-Woei Tsay, Ping-I Hsu, and Deng-Chyang Wu. A new look at antiHelicobacter pylori therapy // World J. Gastroenterol. 2011. Vol. 17(35). P. 3971-3975.

231. Kun-DerLin et al. Effects of Anti-Helicobacter pylori Therapy on Incidence of Autoimmune Diseases, Including Inflammatory Bowel Diseases // Clinical Gastroenterology and Hepatology 2019. Vol. 17(10). P. 1991-1999.

232. Hiroaki Takeuchi et al. Natural products and food components with anti-Helicobacter pylori activities // World J. Gastroenterol. 2014. Vol. 20(27). P. 8971-8978.

233.Te-Fu Lin, Ping-I Hsu. Second-line rescue treatment of Helicobacter pylori infection: Where are we now? // World J. Gastroenterol.2018. Vol. 24(40). P. 4548-4553.

234. Yi Hu, Yin Zhu, Nong-Hua Lu. Novel and Effective Therapeutic Regimens for Helicobacter pylori in an Era of Increasing Antibiotic Resistance // Front Cell Infect. Microbiol. 2017. Vol. 7. P. 168.

235. WK Lee et al. Construction of a Helicobacter pylori-Escherichia coli Shuttle Vector for Gene Transfer in Helicobacter pylori // Appl. Environ. Microbiol. 1997. Vol. 63(12). P. 4866-71.

236. Ivo G Boneca et al. Development of Inducible Systems To Engineer Conditional Mutants of Essential Genes of Helicobacter pylor // Appl. Environ. Microbiol. 2008. Vol. 74(7). P. 2095-102.

237. EJ Walsh , AP Moran. Influence of medium composition on the growth and antigen expression of Helicobacter pylori // J. Appl. Microbiol. 1997. Vol. 83(1). P. 67-75.

238. Hao Zeng et al. Proteomic Insights into Helicobacter pylori Coccoid Forms Under Oxidative Stress // Microbiol. 2008. Vol. 57. P. 281-2860.

239. Fusun Can et al. Urease Activity and Urea Gene Sequencing of Coccoid Forms of H. pylori Induced by Different Factors // Curr. Microbiol. 2008. Vol. 56. P. 150-155.

240.Guadalupe Ayala et al. Quantitation of H. pylori cytotoxin mRNA by real-time RT-PCR shows a wide expression range that does not correlate with promoter sequences // Microbial Pathogenesis 2004. Vol. 37. P. 163-167.

241.Allan E, Clayton CL, McLaren A et al. Characterization of low-pH responses of Helicobacter pylori using genomic DNA arrays // Microbiology 2001. Vol. 147. P. 22852292.

242. Ang S, Lee CZ, Peck K et al. Acid-induced expression in Helicobacter pylori: study in genomic scale by microarray // Infect. Immun. 2001. Vol. 69. P. 1679-1686.

243. Thompson L, Merrell DS, Neilan BA et al. Gene expression profiling of Helicobacter pylori reveals a growth-phasedependent switch in virulence gene expression // Infect. Immun. 2003. Vol. 71. P. 2643-2655.

244. Contreras M, Thiberge JM, Mandrand-Berthelot MA & Labigne A. Characterization of the roles of NikR, a nickelresponsive pleiotropic autoregulator of Helicobacter pylori // Mol. Microbiol. 2003. Vol. 49. P. 947-963.

245.Ernst FD, Bereswill S, Waidner B et al. Transcriptional profiling of Helicobacter pylori Fur-and iron-regulated gene expression. Microbiology 2005a. Vol. 151. P. 533-546.

246.Danielli A, Roncarati D, Delany I et al. In vivo dissection of the Helicobacter pylori Fur regulatory circuit by genome-wide location analysis // J. Bacteriol. 2006. Vol. 188. P. 46544662.

247.Forsyth MH, Cao P, Garcia PP et al. Genome-wide transcriptional profiling in a histidine kinase mutant of Helicobacter pylori identifies members of a regulon // J. Bacteriol. 2002. Vol. 184. P. 4630-4635.

248. Gancz H, Censini S & Merrell DS. Iron and pH homeostasis intersect at the level of Fur regulation in the gastric pathogen Helicobacter pylori // Infect. Immun. 2006. Vol. 74. P. 602-614.

249. Pflock M, Finsterer N, Joseph B et al. Characterization of the ArsRS regulon of Helicobacter pylori, involved in acid adaptation // J. Bacteriol. 2006a. Vol. 188. P. 34493462.

250.Loh JT & Cover TL Requirement of histidine kinases HP0165 and HP1364 for acid resistance in Helicobacter pylori // Infect. Immun. 2006. Vol. 74. P. 3052-3059.

251.G. H. Lee, S. H. Kim, K. Ahn, S. H. Lee, J. Y. Park. Separation and sorting of cells in microsystems using physical principles // J. Micromech. Microeng. 2016. Vol. 26.

252. E. K. Sackmann, A. L. Fulton, D. J. Beebe. The present and future role of microfluidics in biomedical research // Nature 2014. Vol. 507. P. 181-9.

253. A. C. R. Grayson, R. S. Shawgo, A. M. Johnson, N. T. Flynn, Y. W. Li, M. J. Cima, R. Langer. A bioMEMS review: MEMS technology for physiologically integrated devices // Proc. IEEE. 2004. Vol. 92. P. 6-21.

254. E. Berthier, E. W. K. Young, D. Beebe. Engineers are from PDMS-land, biologists are from polystyrenia // Lab Chip 2012. Vol. 12. P. 1224-37.

255.J. Y. Park, S. K. Kim, D. H. Woo, E. J. Lee, J. H. Kim, S. H. Lee. Differentiation of neural progenitor cells in a microfluidic chip-generated cytokine gradient // Stem Cells 2009. Vol. 27. P. 2646-54.

256.T. Ahmed, T. S. Shimizu, R. Stocker. Microfluidics for bacterial chemotaxis // Integr. Biol. 2010. Vol. 2. P. 604-29.

257. L. Yu, M. C. Chen, K. C. Cheung. Droplet-based microfluidic system for multicellular tumor spheroid formation and anticancer drug testing // Lab Chip 2010. Vol. 10. P. 2424-32.

258.Alam, K. Emmanuel, Z. Heng, Y. Changqing, L. Cheuk-Wing, X. Tao, Y. Mengsu. Recent advances in microfluidic technology for manipulation and analysis of biological cells (2007-2017) // Analytica Chimica Acta 2018. Vol. 1044. P. 29-65.

259.H. Yin, D. Marshall. Microfluidics for single cell analysis // Curr. Opin. Biotechnol. 2012. Vol. 23. P. 110 - 119.

260. S. Halldorsson, E. Lucumi, R. Gomez-Sjoberg, R. M. T. Fleming. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices // Biosen. Bioelectron. 2015. Vol. 63. P. 218-231.

261.L. Nan, Z. Jiang, X. Wei. Emerging microfluidic devices for cell lysis: a review // Lab Chip 2014. Vol. 14. P. 1060 - 1073.

262. T. Geng, C. Lu. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery // Lab Chip 2013. Vol. 13. P. 3803-21.

263. J. Nilsson, M. Evander, B. Hammarstrom, T. Laurell. Review of cell and particle trapping in microfluidic systems // Anal. Chim. Acta 2009. Vol. 649. P. 141-157.

264. J. Wu, X. Wu, F. Lin. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies // Lab Chip 2013. Vol. 13. P. 2484-99.

265. D. C. Duffy, J. C. McDonald, O. J. Schueller, G. M. Whitesides. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane) // Anal. Chem. 1998. Vol. 70. P. 4974-84.

266. C. W. Li, C. N. Cheung, J. Yang, C. H. Tzang, M. Yang. PDMS-based microfluidic device with multi-height structures fabricated by single-step photolithography using printed circuit board as masters // Analyst. 2003. Vol. 128. P. 1137-42.

267. G. V. Kaigala, S. Ho, R. Penterman, C. J. Backhouse. Rapid prototyping of microfluidic devices with a wax printer // Lab chip 2007. Vol. 7. P. 384-7.

268.M. W. Toepke, D. J. Beebe. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications // Lab chip 2006. Vol. 6. P. 1484-6.

269. H. Sasaki, H. Onoe, T. Osaki, R. Kawano, S. Takeuchi. Parylene-coating in PDMS microfluidic channels prevents the absorption of fluorescent dyes // Sens. Actuator B Chem. 2010. Vol. 150. P. 478-82.

270. B. Huang, H. K. Wu, S. Kim, R.N. Zare. Coating of poly(dimethylsiloxane) with n-dodecylbeta-D-maltoside to minimize nonspecific protein adsorption // Lab chip 2005. Vol. 5. P. 1005-7.

271.C.W. Li, Y. Zhu, J. S. Zhan, J. P. Ma, L. J. Gu, Y. N. Fang, C. Q. Yi. Separation of polystyrene nanoparticles in polydimethylsiloxane microfluidic devices with a combined titania and sodium dodecyl sulfate inner coating // Microchim. Acta. 2017. Vol. 184. P. 2227-39.

272.Б. Г. Беленький, Н. И. Комяк, В. Е. Курочкин, А. А. Евстрапов, В. Л. Суханов. Микрофлюидные аналитические системы (часть 2) // Научное приборостроение 2000. Том 10(3). С. 3-16.

273. Martynova L., Locascio L.E., Gaitan M., Kramer G.W., Christensen R.G., MacCrehan W.A. Fabrication of plastic microfluid channels by imprinting methods // Anal. Chem. 1997. Vol. 69. P. 4783-4789.

274. Effenhauser C.S., Bruin G.J.M., Paulus A., Ehrat M. Integrated capillary electrophoresis on flexible silicone microdevices: analysis of DNA restriction fragments and detection of single DNA molecules on microchips // Anal. Chem. 1997. Vol. 9. P. 3451-3457.

275.Matthew A. Roberts, Joel S. Rossier, Paul Bercier, and Hubert Girault. UV Laser Machined Polymer Substrates for the Development of Microdiagnostic Systems // Anal. Chem. 1997. Vol. 69(11). P. 2035-2042.

276.Levinson G, Gutman GA. Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution // Mol. Biol. Evol. 1987. Vol. 4(3). P. 203-21.

277. Jae-Young Song et al. Characterization of a small cryptic plasmid, pHP51, from a Korean isolate of strain 51 of Helicobacter pylori // Plasmid 2003. Vol. 50. P. 145-151.

278.M Quiñones, J E Knesek, S A McIntire. Sequence and Gene Expression Analyses of Plasmid pHPM8 from Helicobacter pylori Reveal the Presence of Two Operons with Putative Roles in Plasmid Replication and Antibiotic Activity // Plasmid 2001. Vol. 46(3). P. 223-8.

279. Yoshio Hosaka, Ryoichi Okamoto, Kazuhiko Irinoda, Satoru Kaieda, Wasaburo Koizumi, Katunori Saigenji, Matsuhisa Inoue. Characterization of pKU701, a 2.5-kb plasmid, in a Japanese Helicobacter pylori isolate // Plasmid 2002. Vol. 47(3). P. 193-200.

280. Момыналиев К.Т. Геномно-протеомная характеристика вариабельности Helicobacter pylori // Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, РАМН 2009. С.244.

281.Льюин Б. Гены // БИНОМ-Пресс 2011.

282.Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 2001, P. 2100.

283.Sambrook, Joseph; Russell, David W. Commonly Used Techniques in Molecular Cloning // Molecular Cloning. 2001

284.Oleg V.Podgorny et al. Isolation of single Chlamydia-infected cells using laser microdissection // Journal of Microbiological Methods 2015. Vol. 109. P. 123-128.

285.Sören Schreiber, Manuela Konradt, Claudia Groll, Peter Scheid, Guido Hanauer, Hans-Otto Werling, Christine Josenhans, Sebastian Suerbaum. The spatial orientation of Helicobacter pylori in the gastric mucus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004. Vol. 101(14). P. 5024-9.

286.J Khan, H Pelli, R Lappalainen-Lehto, S Järvinen, J Sand, I Nordback. Helicobacter Pylori in Alcohol Induced Acute Pancreatitis // Scand J Surg. 2009. Vol. 98(4). P. 221-4.

287. M Copass, G Grandi, R Rappuoli. Introduction of unmarked mutations in the Helicobacter pylori vacA gene with a sucrose sensitivity marker // Infect. Immun. 1997. Vol. 65(5). P. 1949-52.

288.A Lee, J O'Rourke, M C De Ungria, B Robertson, G Daskalopoulos, M F Dixon. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain // Gastroenterology 1997. Vol. 112(4). P. 1386-97.

289. M Tsuda, M Karita, T Nakazawa. Genetic Transformation in Helicobacter pylori // Microbiol. Immunol. 1993. Vol. 37(1). P. 85-9.

290. J T Wang, J C Sheu, J T Lin, T H Wang, M S Wu. Direct DNA amplification and restriction pattern analysis of Helicobacter pylori in patients with duodenal ulcer and their families // J. Infect. Dis. 1993. Vol. 168(6). P. 1544-8.

291.Go M F, Cissell L, Graham D Y. Helicobacter pylori plasmids: epidemiology in different geographical regions. In: Hunt R H, Tytgat G N J, editors. Helicobacter pylori—basic

mechanisms to clinical cure // Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers; 1998. P. 4.

292. J. Sun, W. Liu, Y. Li, A. Gholamipour-Shirazi, A. Abdulla, X. Ding. An on-chip cell culturing and combinatorial drug screening // System. Microfluid. Nanofluidics 2017, Vol. 21. P. 125.

293.H. Huang, Y. Yu, Y. Hu, X. He, O. B. Usta, M. L. Yarmush. Generation and manipulation of hydrogel microcapsules by droplet-based microfluidics for mammalian cell culture // Lab Chip 2017. Vol. 17. P. 1913

294.K. Middleton, S. Al-Dujaili, X. Mei, A. Gunther. L. You. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signaling during fluid shear stress mechanostimulation // J. Biomech. 59 (2017) 35-42.

295.J. M. Lee, H. I. Seo, J. H. Bae, B. G. Chung. Hydrogel microfluidic co-culture device for photothermal therapy and cancer migration // Electrophoresis 38 (2017) 1318-1324

296.J. Sun, W. Liu, Y. Li, A. Gholamipour-Shirazi, A. Abdulla, X. Ding. An on-chip cell culturing and combinatorial drug screening System // Microfluid. Nanofluidics 21 (2017) 125.

297.Miguel A De la Cruz et al. Gene Expression Profiling of Transcription Factors of Helicobacter pylori under Different Environmental Conditions // Front. Microbiol. 2017. Vol. 8. P. 615.

298. Govorun V., Momynaliev К., and Lokhov P. Molecular typing of the H. pylori clinical isolates in Russia by genome and proteome analysis // Molecular & Cellular Proteomics 2002. Vol. 9(1). P. 657.

299.О. К. Поздеев, А О Поздеева, Ю. В. Валеева, П. Е. Гуляев, А. Н. Савинова.

Механизмы взаимодействия Helicobacter pylori c эпителием слизистой оболочки желудка. II. Реакция эпителия слизистой оболочки желудка в ответ на колонизацию и персистирование H. pylori. Инфекция и иммунитет. Том 9, № 2 (2019).

300.Пельтек С.Е., Горячковская Т.Н., Рубцов Н.Б., Хлебодарова Т.М., Колчанов Н.А., Попик В.М., Пиндюрин В.Ф., Гольденберг Б.Г., Щеглов М.А., Кулипанов Г.Н. Микрофлюидные системы в биологии и конструирование геносенсоров. Нанотехнологии Экология Производство. 2010.

301.М.Л. Занавескин, А.А. Миронова, А.М. Попов. МИКРОФЛЮИДИКА И ЕЕ ПЕРСПЕКТИВЫ В МЕДИЦИНЕ. МОЛЕКУЛЯРНАЯ МЕДИЦИНА 2012

302. Момыналиев К.Т. Геномно-протеомная характеристика вариабельности Helicobacter pylori. Диссретационная работа 2009.

303. Маев И.В., Самсонов А.А., Андреев Д.Н.: Инфекция Helicobacter pylori. Монография. 2016.